CN1671862A - 在不同条件下通过多重测定对生物聚合物结合进行匀相分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了匀相分析生物聚合物结合的方法，包括在向试验样品施加刺激之前，过程中和/或之后从试验样品获得信号并且使信号相互关联。强度大小与结合亲和力相关的信号可以为，例如，电导率和/或荧光强度。刺激可以为，例如，电压和/或激光辐射。优选的，测定不同类型的信号并且进行比较从而提高分析的可靠性。

Description

在不同条件下通过多重测定对 生物聚合物结合进行匀相分析
发明背景
发明领域
本发明涉及分析生物聚合物结合的方法，尤其是涉及分析探针和含有核碱基和/或氨基酸的靶结合的方法。
现有技术描述
多年以来人们已经明白可以通过向样品施加电场对生物分子进行分离和鉴定。
电泳可能是基于电场对于生物材料的作用最广为公知的分离和鉴定技术的例子。在凝胶电泳中，例如向聚丙烯酰胺施加电场由聚丙烯酰胺形成均一的介质或凝胶。上样到凝胶一端的混合物将根据它们的大小和与电场的相互作用迁移通过凝胶。依赖于物质的独特特征诸如构象，大小和电荷进行迁移。可通过改变凝胶的孔径大小，诸如，通过形成浓度或者pH梯度，或者通过改变缓冲液的组成(pH，SDS，DOC，甘氨酸，盐)影响迁移。在大多数研究实验室中，单向和双向凝胶电泳是相当常规的方法。靶物质可通过凝胶迁移和/或从凝胶中进行物理提取而加以纯化。
最近发展的将电场施加到生物样品的方法公开于授权给Stanley的美国专利5,824,477中。Stanley的专利公开了检测样品中预定核酸序列存在与否的方法。所述方法包括：(a)通过用电极对溶液中的样品施加电压的方法将样品双链核酸进行变性；(b)将变性的核酸与针对序列的寡核苷酸探针杂交；以及(c)鉴定杂交是否发生。Stanley的专利公开了对待分析样品施加电场目的仅仅是将靶序列变性。
一种更广为公知的杂交分析的类型是基于荧光标记试剂的使用。在它们最基本的形式中，以荧光强度为基础的分析通常包括将靶与含荧光团的探针接触，从结合的探针中去除未结合的探针，以及在洗涤后的样品中检测荧光。匀相分析方法改良了这些基本的分析方法，因为前者不需要洗涤的步骤或者不需要提供非-液相支持物。
基于荧光团能够结合在杂交复合体中核酸链之间，一些分析方法已经应用了嵌入荧光团以检测核酸杂交。
例如，授权给Burke等人的美国专利No.5,824,557公开了对核酸分子进行检测和定量分析的方法和试剂盒。优选的实施方案取决于将染料嵌入双链核酸螺旋或者单链核酸中。嵌入后，染料发荧光，并且强度为样品中存在的核酸量的直接测量值。虽然Burke等人的方法目的是用于测定样品中核酸的含量，但是该方法所基于的嵌入剂和核酸之间的非特异性结合使得该方法不能用于检测非特异性结合，尤其是在非靶核酸双链体存在的条件下。
授权给Ishiguro等人的美国专利No.5,814,447公开了一种分析方法，其目的在于改良基于嵌入剂和核酸双链体之间非特异性相互作用的分析方法，诸如Burke等人的分析方法，以及Ishiguro等人的较早描述于日本专利公开No.237000/1993的分析方法。早期的发展包括在通过PCR扩增靶核酸的特异性区域之前向样品溶液中加入在嵌入时有趋势显现荧光强度增加的嵌入荧光染料，以及在扩增前在给定时间间隔从反应液测定荧光强度以对靶核酸进行检测和定量分析。’447专利通过提供具有改良特异性的分析方法试图对早期的发展进行改良，其特征在于探针为用嵌入荧光染料标记的单链寡核苷酸，所述嵌入荧光染料将嵌入靶核酸和单链寡核苷酸探针之间的互补结合部分。
在正在进行的寻找更灵敏、准确和快速分析技术的过程中，一个研究组开发了包括分析电场对于核酸杂交双链体荧光强度的影响的测定方法。参见在1997年2月27日提交的美国专利申请No.08/807,901以及美国专利No.6,060,242。研究者指出一个碱基对错配双链体的荧光强度和完全匹配的双链体的荧光强度不同。因此，这些申请目的在于公开检测核酸序列的方法，其中在检测步骤之前或者同时向液体介质施加电场，并且以电场为函数检测荧光发射强度的改变来显示探针是否杂交到完全互补的核苷酸序列或者不完全互补的核苷酸序列。
尽管有了上述的发展，现有技术依然需要一种简单，高度灵敏，有效和快速的方法用于分析核酸和/或核酸类似物之间的相互作用。
所有在此引用的文献以其全文引作参考。
