KR100617427B1 - 다양한 조건하의 다중 측정에 의한 생중합체 결합의 균일분석 방법 - Google Patents

다양한 조건하의 다중 측정에 의한 생중합체 결합의 균일분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시험 샘플에 자극을 가하기 전, 자극을 가하는 동안 및(또는) 자극을 가한 후 상기 시험 샘플로부터 신호를 얻는 단계 및 이 신호의 상관관계를 나타내는 단계를 포함하는, 생중합체의 결합을 균일 분석하는 방법을 제공한다. 이러한 신호는 그의 크기가 결합 친화도와 상관관계가 있으며, 상기 신호는 예를 들어 전기 전도도 및(또는) 형광 강도일 수 있다. 자극은 예를 들어 전압 및(또는) 레이저 방사선일 수 있다. 바람직하게는, 여러 유형의 신호를 측정 및 비교하여 본 발명의 분석법의 신뢰도를 증대시킨다.
생중합체, 결합 친화도, 혼성화, 핵염기.

Description

다양한 조건하의 다중 측정에 의한 생중합체 결합의 균일 분석 방법 {Homogeneous Assay of Biopolymer Binding by Means of Multiple Measurements Under Varied Conditions}
본 발명은 생중합체 결합을 분석하는 방법, 보다 구체적으로는 핵염기 (nucleobase) 및(또는) 아미노산을 포함하는 프로브와 표적의 결합을 분석하는 방법에 관한 것이다.
전기장을 샘플에 인가하여 생물학적 분자를 단리 및 특성화할 수 있다는 것은 다년간 이해되어 왔다.
전기영동은 아마도 생물학적 분자에 대한 전기장의 영향을 기초로 하는 단리 및 특성화 기술의 가장 잘 알려진 예일 것이다. 겔 전기영동에서, 균질 매트릭스 또는 겔은 예를 들어 전기장이 인가되는 폴리아크릴아미드로부터 형성된다. 겔의 한쪽 끝에 가해지는 혼합물은 혼합물의 크기 및 전기장과의 상호작용에 따라 겔을 통해 이동할 것이다. 이동성은 물질의 독특한 특성, 예를 들어 형태, 크기 및 전하 등에 따라 달라진다. 겔의 공극 크기를 달리하거나, 농도 또는 pH 구배를 형성하거나 또는 완충액의 조성 (pH, SDS, DOC, 글리신, 염)에 변화를 주어 이동성에 영향을 줄 수 있다. 1-차원 및 2-차원 겔 전기영동은 대부분의 연구 실험실에서 상당히 일반적인 방법이다. 표적 물질을 겔에 통과시키고(시키거나) 겔로부터 물리적으로 추출하여 정제할 수 있다.
보다 최근에 개발된, 전기장을 생물학적 샘플에 인가하는 방법은 스탠리 (Stanley)의 미국 특허 제5,824,477호에 개시되어 있다. 스탠리의 상기 특허 문헌은 소정의 핵산 서열이 샘플에 존재하는지 그렇지 않은지를 검출하는 방법을 개시한다. 이 방법은 (a) 전극을 이용하여 전압을 용액 중 샘플에 인가함으로써 샘플의 이중 가닥 핵산을 변성시키는 단계; (b) 변성된 핵산을 이 서열에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 혼성화가 일어났는지를 결정하는 단계를 포함한다. 스탠리의 상기 특허 문헌은 표적 서열을 변성시키는 제한된 목적을 위해 전기장을 분석될 샘플에 인가하는 것을 개시한다.
보다 잘 알려진 형태의 혼성화 분석법은 형광 표시 물질의 사용을 기초로 한다. 가장 기본적인 형태로서, 형광 강도를 기초로 한 분석은 통상적으로 표적을 형광발색단 (fluorophore)-함유 프로브와 접촉시키는 단계, 결합되지 않은 임의의 프로브를 결합된 프로브로부터 제거하는 단계 및 세척된 샘플에서 형광을 검출하는 단계를 포함한다. 균일 (homogeneous) 분석법은 그가 세척 단계 또는 비-액상 지지체 조건을 필요로 하지 않는다는 점에서 상기 기본 분석법에 비해 개선되었다.
몇몇 분석법에서는 개재성 (intercalating) 형광발색단을 사용하여 핵산 혼성화를 검출하였는데, 이는 상기 형광발색단이 혼성화 복합체 중 핵산 가닥 사이에 결합하는 능력을 기초로 한다.
예를 들어, 버크 (Burke) 등의 미국 특허 제5,824,557호는 핵산 분자를 검출 및 정량하는 방법 및 이를 위한 키트를 개시한다. 바람직한 한 실시양태에서는 염료를 이중 가닥 핵산의 나선구조 또는 단일 가닥 핵산에 개재한다. 염료는 개재된 후 형광을 발생시키며, 형광 강도는 샘플에 존재하는 핵산의 양에 대한 직접적인 측정치이다. 버크 등의 상기 방법은 샘플 중 핵산의 양을 측정하는 데 유용하다는 의미가 있지만, 이 방법의 기초가 되는 개재물질 (intercalator)과 핵산 사이의 비-특이적 결합으로 인해 이 방법은 특이적 결합을, 특히 비-표적 핵산 이중체 (duplex)가 존재하는 조건하에서 검출하는 데 있어서 실용적이지 못하다.
이시구로 (Ishiguro) 등의 미국 특허 제5,814,447호는 개재물질 (intercalating agent)과 핵산 이중체 사이의 비-특이적 상호작용에 의존하는 분석법, 예를 들어 버크 등의 상기 방법 및 이시구로 등에 의해 일본 특허 공개 제237000/1993호에 기재된 종래의 분석법을 향상시킨 것에 의미가 있는 분석법을 개시한다. 이러한 종래의 개선된 방법은 개재되는 경우 증가된 형광 강도를 나타내는 경향이 있는 개재성 형광색소 (fluorochrome)를, 표적 핵산의 특정 영역이 PCR에 의해 증폭되기 전에 샘플 용액에 첨가하는 단계 및 정해진 시간 간격으로 반응 용액으로부터의 형광 강도를 측정하여 증폭 이전의 표적 핵산을 검출 및 정량하는 단계를 포함하였다. 상기 '447 특허 문헌에서는 프로브가 표적 핵산과 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브 사이의 상보적 결합 부위에 개재될 개재성 형광색소로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 특이성이 향상된 분석법을 제공함으로써 종래의 방법을 개선시키고자 하였다.
보다 민감하고, 정확하며, 빠른 분석 기술에 대한 계속된 연구에서, 한 연구 단은 핵산 혼성화 이중체의 형광 강도에 대한 전기장의 효과를 분석하는 것을 포함하는 분석법을 개발하였다. 1997년 2월 27일 출원된 미국 특허 출원 제08/807,901호, 및 미국 특허 제6,060,242호를 참조한다. 연구자들은 하나의 염기쌍이 매스매치된 이중체의 형광 강도가 완전하게 매치된 이중체의 형광 강도와 차이가 있음을 지적하였다. 따라서, 이들 출원은 전기장을 검출 단계에 앞서 또는 그와 동시에 액체 매질에 인가하고, 형광 방출 강도의 변화를 전기장의 함수로서 검출하여 프로브가 완전하게 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 불완전하게 상보적인 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는지를 표시하는, 뉴클레오티드 서열 검출 방법을 개시한 것에 의미가 있다.
