JP4110223B2 - Ｐｎａプローブを用いる、溶液中でのヌクレオチドアッセイ法 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブ、および固体支持体もしくは隣接二本鎖ヌクレオチド構築体なしにＰＮＡプローブを溶液中のヌクレオチドの配列決定またはアッセイに用いる方法に関する。
関連技術の説明
ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡのポリアミド類似体である。たとえば米国特許第５，５３９，０８２号（ニールセンら）参照。ニールセンらは、ＰＮＡが相補的一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖を結合することにより天然ポリヌクレオチドに類似の行動を示すと記載している。ＰＮＡは一般にペプチド主鎖に結合したリガンドを含む。代表的なリガンドには、適切なリンカーを介してペプチド主鎖に結合した４種類の主要な天然ＤＮＡ塩基（すなわちチミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）または他の天然核酸塩基（たとえばイノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）または人工塩基（たとえばブロモチミン、アザアデニンまたはアザグアニンなど）が含まれる。
ＰＮＡ配列を含むプローブは、標的ヌクレオチド配列の検出に用いられている。米国特許第５，５０３，９８０号（カントー）には、二本鎖部分に隣接した一本鎖部分内にあるランダムではあるが決定可能な塩基配列を含む一組のＰＮＡプローブと核酸をハイブリダイズさせることにより、核酸の配列決定法にＰＮＡプローブを用いることを示唆している。その際、その一組の一本鎖部分は、予め定めた範囲全体にわたって可能性のあるあらゆる組合わせの配列を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーションは標的の一本鎖部分がプローブの一本鎖部分で相補認識されることによって起き、熱力学的にはプローブの隣接二本鎖性の存在が好ましい。
カントーは核酸がＰＮＡであってもよいと記載しているが、そのようなプローブを固体支持体の不存在下で使用することを開示または示唆してはいない。さらに、本発明は被験ＤＮＡ材料の隣接構築体を必要としない。
Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，“ペプチド核酸プレゲルハイブリダイゼーション：サザンハイブリダイゼーションの代替法”，９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １４６７０（１９９６年１２月）には、カントーのように固体支持体の使用が教示されているほか、ＰＮＡは一般に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に良好には結合しないことも教示されている。Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，ｐ．１４６７３、脚注参照。さらに、ｄｓＤＮＡを良好に結合することが認められたホモピリミジンＰＮＡ構築体は、プローブとしては有用でないであろう。本発明者らは、ホモピリミジンのみが鎖逆位によりｄｓＤＮＡと結合しうることを示唆する限定は誤りであり、これは用いるハイブリダイゼーション条件により生じるということを見出した。
Ｓｍｕｌｅｖｉｔｃｈら，“主鎖電荷の操作による、オリゴヌクレオチドによる鎖逆位の増大”，１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７００（１９９６年１２月）（Ｌａｎｄｓｄｏｒｐ，“ＰＮＡ類の近縁体”，１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６５３（１９９６年１２月）に記載）には、ｄｓＤＮＡとハイブリダイズするＰＮＡプライマーの使用が記載されている。しかしＳｍｕｌｅｖｉｔｃｈらはハイブリダイゼーションの検出にゲルを用いることを教示し、蛍光マーカーの使用は示唆していない。
多くのタイプの試料分析法が、染料の蛍光特性に依存している。ある波長の光で励起された分子がより長い波長の光を放射して非励起（基底）状態に戻るとき、蛍光が生じる。励起光と放射光は異なる波長のものであるため、光学フィルター、カメラまたはＣＣＤを用いて互いに分離できる。蛍光は特定の分子（したがって構造）を光学顕微鏡検査により可視化するために長年用いられており、フローサイトメトリーなど他の分析法にも採用されている。さらに、異なる色を示す蛍光を肉眼、カメラまたは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）で検出できる。
たとえば米国特許第５，５９４，１３８号（ジクストラら）には、核酸の蛍光検出法が開示されている。この方法は、核酸を蛍光マーカー、すなわちビス−ジカチオンアリールフラン化合物と接触させ、そしてその蛍光マーカーの蛍光を誘発する周波数の光に核酸を露光することを含む。蛍光マーカーはハイブリダイゼーション試験のためのプローブとしてのヌクレオチド配列にコンジュゲートしていてもよく、あるいはインサイチオ標識試験のための多数の試薬にコンジュゲートしていてもよい。
米国特許第４，９６３，４７７号（チェン）には、修飾核酸を含有する高感度プローブが開示されており、これを特異的抗体により認識できる。
蛍光インサイチオハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ガラススライドなどの固体支持体にＤＮＡを結合させることにより、ヒト染色体への蛍光プローブの結合を検出することを含む方法である。たとえばＫ．Ｈ．Ａｎｄｙ ｃｈｏｏ編，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，２および４章（ヒューマン・プレス、ニュージャージー州トトワ、１９９４）参照。プローブとのハイブリダイゼーションを含む従来の他のすべての検出法と同様に、この方法は、プローブが２つのＤＮＡ相補鎖のうちの一方とハイブリダイズする間、これらの相補鎖を離しておくために、固体支持体に依存する。さらにＦＩＳＨは、複雑な緩衝液および温度調節のプロトコールを必要とし、終夜インキュベーションを伴う。
試料を破壊せず、放射線を利用したアッセイ法より実験者にとって害が少なく、固体支持体調製の経費や遅れを必要とせず、容易に自動化できる方法を用いて、溶液中のヌクレオチド配列の存在を迅速に調べることは、本発明以前は不可能であった。時間と経費の点で効率的な変異遺伝子配列検出法が、変異遺伝子型と変化した表現型との関連を調べる際の律速段階であった。従来のＤＮＡ配列決定法は最も正確な変異同定手段であると考えられていたが、これらの方法はかなり緩慢で、労働集約的であり、多数のゲノムＤＮＡ試料を迅速にスクリーニングするのに特に好適というわけではなかった。
本明細書に引用する参考文献すべてにつき、それらの全体を本明細書に援用する。
発明の概要
本発明は、核酸配列を検出し、および／または核酸からの配列情報を決定するための方法を提供する。本発明によるプローブはＰＮＡを含有する。
本発明は、液体媒質中の少なくとも１つの一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列を検出する方法であって、それぞれ少なくとも１つのマーカーを有するＰＮＡプローブ類を液体媒質に添加して、この媒質中の少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１つのハイブリダイゼーション複合体を形成させ、液体媒質中の少なくとも１つのハイブリダイゼーション複合体の量と相関する少なくとも１つの信号を検出することにより、少なくとも１つのヌクレオチド配列を検出することを含む方法を提供する。
本発明方法は、ＰＮＡプローブ、ヌクレオチド配列またはハイブリダイゼーション複合体を、固体支持体またはゲルに結合させずに実施できる。
【図面の簡単な説明】
本発明を以下の図面に関して記載する。図中の同様な参照番号は同様なエレメントを表す。
図１は、本発明による装置の模式図である。
図２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄおよび１９Ｅは蛍光スペクトルである。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、試料中のヌクレオチド配列を検出および／または解明するためにＰＮＡプローブを使用する。ＰＮＡプローブは一方の鎖に結合することによりｄｓＤＮＡを認識し、これにより他方の鎖とハイブリダイズしてＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を生成することができると思われる。そのような認識は、塩基対２０以上の長さのｄｓＤＮＡ標的配列に対し行うことができる。８〜２０塩基のいかなる長さのプローブ配列も好ましい。これが、原核細胞および真核細胞の最小ユニークＤＮＡ配列にみられる範囲だからである。１２〜１８塩基のプローブがヒトゲノムの最小ユニーク配列であるので特に好ましい。しかし、より短い複数のプローブを用いて、その中に複数の非ユニーク−標的配列を含むヌクレオチド配列を検出し、これを合わせてヌクレオチド配列を独自に同定することができる。
本発明のプローブは、ｄｓＤＮＡとトリプレックス複合体、ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡとデュプレックス複合体を形成することができる。本発明化合物は、第１ＰＮＡプローブがＲＮＡまたはｓｓＤＮＡと結合し、得られたデュプレックス複転合体と第２ｓｓＤＮＡ鎖が結合したトリプレックス複合体を形成することもできる。たとえばＥｇｈｏｌｍら，“ＰＮＡはワトソン−クリック水素結合法則に従って相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする”，３６５ Ｎａｔｕｒｅ ５６６（１９９３）、およびＴｏｍａｃら，“ペプチド核酸複合体の安定性およびコンホメーションに対するイオン効果”，１１８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５５４４（１９９６）参照。
本発明によるＰＮＡプローブにおいて、ポリアミド主鎖に結合した塩基は主として、プローブ調製に必要な位置に結合した天然核酸塩基である。あるいは塩基は天然に存在しない核酸塩基（核酸塩基類似体）、他の塩基結合性部分、芳香族部分、（Ｃ１〜Ｃ４）アルカノイル、ヒドロキシル類、または水素であってもよい。核酸塩基という用語に除去可能な保護基を保有する核酸塩基が含まれることは理解されるであろう。さらに、ポリアミド骨格上の少なくとも１個の塩基を、ＤＮＡインターカレーター、リポーターリガンド、たとえば発蛍光団、放射性標識、スピン標識、ハプテン、または蛋白質認識リガンド、たとえばビオチンで、交換または置換してもよい。好ましい検出可能な標識には、放射性同位体、安定な同位体、酵素、蛍光性化学物質、発光性化学物質、発色性化学物質、金属、電荷、または空間構造体が含まれる。
特に好ましい態様において、ＰＮＡプローブは蛍光マーカーに共有結合したＰＮＡ配列を含み、これはレーザーを照射すると蛍光を発する。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセインが含まれる。
蛍光マーカーは、ＰＮＡとの相互作用を最小限にするために、短いリンカーを用いてＰＮＡの５’末端に付与することが好ましい。
変異ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列がわずか１塩基程度異なる場合にこれら２者を識別するためには、変異ヌクレオチドの変異部分がＰＮＡプローブの中心に対応するようにＰＮＡプローブを設計することが好ましい。プローブとヌクレオチドのミスマッチがプローブの中心にあるので、この設計によって、ヌクレオチドの変異部分がプローブの末端にある場合より高いハイブリダイゼーション収率およびより安定なハイブリッドが得られる。
少なくとも１つのヌクレオチド配列および／またはこの少なくとも１つの配列の変異形を含有すると思われる液体媒質に、ＰＮＡプローブを添加する。液体媒質は、ヌクレオチドの保存に適することが知られている慣用媒質のいずれであってもよい。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ”，第２版（１９８９）参照。たとえば液体媒質はヌクレオチド、水、緩衝液および界面活性剤を含むことができる。
液体媒質中のヌクレオチドは臨床試料から、自動化された方法を含めた任意の常法により得ることができる。そのような方法の例は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｖｏｌ．２，Ｐ．９．１６−９．１９および７．６−７．７に要約されている。自動核酸精製装置の例は、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）製バイオロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ）９６００である。
たとえば多様な疾患が個体ゲノム中の変異ＤＮＡの存在と関連することが知られている。野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡの配列が分かっている場合、これらのヌクレオチド配列を常法により臨床試料から単離することができる。ＰＣＲは臨床試料からヌクレオチドを単離する好ましい方法である。ＰＣＲは、野生型ＤＮＡおよび変異ＤＮＡの配列を増幅しうるプライマーを用いて実施される。
ヌクレオチド配列を既知濃度の液体媒質に添加する。濃度は、本発明方法の後続工程で発せられる信号の大きさ（たとえば蛍光強度）に影響を与える可能性があるからである。ヌクレオチド濃度は、たとえば２６０ｎｍでＵＶ吸収を測定することにより測定できる。
単離したヌクレオチドを液体媒質に添加し、検出前に変性させる。好ましくは、約９０〜約１００℃で約３０秒〜約５時間、ＰＮＡプローブの存在下に変性を行う。
好ましくはＰＮＡプローブを、検出すべきヌクレオチド配列の濃度の１〜２０倍の濃度で液体媒質に添加する。
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩類濃度、静電強度および緩衝液組成の異なる多様な条件下で起きる。これらの条件およびそれらを適用する方法の例は、当技術分野で知られている。たとえばＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｅｇｈｏｌｍら、Ｔｏｍａｃら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｖｏｌ．２，Ｐ．９．４７−９．５５、ならびにＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ，Ｖｏｌ４，Ｎｏ．３参照。
約４〜約７５℃の温度および約２分〜約２４時間でハイブリダイゼーション複合体を形成させることが好ましい。ＰＮＡプローブの存在下に６０分以内で変性を行わせた後、急冷せずに室温にまで放冷することが特に好ましい。
特定の試薬を用いて溶液中でのハイブリダイゼーションを促進することができる。これらの試薬の好ましい例には、一本鎖結合性蛋白質、たとえばＲｅｃＡ蛋白質、Ｔ４遺伝子３２蛋白質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合性蛋白質、核酸主溝および副溝結合性蛋白質、二価イオン、多価イオン、ならびにインターカレーション物質、たとえば臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）およびアンゲリシン（ａｎｇｅｌｉｃｉｎ）が含まれる。
本発明方法の各態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブの信号を検出する前に、ハイブリダイゼーション複合体をハイブリダイズしていないＰＮＡから分離する。分離は、ろ過、遠心分離、沈殿、イオン交換樹脂分離、および自由溶液電気泳動（すなわち、ゲル電気泳動と異なり、液体媒質中での電気泳動）のうち少なくとも１つにより行われる。
分離をＧ５０カラムにより行うことができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション複合体ならびにハイブリダイズしていないＤＮＡおよびＰＮＡの混合物をＧ５０カラムに移す。カラムを５００〜１０００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離する。結合していないＰＮＡはろ過されてカラムに保持される。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する溶液はカラムを通過し、キュベット内に回収される。
実際にはろ過を省くことができる。溶液を重力によりカラムに流し、または余分な緩衝液で洗浄することができる。しかし遠心分離は分離時間を短縮し、試料が希釈されるのを避けるためのものである。
分離を遠心分離により行うことができる。ハイブリダイゼーション後、１０００〜１００００ｒｐｍで４〜２０時間遠心分離することにより（移さずに）試料を２層に分離させる（勾配）。軽い方のハイブリダイズしていないＰＮＡは上層に多く、一方、重い方のハイブリダイゼーション複合体は下層に濃縮される。下層を蛍光測定のためキュベットに回収する。