发明简述
本发明提供了分析序列特异性杂交的方法，包括：
提供含有至少一个靶生物聚合物序列的靶；
提供含有至少一个探针生物聚合物序列的探针；
向结合介质加入探针和靶以提供试验样品；
向试验样品施加第一种刺激以提供第一个刺激的试验样品；
从第一个刺激的试验样品检测第一个信号，其中第一个信号与探针和靶之间的结合亲和力相关；
向第一个刺激的试验样品施加第二种刺激以提供第二个刺激的试验样品；
从第二个刺激的试验样品检测第二个信号，其中第二个信号与探针和靶之间的结合亲和力相关；以及
比较第一个信号和第二个信号完成分析；
其中在试验样品中提供至少一种标记，并且第一个刺激，第二个刺激，第一个信号和第二个信号为电磁辐射，前提是当第一个刺激和第二个刺激为光子辐射时，在第一个刺激以后和第二个刺激以前向试验样品施加中间电子刺激，并且当第一个刺激和第二个刺激为电子辐射时，第一个信号和第二个信号为电流。
本发明还提供了分析序列特异性杂交的方法，所述方法包括：
提供靶；
提供探针，其中探针和靶中至少一种包括至少一种生物聚合物序列；
向结合介质加入探针和靶以提供试验样品；
向试验样品施加第一个刺激以提供第一个刺激的试验样品；
从第一个刺激的试验样品检测第一个信号，其中第一个信号与探针和靶之间的结合亲和力相关；
向第一个刺激的试验样品施加第二种刺激以提供第二个刺激的试验样品；
从第二个刺激的试验样品检测第二个信号，其中第二个信号与探针和靶之间的结合亲和力相关；以及
比较第一个信号和第二个信号完成分析；
其中在试验样品中提供至少一种标记，并且第一个刺激，第二个刺激，第一个信号和第二个信号为电磁辐射，前提是当第一个刺激和第二个刺激为光子辐射时，在第一个刺激以后和第二个刺激以前向试验样品施加中间电子刺激，并且当第一个刺激和第二个刺激为电子辐射时，第一个信号和第二个信号为电流。
附图简述
本发明将结合下列附图描述，其中同样的标号指定同样的元件，以及其中：
图1A和2B表示以时间和互补性为函数的电流强度；
图1C和1D表示以温度和互补性为函数的电流强度；
图2A、2B、2C、3A和3B表示以温度、互补性和其他因素为函数的电流强度；
图4表示以时间和互补性为函数的电流强度；以及
图5A、5B、5C和6为表示荧光强度的图谱。
发明详述
本发明提供快速、灵敏、环保和安全的方法，用于分析靶和探针之间的结合，其中靶包括核酸序列或核酸类似物序列并且探针包括核酸序列或核酸类似物序列。本发明的分析方法也适用于分析靶和探针之间的结合，其中靶和/或探针包括氨基酸序列。因此，本发明也适用于分析生物聚合物的结合，此处所述的生物聚合物是指含有至少两个氨基酸，氨基酸类似物，核酸，核酸类似物和/或它们各自的组合的序列。
与某些现有技术分析不同，本发明不仅检测特异性结合的存在，而且提供有关探针和靶之间结合性质的定性和定量信息。因此，在包括核碱基和核碱基结合分析的实施方案中，本发明使操作者能够区分完全匹配、一个碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、一个碱基对缺失、两个碱基对缺失和三个碱基对缺失。
本发明的实施方案包括对照其他探针与相同类型的靶结合所显示的相同类型的信号来校正第一探针-靶混合物的测定信号(例如，电流强度和/或荧光强度)，其中其他探针各自与第一探针有至少一个碱基的区分。
在特定实施方案中，在测定上述信号之前或者同时向样品施加低电压，电压的选择高到足以使不完全匹配的杂交配对体不稳定，但是又不足以使完全匹配的杂交配对体不稳定。在特定优选的实施方案中，电压为大约1V到大约20V。
形成校正曲线，其中测定信号(例如，电流和/或荧光强度)的大小是靶和探针之间结合亲和力的函数。在核碱基-核碱基的分析中，由于靶和多个不同探针之间的结合亲和力随着错配碱基数、错配的性质(A-G对A-C对T-G对T-C等)、杂交复合体内错配位置等而变化等，因此本发明的分析可用于测定靶的序列。
测定的信号可以是，例如，电导率。在这样的实施方案中，探针和靶之间的结合亲和力直接相关于信号的大小。换言之，随着探针和靶之间的匹配程度提高，优选包括0-2个错配和/或缺失的范围，更优选包括0-3个错配和/或缺失的范围，电导率增加。