상기 개발된 방법들에도 불구하고, 당업계에서는 핵산 및(또는) 핵산 유사체 사이의 상호작용을 분석하기 위한, 간단하고, 고도로 민감하며, 효과적이고 빠른 방법에 대한 요구가 계속되고 있는 실정이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 개요>
본 발명은
하나 이상의 표적 생중합체 서열을 포함하는 표적을 제공하는 단계;
하나 이상의 프로브 생중합체 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계;
상기 프로브 및 상기 표적을 결합 매질에 가하여 시험 샘플을 제공하는 단계;
제1 자극을 상기 시험 샘플에 가하여 제1 자극된 시험 샘플을 제공하는 단 계;
상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제1 신호를 상기 제1 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계;
제2 자극을 상기 제1 자극된 시험 샘플에 가하여 제2 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제2 신호를 상기 제2 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계; 및
상기 제1 신호를 상기 제2 신호와 비교하여 분석을 수행하는 단계
를 포함하며, 여기서 하나 이상의 표지가 상기 시험 샘플에 제공되고, 상기 제1 자극, 제2 자극, 제1 신호 및 제2 신호는 전자기 (electromagnetic) 방사선이되, 단 상기 제1 자극 및 제2 자극이 광 (photonic) 방사선인 경우에 중간 전자 (electronic) 자극을 상기 제1 자극 이후 및 제2 자극 이전에 상기 시험 샘플에 가하고, 상기 제1 자극 및 제2 자극이 전자 방사선인 경우에 상기 제1 신호 및 제2 신호는 전류인 것인, 서열-특이적 혼성화를 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
표적을 제공하는 단계;
프로브를 제공하는 단계 (여기서, 상기 프로브 및 상기 표적 중 하나 이상은 하나 이상의 생중합체 서열을 포함함);
상기 프로브 및 상기 표적을 결합 매질에 가하여 시험 샘플을 제공하는 단계;
제1 자극을 상기 시험 샘플에 가하여 제1 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제1 신호를 상기 제1 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계;
제2 자극을 상기 제1 자극된 시험 샘플에 가하여 제2 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제2 신호를 상기 제2 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계; 및
상기 제1 신호를 상기 제2신호와 비교하여 분석을 수행하는 단계
를 포함하며, 여기서 하나 이상의 표지가 상기 시험 샘플에 제공되고, 상기 제1 자극, 제2 자극, 제1 신호 및 제2 신호는 전자기 방사선이되, 단 상기 제1 자극 및 제2 자극이 광 방사선인 경우에 중간 전자 자극을 상기 제1 자극 이후 및 제2 자극 이전에 상기 시험 샘플에 가하고, 상기 제1 자극 및 제2 자극이 전자 방사선인 경우에 상기 제1 신호 및 제2 신호는 전류인 것인, 서열-특이적 혼성화를 분석하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면과 관련하여 설명할 것이며, 유사한 기준 숫자는 유사한 요소를 나타낸다:
도 1A 및 1B는 전류를 시간 및 상보성의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 1C 및 1D는 전류를 온도 및 상보성의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 2A, 2B, 2C, 3A 및 3B는 전류를 온도, 상보성 및 다른 인자의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 4는 전류를 시간 및 상보성의 함수로 나타낸 그래프이다.
도5A, 5B, 5C 및 6은 형광 강도 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 핵산 서열 또는 핵산 유사체 서열을 포함하는 표적과, 핵산 서열 또는 핵산 유사체 서열을 포함하는 프로브 사이의 결합을 분석하기 위한, 빠르고, 민감하고, 친환경적이며 안전한 방법을 제공한다. 본 발명의 분석법은 또한 표적과 프로브 사이의 결합을 분석하는 데 적합한데, 상기 표적 및(또는) 프로브는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본원에 사용된 바와 같이 2개 이상의 아미노산, 아미노산 유사체, 핵산, 핵산 유사체 및(또는) 이들의 조합을 포함하는 서열을 의미하는 생중합체의 결합을 분석하는 데 적합하다.
선행 기술의 여러 분석법과는 달리, 본 발명의 방법은 특이적 결합의 존재를 검출할 뿐 아니라, 프로브와 표적 사이의 결합 특성에 대한 정성적 정보 및 정량적 정보도 제공한다. 따라서, 핵염기 대 핵염기 결합 분석을 포함하는 실시양태에서, 본 발명은 당업자가 완전한 매치, 1개의 염기쌍 미스매치 (mismatch), 2개의 염기쌍 미스매치, 3개의 염기쌍 미스매치, 1개의 염기쌍 결실, 2개의 염기쌍 결실 및 3개의 염기쌍 결실을 서로 구별할 수 있게끔 한다.
본 발명의 실시양태는 제1 프로브-표적 혼합물에 대해 측정된 신호 (예, 전류 및(또는) 형광 강도)를 동일한 표적과 결합된 다른 프로브에 의해 나타나는 동 일한 유형의 신호에 대비하여 측정하는 것을 포함하며, 여기서 다른 프로브의 각각은 제1 프로브와 하나 이상의 염기에서 차이가 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 신호를 측정하기에 앞서 또는 그와 동시에 낮은 전압을 샘플에 인가한다. 일반적으로, 전압은 불완전하게 매치된 혼성화 대응물을 불안정화하기에 충분히 높지만 완전하게 매치된 혼성화 대응물을 불안정화할 정도로 높지는 않도록 선택된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 전압은 약 1 V 내지 약 20 V이다.
측정된 신호 (예, 전류 및(또는) 형광 강도)의 크기가 표적과 프로브 사이의 결합 친화도의 함수인 검정 곡선을 생성시킬 수 있다. 표적과 다수의 상이한 프로브 사이의 결합 친화도는 핵염기-핵염기 분석에서 미스매치된 염기의 수, 미스매치의 특성 (A-G 대 A-C 대 T-G 대 T-C 등), 혼성화 복합체내 미스매치의 위치 등에 따라 달라지기 때문에, 본 발명의 분석을 이용하여 표적을 서열화할 수 있다.
측정된 신호는 예를 들어 전기 전도도일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 프로브와 표적 사이의 결합 친화도는 신호의 크기와 직접적인 상관관계에 있다. 즉, 전기 전도도는 프로브와 표적 사이의 매치 정도에 따라, 바람직하게는 0개 내지 2개의 미스매치 및(또는) 결실을 포함하는 범위, 보다 바람직하게는 0개 내지 3개의 미스매치 및(또는) 결실을 포함하는 범위에서 증가한다.
다른 실시양태에서, 측정된 신호는 시험 샘플에 포함된 형광발색단의 형광 강도일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 프로브와 표적 사이의 결합 친화도는 형광발색단이 신호 소멸 또는 신호 증폭을 통해 혼성화를 신호화하는지의 여부에 따라 형광 강도와 직접적인 상관관계에 있거나 반비례 관계에 있을 수 있다. 따라서, 개재물질에 의해 생성된 형광 강도는 프로브-표적 결합 친화도와 직접적인 상관관계에 있지만, 프로브와 공유 결합된 비-개재성 형광발색단을 사용하는 실시양태의 강도는 프로브-표적 결합 친화도와 반비례 관계에 있다. 형광 강도는 프로브와 표적 사이의 매치 정도에 따라, 바람직하게는 0개 내지 2개의 미스매치 및(또는) 결실을 포함하는 범위, 보다 바람직하게는 0개 내지 3개의 미스매치 및(또는) 결실을 포함하는 범위에서 증가 (또는 비-개재물질의 경우 감소)한다.
발명자들이 핵염기-함유 서열의 혼성화를 분석하는 형광 강도 분석법 (예를 들어, 1999년 12월 21일 출원된 미국 특허 출원 제09/468,679호 참조)의 이점, 펩티드:핵산 결합을 분석하는 형광 강도 분석법 (1998년 12월 31일 출원된 미국 특허 출원 제09/224,505호 참조)의 이점 및 펩티드:펩티드 결합을 분석하는 형광 강도 분석법 (1999년 6월 25일 출원된 미국 특허 출원 제09/344,525호 참조)의 이점을 이미 개시하였지만, 전기장을 샘플에 인가하는 것은 하기 실시예 6에 나타낸 바와 같이 분석법의 구별능을 증가시키는 것으로 보인다.
또한, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 분석법은 샘플에서 2가지 이상의 신호를 측정하는 것을 포함한다. 제1 신호는 바람직하게는 형광 강도이며, 제2 신호는 바람직하게는 여러 전도도 측정치들로부터 선택된다 (또는 이와 반대로 선택됨).
바람직한 다중 측정 실시양태에서, 제1 신호는 제2 신호와 동일하거나 상이할 수 있다. 측정된 제1 신호 및 제2 신호가 동일한 경우, 제2 신호는 제1 신호 및(또는) 제1 신호를 측정하는 데 사용되는 동일한 기준 신호에 대비하여 측정할 수 있다. 또한, 하나 이상의 상태-변화 자극을 바람직하게는 제1 신호 측정 이후 및 제2 신호 측정 이전에 시험 샘플에 가한다. 이러한 자극은 하나 이상의 신호에 의해 나타난 바와 같이 결합을 측정가능하게 변화시키기에 충분한 것이 바람직하다. 본 발명의 핵염기-핵염기 결합 분석법에서, 자극은 프로브와 표적 사이의 불완전한 상보적 혼성화에 유의한 영향을 주기에 충분한 것이 바람직하며, 프로브와 표적 사이의 완전한 상보적 혼성화에는 유의한 영향을 주기에 충분하지 않은 것이 바람직하다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 자극을 1회 또는 다수회 가한다. 자극은 연속적으로 가하거나 비연속적으로 가할 수 있다. 자극은 신호 검출 이전, 신호 검출 동안 및(또는) 신호 검출 이후에 가할 수 있다.