特定の態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡの濃縮に電気的方法を用いる場合、ろ過工程を省くことができる。これらの態様においては、目的ヌクレオチド配列を検出する前に、または検出と並行して、液体媒質に電界を印加し、蛍光発光強度の変化を電界の関数として検出し、これをＰＮＡプローブが少なくとも１つの完全相補核酸配列および不完全相補核酸配列にハイブリダイズしたか否かの指標とする。
本発明に用いるのに好ましいマーカーは発蛍光団である。当業者に理解されるように、好ましくは蛍光マーカーの蛍光を誘発するために選択される波長は、当技術分野で“励起最大”波長、すなわち分子により吸収されてその分子をより高い電子状態に励起する波長として知られている。マーカー分子が高い電子状態から低い電子状態へ通過するとき、その分子は“発光最大”波長と呼ばれる波長の、あるタイプの可視放射線、すなわち蛍光を発する。本発明において検出するのは、この蛍光である。化合物が発する検出可能な信号を当技術分野で知られている方法で、たとえば肉眼、発光波長検出のためのエレクトロニクス手段（たとえばカメラおよびＣＣＤ）などを用いる観察により検出できる。有利には、蛍光波長は光学フィルターで２波長を良好に分離できるほど十分に励起光線の波長から離れている。
励起波長は、用いるマーカーのこの励起最大波長に相当するように選択され（ルーティンな実験および／または従来の知識による）、好ましくは４００〜１０００ｎｍ、より好ましくは４００〜７５０ｎｍである。たとえばマーカーがフルオレセインである場合、好ましい励起波長は約４８８ｎｍである。
好ましい態様においては、４００〜５２０ｎｍの波長のアルゴンイオンレーザーを用いてマーカーを照射し、５００〜７５０ｎｍで蛍光発光を検出する。照射時間は、好ましくは約１０ミリ秒〜約１分間である。
本発明方法を実施するための装置は、液体媒質を収容するための液体媒質容器；ヌクレオチドを照射するためのレーザー；レーザーにより誘発された蛍光を検出するための蛍光検出器；蛍光検出器で得たデータを分析するためのデータ分析デバイス；およびデータ分析デバイスで得たデータ分析値を報告する出力デバイスを含むことができる。本発明方法に用いるのに適した蛍光検出システムの模式図を示す図１を参照。
特定の態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブとハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを分離せずに、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブの照射により発する蛍光発光をハイブリダイズしていないＰＮＡプローブの蛍光発光と識別する。特定の態様においては、あるヌクレオチド配列にハイブリダイズしたあるタイプのＰＮＡプローブの蛍光発光を、第１ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズした他のタイプのＰＮＡプローブの蛍光発光と識別する。たとえば、わずか１個程度のヌクレオチドだけ異なる２つのヌクレオチド配列のうちのいずれかの存在を、下記に基づいて検出できる：２ヌクレオチドのうちの一方に厳密に相補的な蛍光ＰＮＡプローブは、厳密に相補的ではないものと比べて厳密な相補体といっそう効率的に結合し、したがってハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを除去した後には、より高濃度のハイブリダイゼーション複合体が溶液中にあり、より高い蛍光強度が得られるであろう。
複数のＰＮＡプローブを同時に用いて、多様な効果を達成することができる。検出法の信頼性を高めるために、単一ヌクレオチド配列の異なるセグメントを標的とする数種類のプローブを用いることができる。また１プローブがｄｓＤＮＡの一方の鎖を標的とし、他のプローブがｄｓＤＮＡの相補鎖を標的とすることもできる。
ＤＮＡが変異型または対応する野生型のいずれであるかを検出するための好ましい方法は、下記のものを同時に使用することを含む：（ａ）野生型と変異型の両方のＤＮＡ中にあるが、他の点ではユニークである配列を標的とする第１タイプのＰＮＡプローブ、および（ｂ）変異型ＤＮＡにユニークな配列を標的とする第２タイプのＰＮＡプローブ；その際第１タイプと第２タイプのＰＮＡプローブは識別可能な信号を発する異なるマーカーをもつ。したがって、第１プローブの信号の検出は試験が適正に行われたことを示し（すなわち、第１プローブは陽性対照として機能する）、第２プローブの信号の検出は変異ＤＮＡが存在することを示す。たとえば１プローブは５２５ｎｍに蛍光発光強度ピークを示すフルオレセインマーカーをもち、他方のプローブは５８０ｎｍに蛍光発光強度ピークを示すローダミンマーカーをもつことができる。
先行技術の検出方法と異なり、本発明は特定の態様においては液体媒質の全容量（すなわち分析される試料）を約２００μｌ以下に制限できる。特定の態様においては、全容量を約１０μｌ以下に制限することもできる。
ＰＮＡを用いて変異ｄｓＤＮＡを調べる場合、依然として疑わしい結果が得られたときは、その相補的ＰＮＡプローブを添加してＤＮＡの相補鎖を調べることにより、その試料につき直ちに追加試験を行うことができる。第１試験の一部として遠心分離した場合、試料を新たな試験管に取り出し、相補的ＰＮＡとハイブリダイズさせる。あるいは最初および同時に、変性ＤＮＡ鎖にそれぞれハイブリダイズしたＰＮＡプローブおよび相補的ＰＮＡプローブの両方を用いて、ＰＮＡ試験を行うことができる。
法廷用として、試料を試験し、保存し、次いで再試験することができる。ＰＮＡは数日たつとハイブリダイゼーションから放出され、ＤＮＡは時間がたつと再結合し、この方法で分解することがないからである。したがって試験後凍結した試料をその後同じ試験管内で何度も再試験できる。
図２にはＤＮＡの経時ハイブリダイゼーションを示す。ＰＮＡプローブを野生型ＤＮＡ（ＷＴ ＤＮＡ）および変異ＤＮＡ（ＭＴ ＤＮＡ）とハイブリダイズさせた。蛍光強度を測定することにより、プローブとＤＮＡのハイブリダイゼーションを経時的に追跡した。図２は、時間がたつとＰＮＡプローブとＤＮＡのハイブリダイゼーションが最終的には低下することを示す。これはＤＮＡがＰＮＡを置換することにより、経時的にその天然構造を回復することを示唆する。
従来法で一般的な量より少なくとも１００倍少ない化学物質またはゲノム材料（１００μｌ対１０ｍｌ）を用いて臨床試料を試験することができる。したがって従来用いられているより１０〜２０倍濃度のＰＮＡを用いるが、試験には１／５〜１／１０量のＰＮＡが消費されるにすぎず、一方ではきわめて決定的な結果が得られる。
以下の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。ただし本発明はそれらに限定されると解すべきではない。
実施例１
野生型ｐ５３遺伝子由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐ（塩基対）フラグメント（配列番号：１）をＰＣＲにより増幅させた。パーキン・エルマーのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ系２４００を用いてＰＣＲを実施し、９５℃で５分間の高温開始を行った。Ｔａｑ酵素を添加した後、下記のように３５サイクルを実施した：
変性： ９４℃、３０分間
アニーリング： ４５℃、４５分間（４５℃はプライマーのＴｍより５℃低い）
延長： ７２℃、３０分間（１ｋｂ／分）×３５
ＰＣＲは、１００ｍｌ容量中に、１０×反応緩衝液（１０μｌ）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2（１０μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（２μｌ）、２５ｐｍｏｌ／μｌのプライマー１（１μｌ）、２５ｐｍｏｌ／μｌのプライマー２（１μｌ）、１００μｇ／μｌのＤＮＡ鋳型（１μｌ）、ｄｄＨ2Ｏ（７４μｌ）、およびＴａｑポリメラーゼ（１μｌ）（５単位／μｌ）を含む混合物を用いて行われた。
同様に、同じゲノムの１５０ｂｐフラグメントの変異フラグメント（配列番号：２）もＰＣＲにより増幅させた。変異フラグメントは、３４４位のアミノ酸における点変異以外は野生型フラグメントと一致した。この位置で野生型ＤＮＡ配列ＣＴＧがＣＡＧに変化していた。
パーセプティブ・バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）社（米国マサチュセッツ州フラミンガム）から１２−ｍｅｒ ＰＮＡプローブを入手し、１５０ｂｐのｐ５３野生型フラグメント（配列番号：１）の１２ヌクレオチドセグメントに相補的になるように設計した。このプローブは下記の構造をもっていた：
５’−Ｈ−ＦｌｕＯ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ2
ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）であった。５０ｐｍｏｌの野生型ゲノムＤＮＡを３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブに添加し、１００ｍｌの緩衝液に混入した。５０ｐｍｏｌの変異ゲノムＤＮＡを３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブに添加し、１００μｌの緩衝液に混入した。
各試料を９５℃に３０分間加熱した。次いで各試料を３０℃に予熱した緩衝液に添加し、１時間ハイブリダイズさせた。
Ｇ５０スピンカラム（ファルマシア・バイオテク、スウェーデン国ウプサラ）で６００ｇ、２分間の遠心により、各試料の成分を分離した。結合していないＰＮＡはろ過されてカラムに保持された。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する溶液はカラムを通過し、蛍光検出用にキュベット内に回収された。次いで、キュベットをレーザー誘発蛍光のために蛍光分光計に装入し（すべての実施例において、照射波長４８８ｎｍ）、標的ゲノムＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出を行った。図３Ｂおよび３Ｃに示すように、５２５ｎｍにおける野生型ゲノムＤＮＡ試料の相対蛍光強度（図３Ｂ）は変異試料のもの（図３Ｃ）より４倍高く、これにより変異ゲノムＤＮＡ試料を野生型ゲノムＤＮＡ試料から識別できた。図３Ａは、プローブのみの蛍光強度を示す。
実施例２
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。変異ゲノムＤＮＡ試料（配列番号：３）は、３４４位のアミノ酸における塩基配列が野生型配列のＣＴＧからＣＧＧに変化していた。両試料を９４℃に２０分間加熱した。緩衝液を２５℃に予熱し、試料を３０分間ハイブリダイズさせた。Ｇ５０スピンカラムで８００ｒｐｍ、１．５分間の遠心により、各試料の成分を分離した。５２５ｎｍにおいて野生型ゲノムＤＮＡ試料から検出された蛍光の相対強度（図４Ｂ）は変異ゲノムＤＮＡ試料のもの（図４Ｃ）より６倍高く、これにより変異ゲノム試料を野生型ゲノム試料から識別できた。図４Ａは、溶液中プローブのみの蛍光強度を示す。
実施例３
この実施例は、下記の細部以外は実施例１および２と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号４）は、アミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＡＡＧへの２塩基の変化を有していた。各試料を最初に１００℃で４５分間加熱した。緩衝液を４５℃で予熱し、各試料を２０分間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ７５スピンカラムを用いて１０００ｒｐｍで１分間遠心することにより分離した。野生型ゲノムＤＮＡ試料（図５Ａ）から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料（図５Ｂ）からのものより８倍高く、野生型ゲノム試料を変異ゲノム試料から識別することが可能であった。
実施例４
この実施例は、下記の細部以外は実施例３と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号５）はアミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＧＣＧへの２塩基の変化を有した。各試料を最初に１００℃で１５分間加熱した。緩衝液を５０℃に予熱し、各試料を２時間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ５０スピンカラムを用いて、１２００ｒｐｍで１分間遠心することにより分離した。野生型ゲノムＤＮＡ試料から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料からのものより７倍高く、野生型ゲノム試料（図６Ａ）を変異ゲノム試料（図６Ｂ）から識別することが可能であった。
実施例５
この実施例は、下記の細部以外は他の実施例と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号６）は、アミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＴＡＣへの３塩基の変化を有していた。各試料を最初に９５℃で３０分間加熱した。緩衝液を２５℃で予熱し、各試料を６０分間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ５０スピンカラムを用いて７５０ｒｐｍで２分間遠心することにより分離した。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、野生型ゲノムＤＮＡ試料（図７Ａ）から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料（図７Ｂ）からのものより１０倍高く、野生型ゲノム試料を変異ゲノム試料から識別することが可能であった。
実施例６
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。フルオレセイン（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した実施例１の１００ｐｍｏｌの１２ｂｐのＰＮＡ，２５ｐｍｏｌの１５０ｂｐのＰＣＲ増幅ｄｓＤＮＡ（野生型（ＣＴＧ）（配列番号１）および１塩基変異ＤＮＡ（ＣＡＧ，配列番号２，およびＣＧＧ，配列番号３）を含む）、および１１５マイクロリットルの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ作用溶液（０．０２２５Ｍ Ｔｒｉｓホウ酸／０．０００５Ｍ ＥＤＴＡ），ｐＨ６．５）を室温で混合した。次に混合物を９５℃で３０分間加熱し、室温で約１時間ハイブリダイズさせた。
電極として働く２つの金属の針金を各試料に入れた。蛍光強度は５２５ｎｍでモニターし、この間、電極間距離約７または８ｍｍで電圧５ボルト、電流１０ｍＡをオンとオフに切り換えた。電圧が印加されたとき、ＤＮＡは負に帯電しているためＤＮＡおよびＤＮＡ−ＰＮＡはアノードに移動し、一方、未結合ＰＮＡは中性のため移動しなかった。
図８Ａは、野生型ＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。２５℃で１時間ハイブリダイズさせた後、溶液をキュベット中に移した。キュベットを蛍光分光計中に装入し、次に２つの電極を溶液中に入れて、印加した電界に伴う波長５２５ｎｍにおける蛍光強度の変化を検出した。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、電圧を印加すると減少し、電圧を除くと増加した。図８Ｂおよび８Ｃは、１塩基対ミスマッチＤＮＡ（それぞれ配列番号２および配列番号３）の蛍光スペクトルを示す。２５℃で１時間ハイブリダイズさせた後、変異体ＤＮＡの蛍光スペクトルは、野生型ＤＮＡのスペクトルとの相違を示した。電圧を印加すると、強度は急速に増加し、電圧を除くと、強度は減少した。
実施例７
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。Ｐ５３野生型ＤＮＡ（配列番号７）の３７５ｂｐのフラグメント、対応する３７５ｂｐの変異体型ＤＮＡフラグメント（配列番号８）、対応する３７５ｂｐの変異体型ＤＮＡフラグメント（配列番号９）および６３３ｂｐのＤＮＡフラグメント（配列番号１０）はＰＣＲにより得た。３７５ｂｐの野生型ＤＮＡは、実施例１からの１２塩基ＰＮＡに相補的なＤＮＡの標的配列を含有した。６３３ｂｐのＤＮＡは、そのような標的配列を欠失しており、この実施例において陰性対照として用いられた。配列番号８は、野生型フラグメント（配列番号７）と同一であるが、ただしアミノ酸位置３４４において点突然変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＣＴＧがＣＡＧに変化していた。配列番号９は、野生型フラグメント（配列番号７）と同一であるが、ただしアミノ酸位置３４４において点突然変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＣＴＧがＣＧＧに変化していた。
各試料は、５０ｐｍｏｌのそれぞれのＤＮＡフラグメント，２００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブおよび１３０ｍｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含有していた。各試料を９５℃で約３０分間加熱した。次に各試料を周囲条件（２５℃）において１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、Ｇ５０カラムを用いて未結合プローブを溶液から濾過した。
各試料を、標的ゲノムＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出のために蛍光分光計中に装入した。先の実施例と同様に、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、プローブに完全に相補的なＤＮＡフラグメントを含有する試料について最も高く、したがって変異体ＤＮＡフラグメント（図９Ｂ−９Ｃ）を含有する試料を野生型ＤＮＡフラグメント（図９Ａ）を含有する試料から識別することができた。予測されたように、陰性対照ＤＮＡフラグメントは、すべての中で最も低い蛍光強度を示した（図９Ｄ）。
実施例８
臨床試料は、ヒトゲノムの既知のセグメント中の単一のヌクレオチド変異に起因することが知られている疾患に罹患していると疑われる個体から得た。この遺伝子セグメントのフラグメントを、フラグメントが野生型ＤＮＡまたは変異体型ＤＮＡを有するかにかかわらずフラグメントを増幅しうるプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
１２塩基のＰＮＡプローブは、変異体ヌクレオチドを含む変異体型ＤＮＡフラグメントの一部に相補的であるように調製し、ここで、変異体ヌクレオチドはプローブの真中に位置する塩基に相補的な塩基を有する。プローブはその５’末端でフルオレセインで標識した。
ＰＣＲから得られた５０ｐｍｏｌのＤＮＡおよび３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブを１００ｍｌの緩衝液に加える。試料を９５℃で３０分間加熱する。次に、３０℃に予熱した緩衝液に試料を加え、１時間ハイブリダイズさせる。
試料の成分は、Ｇ５０スピンカラムで６００ｒｐｍで２分間遠心することにより分離する。ハイブリダイズしていないＰＮＡはカラムで濾過され、ハイブリッドおよびＤＮＡを含む液体媒体はカラムを通過し、キュベット中に回収される。
ＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出のためにキュベットを蛍光分光計中に装入する。試料の５２５ｎｍにおける蛍光強度があらかじめ決定された強度値を越える場合、変異体型ＤＮＡが個体において検出されている。試料の５２５ｎｍにおける蛍光強度があらかじめ決定された強度値を越えない場合には、変異体型ＤＮＡは個体において検出されていない。あらかじめ決定された強度値は、陰性および陽性対照試料を用いて分光計を検量することにより前もって決定する。
実施例９
この実施例は、下記の細部以外は実施例８と同様である。２つの未標識ＤＮＡ（一方は野生型（配列番号１）であり、他方は変異型（配列番号３）である）を同定する必要がある。以下の配列：
（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより合成）を有する、変異ＤＮＡ（配列番号３）に相補的なプローブを用いて、２つの未知のＤＮＡを同定した。
１００ｐｍｏｌのプローブ，２５ｐｍｏｌのＤＮＡ（ＷＴ ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）および１１５μｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含む各試料を、９５℃で３０分間加熱した。次に各試料を２５℃で１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、各試料をＧ５０カラム中に移し、７５０ｒｐｍで２分間遠心分離した。ハイブリッドはカラムを通過してキュベット中に回収されるが、一方ハイブリダイズしていないプローブは濾過され、カラム中に残る。キュベットを蛍光測定のために蛍光分光計中に装入した。
図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、スペクトルが大きく相違することを示した。より強い蛍光シグナル（図１０Ａ）を有する試料は、変異体ＤＮＡ（配列番号３）として同定される。より弱い蛍光強度を有する他の試料は、野生型ＤＮＡ（配列番号１）である。
実施例１０
この実施例は、下記の細部以外は実施例８と同様である。実施例８におけるように１つのプローブを用いずに、この実施例においては２つのプローブを用いる。第１のプローブは実施例８のプローブであり、これは変異体型ＤＮＡフラグメントの一部に完全に相補的である。第２のプローブは第１のプローブと同一であるが、ただし、変異体型核塩基配列の代わりに野生型核塩基配列を有する。試料の第１の部分を実施例８にしたがって第１のプローブを用いて探索する。第１の部分と同じサイズの第２の部分を同様に第２のプローブで探索する。変性、ハイブリダイゼーションおよび分離の後、各部分の蛍光を測定した。第１の部分の蛍光強度が第２の部分のものを越える場合には、変異体型ＤＮＡが個体において検出されている。第２の部分の蛍光強度が第１の部分のものを越える場合には、変異体型ＤＮＡは個体において検出されていない。
この実施例の方法は、支持体の異なる領域に結合した２つの対比型ＰＮＡプローブを有する固体支持体を含む診断装置で用いるのに適合させることができる。試料は分割されず、両方の型のプローブと等しく接触するように、支持体上に均一に分散される。装置の２つの領域の蛍光強度を、実施例９における２つの別々の試料の場合と同様の方法で比較することができる。
実施例１１
ビオチニル化二本鎖ＤＮＡ（配列番号１および配列番号３）をＰＣＲにより増幅した。一本鎖ＤＮＡは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ社より）を用いて、以下のように調製した。２５μｌの２ｘ結合緩衝液および洗浄緩衝液（Ｍ−２８０ストレプトアビジンキットより）および２５μｌ（２５ｐｍｏｌ）のビオチニル化ＤＮＡ（配列番号１および２）を、２ｍｇの予洗したＭ−２８０ストレプトアビジンのダイナビーズに加えた。ビーズを懸濁したまま混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に混合物を磁気粒子濃縮器（ＭＰＣ，Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）上に室温で２分間放置し、続いてピペットで上清を除去した。２０μｌの新たに調製した０．１Ｎ ＮａＯＨを加え、混合物を室温に５分間放置した。固定化ビオチニル化鎖を含むダイナビーズをＭＰＣを用いて管の側面に回収し、非ビオチニル化一本鎖ＤＮＡを含むＮａＯＨ上清を新しい管に移した。ＮａＯＨ上清を２．５μｌの新たに調製した０．２Ｎ ＨＣｌで中和した。
２００ｐｍｏｌのプローブおよび１５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液を一本鎖ＤＮＡを含有する上清に加えた。混合物を９４℃で５分間加熱し、次に室温で１時間インキュベートした。Ｇ５０カラムにより６５０ｒｐｍで２分間分離した後、未結合ＰＮＡをカラム中に濾過し、ハイブリッドをカラムを通して流し、キュベット中に回収した。試料を蛍光検出のために蛍光分光計中に装入した。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、一本鎖野生型ＤＮＡ試料（図１１Ａ）の５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、変異体一本鎖ＤＮＡ（図１１Ｂ）のものより５倍高かった。
実施例１２
４００ｐｍｏｌのプローブ、１００ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）および１００μｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含む各試料を９５℃で３０分間加熱した。次に、各試料を２５℃で１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、各試料をＧ５０カラム中に移し、７２０ｒｐｍで２分間遠心分離した。ハイブリッドはカラムを通過してキュベット中に回収され、一方ハイブリダイズしていないプローブは濾過され、カラム中に残った。キュベットを蛍光測定のために蛍光分光計に装入した。
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度はスペクトルの大きな相違を示す。より強い蛍光シグナル（図１２Ａ）を有するスペクトルは、ＷＴ ＤＮＡ（配列番号１）との完全にマッチしたプローブのハイブリダイゼーションを示す。より弱い蛍光強度を有する他のスペクトル（図１２Ｂ）は、ＷＴ ＤＮＡ（配列番号１）との１塩基対ミスマッチプローブのハイブリダイゼーションを示す。
実施例１３
同じ染料（フルオレセイン）を有する２つのＰＮＡプローブを異なる鎖中の２つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１３ａ：１つの標的配列に完全にマッチする１つのプローブ
変異型ｐ５３ＤＮＡ（配列番号１１）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。変異フラグメントは、野生型フラグメント（配列番号１）と同一であったが、ただし、アミノ酸位置３４０（すなわち塩基８８−９０）において２塩基の変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＡＴＧがＧＡＧに変異していた。
１２−ｍｅｒのＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．１）は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により合成された。次の構造：
を有するプローブは、１５０ｂｐのｐ５３ ＭＥ ＤＮＡの塩基対位置９５で始まり塩基対位置１０６で終わる１２ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計した（配列番号１１を参照）。
０．５ｘＴＢＥ溶液（０．０２２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／０．０００５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．５）をハイブリダイゼーション緩衝液として用いた。５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから購入）により溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ａは、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。ピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１３ｂ：１つの標的配列に完全にマッチする１つのプローブ
以下の構造：
を有する、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，により合成された１２−ｍｅｒのＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．２）は、実施例１３ａにおいて標的とした鎖に相補的なＭＥ ＤＮＡの鎖中の塩基対位置８３で始まり塩基対位置９４で終わる標的に完全に相補的であるように調製した（配列番号１１を参照）。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、プローブを溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。
実施例１３ｃ：異なる鎖の２つの標的配列に完全にマッチする２つのプローブ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ｃは、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。図１３Ｃに示されるように、５２５ｎｍにおける蛍光強度は、ほぼ、図１３Ａおよび１３Ｂに示される５２５ｎｍにおける強度の合計であった。
実施例１４
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローブを、１つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１４ａ
野生型ｐ５３ＤＮＡ（配列番号１）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，により合成された、次の構造：
を有する１２−ｍｅｒのローダミン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ−３）は、１５０ｂｐのｐ５３ＤＮＡの塩基対位置９５で始まり、塩基対位置１０６で終わる１２ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計した（配列番号１，１１，および１２を参照）。
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１４Ａは、ローダミン標識ＰＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。蛍光スペクトル中の放射ピークは、約５８０ｎｍに現れる。
実施例１４ｂ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、１５ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）および５ｐｍｏｌのフルオレセイン標識プローブ（プローブＮｏ．１）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１４Ｂは、ローダミン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．３）およびフルオレセイン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．１）の混合プローブとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。標的配列にハイブリダイズしたローダミン標識プローブに少なくとも部分的起因するショルダーは５８０ｎｍに現れ、標的配列にハイブリダイズしたフルオレセイン標識プローブに部分的に起因するピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１５
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローブを、２つの鎖上の完全にマッチした２つの標的にハイブリダイズさせた。
実施例１５ａ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１５Ａは、ローダミン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．３）とハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。ローダミンで標識したハイブリダイゼーション複合体によるブロードなピークは５８０ｎｍに現れる。
実施例１５ｂ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）および５ｐｍｏｌのフルオレセイン標識プローブ（プローブＮｏ．２）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１５Ｂは、プローブＮｏ．２および３とハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。ローダミン標識プローブによるブロードなピークは５８０ｎｍに現れ、フルオレセイン標識プローブによるピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１６
ＰＣＲで増幅し精製した、標的配列を欠失する６３３ｂｐのＤＮＡ（配列番号１０）をプローブの陰性対照として用いた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１０）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加え、次にプローブＮｏ．１−３を溶液に加えた。各試料を９５℃で１０分間加熱し、次に２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１６Ａは、プローブのみ（すなわち、１５ｐｍｏｌのプローブ（プローブＮｏ．１，２および３をそれぞれ５ｐｍｏｌ）を含む試料にＤＮＡを加えない）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｄは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
すべてのスペクトルは、５２５ｎｍおよび５８０ｎｍにおいてバックグラウンドレベルの蛍光強度を示した。
実施例１７
同じ染料（フルオレセイン）を有する２つのＰＮＡプローブを、１塩基対ミスマッチ標的配列および完全にマッチした標的配列にハイブリダイズさせた。