在其它实施方案中，所测定的信号可以是测试样品中所含荧光团的荧光强度。在这样的实施方案中，探针和靶之间的结合亲和力可以与强度正相关或负相关，这依赖于荧光团是否通过信号猝灭或信号放大对杂交发信号。因此，嵌入剂所产生的荧光强度可以与探针-靶结合亲和力正相关，而在利用非嵌入荧光团共价结合探针的优选实施方案中，强度可以与探针-靶结合亲和力负相关。随着探针和靶之间的匹配程度提高，优选包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选包括0-3个错配和/或缺失的范围内，荧光强度增加(或对于非嵌入剂而言荧光强度降低)。
虽然本发明的发明者以前公开了荧光强度测定用于分析含核碱基序列杂交的优点(参见美国专利申请No.09/468,679，在1999年12月21日提交)以及荧光强度测定用于分析肽：核酸结合(参见美国专利申请No.09/224,505，在1998年12月31日提交)和肽：肽结合(参见美国专利申请No.09/344,525，在1999年6月25日提交)的优点，但是向样品施加电场显示测定分辨率的提高，如下面的实施例6所示。
此外，在本发明尤其优选的实施方案中，分析包括测定样品的至少两种信号。第一个信号优选为荧光强度，第二个信号优选自多个电导率的测定值(反之亦然)。
在优选的多重测定实施方案中，第一个信号可以和第二个信号相同或者不同。当测定的第一个信号和第二个信号相同时，可以对照第一个信号和/或用于校准第一个信号的相同参考信号校准第二个信号。此外，在第一个信号测定之后和第二个信号测定之前向试验样品施加至少一种条件改变的刺激。刺激优选足以改变结合到可测定的程度，如至少一个信号所显示的。在本发明核碱基-核碱基结合试验中，刺激优选足以显著影响探针和靶之间的不完全互补杂交，并且不足以显著影响探针和靶之间的完全互补杂交。
在本发明的特定实施方案中，施加一次或者多次至少一种刺激。刺激可被持续施加或者非持续施加。可以在信号检测之前，过程中和/或之后施加刺激。
合适的刺激可以为，例如光子辐射(诸如，激光)和/或电子。检测到的信号可以为，例如光子和/或电子等。
例如，在本发明尤其优选的实施方案中，第一个检测信号为加电前的荧光强度(即，在向试验样品施加条件改变的电压之前测定的强度)并且第二个检测信号为加电后的荧光强度(即，在向试验样品施加条件改变的电压过程中或者之后测定的强度)。
上述实施方案的其它测定提高了分析的可靠性并且能够立即重复测定可疑的结果。至少两次测定结果不一致通常需要重复测定。
本发明能够定量检测探针和靶之间的结合亲和力。这种信息对各种用途是有价值的，包括设计具有优化结合特征的反义药物。
与现有技术方法不同，本发明分析优选是匀相的。该分析的进行无需在检测测定信号大小之前从游离探针和靶中分离出探针-靶复合体。该分析也无需凝胶分离步骤，由此使得测试通量大幅提高。定量分析简便而准确。结果，结合分析节省大量时间和花费，并且可容易加以自动化。另外，其还使得结合变量快速确定，这些变量如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列长度以及可能的必要辅助因子。
分析可在例如不可渗透表面或生物芯片上的孔内的溶液中进行。
此外，本发明分析的进行优选无需在靶或探针上提供信号猝灭剂。
本发明的优选实施方案特异性检测探针和双链靶之间的三链体和/或四链体杂交，由此排除使靶变性的需要。通过在待检测样品中加入嵌入剂可以提高三链体和四链体的形成和/或稳定性。参见，例如在2001年6月20日提交的美国专利申请No.09/885,731，和在2001年7月20日提交的美国专利申请代理人卷号E1047/20057，名称为“平行或反平行，同源或者互补结合核酸或者其类似物以形成双链体，三链体或者四链体复合体(PARALLEL OR ANTIPARALLEL，HOMOLOGOUS OR COMPLEMENTARY BINDING OF NUCLEICACIDS OR ANALOGUES THEREOF TO FORM DUPLEX，TRIPLEXOR QUADRUPLEX COMPLEXES)”。
用于本发明分析的适当的含核碱基探针包括例如ssDNA、RNA、PNA和其他不带电荷或带部分电荷的主链的核酸类似物。虽然反平行探针在特定的实施方案中是优选的，但是探针也可以是平行的。优选任意长度为8-20个碱基的探针序列，因为这是原核生物和真核生物中所发现的最小的独特DNA序列的范围。特别优选探针为12-18个碱基，因为这是人基因组中独特序列的最小长度。在实施方案中，6-30个碱基的探针是最优选的。然而，多个较短探针可用来检测其中具有多个非独特靶序列的核苷酸序列，它们结合以独特地识别核苷酸序列。探针长度可加以选择来匹配靶的长度。