적합한 자극은 예를 들어 광 방사선 (예, 레이저 광) 자극 및(또는) 전자 자극일 수 있다. 검출된 신호는 예를 들어 광 신호 및(또는) 전자 신호일 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 측정된 제1 신호는 대전 전 (pre-electrification) 형광 강도 (즉, 상태-변화 전압을 시험 샘플에 인가하기 전에 측정된 강도)이며, 측정된 제2 신호는 대전 후 (post-electrification) 형광 강도 (즉, 상태-변화 전압을 시험 샘플에 인가하는 동안 또는 그 이후에 측정된 강도)이다.
상기 실시양태에서 추가의 측정은 분석의 신뢰도를 증가시키며, 의심스런 결 과가 즉시 재시험될 수 있게끔 한다. 2가지 이상의 측정에 의해 얻어진 결과가 일치하지 않을 경우, 통상적으로는 재시험하게 될 것이다.
본 발명에 의해 프로브와 표적 사이의 결합 친화도를 정량할 수 있다. 이러한 정보는 최적의 결합 특성을 갖는 안티센스 약물을 설계하는 것을 비롯한 다양한 용도에서 매우 유용할 수 있다.
선행 기술의 방법들과는 달리, 본 발명의 분석법은 바람직하게는 균일 분석법이다. 본 발명의 분석법은 측정된 신호의 크기를 검출하기에 앞서 프로브-표적 복합체를 유리 프로브 및 표적으로부터 분리하지 않고서도 수행할 수 있다. 본 발명의 분석법은 겔 분리 단계를 필요로 하지 않기 때문에, 시험 처리량을 크기 증가시킬 수 있다. 정량 분석법은 간단하며 정확하다. 결론적으로, 본 발명의 결합 분석법은 많은 시간과 비용을 절감하며, 쉽게 자동화할 수 있다. 또한, 본 발명의 결합 분석법은 결합 변수, 예를 들어 완충액, pH, 이온 농도, 온도, 인큐베이션 시간, 프로브 및 표적 서열의 상대적 농도, 개재물질 농도, 표적 서열의 길이, 프로브 서열의 길이 및 가능한 보조인자 요건을 빠르게 결정할 수 있다.
본 발명의 분석법은 예를 들어 웰 내부의 용액 중에서, 비투과성 표면상에서 또는 바이오칩상에서 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 분석법은 표적 또는 프로브에 신호 소멸제를 제공하지 않고 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 프로브와 이중 가닥 표적 사이의 삼중체 (triplex) 및(또는) 사중체 (quadruplex) 혼성화를 특이적으로 검출함으로써, 표적 을 변성시킬 필요가 없다. 삼중체 및 사중체의 형성 및(또는) 안정화는 시험되는 샘플 중 개재물질의 존재에 의해 증대된다. 예를 들어, 2001년 6월 20일 출원된 미국 특허 출원 제09/885,731호 및 2001년 7월 20일 출원된 미국 특허 출원 (대리인 정리 번호 제E1047/20057호, 발명의 명칭 ("PARALLEL OR ANTIPARALLEL, HOMOLOGOUS OR COMPLEMENTARY BINDING OF NUCLEIC ACIDS OR ANALOGUES THEREOF TO FORM DUPLEX, TRIPLEX OR QUADRUPLEX COMPLEXES"))을 참조한다.
본 발명의 분석법에 사용하기에 적합한 핵염기-함유 프로브로는 예를 들어 하전되지 않거나 부분적으로 하전된 주쇄를 갖는 ssDNA, RNA, PNA 및 다른 핵산 유사체를 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서는 역평행 (antiparallel) 프로브가 바람직하지만, 프로브는 평행 (parallel)할 수도 있다. 염기수 8 내지 20의 임의의 길이를 갖는 프로브 서열이 바람직한데, 이는 상기 범위가 원핵생물 및 진핵생물의 가장 작은 특이적 DNA 서열이 발견되는 범위에 해당하기 때문이다. 염기수 12 내지 18의 프로브가 특히 바람직한데, 이는 상기 범위가 인간 게놈에서 가장 작은 특이적 서열의 길이에 해당하기 때문이다. 몇몇 실시양태에서, 염기수 6 내지 30의 프로브가 가장 바람직하다. 그러나, 더 짧은 다수의 프로브를 사용하여 내부에 다수의 비-특이적 표적 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있으며, 이 프로브는 상기 뉴클레오티드 서열과 결합하여 그를 특이적으로 동정한다. 프로브의 길이는 표적의 길이와 매치되도록 선택할 수 있다.
적합한 아미노산-함유 프로브는 단일 아미노산, 단일 아미노산 유사체, 펩티드류 유사체, 펩티도이드 (peptidoid), 펩티드모방체, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티 드, 폴리펩티드, 단백질 또는 다중-단백질 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명은 사용하기에 위험하고, 불편하며, 시간이 많이들고, 지속적으로 재생시켜야 하는 방사성 프로브의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 사용하기에 안전하며, 수년 동안 안정하다. 따라서, 프로브를 다량 주문 또는 제조하여 보관할 수 있다.
표적이 아미노산을 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 표적은 바람직하게는 펩티드 서열 또는 펩티드류 유사체 서열, 예를 들어 디펩티드, 트리펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 다중-단백질 복합체를 포함한다. 보다 바람직하게, 표적은 프로브에 대해 하나 이상의 수용체 부위를 갖는 단백질이다.
표적이 핵염기를 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 표적은 바람직하게는 8내지 3.3 ×109개의 염기쌍 길이이며, 핵산의 단일 가닥 또는 이중 가닥 서열 및(또는) 그의 유사체일 수 있다.
프로브 및 표적은 표지되지 않은 것이 바람직하지만, 다른 실시양태에서 개재물질은 프로브에 공유 결합된다. 이러한 실시양태에서, 개재물질은 바람직하게는 프로브의 각 말단에 결합된다.
다른 실시양태에서, 개재물질은 프로브에 공유 결합되지 않지만, 개재물질 자체는 분석 동안 프로브와 표적 사이에 비-공유결합 방식으로 프로브에 대해 센스 결합으로 삽입될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 개재물질로는 예를 들어 YOYO-1, TOTO-1, 에 티듐 브로마이드, 에티듐 호모이합체-1, 에티듐 호모이합체-2 및 아크리딘을 들 수 있다. 일반적으로, 개재물질은 이중체, 삼중체 및(또는) 사중체 핵산 복합체의 가닥들 사이에 개재될 수 있는 잔기이다. 바람직한 실시양태에서, 개재물질 (또는 그의 성분)은 핵산의 부재하에서 본질적으로 비-형광성이며, 개재되어 적절한 파장의 방사선에 의해 여기되는 경우 형광을 발생시키고, 이중체 또는 삼중체 핵산 복합체내에 개재되는 경우 100배 내지 10,000배 증가된 형광을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 개재물질이 개재되어 적절한 파장의 방사선에 의해 여기되는 경우 형광 파장의 변화를 나타낼 수 있다. 정확한 형광 파장은 개재되는 핵산의 구조, 예를 들어 DNA 대 RNA, 이중체 대 삼중체 등에 따라 달라질 수 있다.
여기 파장은 사용되는 형광발색단에 대한 상기 최대 여기에 상응하도록 (일상적인 실험 및(또는) 통상의 지식에 의해) 선택되며, 바람직하게는 200 nm 내지 1,000 nm이다. 개재물질은 바람직하게는 200 nm 내지 1,000 nm의 방출 파장을 갖도록 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 아르곤 이온 레이저를 사용하여 400 nm 내지 540 nm 범위의 파장을 갖는 광으로 형광발색단을 조사하였으며, 500 nm 내지 750 nm 범위에서 형광 방출을 검출하였다.
본 발명의 분석법은 넓은 범위의 다양한 온도, 예를 들어 5 ℃ 내지 85 ℃의 범위 등에서 수행할 수 있다. 선행 기술의 여러 분석법들은 승온, 증가된 비용 및 긴 분석 시간을 필요로 한다. 한편, 본 발명은 실온 이하 (예, 25 ℃ 미만의 온도)에서 수행할 수 있다.
본 발명의 분석법은 매우 민감하며, 따라서 표적의 PCR 증폭을 수행해야 할 필요가 없다. 예를 들어, 적어도 형광 강도 실시양태에서는 약 10 펨토몰 (femtomole)의 표적 및 약 10 펨토몰의 프로브를 포함하는, 부피가 약 20 마이크로리터인 시험 샘플을 분석할 수 있다. 본 발명의 실시양태는 5 ×10-9 M의 농도, 바람직하게는 5 ×10-10 M 이하 농도의 표적을 분석하기에 충분히 민감하다. 본 발명의 실시양태는 5 ×10-9 M의 농도, 바람직하게는 5 ×10-10 M 이하 농도의 프로브를 사용하기에 충분히 민감하다.