実施例１７ａ
ｐ５３ＤＮＡ遺伝子ＭＱ（配列番号１２）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。変異フラグメントは、ＭＥ ＤＮＡ（配列番号１１）フラグメントと同一であるが、ただし、アミノ酸位置３４０（塩基８８−９０）において１塩基変異を有し、ここではＤＮＡ配列ＣＴＣがＧＴＣに変化していた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、バックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１７ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、プローブＮｏ．１を溶液に加えた。このプローブはＤＮＡ標的に完全にマッチした。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。図１７Ｂに５２５ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示される。
実施例１７ｃ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１７Ｂに示される強度とほぼ等しい。
実施例１８
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローーブを、１塩基対ミスマッチ標的および完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１８ａ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）を溶液に加えた。このプローブは、標的配列に完全にマッチしていた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１８Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。図１８Ａに５８０ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示されている。
実施例１８ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、標的配列に完全にマッチする５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１８Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１８Ａに示される強度とほぼ等しい。５８０ｎｍにおける強度と５２５ｎｍにおける強度との間の相違は、図１８Ａに示されるものとほぼ等しい。
実施例１９
同じ染料（フルオレセイン）を有する３つのＰＮＡプローブを、２つの１塩基対ミスマッチ標的配列および１つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１９ａ
ｐ５３ＤＮＡ遺伝子ＱＲ（配列番号１３）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。変異フラグメントは、ＭＥ ＤＮＡ（配列番号１１）フラグメントと同一であるが、ただしアミノ酸位置３４０（塩基８５−８７）において１塩基変異を有しており、ここではＤＮＡ配列ＣＴＣがＧＴＣに変化しており、およびアミノ酸位置３４４（塩基１００−１０２）において１塩基ミスマッチを有しており、ここではＤＮＡ配列ＣＴＧがＣＧＧに変化していた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、塩基対位置１０１において標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍでのバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、塩基対位置８５において標的配列に１塩基対ミスマッチを有するプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍにおけるバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｃ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，により合成された、次の構造：
を有する１２−ｍｅｒのフルオレセイン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．４）は、塩基対位置９５で始まり塩基対位置１０６で終わる配列番号１３の１２ヌクレオチドセグメントに完全に相補的であるように設計した。このプローブを溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．４とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。図１９Ｃに５２５ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示される。
実施例１９ｄ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｄは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍにおけるバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｅ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．４を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｅは、ＰＮＡプローブＮｏ．１，２および４とハイブリダイズしたＱＲ ＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１９Ｃに示される強度とほぼ等しい。
本発明を詳細に、その特定の例を参照して記述してきたが、当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更および改変をなしうることが明らかであろう。
【配列表】
発明の分野
本発明は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブ、および固体支持体もしくは隣接二本鎖ヌクレオチド構築体なしにＰＮＡプローブを溶液中のヌクレオチドの配列決定またはアッセイに用いる方法に関する。
関連技術の説明
ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡのポリアミド類似体である。たとえば米国特許第５，５３９，０８２号（ニールセンら）参照。ニールセンらは、ＰＮＡが相補的一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖を結合することにより天然ポリヌクレオチドに類似の行動を示すと記載している。ＰＮＡは一般にペプチド主鎖に結合したリガンドを含む。代表的なリガンドには、適切なリンカーを介してペプチド主鎖に結合した４種類の主要な天然ＤＮＡ塩基（すなわちチミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）または他の天然核酸塩基（たとえばイノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）または人工塩基（たとえばブロモチミン、アザアデニンまたはアザグアニンなど）が含まれる。
ＰＮＡ配列を含むプローブは、標的ヌクレオチド配列の検出に用いられている。米国特許第５，５０３，９８０号（カントー）には、二本鎖部分に隣接した一本鎖部分内にあるランダムではあるが決定可能な塩基配列を含む一組のＰＮＡプローブと核酸をハイブリダイズさせることにより、核酸の配列決定法にＰＮＡプローブを用いることを示唆している。その際、その一組の一本鎖部分は、予め定めた範囲全体にわたって可能性のあるあらゆる組合わせの配列を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーションは標的の一本鎖部分がプローブの一本鎖部分で相補認識されることによって起き、熱力学的にはプローブの隣接二本鎖性の存在が好ましい。
カントーは核酸がＰＮＡであってもよいと記載しているが、そのようなプローブを固体支持体の不存在下で使用することを開示または示唆してはいない。さらに、本発明は被験ＤＮＡ材料の隣接構築体を必要としない。
Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，“ペプチド核酸プレゲルハイブリダイゼーション：サザンハイブリダイゼーションの代替法”，９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １４６７０（１９９６年１２月）には、カントーのように固体支持体の使用が教示されているほか、ＰＮＡは一般に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に良好には結合しないことも教示されている。Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，ｐ．１４６７３、脚注参照。さらに、ｄｓＤＮＡを良好に結合することが認められたホモピリミジンＰＮＡ構築体は、プローブとしては有用でないであろう。本発明者らは、ホモピリミジンのみが鎖逆位によりｄｓＤＮＡと結合しうることを示唆する限定は誤りであり、これは用いるハイブリダイゼーション条件により生じるということを見出した。
Ｓｍｕｌｅｖｉｔｃｈら，“主鎖電荷の操作による、オリゴヌクレオチドによる鎖逆位の増大”，１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７００（１９９６年１２月）（Ｌａｎｄｓｄｏｒｐ，“ＰＮＡ類の近縁体”，１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６５３（１９９６年１２月）に記載）には、ｄｓＤＮＡとハイブリダイズするＰＮＡプライマーの使用が記載されている。しかしＳｍｕｌｅｖｉｔｃｈらはハイブリダイゼーションの検出にゲルを用いることを教示し、蛍光マーカーの使用は示唆していない。
多くのタイプの試料分析法が、染料の蛍光特性に依存している。ある波長の光で励起された分子がより長い波長の光を放射して非励起（基底）状態に戻るとき、蛍光が生じる。励起光と放射光は異なる波長のものであるため、光学フィルター、カメラまたはＣＣＤを用いて互いに分離できる。蛍光は特定の分子（したがって構造）を光学顕微鏡検査により可視化するために長年用いられており、フローサイトメトリーなど他の分析法にも採用されている。さらに、異なる色を示す蛍光を肉眼、カメラまたは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）で検出できる。
たとえば米国特許第５，５９４，１３８号（ジクストラら）には、核酸の蛍光検出法が開示されている。この方法は、核酸を蛍光マーカー、すなわちビス−ジカチオンアリールフラン化合物と接触させ、そしてその蛍光マーカーの蛍光を誘発する周波数の光に核酸を露光することを含む。蛍光マーカーはハイブリダイゼーション試験のためのプローブとしてのヌクレオチド配列にコンジュゲートしていてもよく、あるいはインサイチオ標識試験のための多数の試薬にコンジュゲートしていてもよい。
米国特許第４，９６３，４７７号（チェン）には、修飾核酸を含有する高感度プローブが開示されており、これを特異的抗体により認識できる。
蛍光インサイチオハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ガラススライドなどの固体支持体にＤＮＡを結合させることにより、ヒト染色体への蛍光プローブの結合を検出することを含む方法である。たとえばＫ．Ｈ．Ａｎｄｙ ｃｈｏｏ編，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，２および４章（ヒューマン・プレス、ニュージャージー州トトワ、１９９４）参照。プローブとのハイブリダイゼーションを含む従来の他のすべての検出法と同様に、この方法は、プローブが２つのＤＮＡ相補鎖のうちの一方とハイブリダイズする間、これらの相補鎖を離しておくために、固体支持体に依存する。さらにＦＩＳＨは、複雑な緩衝液および温度調節のプロトコールを必要とし、終夜インキュベーションを伴う。
試料を破壊せず、放射線を利用したアッセイ法より実験者にとって害が少なく、固体支持体調製の経費や遅れを必要とせず、容易に自動化できる方法を用いて、溶液中のヌクレオチド配列の存在を迅速に調べることは、本発明以前は不可能であった。時間と経費の点で効率的な変異遺伝子配列検出法が、変異遺伝子型と変化した表現型との関連を調べる際の律速段階であった。従来のＤＮＡ配列決定法は最も正確な変異同定手段であると考えられていたが、これらの方法はかなり緩慢で、労働集約的であり、多数のゲノムＤＮＡ試料を迅速にスクリーニングするのに特に好適というわけではなかった。
本明細書に引用する参考文献すべてにつき、それらの全体を本明細書に援用する。
発明の概要
本発明は、核酸配列を検出し、および／または核酸からの配列情報を決定するための方法を提供する。本発明によるプローブはＰＮＡを含有する。
本発明は、液体媒質中の少なくとも１つの一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列を検出する方法であって、それぞれ少なくとも１つのマーカーを有するＰＮＡプローブ類を液体媒質に添加して、この媒質中の少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１つのハイブリダイゼーション複合体を形成させ、液体媒質中の少なくとも１つのハイブリダイゼーション複合体の量と相関する少なくとも１つの信号を検出することにより、少なくとも１つのヌクレオチド配列を検出することを含む方法を提供する。
本発明方法は、ＰＮＡプローブ、ヌクレオチド配列またはハイブリダイゼーション複合体を、固体支持体またはゲルに結合させずに実施できる。
【図面の簡単な説明】
本発明を以下の図面に関して記載する。図中の同様な参照番号は同様なエレメントを表す。
図１は、本発明による装置の模式図である。
図２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄおよび１９Ｅは蛍光スペクトルである。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、試料中のヌクレオチド配列を検出および／または解明するためにＰＮＡプローブを使用する。ＰＮＡプローブは一方の鎖に結合することによりｄｓＤＮＡを認識し、これにより他方の鎖とハイブリダイズしてＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を生成することができると思われる。そのような認識は、塩基対２０以上の長さのｄｓＤＮＡ標的配列に対し行うことができる。８〜２０塩基のいかなる長さのプローブ配列も好ましい。これが、原核細胞および真核細胞の最小ユニークＤＮＡ配列にみられる範囲だからである。１２〜１８塩基のプローブがヒトゲノムの最小ユニーク配列であるので特に好ましい。しかし、より短い複数のプローブを用いて、その中に複数の非ユニーク−標的配列を含むヌクレオチド配列を検出し、これを合わせてヌクレオチド配列を独自に同定することができる。
本発明のプローブは、ｄｓＤＮＡとトリプレックス複合体、ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡとデュプレックス複合体を形成することができる。本発明化合物は、第１ＰＮＡプローブがＲＮＡまたはｓｓＤＮＡと結合し、得られたデュプレックス複転合体と第２ｓｓＤＮＡ鎖が結合したトリプレックス複合体を形成することもできる。たとえばＥｇｈｏｌｍら，“ＰＮＡはワトソン−クリック水素結合法則に従って相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする”，３６５ Ｎａｔｕｒｅ ５６６（１９９３）、およびＴｏｍａｃら，“ペプチド核酸複合体の安定性およびコンホメーションに対するイオン効果”，１１８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５５４４（１９９６）参照。
本発明によるＰＮＡプローブにおいて、ポリアミド主鎖に結合した塩基は主として、プローブ調製に必要な位置に結合した天然核酸塩基である。あるいは塩基は天然に存在しない核酸塩基（核酸塩基類似体）、他の塩基結合性部分、芳香族部分、（Ｃ１〜Ｃ４）アルカノイル、ヒドロキシル類、または水素であってもよい。核酸塩基という用語に除去可能な保護基を保有する核酸塩基が含まれることは理解されるであろう。さらに、ポリアミド骨格上の少なくとも１個の塩基を、ＤＮＡインターカレーター、リポーターリガンド、たとえば発蛍光団、放射性標識、スピン標識、ハプテン、または蛋白質認識リガンド、たとえばビオチンで、交換または置換してもよい。好ましい検出可能な標識には、放射性同位体、安定な同位体、酵素、蛍光性化学物質、発光性化学物質、発色性化学物質、金属、電荷、または空間構造体が含まれる。
特に好ましい態様において、ＰＮＡプローブは蛍光マーカーに共有結合したＰＮＡ配列を含み、これはレーザーを照射すると蛍光を発する。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセインが含まれる。