适当的含氨基酸探针可包括单个氨基酸，单个氨基酸的类似物，类似肽的类似物，peptidoid，拟肽(peptidomimetic)，肽，二肽，三肽，多肽，蛋白或者多蛋白复合体。
本发明不要求采用放射性探针，其使用是危险、烦琐和耗时的，并且需要不断地再生。本发明的探针优选使用安全，并且常年稳定。因此，探针可以大量制备或预订和储存。
在本发明的靶含有氨基酸的实施方案中，靶优选包括肽序列或者类似肽的类似物序列，诸如，例如，二肽、三肽、多肽、蛋白或者多蛋白复合体。更优选的，靶为具有至少一个探针受体位点的蛋白。
在本发明的靶含有核碱基的实施方案中，靶的优选长度为8-3.3×109个碱基对长，并且可以为核酸和/或其类似物的单链或者双链序列。
优选的情况是，探针和靶未标记，但是在选择的实施方案中，有嵌入剂共价结合到探针上。在这样的实施方案中，嵌入剂优选结合到探针的两端。
在其它实施方案中，嵌入剂没有共价结合到探针上，虽然它可以在分析过程中自身插入到探针和靶之间，而是以非共价的方式有义结合到探针上。
本发明使用的优选嵌入剂包括，例如，YOYO-1、TOTO-1、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2和吖啶。通常，嵌入剂为能够嵌入双链体，三链体和/或四链体核酸复合体的链之间的部分。在优选的实施方案中，嵌入剂(或者其组分)在不存在核酸时通常不发荧光，而当嵌入并受到合适波长的照射激发时而发荧光，当嵌入双链体或三链体核酸复合体时，表现出100倍到10000倍的荧光增强。
在其它实施方案中，嵌入剂根据嵌入和通过合适的波长照射激发表现出荧光波长的位移。准确的荧光波长将依赖于嵌入的核酸的结构，例如DNA对RNA，双链体对三链体等进行确定。
选择激发波长(通过常规实验和/或常识)，以对应于在用荧光团的激发最大值，优选地是200-1000nm。优先选择的嵌入剂具有200-1000nm的辐射波长。在优选的实施方案中，氩离子激光器用来照射荧光团，光的波长范围是400-540nm，并在500-750nm的范围内检测荧光辐射。
本发明分析可以在各种温度下进行，如5-85℃。现有技术的某些分析需要提高的温度、增加成本和延迟测定。然而，本发明在室温或低于室温(例如低于25℃)下进行。
本发明分析是极其灵敏的，从而排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，在至少是荧光强度的实施方案中，可以分析具有约20微升体积的测试样品，其含有约10fmol的靶和约10fmol的探针。本发明的实施方案是灵敏的，足以测定浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的靶。本发明的实施方案是灵敏的，足以利用浓度为5×10-9M、优选不超过5×10-10M的探针。
电导率的测定能够区分在40微升中具有少到大约1pmole的探针和1pmole靶的样品。样品体积减少可以使用甚至更少量的探针和靶。
不用多说上述的值并不是意味着所述方法不能检测更高的浓度。
在测试的探针和靶的每个浓度下，可以使用浓度范围很大的嵌入剂。例如，当5×10-10M的探针和5×10-10M的靶杂交时，嵌入剂YOYO-1的最适浓度范围从25nM到2.5nM。在探针和靶的浓度均为5×10-8M下，优选YOYO-1的浓度范围是从1000nM到100nM。
本发明的分析方法足够灵敏能够从两个碱基对错配的探针-靶复合体区分一个碱基对错配的探针-靶复合体，并且优选从三个碱基对错配的探针-靶复合体区分两个碱基对错配的探针-靶复合体。当然，本发明的分析足够灵敏能从上述任何错配的复合体中区分完全匹配的探针-靶复合体。
结合介质可以是任何传统的公知适合保存核苷酸和/或蛋白的介质。例如参见，Sambrook等人的“Molecular Cloning：A Lab Manual，”Vol.2(1989)。例如液体介质可包含核苷酸，水，缓冲液和标准盐浓度。
互补碱基之间的杂交可以发生在多种条件下，条件变化包括温度，盐浓度，静电强度和缓冲液组成。用于应用这些条件和方法的例子是本领域公知的。