전도도 측정에 의해 프로브 및 표적을 각각 약 1 pmole 만큼 적게 포함하며 부피가 40 마이크로리터인 샘플을 구별할 수 있다. 샘플 부피를 감소시켜 훨씬 적은 양의 프로브 및 표적을 사용할 수 있다.
상기 값들이 본 발명의 방법에서 더 높은 농도를 검출할 수 없음을 시사하려는 것이 아님은 말할 나위도 없다.
넓은 범위의 개재물질 농도는 시험될 프로브 및 표적의 각 농도에서 허용된다. 예를 들어, 5 ×10-10 M의 프로브 및 5 ×10-10 M의 표적이 혼성화되는 경우, 개재물질 YOYO-1의 최적 농도는 25 nM 내지 2.5 nM의 범위이다. 프로브 및 표적 둘 다의 농도가 5 ×10-8 M인 경우, 바람직한 YOYO-1 농도 범위는 1,000 nM 내지 100 nM이다.
본 발명의 분석법은 하나의 염기쌍이 미스매치된 프로브-표적 복합체를 2개의 염기쌍이 미스매치된 프로브-표적 복합체와 구별하기에 충분히 민감하며, 바람 직하게는 2개의 염기쌍이 미스매치된 프로브-표적 복합체를 3개의 염기쌍이 미스매치된 프로브-표적 복합체와 구별하기에 충분히 민감하다. 물론, 본 발명의 분석법은 완전하게 매치된 프로브-표적 복합체를 상기 미스매치된 임의의 복합체와 구별하기에 충분히 민감하다.
결합 매질은 뉴클레오티드 및(또는) 단백질을 보존하기에 적합한 것으로 알려진 임의의 통상의 매질일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Lab Manual," Vol. 2 (1989)]을 참조한다. 예를 들어, 액체 매질은 뉴클레오티드, 물, 완충액 및 표준 염 농도를 포함할 수 있다.
상보적 염기들 사이의 혼성화는 온도, 염 농도, 정전기 강도 및 완충액 조성에서의 변화를 포함하는 매우 다양한 조건하에서 일어난다. 이러한 조건 및 이들을 적용하는 방법의 예는 당업계에 공지되어 있다.
혼성화 복합체는 약 15 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도에서 약 1분 내지 약 5분 동안 형성되는 것이 바람직하다. 더 긴 반응 시간이 필요한 것은 아니지만, 수시간 동안의 인큐베이션이 혼성화 복합체에 불리한 영향을 주지는 않을 것이다.
(특히, 개재물질을 포함하는 실시양태의 경우에는 불필요하지만) 여러 시약을 사용하여 용액 중 혼성화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 시약의 바람직한 예로는 단일 가닥 결합 단백질, 예를 들어 Rec A 단백질, T4 유전자 32 단백질, 이. 콜라이 (E. coli) 단일 가닥 결합 단백질, 핵산의 메이저 (major) 또는 마이너 (minor) 그루브 (groove) 결합 단백질, 2가 이온, 다가 이온, 비올로젠 (viologen) 및 개재성 물질, 예를 들어 에티듐 브로마이드, 악티노마이신 D, 프소랄렌 (psoralen) 및 안젤리신 (angelicin)을 들 수 있다. 이러한 촉진성 시약은 극단적인 수행 조건, 예를 들어 비정상적 pH 수준 또는 극도로 높은 온도에서 유용한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 분석법을 이용하여, 예를 들어 폴딩된 뉴클레오티드 서열에서 접근가능한 영역을 확인하고, 혼성화 복합체에서 미스매치된 염기쌍의 수를 결정하며, 게놈을 맵핑할 수 있다.
개재물질을 사용하여 형광 강도를 검출하는 실시양태에서, 형광 강도는 프로브와 표적 사이의 결합 친화도의 증가에 따라 상승한다. 비-개재성 형광발색단을 사용하여 형광 강도를 검출하는 실시양태에서, 형광 강도는 프로브와 표적 사이의 결합 친화도의 증가에 따라 감소한다. 형광발색단이 개재되는지 아닌지의 여부와는 무관하게, 본 발명의 방법은 형광 이방향성 (anisotropy) 방법과는 달리 형광 분극화의 측정을 필요로 하지 않는다.
하기 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이지만, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다.
실시예 1
인간 낭성 섬유증 유전자 (Nature 380, 207 (1996))의 엑손 10으로부터 유도된 센스 및 안티센스 50-mer ssDNA 표적 서열을 DNA 합성기 (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems)로 합성하여 HPLC에 의해 정제하였다. 등몰량의 상보적 올리고뉴클레오티드를 95 ℃에서 10분간 변성시켰으며, 온도가 1.5시간에 걸쳐 21 ℃ 로 냉각됨에 따라 상기 올리고뉴클레오티드는 점차적으로 어닐링되었다. 이중 가닥 DNA (dsDNA) 올리고뉴클레오티드를 ddH2O 중에 1 pmole/㎕의 농도로 용해시켰다.
야생형 표적 DNA (서열 1)의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
야생형 표적 DNA (서열 1)의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
dsDNA (서열 1)의 예상 용융 온도 (Tm)는 65.2 ℃이었다.
서열 2는 야생형 서열의 아미노산 위치 507에서 CAT가 CGT로 바뀐 하나의 염기쌍 돌연변이 (밑줄로 표시)를 제외하면 야생형 표적 DNA (서열 1)과 동일한 50-mer 돌연변이 dsDNA 표적 서열이었다.
서열 2의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
서열 2의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
dsDNA (서열 2)의 예상 용융 온도 (Tm)는 66.0 ℃이었다.
서열 3은 야생형 서열의 아미노산 위치 506 및 507에서 CAT가 ACT로 바뀐 구성적 (consecutive)인 2개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄로 표시)를 제외하면 야생형 표적 DNA (서열 1)과 동일한 50-mer 돌연변이 dsDNA 표적 서열이었다.
서열 3의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
서열 3의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
dsDNA (서열 3)의 예상 용융 온도 (Tm)는 65.2 ℃이었다.
실시예에 사용된 PNA 프로브를 합성하고, HPLC 정제하고, 커먼웰쓰 바이오테크놀러지스, 인크. (Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA, USA))사의 질량 분광법으로 확인하였다. PNA 프로브를 먼저 0.1％ TFA (트리플루오로아세트산) 중에 10 mg/ml의 농도로 용해시킨 다음, ddH2O를 가하여 1 mg/ml로 희석시켰다. 최종 PNA 원액을 ddH2O 중에서 1 pmole/㎕의 농도로 제조하였다.
프로브 1은 아미노산 위치 505 내지 510이 중복되는, 50-mer 야생형 표적 DNA (서열 1)의 센스 가닥의 뉴클레오티드 15개로 구성된 단편에 완전하게 상보적이도록 설계된 15-mer 역평행 PNA 프로브이었다 (Nature 380, 207 (1996)). 이 프로브는 다음과 같은 구조를 가졌다 (서열 8):
5'-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH2-3'
혼성화 반응 혼합물 (80 ㎕)은 표적 dsDNA 2 pmole, PNA 프로브 2 pmole, 0.5X TBE 및 250 nM의 DNA 개재물질 YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 포함하였다. 샘플을 3 mm 석영 큐벳 (quartz cuvette)에 넣고, 1 볼트 또는 5 볼트로 15초 동안 DC (V) 대전처리하였다. 전류법 (amperometric) 분석은 전압을 용액에 인가하는 동안 전류를 모니터링하는 것으로 구성되었다. 온도 프로브를 각 용액에 넣어 전류법 평가 시점에서 온도를 측정하였다. 1 볼트에서, 전류 피크는 대전 후 처음 2초 동안 관찰되었다. 전류는 이후 13초 동안 급격하게 감소되었다. 5 볼트를 인가하는 실험에서는 전류가 전체 대전 시간 (15초) 동안 비교적 안정하게 유지되었다.