蛍光マーカーは、ＰＮＡとの相互作用を最小限にするために、短いリンカーを用いてＰＮＡの５’末端に付与することが好ましい。
変異ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列がわずか１塩基程度異なる場合にこれら２者を識別するためには、変異ヌクレオチドの変異部分がＰＮＡプローブの中心に対応するようにＰＮＡプローブを設計することが好ましい。プローブとヌクレオチドのミスマッチがプローブの中心にあるので、この設計によって、ヌクレオチドの変異部分がプローブの末端にある場合より高いハイブリダイゼーション収率およびより安定なハイブリッドが得られる。
少なくとも１つのヌクレオチド配列および／またはこの少なくとも１つの配列の変異形を含有すると思われる液体媒質に、ＰＮＡプローブを添加する。液体媒質は、ヌクレオチドの保存に適することが知られている慣用媒質のいずれであってもよい。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ”，第２版（１９８９）参照。たとえば液体媒質はヌクレオチド、水、緩衝液および界面活性剤を含むことができる。
液体媒質中のヌクレオチドは臨床試料から、自動化された方法を含めた任意の常法により得ることができる。そのような方法の例は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｖｏｌ．２，Ｐ．９．１６−９．１９および７．６−７．７に要約されている。自動核酸精製装置の例は、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）製バイオロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ）９６００である。
たとえば多様な疾患が個体ゲノム中の変異ＤＮＡの存在と関連することが知られている。野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡの配列が分かっている場合、これらのヌクレオチド配列を常法により臨床試料から単離することができる。ＰＣＲは臨床試料からヌクレオチドを単離する好ましい方法である。ＰＣＲは、野生型ＤＮＡおよび変異ＤＮＡの配列を増幅しうるプライマーを用いて実施される。
ヌクレオチド配列を既知濃度の液体媒質に添加する。濃度は、本発明方法の後続工程で発せられる信号の大きさ（たとえば蛍光強度）に影響を与える可能性があるからである。ヌクレオチド濃度は、たとえば２６０ｎｍでＵＶ吸収を測定することにより測定できる。
単離したヌクレオチドを液体媒質に添加し、検出前に変性させる。好ましくは、約９０〜約１００℃で約３０秒〜約５時間、ＰＮＡプローブの存在下に変性を行う。
好ましくはＰＮＡプローブを、検出すべきヌクレオチド配列の濃度の１〜２０倍の濃度で液体媒質に添加する。
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩類濃度、静電強度および緩衝液組成の異なる多様な条件下で起きる。これらの条件およびそれらを適用する方法の例は、当技術分野で知られている。たとえばＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｅｇｈｏｌｍら、Ｔｏｍａｃら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｖｏｌ．２，Ｐ．９．４７−９．５５、ならびにＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ，Ｖｏｌ４，Ｎｏ．３参照。
約４〜約７５℃の温度および約２分〜約２４時間でハイブリダイゼーション複合体を形成させることが好ましい。ＰＮＡプローブの存在下に６０分以内で変性を行わせた後、急冷せずに室温にまで放冷することが特に好ましい。
特定の試薬を用いて溶液中でのハイブリダイゼーションを促進することができる。これらの試薬の好ましい例には、一本鎖結合性蛋白質、たとえばＲｅｃＡ蛋白質、Ｔ４遺伝子３２蛋白質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合性蛋白質、核酸主溝および副溝結合性蛋白質、二価イオン、多価イオン、ならびにインターカレーション物質、たとえば臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）およびアンゲリシン（ａｎｇｅｌｉｃｉｎ）が含まれる。
本発明方法の各態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブの信号を検出する前に、ハイブリダイゼーション複合体をハイブリダイズしていないＰＮＡから分離する。分離は、ろ過、遠心分離、沈殿、イオン交換樹脂分離、および自由溶液電気泳動（すなわち、ゲル電気泳動と異なり、液体媒質中での電気泳動）のうち少なくとも１つにより行われる。
分離をＧ５０カラムにより行うことができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション複合体ならびにハイブリダイズしていないＤＮＡおよびＰＮＡの混合物をＧ５０カラムに移す。カラムを５００〜１０００ｒｐｍで１〜２分間遠心分離する。結合していないＰＮＡはろ過されてカラムに保持される。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する溶液はカラムを通過し、キュベット内に回収される。
実際にはろ過を省くことができる。溶液を重力によりカラムに流し、または余分な緩衝液で洗浄することができる。しかし遠心分離は分離時間を短縮し、試料が希釈されるのを避けるためのものである。
分離を遠心分離により行うことができる。ハイブリダイゼーション後、１０００〜１００００ｒｐｍで４〜２０時間遠心分離することにより（移さずに）試料を２層に分離させる（勾配）。軽い方のハイブリダイズしていないＰＮＡは上層に多く、一方、重い方のハイブリダイゼーション複合体は下層に濃縮される。下層を蛍光測定のためキュベットに回収する。
特定の態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡの濃縮に電気的方法を用いる場合、ろ過工程を省くことができる。これらの態様においては、目的ヌクレオチド配列を検出する前に、または検出と並行して、液体媒質に電界を印加し、蛍光発光強度の変化を電界の関数として検出し、これをＰＮＡプローブが少なくとも１つの完全相補核酸配列および不完全相補核酸配列にハイブリダイズしたか否かの指標とする。
本発明に用いるのに好ましいマーカーは発蛍光団である。当業者に理解されるように、好ましくは蛍光マーカーの蛍光を誘発するために選択される波長は、当技術分野で“励起最大”波長、すなわち分子により吸収されてその分子をより高い電子状態に励起する波長として知られている。マーカー分子が高い電子状態から低い電子状態へ通過するとき、その分子は“発光最大”波長と呼ばれる波長の、あるタイプの可視放射線、すなわち蛍光を発する。本発明において検出するのは、この蛍光である。化合物が発する検出可能な信号を当技術分野で知られている方法で、たとえば肉眼、発光波長検出のためのエレクトロニクス手段（たとえばカメラおよびＣＣＤ）などを用いる観察により検出できる。有利には、蛍光波長は光学フィルターで２波長を良好に分離できるほど十分に励起光線の波長から離れている。
励起波長は、用いるマーカーのこの励起最大波長に相当するように選択され（ルーティンな実験および／または従来の知識による）、好ましくは４００〜１０００ｎｍ、より好ましくは４００〜７５０ｎｍである。たとえばマーカーがフルオレセインである場合、好ましい励起波長は約４８８ｎｍである。
好ましい態様においては、４００〜５２０ｎｍの波長のアルゴンイオンレーザーを用いてマーカーを照射し、５００〜７５０ｎｍで蛍光発光を検出する。照射時間は、好ましくは約１０ミリ秒〜約１分間である。
本発明方法を実施するための装置は、液体媒質を収容するための液体媒質容器；ヌクレオチドを照射するためのレーザー；レーザーにより誘発された蛍光を検出するための蛍光検出器；蛍光検出器で得たデータを分析するためのデータ分析デバイス；およびデータ分析デバイスで得たデータ分析値を報告する出力デバイスを含むことができる。本発明方法に用いるのに適した蛍光検出システムの模式図を示す図１を参照。
特定の態様においては、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブとハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを分離せずに、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブの照射により発する蛍光発光をハイブリダイズしていないＰＮＡプローブの蛍光発光と識別する。特定の態様においては、あるヌクレオチド配列にハイブリダイズしたあるタイプのＰＮＡプローブの蛍光発光を、第１ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズした他のタイプのＰＮＡプローブの蛍光発光と識別する。たとえば、わずか１個程度のヌクレオチドだけ異なる２つのヌクレオチド配列のうちのいずれかの存在を、下記に基づいて検出できる：２ヌクレオチドのうちの一方に厳密に相補的な蛍光ＰＮＡプローブは、厳密に相補的ではないものと比べて厳密な相補体といっそう効率的に結合し、したがってハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを除去した後には、より高濃度のハイブリダイゼーション複合体が溶液中にあり、より高い蛍光強度が得られるであろう。
複数のＰＮＡプローブを同時に用いて、多様な効果を達成することができる。検出法の信頼性を高めるために、単一ヌクレオチド配列の異なるセグメントを標的とする数種類のプローブを用いることができる。また１プローブがｄｓＤＮＡの一方の鎖を標的とし、他のプローブがｄｓＤＮＡの相補鎖を標的とすることもできる。
ＤＮＡが変異型または対応する野生型のいずれであるかを検出するための好ましい方法は、下記のものを同時に使用することを含む：（ａ）野生型と変異型の両方のＤＮＡ中にあるが、他の点ではユニークである配列を標的とする第１タイプのＰＮＡプローブ、および（ｂ）変異型ＤＮＡにユニークな配列を標的とする第２タイプのＰＮＡプローブ；その際第１タイプと第２タイプのＰＮＡプローブは識別可能な信号を発する異なるマーカーをもつ。したがって、第１プローブの信号の検出は試験が適正に行われたことを示し（すなわち、第１プローブは陽性対照として機能する）、第２プローブの信号の検出は変異ＤＮＡが存在することを示す。たとえば１プローブは５２５ｎｍに蛍光発光強度ピークを示すフルオレセインマーカーをもち、他方のプローブは５８０ｎｍに蛍光発光強度ピークを示すローダミンマーカーをもつことができる。
先行技術の検出方法と異なり、本発明は特定の態様においては液体媒質の全容量（すなわち分析される試料）を約２００μｌ以下に制限できる。特定の態様においては、全容量を約１０μｌ以下に制限することもできる。
ＰＮＡを用いて変異ｄｓＤＮＡを調べる場合、依然として疑わしい結果が得られたときは、その相補的ＰＮＡプローブを添加してＤＮＡの相補鎖を調べることにより、その試料につき直ちに追加試験を行うことができる。第１試験の一部として遠心分離した場合、試料を新たな試験管に取り出し、相補的ＰＮＡとハイブリダイズさせる。あるいは最初および同時に、変性ＤＮＡ鎖にそれぞれハイブリダイズしたＰＮＡプローブおよび相補的ＰＮＡプローブの両方を用いて、ＰＮＡ試験を行うことができる。
法廷用として、試料を試験し、保存し、次いで再試験することができる。ＰＮＡは数日たつとハイブリダイゼーションから放出され、ＤＮＡは時間がたつと再結合し、この方法で分解することがないからである。したがって試験後凍結した試料をその後同じ試験管内で何度も再試験できる。
図２にはＤＮＡの経時ハイブリダイゼーションを示す。ＰＮＡプローブを野生型ＤＮＡ（ＷＴ ＤＮＡ）および変異ＤＮＡ（ＭＴ ＤＮＡ）とハイブリダイズさせた。蛍光強度を測定することにより、プローブとＤＮＡのハイブリダイゼーションを経時的に追跡した。図２は、時間がたつとＰＮＡプローブとＤＮＡのハイブリダイゼーションが最終的には低下することを示す。これはＤＮＡがＰＮＡを置換することにより、経時的にその天然構造を回復することを示唆する。
従来法で一般的な量より少なくとも１００倍少ない化学物質またはゲノム材料（１００μｌ対１０ｍｌ）を用いて臨床試料を試験することができる。したがって従来用いられているより１０〜２０倍濃度のＰＮＡを用いるが、試験には１／５〜１／１０量のＰＮＡが消費されるにすぎず、一方ではきわめて決定的な結果が得られる。
以下の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。ただし本発明はそれらに限定されると解すべきではない。
実施例１
野生型ｐ５３遺伝子由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐ（塩基対）フラグメント（配列番号：１）をＰＣＲにより増幅させた。パーキン・エルマーのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ系２４００を用いてＰＣＲを実施し、９５℃で５分間の高温開始を行った。Ｔａｑ酵素を添加した後、下記のように３５サイクルを実施した：
変性： ９４℃、３０分間
アニーリング： ４５℃、４５分間（４５℃はプライマーのＴｍより５℃低い）
延長： ７２℃、３０分間（１ｋｂ／分）×３５
ＰＣＲは、１００ｍｌ容量中に、１０×反応緩衝液（１０μｌ）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2（１０μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（２μｌ）、２５ｐｍｏｌ／μｌのプライマー１（１μｌ）、２５ｐｍｏｌ／μｌのプライマー２（１μｌ）、１００μｇ／μｌのＤＮＡ鋳型（１μｌ）、ｄｄＨ2Ｏ（７４μｌ）、およびＴａｑポリメラーゼ（１μｌ）（５単位／μｌ）を含む混合物を用いて行われた。
同様に、同じゲノムの１５０ｂｐフラグメントの変異フラグメント（配列番号：２）もＰＣＲにより増幅させた。変異フラグメントは、３４４位のアミノ酸における点変異以外は野生型フラグメントと一致した。この位置で野生型ＤＮＡ配列ＣＴＧがＣＡＧに変化していた。
パーセプティブ・バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）社（米国マサチュセッツ州フラミンガム）から１２−ｍｅｒ ＰＮＡプローブを入手し、１５０ｂｐのｐ５３野生型フラグメント（配列番号：１）の１２ヌクレオチドセグメントに相補的になるように設計した。このプローブは下記の構造をもっていた：
５’−Ｈ−ＦｌｕＯ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＣ Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ2
ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、および０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）であった。５０ｐｍｏｌの野生型ゲノムＤＮＡを３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブに添加し、１００ｍｌの緩衝液に混入した。５０ｐｍｏｌの変異ゲノムＤＮＡを３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブに添加し、１００μｌの緩衝液に混入した。
各試料を９５℃に３０分間加熱した。次いで各試料を３０℃に予熱した緩衝液に添加し、１時間ハイブリダイズさせた。
Ｇ５０スピンカラム（ファルマシア・バイオテク、スウェーデン国ウプサラ）で６００ｇ、２分間の遠心により、各試料の成分を分離した。結合していないＰＮＡはろ過されてカラムに保持された。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する溶液はカラムを通過し、蛍光検出用にキュベット内に回収された。次いで、キュベットをレーザー誘発蛍光のために蛍光分光計に装入し（すべての実施例において、照射波長４８８ｎｍ）、標的ゲノムＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出を行った。図３Ｂおよび３Ｃに示すように、５２５ｎｍにおける野生型ゲノムＤＮＡ試料の相対蛍光強度（図３Ｂ）は変異試料のもの（図３Ｃ）より４倍高く、これにより変異ゲノムＤＮＡ試料を野生型ゲノムＤＮＡ試料から識別できた。図３Ａは、プローブのみの蛍光強度を示す。
実施例２
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。変異ゲノムＤＮＡ試料（配列番号：３）は、３４４位のアミノ酸における塩基配列が野生型配列のＣＴＧからＣＧＧに変化していた。両試料を９４℃に２０分間加熱した。緩衝液を２５℃に予熱し、試料を３０分間ハイブリダイズさせた。Ｇ５０スピンカラムで８００ｒｐｍ、１．５分間の遠心により、各試料の成分を分離した。５２５ｎｍにおいて野生型ゲノムＤＮＡ試料から検出された蛍光の相対強度（図４Ｂ）は変異ゲノムＤＮＡ試料のもの（図４Ｃ）より６倍高く、これにより変異ゲノム試料を野生型ゲノム試料から識別できた。図４Ａは、溶液中プローブのみの蛍光強度を示す。
実施例３