优选在大约15到大约25℃的温度下，杂交复合体形成大约1分钟到大约5分钟。无需较长的反应时间，但是温育几个小时对杂交复合体并无不利影响。
尽管不需要，尤其是对于含有嵌入剂的实施方案而言，通过使用特定的试剂可以促进溶液中的杂交。这些试剂的优选例子包括单链结合蛋白质如Rec A蛋白质、T4基因32蛋白质、大肠杆菌单链结合蛋白质、大或小核酸沟结合蛋白质、二价离子、多价离子、紫罗碱和其它嵌入物质如溴化乙锭、放线菌素D、补骨脂内酯和当归根素。这样的促进剂可以证明在极端操作条件，例如在异常pH水平或极端高温下是有用的。
本发明的分析可以用于例如鉴定折叠的核苷酸序列中可接近的区域、确定杂交复合体中错配碱基对的数目，以及对基因组作图。
在利用嵌入剂检测荧光强度的实施方案中，随着探针和靶之间结合亲和力的增加而强度增加。在利用非嵌入荧光团检测荧光强度的实施方案中，随着探针和靶之间结合亲和力的增加而强度降低。不管是否存在荧光团的嵌入，与荧光各向异性的方法不同，本发明的方法不需要在测定荧光的极化强度。
参照下列实施例，本发明将更详细加以说明，但应理解本发明不视为受限于此。
实施例
实施例1
有义和反义50聚体ssDNA靶序列衍生自人囊性纤维化基因的外显子10[Nature 380，207(1996)]，经DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成并通过HPLC纯化。将等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃变性10分钟，并且随着温度在1.5小时冷却至21℃逐渐退火。把双链DNA(dsDNA)寡核苷酸以浓度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：1)为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：1)解链温度(Tm)为65.2℃。
SED ID NO：2为50聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置507上有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上野生型有义链序列CAT变为C GT。
SEQ ID NO：2的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT C GT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：2的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA  CGA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：2)解链温度(Tm)为66.0℃。
SED ID NO：3为50聚体的突变dsDNA靶序列，与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同，除了在氨基酸位置506和507上有两个连续碱基对突变(下划线)以外，在这两个位置上野生型有义链序列CAT变为 ACT。
SEQ ID NO：3的有义链的序列为：
5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT  ACT CTT TGG TGT TTCCTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：3的反义链的序列为：
5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA  GTA TAT TTTCTT TAA TGG TGC CA-3’。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：3)解链温度(Tm)为65.2℃。
合成实施例中使用的PNA探针，进行HPLC纯化并通过Commonwealth Biotechnologie，Inc.(Richmond，VA，USA)的质谱进行鉴定。PNA探针首先溶于0.1％的TFA(三氟乙酸)至浓度为10mg/ml，然后通过加入ddH2O稀释到1mg/ml。终PNA储液在ddH2O中以浓度为1pmole/μl制备。