DNA 또는 PNA가 존재하지 않은 경우 (대조군) 또는 야생형 서열 1, 돌연변이 서열 2 또는 돌연변이 서열 3이 역평행 PNA 프로브 1과 반응한 경우의 전도도 값을 관찰하는 일련의 실험을 수행하였다. 도 1A 및 1B는 각 실험에서 전도도에 대해 얻어진 데이타에 관한 그래프이다. 도 1A는 1 V의 대전 전압을 인가한 결과를 나타내며, 도 1B는 5 V를 인가한 결과를 나타낸다. 완전하게 상보적인 서열 (서열 1 + 프로브 1)로 이루어진 이중 가닥 DNA:PNA 하이브리드 삼중체에는 YOYO-1이 최대로 개재될 수 있으며, 1 V를 총 15초 인가하는 동안 가장 높은 전도도 값 (도면에 음의 전류 값으로 나타냄)을 나타낸다. 역평행 PNA 프로브와 1 bp가 미스매치된 dsDNA (서열 2 + 프로브 1) 및 2 bp가 미스매치된 dsDNA (서열 3 + 프로브 1)의 삼중체 혼성화에 대한 표준화된 피크 전도도는 전압을 인가하는 제1초 동안 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 하이브리드 (서열 1 + 프로브 1)에서 관찰된 것보다 각각 79％ 및 96％ 더 낮았다 (도 1A). 전압을 총 15초 인가하는 동안의 전도도 값을 평균했을 때 완전하게 상보적인 삼중체와 미스매치된 염기쌍을 포함하는 삼중체 사이에서 유사한 비율의 전도도 감소가 나타났다. 도 1A에서, 1 bp 및 2 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 하이브리드는 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 하이브리드에 대한 평균 전도도 값보다 각각 65％ 및 91％ 더 낮은 평균 전도도 값을 나타냈다. 도 1A 에 나타낸 모든 실험은 실온 (23 ℃)에서 수행하였다. 프로브와 이중 가닥 표적 사이의 미스매치 정도가 증가함에 따라, YOYO-1이 개재되는 수준 및 전도도 수준이 감소하였다. 또한, 이러한 관계는 상기 언급한 실험을 반복하고 더 높은 전압 (5 V)을 인가하는 경우에 관찰되었다. 5 V를 인가하는 동안, 1 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 2 + 프로브 1) 및 2 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 3 + 프로브 1)에 대한 표준화된 평균 전도도 값은 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 3 + 프로브 1)에 대해 관찰된 것보다 각각 52％ 및 67％ 더 낮았다 (도 1B). 도 1B에 나타낸 실험은 실온 (23 ℃)에서 수행하였다.
실험을 50 ℃ 및 65 ℃로 증가된 온도에서 반복한 경우, 유사한 전류법 값이 관찰되었다. 50 ℃에서, 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 1 + 프로브 1)에 1 V를 15초 동안 인가하자 각각 1 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 2 + 프로브 1) 및 2 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 3 + 프로브 1)에 대한 -0.15 μAmp (40％ 감소) 및 -0.06 μAmp (76％ 감소)의 값에 비해 -0.25 μAmp의 평균 전류를 생성하였다 (도 1C). 65 ℃에서, 1 V의 전압을 15초 동안 인가했을 때 유사한 관찰 결과가 얻어졌다. 완전하게 매치된 핵산 하이브리드는 각각 1 bp 및 2 bp가 미스매치된 하이브리드에 대한 -0.16 μAmp (57％ 감소) 및 -0.01 μAmp (97％ 감소)에 비해 -0.37 μAmp의 평균 전류를 생성하였다 (도 1C). 고온에서 5 볼트를 인가하자 유사한 결과가 나타났다. 50 ℃에서 수행된 실험은 완전하게 매치된 하이브리드, 1 bp가 미스매치된 하이브리드 및 2 bp가 미스매치된 하이브리드 각각에 대해 -0.27 mAmp, -0.13 mAmp (52％ 감소) 및 -0.08 mAmp (70％ 감소)의 평 균 전류를 발생시켰지만, 65 ℃에서 수행된 실험은 동일한 3가지 군의 각각에 대해 -0.31 mAmp, -0.14 mAmp (55％ 감소) 및 -0.10 mAmp (68％ 감소)의 평균 전류 값을 나타냈다 (도 1D). 상기 모든 실험에서, dsDNA는 역평행 PNA 프로브 1과의 삼중체 혼성화 이전에는 변성되지 않았다.
혼성화 혼합물을 65 ℃로 가열하고 즉시 냉각한 다음, 여러 온도에서 유사한 실험을 수행하였다. 실온 (23 ℃)으로 냉각한 다음, 완전하게 매치된 샘플 (서열 1 + 프로브 1)에 1 V를 15초 동안 인가하자 -0.184 μAmp의 평균 전류를 생성하였다. 이에 비해, 1 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 하이브리드 (서열 2 + 프로브 1) 및 2 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 하이브리드 (서열 3 + 프로브 1)에 대해 각각 -0.06 μAmp (67％ 감소) 및 -0.05 μAmp (72％ 감소)의 값이 관찰되었다 (데이타는 나타내지 않음). 샘플을 65 ℃에서 50 ℃로 냉각시킨 경우, 이후 1 V를 15초 동안 인가했을 때 유사한 관찰 결과가 나타났다. 완전하게 매치된 샘플 (서열 1 + 프로브 1)은 1 bp 및 2 bp가 미스매치된 샘플에 대해 각각 관찰된 -0.11 μAmp (52％ 감소) 및 -0.01 μAmp (96％ 감소)에 비해 -0.23 μAmp의 평균 전류를 생성하였다 (데이타는 나타내지 않음). 23 ℃ 또는 50 ℃로 냉각시킨 후 5 V를 인가했을 때, 완전하게 매치된 삼중체 하이브리드 (서열 1 + 프로브 1), 1 bp가 미스매치된 삼중체 하이브리드 (서열 2 + 프로브 1) 및 2 bp가 미스매치된 삼중체 하이브리드 (서열 3 + 프로브 1)에서 발생된 평균 전류는 23 ℃에서 각각 -0.15 mAmp, -0.09 mAmp (40％ 감소) 및 -0.07 mAmp (53％ 감소)이었으며, 50 ℃에서 각각 -0.23 mAmp, -0.09 mAmp (61％ 감소) 및 -0.09 mAmp (61％ 감소)이었다 (데이타는 나타내지 않음).
65℃ (50-mer dsDNA 서열의 Tm)에서의 혼성화 혼합물의 예비처리 이후에 냉각시키는 것은, 역평행 PNA 프로브를 사용하는 경우 23℃ 또는 50℃에서 직접 측정했을 때 (65℃에서 미리 가열하지 않음), 완전하게 상보적인 dsDNA:PNA 삼중체와 1 bp 또는 2 bp 미스매치를 함유하는 삼중체 사이에서 관찰되는 전도도 차이에 유의하게 영향을 주지 않았다. 분명하게, DNA 개재물질인 YOYO-1의 존재시 역평행 PNA 프로브는 dsDNA 표적과 삼중체 구조를 형성할 수 있었다. 낮은 수준의 전압 (예를 들어, 1 V 또는 5 V) 인가로 인해, 서열을 미리 변성시키는 단계 없이도 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 서열을 1 bp 또는 2 bp 돌연변이를 함유하는 삼중체 서열과 구별하는 것이 가능하게 되었다.
실시예 2
도 2는, 사용된 PNA 프로브가 표적 DNA 서열에 대해 역평행인 경우에 본 발명의 전류법 분석이 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 하이브리드와 1 bp 또는 2 bp 미스매치를 함유하는 삼중체 하이브리드를 식별할 수 있음을 입증한다. 프로브 2는 프로브 1과 서열이 동일한 15-mer PNA 프로브였으나, 종래의 역평행한 배향 대신에 표적 DNA의 평행한 배향과 매치되도록 합성되었다. 프로브 2는 하기 구조를 갖는다 (서열 9):
5'-H-TAT AGT AGA AAC CAC-Lys-CONH2-3'
프로브 1 대신 프로브 2을 사용한 유일한 차이를 제외하고는 실시예 1에 기 재된 것과 동일한 분석 조건으로 실험을 수행하였다. 1 볼트가 인가되었을 때, 1 bp 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 2 + 프로브 2), 및 연속된 2 bp가 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 3 + 프로브 2)에 대한 평균 전류는, 매칭 온도에서 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 1 + 프로브 2)에 비해 23℃에서 각각 25％ 및 32％ 더 낮았고, 50℃에서 각각 30％ 및 23％ 더 낮았으며, 65℃에서 각각 28％ 및 65％ 더 낮았다 (도 2A).
(1 V 대신) 5 V를 15초 동안 인가했을 때 유사한 결과를 얻었다. 23℃, 50℃ 및 65℃에서 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 하이브리드는 각각 -0.15 mAmp, -0.24 mAmp 및 -0.17 mAmp의 평균 전류를 생성하였다 (도 2B). 1 bp 미스매치 및 2 bp 미스매치된 불완전하게 상보적인 삼중체는, 완전하게 매치된 하이브리드 샘플에 의해 얻어진 것보다, 23℃에서 각각 27％ 더 낮은 (-0.11 mAmp) 평균 전류 및 53％ 더 낮은 (-0.07 mAmp) 평균 전류를 생성하였고, 50℃에서 각각 21％ 더 낮은 (-0.19 mAmp) 평균 전류 및 46％ 더 낮은 (-0.13 mAmp) 평균 전류를 생성하였으며, 65℃에서 각각 변하지 않은 (-0.17 mAmp) 평균 전류 및 18％ 더 낮은 (-0.14 mAmp) 평균 전류를 생성하였다.