この実施例は、下記の細部以外は実施例１および２と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号４）は、アミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＡＡＧへの２塩基の変化を有していた。各試料を最初に１００℃で４５分間加熱した。緩衝液を４５℃で予熱し、各試料を２０分間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ７５スピンカラムを用いて１０００ｒｐｍで１分間遠心することにより分離した。野生型ゲノムＤＮＡ試料（図５Ａ）から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料（図５Ｂ）からのものより８倍高く、野生型ゲノム試料を変異ゲノム試料から識別することが可能であった。
実施例４
この実施例は、下記の細部以外は実施例３と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号５）はアミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＧＣＧへの２塩基の変化を有した。各試料を最初に１００℃で１５分間加熱した。緩衝液を５０℃に予熱し、各試料を２時間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ５０スピンカラムを用いて、１２００ｒｐｍで１分間遠心することにより分離した。野生型ゲノムＤＮＡ試料から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料からのものより７倍高く、野生型ゲノム試料（図６Ａ）を変異ゲノム試料（図６Ｂ）から識別することが可能であった。
実施例５
この実施例は、下記の細部以外は他の実施例と同様であった。変異体ゲノムＤＮＡ試料（配列番号６）は、アミノ酸位置３４４において野生型ゲノムＤＮＡからのＣＴＧからＴＡＣへの３塩基の変化を有していた。各試料を最初に９５℃で３０分間加熱した。緩衝液を２５℃で予熱し、各試料を６０分間ハイブリダイズさせた。各試料の成分をＧ５０スピンカラムを用いて７５０ｒｐｍで２分間遠心することにより分離した。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、野生型ゲノムＤＮＡ試料（図７Ａ）から検出された蛍光の５２５ｎｍにおける相対的強度は、変異ゲノム試料（図７Ｂ）からのものより１０倍高く、野生型ゲノム試料を変異ゲノム試料から識別することが可能であった。
実施例６
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。フルオレセイン（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した実施例１の１００ｐｍｏｌの１２ｂｐのＰＮＡ，２５ｐｍｏｌの１５０ｂｐのＰＣＲ増幅ｄｓＤＮＡ（野生型（ＣＴＧ）（配列番号１）および１塩基変異ＤＮＡ（ＣＡＧ，配列番号２，およびＣＧＧ，配列番号３）を含む）、および１１５マイクロリットルの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ作用溶液（０．０２２５Ｍ Ｔｒｉｓホウ酸／０．０００５Ｍ ＥＤＴＡ），ｐＨ６．５）を室温で混合した。次に混合物を９５℃で３０分間加熱し、室温で約１時間ハイブリダイズさせた。
電極として働く２つの金属の針金を各試料に入れた。蛍光強度は５２５ｎｍでモニターし、この間、電極間距離約７または８ｍｍで電圧５ボルト、電流１０ｍＡをオンとオフに切り換えた。電圧が印加されたとき、ＤＮＡは負に帯電しているためＤＮＡおよびＤＮＡ−ＰＮＡはアノードに移動し、一方、未結合ＰＮＡは中性のため移動しなかった。
図８Ａは、野生型ＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。２５℃で１時間ハイブリダイズさせた後、溶液をキュベット中に移した。キュベットを蛍光分光計中に装入し、次に２つの電極を溶液中に入れて、印加した電界に伴う波長５２５ｎｍにおける蛍光強度の変化を検出した。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、電圧を印加すると減少し、電圧を除くと増加した。図８Ｂおよび８Ｃは、１塩基対ミスマッチＤＮＡ（それぞれ配列番号２および配列番号３）の蛍光スペクトルを示す。２５℃で１時間ハイブリダイズさせた後、変異体ＤＮＡの蛍光スペクトルは、野生型ＤＮＡのスペクトルとの相違を示した。電圧を印加すると、強度は急速に増加し、電圧を除くと、強度は減少した。
実施例７
この実施例は、下記の細部以外は実施例１と同様であった。Ｐ５３野生型ＤＮＡ（配列番号７）の３７５ｂｐのフラグメント、対応する３７５ｂｐの変異体型ＤＮＡフラグメント（配列番号８）、対応する３７５ｂｐの変異体型ＤＮＡフラグメント（配列番号９）および６３３ｂｐのＤＮＡフラグメント（配列番号１０）はＰＣＲにより得た。３７５ｂｐの野生型ＤＮＡは、実施例１からの１２塩基ＰＮＡに相補的なＤＮＡの標的配列を含有した。６３３ｂｐのＤＮＡは、そのような標的配列を欠失しており、この実施例において陰性対照として用いられた。配列番号８は、野生型フラグメント（配列番号７）と同一であるが、ただしアミノ酸位置３４４において点突然変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＣＴＧがＣＡＧに変化していた。配列番号９は、野生型フラグメント（配列番号７）と同一であるが、ただしアミノ酸位置３４４において点突然変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＣＴＧがＣＧＧに変化していた。
各試料は、５０ｐｍｏｌのそれぞれのＤＮＡフラグメント，２００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブおよび１３０ｍｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含有していた。各試料を９５℃で約３０分間加熱した。次に各試料を周囲条件（２５℃）において１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、Ｇ５０カラムを用いて未結合プローブを溶液から濾過した。
各試料を、標的ゲノムＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出のために蛍光分光計中に装入した。先の実施例と同様に、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、プローブに完全に相補的なＤＮＡフラグメントを含有する試料について最も高く、したがって変異体ＤＮＡフラグメント（図９Ｂ−９Ｃ）を含有する試料を野生型ＤＮＡフラグメント（図９Ａ）を含有する試料から識別することができた。予測されたように、陰性対照ＤＮＡフラグメントは、すべての中で最も低い蛍光強度を示した（図９Ｄ）。
実施例８
臨床試料は、ヒトゲノムの既知のセグメント中の単一のヌクレオチド変異に起因することが知られている疾患に罹患していると疑われる個体から得た。この遺伝子セグメントのフラグメントを、フラグメントが野生型ＤＮＡまたは変異体型ＤＮＡを有するかにかかわらずフラグメントを増幅しうるプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。
１２塩基のＰＮＡプローブは、変異体ヌクレオチドを含む変異体型ＤＮＡフラグメントの一部に相補的であるように調製し、ここで、変異体ヌクレオチドはプローブの真中に位置する塩基に相補的な塩基を有する。プローブはその５’末端でフルオレセインで標識した。
ＰＣＲから得られた５０ｐｍｏｌのＤＮＡおよび３００ｐｍｏｌのＰＮＡプローブを１００ｍｌの緩衝液に加える。試料を９５℃で３０分間加熱する。次に、３０℃に予熱した緩衝液に試料を加え、１時間ハイブリダイズさせる。
試料の成分は、Ｇ５０スピンカラムで６００ｒｐｍで２分間遠心することにより分離する。ハイブリダイズしていないＰＮＡはカラムで濾過され、ハイブリッドおよびＤＮＡを含む液体媒体はカラムを通過し、キュベット中に回収される。
ＤＮＡに結合した蛍光プローブの検出のためにキュベットを蛍光分光計中に装入する。試料の５２５ｎｍにおける蛍光強度があらかじめ決定された強度値を越える場合、変異体型ＤＮＡが個体において検出されている。試料の５２５ｎｍにおける蛍光強度があらかじめ決定された強度値を越えない場合には、変異体型ＤＮＡは個体において検出されていない。あらかじめ決定された強度値は、陰性および陽性対照試料を用いて分光計を検量することにより前もって決定する。
実施例９
この実施例は、下記の細部以外は実施例８と同様である。２つの未標識ＤＮＡ（一方は野生型（配列番号１）であり、他方は変異型（配列番号３）である）を同定する必要がある。以下の配列：
１００ｐｍｏｌのプローブ，２５ｐｍｏｌのＤＮＡ（ＷＴ ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）および１１５μｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含む各試料を、９５℃で３０分間加熱した。次に各試料を２５℃で１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、各試料をＧ５０カラム中に移し、７５０ｒｐｍで２分間遠心分離した。ハイブリッドはカラムを通過してキュベット中に回収されるが、一方ハイブリダイズしていないプローブは濾過され、カラム中に残る。キュベットを蛍光測定のために蛍光分光計中に装入した。
図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、スペクトルが大きく相違することを示した。より強い蛍光シグナル（図１０Ａ）を有する試料は、変異体ＤＮＡ（配列番号３）として同定される。より弱い蛍光強度を有する他の試料は、野生型ＤＮＡ（配列番号１）である。
実施例１０
この実施例は、下記の細部以外は実施例８と同様である。実施例８におけるように１つのプローブを用いずに、この実施例においては２つのプローブを用いる。第１のプローブは実施例８のプローブであり、これは変異体型ＤＮＡフラグメントの一部に完全に相補的である。第２のプローブは第１のプローブと同一であるが、ただし、変異体型核塩基配列の代わりに野生型核塩基配列を有する。試料の第１の部分を実施例８にしたがって第１のプローブを用いて探索する。第１の部分と同じサイズの第２の部分を同様に第２のプローブで探索する。変性、ハイブリダイゼーションおよび分離の後、各部分の蛍光を測定した。第１の部分の蛍光強度が第２の部分のものを越える場合には、変異体型ＤＮＡが個体において検出されている。第２の部分の蛍光強度が第１の部分のものを越える場合には、変異体型ＤＮＡは個体において検出されていない。
この実施例の方法は、支持体の異なる領域に結合した２つの対比型ＰＮＡプローブを有する固体支持体を含む診断装置で用いるのに適合させることができる。試料は分割されず、両方の型のプローブと等しく接触するように、支持体上に均一に分散される。装置の２つの領域の蛍光強度を、実施例９における２つの別々の試料の場合と同様の方法で比較することができる。
実施例１１
ビオチニル化二本鎖ＤＮＡ（配列番号１および配列番号３）をＰＣＲにより増幅した。一本鎖ＤＮＡは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ社より）を用いて、以下のように調製した。２５μｌの２ｘ結合緩衝液および洗浄緩衝液（Ｍ−２８０ストレプトアビジンキットより）および２５μｌ（２５ｐｍｏｌ）のビオチニル化ＤＮＡ（配列番号１および２）を、２ｍｇの予洗したＭ−２８０ストレプトアビジンのダイナビーズに加えた。ビーズを懸濁したまま混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に混合物を磁気粒子濃縮器（ＭＰＣ，Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）上に室温で２分間放置し、続いてピペットで上清を除去した。２０μｌの新たに調製した０．１Ｎ ＮａＯＨを加え、混合物を室温に５分間放置した。固定化ビオチニル化鎖を含むダイナビーズをＭＰＣを用いて管の側面に回収し、非ビオチニル化一本鎖ＤＮＡを含むＮａＯＨ上清を新しい管に移した。ＮａＯＨ上清を２．５μｌの新たに調製した０．２Ｎ ＨＣｌで中和した。
２００ｐｍｏｌのプローブおよび１５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液を一本鎖ＤＮＡを含有する上清に加えた。混合物を９４℃で５分間加熱し、次に室温で１時間インキュベートした。Ｇ５０カラムにより６５０ｒｐｍで２分間分離した後、未結合ＰＮＡをカラム中に濾過し、ハイブリッドをカラムを通して流し、キュベット中に回収した。試料を蛍光検出のために蛍光分光計中に装入した。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、一本鎖野生型ＤＮＡ試料（図１１Ａ）の５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度は、変異体一本鎖ＤＮＡ（図１１Ｂ）のものより５倍高かった。
実施例１２
４００ｐｍｏｌのプローブ、１００ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）および１００μｌの緩衝液（０．５ｘＴＢＥ，ｐＨ６．５）を含む各試料を９５℃で３０分間加熱した。次に、各試料を２５℃で１時間ハイブリダイズさせた。蛍光測定の前に、各試料をＧ５０カラム中に移し、７２０ｒｐｍで２分間遠心分離した。ハイブリッドはカラムを通過してキュベット中に回収され、一方ハイブリダイズしていないプローブは濾過され、カラム中に残った。キュベットを蛍光測定のために蛍光分光計に装入した。
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、５２５ｎｍにおける相対的蛍光強度はスペクトルの大きな相違を示す。より強い蛍光シグナル（図１２Ａ）を有するスペクトルは、ＷＴ ＤＮＡ（配列番号１）との完全にマッチしたプローブのハイブリダイゼーションを示す。より弱い蛍光強度を有する他のスペクトル（図１２Ｂ）は、ＷＴ ＤＮＡ（配列番号１）との１塩基対ミスマッチプローブのハイブリダイゼーションを示す。
実施例１３
同じ染料（フルオレセイン）を有する２つのＰＮＡプローブを異なる鎖中の２つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１３ａ：１つの標的配列に完全にマッチする１つのプローブ
変異型ｐ５３ＤＮＡ（配列番号１１）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。変異フラグメントは、野生型フラグメント（配列番号１）と同一であったが、ただし、アミノ酸位置３４０（すなわち塩基８８−９０）において２塩基の変異を有し、ここでは、ＤＮＡ野生型配列ＡＴＧがＧＡＧに変異していた。
１２−ｍｅｒのＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．１）は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により合成された。次の構造：
０．５ｘＴＢＥ溶液（０．０２２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／０．０００５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．５）をハイブリダイゼーション緩衝液として用いた。５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから購入）により溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ａは、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。ピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１３ｂ：１つの標的配列に完全にマッチする１つのプローブ
以下の構造：
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、プローブを溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。
実施例１３ｃ：異なる鎖の２つの標的配列に完全にマッチする２つのプローブ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１３Ｃは、２．５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）の蛍光スペクトルを示す。図１３Ｃに示されるように、５２５ｎｍにおける蛍光強度は、ほぼ、図１３Ａおよび１３Ｂに示される５２５ｎｍにおける強度の合計であった。
実施例１４
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローブを、１つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１４ａ
野生型ｐ５３ＤＮＡ（配列番号１）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，により合成された、次の構造：