도 2A 및 2B에 도시된 결과는, 평행 PNA 프로브 2가 사용되었을 때, 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체와 1 bp 또는 2 bp 미스매치를 함유하는 삼중체 사이에서 얻어진 전도도의 차이가 역평행 PNA 프로브 1을 사용하여 얻은 것 (도 1)보다 덜 극적임을 나타낸다.
그러나, 평행 프로브 2를 포함하며, 샘플을 65℃로 가열하고 즉시 냉각시킨 후에 5 V를 인가하는 것을 포함하는 실험은, 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체와 1 bp 또는 2 bp 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 사이의 증대된 신호 차이를 입증하는 전류법 측정치를 나타냈다 (도 2C). 완전하게 매치된 하이브리드 (서열 1 + 프로브 2), 1 bp 미스매치된 하이브리드 (서열 2 + 프로브 2) 및 2 bp 미스매치된 하이브리드 (서열 3 + 프로브 2)는, 23℃에서 각각 -0.19 mAmp, -0.08 mAmp 및 -0.06 mAmp의 평균 전도도 값을 산출하였고, 50℃에서 각각 -0.17 mAmp, -0.09 mAmp 및 -0.07 mAmp의 평균 전도도 값을 산출하였으며, 65℃에서 각각 -0.23 mAmp, -0.13 mAmp 및 -0.08 mAmp의 평균 전도도 값을 산출하였다. 이는, 1 bp 및 2 bp 미스매치된 샘플에 대해 완전하게 상보적인 샘플에 의해 얻은 값을 비교했을 때, 23℃에서 각각 58％ 및 68％의 전도도 감소, 50℃에서 각각 47％ 및 59％의 전도도 감소, 및 65℃에서 43％ 및 65％의 전도도 감소로 해석된다 (도 2C).
따라서, 전류법 분석에 있어서 역평행 및 평행 PNA 프로브 둘 다는 완전하게 상보적인 dsDNA 표적과 1 bp 또는 2 bp 돌연변이를 함유하는 불완전하게 상보적인 dsDNA 표적과의 구별을 가능하게 한다.
실시예 3
프로브 3은 15-mer의 역평행 PNA 프로브 1과 서열 및 배향이 동일한 15-mer의 ssDNA 프로브 (서열 8)였다. 프로브 3은 하기 구조를 갖는다:
5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3'
전류법 분석의 특이성은 ssDNA 프로브 3을, 미리 변성시키지 않은 50-mer의 야생형 및 돌연변이체 dsDNA 표적 서열과 반응시킴으로써 추가로 조사하였다. 분 석 조건은 실시예 1에 기재된 것과 동일하였다.
DNA 개재물질인 YOYO-1에 의해 증대되는 경우, dsDNA:ssDNA 삼중체는 30℃와 65℃ 사이에서 형성되었다. 1 볼트 처리시, 서열 1 + 프로브 3으로 구성된, 완전하게 매치된 DNA 삼중체가 가장 높은 전도도 값을 산출하였다 (도 3A). 이와 반대로, 불완전하게 상보적인 프로브와 표적의 조합 (1 bp 미스매치 (서열 2 + 프로브 3) 및 연속된 2 bp 미스매치 (서열 3 + 프로브 3) 생성)은, 매칭 온도에서 완전하게 상보적인 서열에 대해 관찰된 것보다, 23℃에서 각각 14％ 및 64％ 더 낮은 평균 전도도 값, 50℃에서 각각 30％ 및 70％ 더 낮은 평균 전도도 값, 그리고 65℃에서 각각 25％ 및 72％ 더 낮은 평균 전도도 값을 나타냈다 (도 3A). 이들 샘플에 보다 높은 전압 (5 V)을 인가하면, 완전하게 매치된 샘플과 미스매치된 샘플 사이에서, 특히 보다 저온인 경우에 1 V에서 관찰된 것보다 더 큰 전류법 분석치의 차이를 나타냈다. 5 V로 15초 동안 처리한 후, 1 bp 미스매치된 DNA 삼중체 및 2 bp 미스매치된 DNA 삼중체에 대한 평균 전류는 매칭 온도에서 완전하게 매치된 DNA 삼중체에 대해 관찰된 것보다, 23℃에서 각각 54％ 및 78％ 더 낮은 값, 50℃에서 각각 68％ 및 70％ 더 낮은 값, 그리고 65℃에서 각각 33％ 및 61％ 더 낮은 값을 나타냈다 (도 3B).
유사한 전기적 실험에서, 혼성화 혼합물을 65℃로 가열하고, 이 온도에서 유지시키거나 또는 즉시 50℃ 또는 23℃로 냉각시킨 후에 1 V 또는 5 V를 인가하였다. 완전하게 매치된 DNA 삼중체 서열 (서열 1 + 프로브 3)에 대해 1 V로 15초 동안 처리한 결과, 23℃, 50℃ 및 65℃에서 가장 높은 전도도 값이 나타났다 (도 3A). 1 bp 미스매치 (서열 2 + 프로브 3) 또는 2 bp 미스매치 (서열 3 + 프로브 3)를 함유하는 DNA 삼중체는, 23℃에서 각각 21％ 및 63％만큼, 50℃에서 각각 18％ 및 74％만큼, 그리고 65℃에서 각각 12％ 및 106％만큼 전도도가 더 낮았다 (도 3A). 이와 유사하게, 미리 가열된 샘플에 5 V를 15초 동안 인가했을 때, 1 bp 미스매치된 DNA 삼중체 및 2 bp 미스매치된 DNA 삼중체에 대한 평균 전도도 값은, 완전하게 매치된 DNA 삼중체에 의해 생성된 평균 전도도 값에 비해, 23℃에서 각각 24％ 및 104％만큼, 50℃에서 각각 42％ 및 44％만큼, 그리고 65℃에서 각각 38％ 및 102％만큼 감소하였다 (도 3B).
역평행 PNA 프로브 (도 1)와 ssDNA 프로브 (도 3)가 전류법 분석에서 유사한 방식으로 거동한다는 관찰은, 프로브로서 사용된 핵산의 주쇄가 특별히 중요하지 않음을 시사하였다. YOYO-1의 존재는 dsDNA 표적 및 ssDNA 프로브가 용액 중의 표적과 프로브 사이의 서열 상보성 수준에 따라 상이한 전하를 생성할 수 있는 삼중 나선 구조를 형성하도록 하였다. 프로브와 표적 사이의 미스매치 정도가 증가할수록 전도도의 수준은 감소하였으며, 이는 천연 DNA 프로브가 선행 변성 단계없이 사용되는 경우에 전류법 분석의 신뢰도를 증명한다.
실시예 4
실시예 1 내지 3에 기재된 전류법 분석에서, DNA 개재물질인 YOYO-1은 혼성화 혼합물을 함유하는 용액에 첨가하였다. YOYO-1에 의한 개재는 dsDNA:PNA 삼중체 및 dsDNA:ssDNA 삼중체의 형성을 용이하게 하였다. 전류법 분석에서 ssDNA 프로브에 공유결합으로 부착된 개재물질 잔기를 이용할 가능성은 실시예 4에서 평가 하였다.
아크리딘은 다른 dsDNA 개재물질로서, 삼중체 핵산 구조 내에 개재되는 능력도 지니고 있어서, 삼중 나선 구조를 안정화시킨다. 예를 들어, 문헌 [Kukreti et al., "Extension of the range of DNA sequences available for triple helix formation: stabilization of mismatched triplexes by acridine-containing oligonucleotides." 25 Nucleic Acids Research 4264-4270 (1997)]을 참조한다. 3' 말단에 공유결합으로 부착된 아크리딘 분자 (Glen Research, Sterling, VA, USA)를 함유하는 ssDNA 프로브를 DNA 합성기 (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems)에서 합성하여 HPLC에 의해 정제하였다.
프로브 4는 15-mer의 프로브 3과 서열 및 배향이 동일한 (따라서, 15-mer의 역평행 PNA 프로브 1 (서열 8)과도 서열 및 배향이 동일함) 15-mer의 ssDNA 프로브였으나, 3' 위치에 아크리딘 잔기가 부가되었다. 이 프로브는 하기 구조를 갖는다:
5'-CAC CAA AGA TGA TAT-아크리딘-3'
혼성화 반응 혼합물 (80 ㎕)은 2 pmole의 표적 dsDNA, 2 pmole의 ssDNA 프로브 4 및 0.5X TBE를 함유하였다. 샘플을 3 mm 석영 큐벳에 넣고, 23℃에서 11초 동안 5 V로 DC 대전하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 전류 및 온도를 모니터링하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, ssDNA 프로브 4는 공유결합으로 부착된 아크리딘 잔기의 안정한 개재의 결과로서 완전하게 매치된 50-mer의 dsDNA 표적 (서열 1)과 혼성화될 수 있었고, 이로 인해 -0.53 mAmp의 평균 전류를 생성하였다. 이와 대조적으로, 1 bp 미스매치 (서열 2 + 프로브 4) 또는 2 bp 미스매치 (서열 3 + 프로브 4)를 함유하는 보다 덜 안정한 DNA 삼중체는, 대조군 (표적 DNA없이 프로브 4만)에 대해 표준화했을 때 완전하게 매치된 DNA 삼중체보다 각각 52％ 및 66％ 더 낮은 평균 전류를 생성하였다 (도 4).
따라서, ssDNA 프로브에 부착된 아크리딘은, 전류법 분석에서 표적과 프로브 사이의 서열 상보성 수준에 따라 상이한 전류를 생성한 삼중 DNA 나선을 형성함에 있어서 부착되지 않은 YOYO-1과 그 효율이 동등하였다.
실시예 5
인간 낭성 섬유증 유전자의 10번 엑손에서 유래한 센스 및 안티센스의 15-mer ssDNA 표적 서열을 합성하여, 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제 및 어닐링하였다. dsDNA 올리고 뉴클레오티드를 1 pmole/㎕의 농도로 ddH20 중에 용해시켰다.
서열 4는 프로브 1과 완전하게 상보적인 것으로 디자인된, 서열 1로부터 유래한 15-mer의 dsDNA 표적 서열이었다.
야생형 표적 DNA (서열 4)의 센스 가닥에 대한 서열은 5'-ATA TCA TCT TTG GTG-3'이다.
야생형 표적 DNA (서열 4)의 안티센스 가닥에 대한 서열은 5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3'이다.
dsDNA (서열 4)의 예상 용융 온도 (Tm)는 40.0℃이다.
서열 5는, 서열 TTT가 TAT로 변한 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄)를 제외하고는 야생형 표적 DNA (서열 4)와 동일한 15-mer의 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 5)의 센스 가닥에 대한 서열은 5'-ATA TCA TCT ATG GTG-3'이다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 5)의 안티센스 가닥에 대한 서열은 5'-CAC CAT AGA TGA TAT-3'이다.
dsDNA (서열 5)의 예상 용융 온도 (Tm)는 40.0℃이다.
서열 6은, 서열 ATC가 GGC로 변한 연속된 2개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄)를 제외하고는 야생형 표적 DNA (서열 4)와 동일한 15-mer의 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 6)의 센스 가닥에 대한 서열은 5'-ATA TCG GCT TTG GTG-3'이다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 6)의 안티센스 가닥에 대한 서열은 5'-CAC CAA AGC CGA TAT-3'이다.
dsDNA (서열 6)의 예상 용융 온도 (Tm)는 44.0℃이다.
서열 7은, 3개의 1 bp 돌연변이가 각각 3개의 염기쌍만큼 떨어진 3개의 분리된 염기쌍 돌연변이 (밑줄)를 제외하고는 야생형 표적 DNA (서열 4)와 동일한 15-mer의 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다. 서열 ATC, TCT 및 TGG가 각각 ACC, TAT 및 TAG로 변하였다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 7)의 센스 가닥에 대한 서열은 5'-ATA CCA TAT TTA GTG-3'이다.
돌연변이체 표적 DNA (서열 7)의 안티센스 가닥에 대한 서열은 5'-CAC TAA ATA TGG TAT-3'이다.
dsDNA (서열 7)의 예상 용융 온도 (Tm)는 38.0℃이다.
혼성화 반응 혼합물 (80 ㎕)은 2 pmole의 표적 dsDNA, 2 pmole의 평행 PNA 프로브 2, 0.5X TBE 및 250 nM의 DNA 개재물질 YOYO-1을 함유하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션시켜 변성되도록 한 후, 분석할 때까지 65℃로 유지하였다. 샘플을 석영 큐벳에 넣고, 파장이 488 nm인 아르곤 이온 레이저 빔을 조사하고, 65℃에서 형광 방출에 대해 모니터링하였다. 각 샘플내에 직접 위치시킨 소프트웨어-제어 온도 프로브에 의한 온도 측정을 수반하였다. 최대 형광 강도는 파장 536 nm에서 발생하였으며, 이는 PNA:DNA 하이브리드에 YOYO-1이 개재되었음을 나타낸다. 제2 분석법으로, 각 샘플에 대한 최초 레이저 조사 이후에, 동일한 샘플을 4초 동안 1 V로 DC 대전하였다. 마지막 제2 대전 동안, 샘플을 아르곤 이온 레이저로 2회째 조사하고, 65℃에서 형광 방출을 모니터링하였다. 분석된 각 샘플에 대한 파장의 함수로서, 형광 강도를 플롯팅하였다.
완전하게 상보적인 서열로 구성된 ssDNA:PNA 하이브리드 (서열 4 + 프로브 2)는 YOYO-1의 최대 개재가 가능하였으며, 그 결과 가장 높은 형광 강도를 산출하 였다 (도 5A). 1 bp 미스매치된 ssDNA:PNA 하이브리드 (서열 5 + 프로브 2), 연속된 2 bp 미스매치된 ssDNA:PNA 하이브리드 (서열 6 + 프로브 2), 및 분리된 3 bp 미스매치된 ssDNA:PNA 하이브리드 (서열 7 + 프로브 2)에 대한 형광 강도는 모두, 65℃에서 완전하게 매치된 ssDNA:PNA 하이브리드에 대해 관찰된 형광 강도보다 낮았다 (도 5, 및 데이타 도시하지 않음). 프로브와 표적 사이의 미스매치 정도가 증가함에 따라 YOYO-1에 의한 개재의 수준도 감소하였으며, 따라서 형광 강도의 수준도 감소하였다. DNA나 PNA가 전혀 존재하지 않을 때 (YOYO-1만 존재) 단지 백그라운드 수준의 형광만이 관찰되었다 (도 5A).
완전하게 매치된 ssDNA:PNA 하이브리드를 65℃에서 4초 동안 1 V의 전압을 인가했을 때, 형광 강도는 비교적 일정하게 유지되어 단지 2％만이 감소하였다 (도 5A). 이와는 반대로, 1 bp 미스매치 (도 5B), 2 bp 미스매치 (도 5C) 및 3 bp 미스매치 (데이타 도시하지 않음)를 함유하는 불완전하게 상보적인 이중체에 1 V를 인가하면, 전압의 부재하에 조사된 동일한 샘플에 대해 얻어진 형광 강도에 비해 각각 18％, 39％ 및 71％ 더 낮은 값이 산출되었다. 낮은 수준의 전압 (예를 들어, 1 V)으로의 처리는 염기쌍 미스매치를 함유하는 ssDNA:PNA 하이브리드의 안정성을 추가로 감소시켰다. 프로브와 표적 사이의 서열 상보성 정도가 감소함에 따라 전압의 존재시에 형광 강도 수준이 극적으로 감소하였으며, 이는 완전하게 매치된 서열과 1 bp, 2 bp 또는 3 bp 돌연변이를 함유하는 서열을 구별할 수 있는 매우 신뢰성이 높고 정확한 제2 분석을 제공하였다.
실시예 6
dsDNA 표적 서열의 변성 후에 실시예 5의 혼성화 분석을 수행하여, dsDNA 표적의 용융 온도 (Tm)보다 높은 온도에서 ssDNA:PNA 하이브리드 형성을 측정하였다. 실시예 6은, 미리 변성시키지 않고도 완전하게 매치된 서열과 염기쌍 미스매치 서열을 구별하는 데 있어서, 인가된 전압의 부재 및 존재하에 수행된 형광 강도 분석법의 신뢰도를 입증할 것이다.