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１４Ａは、ローダミン標識ＰＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。蛍光スペクトル中の放射ピークは、約５８０ｎｍに現れる。
実施例１４ｂ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、１５ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）および５ｐｍｏｌのフルオレセイン標識プローブ（プローブＮｏ．１）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１４Ｂは、ローダミン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．３）およびフルオレセイン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．１）の混合プローブとハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。標的配列にハイブリダイズしたローダミン標識プローブに少なくとも部分的起因するショルダーは５８０ｎｍに現れ、標的配列にハイブリダイズしたフルオレセイン標識プローブに部分的に起因するピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１５
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローブを、２つの鎖上の完全にマッチした２つの標的にハイブリダイズさせた。
実施例１５ａ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１５Ａは、ローダミン標識ＰＮＡプローブ（プローブＮｏ．３）とハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。ローダミンで標識したハイブリダイゼーション複合体によるブロードなピークは５８０ｎｍに現れる。
実施例１５ｂ
２０ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１１）を５０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、２０ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）および５ｐｍｏｌのフルオレセイン標識プローブ（プローブＮｏ．２）を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、次に試料を２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１５Ｂは、プローブＮｏ．２および３とハイブリダイズしたＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。ローダミン標識プローブによるブロードなピークは５８０ｎｍに現れ、フルオレセイン標識プローブによるピークは５２５ｎｍに現れる。
実施例１６
ＰＣＲで増幅し精製した、標的配列を欠失する６３３ｂｐのＤＮＡ（配列番号１０）をプローブの陰性対照として用いた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１０）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加え、次にプローブＮｏ．１−３を溶液に加えた。各試料を９５℃で１０分間加熱し、次に２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１６Ａは、プローブのみ（すなわち、１５ｐｍｏｌのプローブ（プローブＮｏ．１，２および３をそれぞれ５ｐｍｏｌ）を含む試料にＤＮＡを加えない）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
図１６Ｄは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および陰性対照ＤＮＡ（配列番号１０）の蛍光スペクトルを示す。
すべてのスペクトルは、５２５ｎｍおよび５８０ｎｍにおいてバックグラウンドレベルの蛍光強度を示した。
実施例１７
同じ染料（フルオレセイン）を有する２つのＰＮＡプローブを、１塩基対ミスマッチ標的配列および完全にマッチした標的配列にハイブリダイズさせた。
実施例１７ａ
ｐ５３ＤＮＡ遺伝子ＭＱ（配列番号１２）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。変異フラグメントは、ＭＥ ＤＮＡ（配列番号１１）フラグメントと同一であるが、ただし、アミノ酸位置３４０（塩基８８−９０）において１塩基変異を有し、ここではＤＮＡ配列ＣＴＣがＧＴＣに変化していた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、バックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１７ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、プローブＮｏ．１を溶液に加えた。このプローブはＤＮＡ標的に完全にマッチした。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。図１７Ｂに５２５ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示される。
実施例１７ｃ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１７Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１７Ｂに示される強度とほぼ等しい。
実施例１８
異なる染料（フルオレセインおよびローダミン）を有する２つのＰＮＡプローーブを、１塩基対ミスマッチ標的および完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１８ａ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのローダミン標識プローブ（プローブＮｏ．３）を溶液に加えた。このプローブは、標的配列に完全にマッチしていた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１８Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。図１８Ａに５８０ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示されている。
実施例１８ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、標的配列に完全にマッチする５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１８Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．３および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１２）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１８Ａに示される強度とほぼ等しい。５８０ｎｍにおける強度と５２５ｎｍにおける強度との間の相違は、図１８Ａに示されるものとほぼ等しい。
実施例１９
同じ染料（フルオレセイン）を有する３つのＰＮＡプローブを、２つの１塩基対ミスマッチ標的配列および１つの完全にマッチした標的にハイブリダイズさせた。
実施例１９ａ
ｐ５３ＤＮＡ遺伝子ＱＲ（配列番号１３）由来のゲノムＤＮＡの１５０ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。変異フラグメントは、ＭＥ ＤＮＡ（配列番号１１）フラグメントと同一であるが、ただしアミノ酸位置３４０（塩基８５−８７）において１塩基変異を有しており、ここではＤＮＡ配列ＣＴＣがＧＴＣに変化しており、およびアミノ酸位置３４４（塩基１００−１０２）において１塩基ミスマッチを有しており、ここではＤＮＡ配列ＣＴＧがＣＧＧに変化していた。
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、塩基対位置１０１において標的配列に１塩基対ミスマッチを有する５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ａは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍでのバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｂ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、塩基対位置８５において標的配列に１塩基対ミスマッチを有するプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｂは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２にハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍにおけるバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｃ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，により合成された、次の構造：
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｃは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．４とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。図１９Ｃに５２５ｎｍにおける陽性シグナルが明らかに示される。
実施例１９ｄ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｄは、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２とハイブリダイズした５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。スペクトルは、５２５ｎｍにおけるバックグラウンドレベルの蛍光強度を示す。
実施例１９ｅ
５ｐｍｏｌのＤＮＡ（配列番号１３）を１１５μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加えた。次に、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．１、５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．２および５ｐｍｏｌのプローブＮｏ．４を溶液に加えた。試料を９５℃で１０分間加熱し、２５℃で３０分間ハイブリダイズさせた。
蛍光測定の前に、未結合プローブをＧ５０スピンカラムにより溶液から濾過した。ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを含む溶液をキュベット中に入れ、蛍光測定を行った。
図１９Ｅは、ＰＮＡプローブＮｏ．１，２および４とハイブリダイズしたＱＲ ＤＮＡ（配列番号１３）の蛍光スペクトルを示す。５２５ｎｍにおける蛍光強度は、図１９Ｃに示される強度とほぼ等しい。
本発明を詳細に、その特定の例を参照して記述してきたが、当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更および改変をなしうることが明らかであろう。
【配列表】
Claims (67)
- 液体媒体中において少なくとも１つの一本鎖または二本鎖ヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、
前記液体媒体に、前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成しうるＰＮＡプローブを加え、ここで前記ＰＮＡプローブは蛍光マーカーを含み；
ハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを前記ハイブリダイゼーション複合体から分離して試験媒体を形成し；
前記試験媒体を、前記蛍光マーカーを励起しかつ前記蛍光マーカーに蛍光を放射させる波長を有するレーザービームで照射し；
前記放射された蛍光の総強度を測定し；そして
前記測定された強度と参照強度とを比較して、前記液体媒体が前記少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を含むか否かを検出する、
の各工程を含み、
ここで、前記測定された強度は、０塩基ミスマッチ（０を含む）から少なくとも３塩基ミスマッチの範囲において、前記少なくとも１つのヌクレオチド標的配列と前記ＰＮＡプローブとの間の塩基ミスマッチの数に反比例し、
前記方法は、前記分離工程以外は全て、ＰＮＡプローブ、前記標的配列ヌクレオチドまたは前記ハイブリダイゼーション複合体を固体支持体またはゲルに結合させることなく実施されることを特徴とする方法。 - 前記分離が、濾過、遠心分離、沈殿および自由溶液電気泳動の少なくとも１つにより実施される、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記レーザービームが、４５０から５３０ｎｍの波長を有する、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記放射された蛍光が、４００−１０００ｎｍの範囲で測定される、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成しうる少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブが前記液体媒体に加えられ、前記少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブの第１のものは第１の標的配列ヌクレオチドの第１のセグメントに相補的であり、前記少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブの第２のものは第２の標的配列ヌクレオチドの第２のセグメントに相補的であり、かつ前記第１のセグメントおよび第２のセグメントは互いに異なる、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のプローブおよび第２のプローブが、それぞれ前記第１のセグメントおよび第２のセグメントに完全に相補的である、請求項５記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１の標的配列ヌクレオチドが、前記第２の標的配列ヌクレオチドに相補的である、請求項６記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１の標的配列ヌクレオチドおよび前記第２の標的配列ヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡとして結合される、請求項７記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１の標的配列ヌクレオチドおよび前記第２の標的配列ヌクレオチドが異なるゲノム中にある、請求項６記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のプローブが第１の波長において第１の蛍光放射強度を有する第１のマーカーを有し、前記第２のプローブが第２の波長において第２の蛍光放射強度を有する第２のマーカーを有し、前記第１の波長および第２の波長は異なり、前記第１のヌクレオチド標的配列は前記第１の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出され、および前記第２のヌクレオチド標的配列は前記第２の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出される、請求項９記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のプローブが第１の波長において第１の蛍光放射強度を有する第１のマーカーを有し、前記第２のプローブが第２の波長において第２の蛍光放射強度を有する第２のマーカーを有し、前記第１の波長および第２の波長は異なり、前記第１のヌクレオチド標的配列は前記第１の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出され、および前記第２のヌクレオチド標的配列は前記第２の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出される、請求項６記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のヌクレオチド標的配列は分析される前記液体媒体中に存在することが予測される陽性対照配列であり、前記第１の強度は前記参照強度であり、前記第２の強度は前記測定された強度であり、および前記第２のヌクレオチド標的配列は前記第１の強度と前記第２の強度とを比較することにより検出される、請求項１１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 