혼성화 반응 혼합물 (80 ㎕)은 4 pmole의 표적 dsDNA, 4 pmole의 역평행 PNA 프로브 1, 0.5X TBE 및 250 nM의 DNA 개재물질 YOYO-1을 함유하였다. 샘플을 석영 큐벳에 넣고, 파장이 488 nm인 아르곤 이온 레이저 빔을 80 msec 동안 조사하고, 23℃에서 형광 방출에 대해 모니터링하였다. 각 샘플내에 직접 위치시킨 소프트웨어-제어 온도 프로브에 의한 온도 측정을 수반하였다. 최대 형광 강도는 파장 536 nm에서 발생하였으며, 이는 PNA:DNA 하이브리드에 YOYO-1이 개재되었음을 나타낸다. 제2 분석법으로, 각 샘플에 대한 최초 레이저 조사 이후에, 동일한 샘플을 4초 동안 20 V로 DC 대전하였다. 대전 3초 직후에, 샘플을 아르곤 이온 레이저로 80 msec 동안 2회째 조사하고, 23℃에서 형광 방출을 모니터링하였다. 분석된 각 샘플에 대한 파장의 함수로서, 형광 강도를 플롯팅하였다.
DNA 개재물질인 YOYO-1에 의해 증대되는 경우, dsDNA:PNA 삼중체는 23℃에서 형성되었다. 가장 높은 형광 강도는 야생형 50-mer dsDNA 표적 서열 (서열 1)이 15-mer의 역평행 PNA 프로브 1과 혼성화되었을 때 달성되었다 (도 6). 이와 대조적으로, 1 bp 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 2 + 프로브 1) 및 연속된 2 bp 미스매치된 dsDNA:PNA 삼중체 (서열 3 + 프로브 1)는, 23℃에서 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체에 대해 관찰된 형광 강도보다 각각 60％ 및 91％ 더 낮았다. YOYO-1을 함유하는 반응 혼합물에 DNA나 PNA가 전혀 존재하지 않을 때, 단지 백그라운드 수준의 형광만이 관찰되었다
완전하게 상보적인 삼중체와 1 bp 또는 2 bp 미스매치를 함유하는 삼중체 사이에서 관찰된 형광 강도의 차이는, 완전하게 매치된 이중체와 불완전하게 매치된 이중체 사이에서 얻어진 것보다 유의하게 더 큰 값을 나타내었다 (도 5와 6 비교). 분명한 것은, 삼중체 형성의 형광 강도 분석법은 염기쌍 미스매치를 검출하는 구별능이 증대되었다는 것이다.
더욱이, 2회째 전압 인가에 의해 야생형 서열과 돌연변이 서열 사이의 추가 구별조차도 가능하였다. 완전하게 매치된 dsDNA:PNA 삼중체에 20 V로 3초 동안 처리하면, 전압을 인가하지 않은 동일한 샘플에 의해 얻어진 것과 사실상 동일한 형광 강도 스펙트럼이 생성되었다 (도 6). 그러나, 1 bp 미스매치 및 2 bp 미스매치를 함유하는 불완전하게 상보적인 삼중체에 20 V를 3초 동안 인가하면, 전압의 부재하에 조사된 동일한 샘플에 대해 얻어진 것보다 각각 23％ 및 71％ 더 낮은 형광 강도가 나타났다 (도 6). 20 V 전압 처리는 완전하게 상보적인 삼중체의 안정성에 영향을 주지 않았지만, 프로브와 표적 사이의 서열 상보성 정도에 따라 염기쌍 미스매치를 함유하는 dsDNA:PNA 삼중체의 안정성을 약화시켰다. 따라서, 형광 강도 분석에 전압을 인가하는 것은, 서열을 미리 변성시키지 않고도 야생형 서열과 1 bp 또는 2 bp 돌연변이를 함유하는 서열을 구별할 수 있는 신뢰성이 훨씬 더 높은 분 석법을 제공한다.
본 발명은 구체적인 실시예를 참조하여 상세하게 설명되었지만, 그의 취지와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (29)

  1. 하나 이상의 표적 생중합체 서열을 포함하는 표적을 제공하는 단계;
    하나 이상의 프로브 생중합체 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계;
    상기 프로브 및 상기 표적을 결합 매질에 가하여 시험 샘플을 제공하는 단계;
    제1 자극을 상기 시험 샘플에 가하여 제1 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
    상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제1 신호를 상기 제1 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계;
    제2 자극을 상기 제1 자극된 시험 샘플에 가하여 제2 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
    상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제2 신호를 상기 제2 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계; 및
    상기 제1 신호를 상기 제2 신호와 비교하여 분석을 수행하는 단계
    를 포함하며, 여기서 (a) 하나 이상의 표지가 상기 시험 샘플에 제공되고, (b) (i) 상기 제1 자극은 전압이고, 상기 제1 신호는 전기적 성질이고, 상기 제2 자극은 여기 (exciting) 방사선이고, 상기 제2 신호는 형광 강도이거나, 또는 (b) (ii) 상기 제1 자극은 여기 방사선이고, 상기 제1 신호는 형광 강도이고, 상기 제2 자극은 전압이고, 상기 제2 신호는 전기적 성질인 것인, 서열-특이적 혼성화를 분석하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2 자극이 적어도 부분적으로는 상기 제1 자극과 동시에 가해지는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 여기 방사선이 레이저 빔인 방법.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 표지가 에너지를 하나 이상의 다른 표지에 전달하여 상기 제1 신호 및 상기 제2 신호 중 하나 이상을 발생시키는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 표지가 화학발광 표지 또는 전기화학발광 표지인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 표지가 전자 스핀 표지인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 프로브 생중합체 서열 및 상기 표적 생중합체 서열이 핵염기 (nucleobase)를 포함하며, 상기 프로브가 상기 표적에 특이적으로 혼성화하여 이중체 (duplex)를 형성하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 프로브 생중합체 서열 및 상기 표적 생중합체 서열이 핵염기를 포함하며, 상기 프로브가 상기 표적에 특이적으로 혼성화하여 삼중체 (triplex)를 형성하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 프로브 생중합체 서열 및 상기 표적 생중합체 서열이 핵염기를 포함하며, 상기 프로브가 상기 표적에 특이적으로 혼성화하여 사중체 (quadruplex)를 형성하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 프로브가 하전되지 않은 주쇄, 부분적으로 하전된 주쇄, 양이온성 잔기, 가교결합제, 가교결합성 측쇄 및 핵염기 유사체 중 하나 이상을 포함하는 핵산 유사체인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 프로브 생중합체 서열 및 상기 표적 생중합체 서열 중 하나 이상이 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 추가 자극을 상기 제2 자극된 시험 샘플에 가하여 추가로 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
    상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 하나 이상의 추가의 신호를 상기 추가로 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계; 및
    상기 제1 신호, 상기 제2 신호 및 상기 하나 이상의 추가의 신호를 비교하여 상기 분석을 수행하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 자극, 상기 제2 자극 및 상기 하나 이상의 추가의 자극이 서로 상이한 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 제1 자극, 상기 제2 자극 및 상기 하나 이상의 추가의 자극 중 하나 이상이 비연속적으로 가해지는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 제1 자극 및 상기 제2 자극 중 하나 이상이 비연속적으로 가해지는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 프로브 및 상기 표적 중 하나 이상이 기재, 표면, 파티션 (partition), 막 또는 전극에 결합되는 것인 방법.
  27. 표적을 제공하는 단계;
    프로브를 제공하는 단계 (여기서, 상기 프로브 및 상기 표적 중 하나 이상은 하나 이상의 생중합체 서열을 포함함);
    상기 프로브 및 상기 표적을 결합 매질에 가하여 시험 샘플을 제공하는 단계;
    제1 자극을 상기 시험 샘플에 가하여 제1 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
    상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제1 신호를 상기 제1 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계;
    제2 자극을 상기 제1 자극된 시험 샘플에 가하여 제2 자극된 시험 샘플을 제공하는 단계;
    상기 프로브와 상기 표적 사이의 결합 친화도와 상관관계가 있는 제2 신호를 상기 제2 자극된 시험 샘플로부터 검출하는 단계; 및
    상기 제1 신호를 상기 제2 신호와 비교하여 분석을 수행하는 단계
    를 포함하며, 여기서 (a) 하나 이상의 표지가 상기 시험 샘플에 제공되고, (b) (i) 상기 제1 자극은 전압이고, 상기 제1 신호는 전기적 성질이고, 상기 제2 자극은 여기 방사선이고, 상기 제2 신호는 형광 강도이거나, 또는 (b) (ii) 상기 제1 자극은 여기 방사선이고, 상기 제1 신호는 형광 강도이고, 상기 제2 자극은 전압이고, 상기 제2 신호는 전기적 성질인 것인, 서열-특이적 혼성화를 분석하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 프로브 및 상기 표적 중 하나 이상이 단백질, 펩티드 또는 지질막인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 프로브 또는 상기 표적 중 하나는 생중합체가 아닌 것인 방법.
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