第２のヌクレオチド標的配列が変異体ゲノムにおいてのみ見いだされ、第１のヌクレオチド標的配列が前記変異体ゲノムおよび対応する野生型ゲノムにおいて見いだされる、請求項１２記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 第１のマーカーおよび第２のマーカーが、フルオレセインおよびローダミンからなる群より選択される、請求項１３記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 第１の波長および第２の波長とは異なる第３の波長において第３の蛍光放射強度を有する第３のマーカーを有する第３のＰＮＡプローブが、いずれの標的配列ヌクレオチドともハイブリダイズしないことが予測される陰性対照配列として前記液体媒体に加えられ、前記第２のヌクレオチド標的配列が、第１の強度、第２の強度および第３の強度を比較することにより検出される、請求項１２記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成しうる少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブが前記液体媒体に加えられ、前記少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブの第１のものは前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドの第１のセグメントに相補的であり、前記少なくとも２つの異なるＰＮＡプローブの第２のものは前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドの第２のセグメントに相補的であり、および前記第１のセグメントおよび第２のセグメントは互いに異なる、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のプローブが第１の波長において第１の蛍光放射強度を有する第１のマーカーを有し、前記第２のプローブが第２の波長において第２の蛍光放射強度を有する第２のマーカーを有し、前記第１の波長および第２の波長は異なり、前記第１のセグメントは前記第１の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出され、および前記第２のセグメントは前記第２の波長における蛍光放射強度をモニターすることにより検出される、請求項１６記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記第１のセグメントは分析される前記液体媒体中に存在することが予測される陽性対照配列であり、前記第１の強度は前記参照強度であり、前記第２の強度は前記測定された強度であり、および前記第２のセグメントは前記第１の強度と前記第２の強度とを比較することにより検出される、請求項１７記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 第１の波長および第２の波長と異なる第３の波長において第３の蛍光放射強度を有する第３のマーカーを有する第３のＰＮＡプローブが、いずれのヌクレオチドセグメントともハイブリダイズしないと予測される陰性対照配列として前記液体媒体に加えられ、および前記第２のセグメントが第１の強度、第２の強度および第３の強度を比較することにより検出される、請求項１８記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記ハイブリダイゼーション複合体が、１つのＰＮＡ配列、１つの発蛍光団および前記標的配列ヌクレオチドからなる、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記方法において用いられるすべてのプローブが同じ配列およびマーカーからなり、前記マーカーは前記方法において検出される唯一のマーカーである、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記放射された蛍光が、前記レーザービーム波長より長い波長をする、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記少なくとも１つの標的配列ヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、請求項１記載の少なくとも１つのヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 第１の液体媒体中の一本鎖または二本鎖ヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、
試料標的配列ヌクレオチドを含む前記第１の液体媒体を提供し；
前記第１の液体媒体に前記標的配列ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成しうるＰＮＡプローブを加え、ここで前記ＰＮＡプローブは蛍光マーカーを含み；
前記第１の液体媒体に、前記蛍光マーカーを励起しかつ前記蛍光マーカーに蛍光を放射させる波長を有するレーザービームを照射し；
前記第１の液体媒体中の前記蛍光の第１の総強度を検出し；そして
前記第１の強度が、前記ＰＮＡプローブとハイブリダイズした前記標的配列ヌクレオチドを含有する第２の液体媒体の第２の強度と等しいか否かを判定して、前記ヌクレオチド標的配列が前記第１の液体媒体中にあるか否かを検出する、
の各工程を含み、
ここで、前記ＰＮＡプローブ、前記標的配列ヌクレオチドおよび前記ハイブリダイゼーション複合体は固体支持体またはゲルに結合しておらず、および前記ハイブリダイゼーション複合体は１つのＰＮＡ配列、１つの発蛍光団および前記標的配列ヌクレオチドからなることを特徴とする方法。 - 前記レーザービームが、４５０から５３０ｎｍの波長を有する光を前記マーカーに照射するアルゴンイオンレーザーにより生成される、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記蛍光が、４００−１０００ｎｍの範囲で検出される、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- （ｉ）前記標的配列ヌクレオチドが、前記変異体型ＤＮＡと異なる野生型ＤＮＡから識別されるべき変異体型ＤＮＡであり、（ｉｉ）前記ＰＮＡプローブが前記変異体型ＤＮＡのセグメントと完全に相補的であり、かつ前記野生型ＤＮＡのセグメントと完全に相補的ではなく、および（ｉｉｉ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しい場合に前記変異体型ＤＮＡが検出される、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- （ｉ）前記標的配列ヌクレオチドが、前記野生型ＤＮＡと異なる変異体型ＤＮＡから識別されるべき野生型ＤＮＡであり、（ｉｉ）前記ＰＮＡプローブが前記野生型ＤＮＡのセグメントと完全に相補的であり、かつ前記変異体型ＤＮＡのセグメントと完全に相補的ではなく、および（ｉｉｉ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しい場合に前記野生型ＤＮＡが検出される、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記標的配列ヌクレオチドが、前記検出工程の前に、８５℃から１００℃の温度で３０秒間から５時間、前記液体媒体中で変性される、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記ハイブリダイゼーション複合体の形成が、４℃から７５℃の温度で２分間から２４時間実施される、請求項２９記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記変性工程が６０分間以下の時間実施され、その後に前記温度が、急冷することなく室温まで放冷される、請求項３０記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記ＰＮＡプローブが、前記標的配列ヌクレオチドの推測される濃度の１から２０倍の濃度で前記第１の液体媒体中に加えられる、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記検出工程中における前記第１の液体媒体の総容量が５ミリリットル以下である、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記総容量が１０マイクロリットル以下である、請求項３３記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記標的配列ヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、請求項２４記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記ＰＮＡプローブが、前記変性工程が完了する前に前記第１の液体媒体中に加えられる、請求項２９記載のヌクレオチド標的配列を検出する方法。
- 前記方法において用いられるすべてのプローブが同じ配列およびマーカーからなり、前記マーカーが前記方法において検出される唯一のマーカーである、請求項２４記載の方法。
- 前記検出された蛍光が、前記マーカーにより放射された前記蛍光からなる、請求項２４記載の方法。
- 前記ＰＮＡプローブが前記標的配列ヌクレオチドのセグメントに完全に相補的である、請求項２４記載の方法。
- 前記ＰＮＡプローブが前記標的配列ヌクレオチドのセグメントの１塩基ミスマッチである、請求項２４記載の方法。
- 前記ＰＮＡプローブが前記標的配列ヌクレオチドのセグメントの２塩基ミスマッチである、請求項２４記載の方法。
- 前記ＰＮＡプローブが前記標的配列ヌクレオチドのセグメントの３塩基ミスマッチである、請求項２４記載の方法。
- （ｉ）前記試料標的配列ヌクレオチドは、前記標的配列ヌクレオチドと同一であるか、または前記標的配列ヌクレオチドと少なくとも１塩基異なる類似体であり、（ｉｉ）前記ＰＮＡプローブは、前記標的配列ヌクレオチドのセグメントと完全に相補的であり、かつ前記類似体のセグメントとは相補的でなく、（ｉｉｉ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しい場合に前記ヌクレオチド標的配列が検出され、および（ｉｖ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しくない場合に前記類似体が検出される、請求項２４記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と１塩基異なる、請求項４３記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と２塩基異なる、請求項４３記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と３塩基異なる、請求項４３記載の方法。
- 前記方法において用いられるすべてのプローブが同じ配列およびマーカーからなり、前記マーカーが前記方法において検出される唯一のマーカーである、請求項４３記載の方法。
- 前記検出された蛍光が、前記マーカーから放射された前記蛍光からなる、請求項４７記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と１塩基異なる、請求項４８記載の方法。
- （ｉ）前記試料ヌクレオチド標的配列が前記ヌクレオチド標的配列と同一であるか、または前記ヌクレオチド標的配列と少なくとも１塩基異なる類似体であり、（ｉｉ）前記ＰＮＡプローブは前記類似体のセグメントと完全に相補的であり、かつ前記ヌクレオチド標的配列のセグメントと完全に相補的ではなく、（ｉｉｉ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しい場合に前記ヌクレオチド標的配列が検出され、および（ｉｖ）前記第１の強度が前記第２の強度と等しくない場合に前記類似体が検出される、請求項２４記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と１塩基異なる、請求項５０記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と２塩基異なる、請求項５０記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と３塩基異なる、請求項５０記載の方法。
- 前記方法において用いられるすべてのプローブが同じ配列およびマーカーからなり、前記マーカーは前記方法において検出される唯一のマーカーである、請求項５０記載の方法。
- 前記検出された蛍光が、前記マーカーから放射された前記蛍光からなる、請求項５４記載の方法。
- 前記類似体が前記ヌクレオチド標的配列と１塩基異なる、請求項５５記載の方法。
- 前記検出された蛍光が前記レーザービーム波長より長い波長を有する、請求項２４記載の方法。
- 前記第１の強度が、０塩基ミスマッチ（０を含む）から少なくとも３塩基ミスマッチの範囲にわたって、前記ヌクレオチド標的配列と前記ＰＮＡプローブとの間の塩基ミスマッチの数に反比例する、請求項２４記載の方法。
- 第１の液体媒体中において一本鎖または二本鎖ヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、
試料標的配列ヌクレオチドを含む前記第１の液体媒体を提供し；
前記第１の液体媒体に前記標的配列ヌクレオチドとハイブリダイゼーション複合体を形成しうるＰＮＡプローブを加え、ここで、前記ＰＮＡプローブは蛍光マーカーを含み；
ハイブリダイズしていないＰＮＡプローブを前記ハイブリダイゼーション複合体から分離して第１の試験媒体を形成し；
前記第１の試験媒体に、前記蛍光マーカーを励起しかつ前記蛍光マーカーに蛍光を放射させる波長を有するレーザービームを照射し；
前記第１の試験媒体中において前記放射された蛍光の第１の総強度を直接検出し；そして
前記第１の強度と、陽性対照配列を探索することにより生成した参照強度と、陰性対照配列を探索することにより生成したベースライン強度とを比較する、
の各工程を含み、
前記第１の強度が前記参照強度と等しい場合に前記ヌクレオチド標的配列が検出され、前記第１の強度が前記ベースライン強度と等しい場合に前記ヌクレオチド標的配列が検出されず、および前記第１の強度が前記ベースライン強度と前記参照強度との間である場合に前記ヌクレオチド標的配列と少なくとも１塩基異なる相同配列が検出され、
前記方法は、前記分離工程以外は全て、前記ＰＮＡプローブ、前記標的配列ヌクレオチドまたは前記ハイブリダイゼーション複合体を固体支持体またはゲルに結合させずに実施されることを特徴とする方法。 - 前記相同配列が前記ヌクレオチド標的配列と１塩基異なる、請求項５９記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション複合体が、１つのＰＮＡ配列、１つの発蛍光団および前記ヌクレオチド標的配列からなる、請求項５９記載の方法。
- 前記方法において用いられるすべてのプローブが同じ配列およびマーカーからなり、前記マーカーが前記方法において検出される唯一のマーカーである、請求項５９記載の方法。
- 前記検出された蛍光が、前記マーカーから放射された前記蛍光からなる、請求項５９記載の方法。
- 前記検出された蛍光が前記レーザービーム波長より長い波長を有する、請求項５９記載の方法。
- 前記第１の強度が、０塩基ミスマッチ（０を含む）から少なくとも３塩基ミスマッチの範囲にわたって、前記ヌクレオチド標的配列と前記ＰＮＡプローブとの間の塩基ミスマッチの数に反比例する、請求項５９記載の方法。
- 液体媒体において一本鎖または二本鎖ヌクレオチド標的配列を検出する方法であって、
前記ヌクレオチド標的配列と同一の第１の標的配列ヌクレオチド、または前記ヌクレオチド標的配列と少なくとも１塩基異なる第２の標的配列ヌクレオチドを含む前記液体媒体を提供し；
前記液体媒体に、前記標的配列ヌクレオチドのセグメントに完全に相補的であり、かつ前記第２の標的配列ヌクレオチドのセグメントに完全に相補的ではないＰＮＡプローブを加え、ここで前記ＰＮＡプローブのそれぞれは蛍光マーカーを含み；
前記ＰＮＡプローブを前記第１のまたは第２の標的配列ヌクレオチドとハイブリダイズさせ；
前記液体媒体を照射して前記蛍光マーカーに４００−１０００ｎｍの波長を有する蛍光を放射させ；そして
前記蛍光の総強度を検出する、
の各工程を含み、
前記検出工程の前にまたは平行して前記液体媒体に電界を印加し、そして前記電界の関数としての前記蛍光の前記強度の変化を、前記ＰＮＡプローブが前記第１の標的配列ヌクレオチドまたは前記第２の標的配列ヌクレオチドにハイブリダイズしたか否かの指標として検出すること、及び
前記方法は、ＰＮＡプローブ、前記標的配列ヌクレオチドまたは前記ハイブリダイゼーション複合体を固体支持体またはゲルに結合させることなく実施されることを特徴とする方法。 - 前記第１のおよび第２のヌクレオチド標的配列が１塩基異なる、請求項６６記載の方法。
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