探针1号为15聚体反平行PNA探针，设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的有义链的15个核苷酸区段完全互补，在氨基酸位置505-510重叠[Nature 380，207(1996)]。探针具有下列结构(SEQID NO：8)：
5’-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH2-3’。
杂交反应混合物(80μl)含有如下成分：2pmole的靶dsDNA，2pmole的PNA探针，0.5×TBE和250nm的DNA嵌入剂YOYO-1(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)。样品放置在3mm的石英比色杯中，然后进行1或者5伏的DC(V)加电15秒钟。电流分析为当对溶液施加电压时监控电流。在每个溶液中放置温度探针测定电流测定时的温度。在1伏时，在加电的最初2秒钟内观察到电流峰。在随后的13秒钟期间电流急剧下降。施加5伏的试验所产生的电流在整个加电期间(15秒钟)保持相对稳定。
进行一系列试验，其中当没有DNA或者PNA存在时(对照)，或者当野生型SEQ ID NO：1、突变体SEQ ID NO：2或突变体SEQ IDNO：3与反平行的一号PNA探针反应时，观察到电导率的值。图1A和1B表示从每个实验中获得的电导率的数据的值。图1A显示施加1V电压的结果，图1B显示施加5V电压的结果。由完全匹配的互补序列(SEQ ID NO：1+1号探针)组成的双链DNA：PNA杂交三链体允许在整个15秒钟1V电压施加的过程中最大程度的嵌入YOYO-1，产生最高的电导率值(在图中表示为负电流值)。带有1bp错配dsDNA(SEQID NO：2+1号探针)和带有2bp错配dsDNA(SEQ ID NO：3+1号探针)的反平行PNA探针的三链体杂交的归一化峰电导率在第一个两秒钟的电压施加期间分别比完全匹配的dsDNA：PNA三链体杂交(SEQ IDNO：+1号探针)观察到的值低79％和96％(图1A)。当将整个15秒钟的电压施加期间电导率值平均获得完全匹配的三链体和含有碱基错配的三链体之间电导率降低的百分比相类似。在图1A中，1bp和2bp错配的dsDNA：PNA杂交产生的平均电导率值分别比那些完全匹配的dsDNA：PNA杂交体低65％和91％。所有在图1A中表示的试验均在室温下(23℃)进行。随着探针和双链靶之间错配程度的加大，YOYO-1的嵌入水平降低并且电导率的水平下降。当重复上述实验并且施加更高的电压(5V)时也观察到这些关系。在施加5V电压期间，1bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)和2bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)的归一化平均电导率值分别比完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)观察到的值低52％和67％(图1B)。在图1B中表示的试验在室温(23℃)进行。
当将温度升高到50℃和65℃重复试验时，观察到类似的电流值。在50℃，向完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：1+1号探针)施加1V的电压15秒钟产生的平均电流为-0.25μAmp，相比之下，1bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)和2bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)分别产生-0.15μAmp(降低40％)和-0.06μAmp(降低76％)(图1C)。在65℃，当施加1V的电压15秒时观察到类似的结果。完全匹配的核酸杂交体产生的平均电流为-0.37μAmp，相比这下，1bp和2bp错配杂交体分别产生-0.16μAmp(降低57％)和-0.01μAmp(降低97％)(图1C)。在高温下施加5伏的电压产生类似的结果。虽然在50℃进行的试验对于完全匹配的杂交体，1bp错配的杂交体和2bp错配的杂交体产生的平均电流分别为-0.27mAmp，-0.13mAmp(降低52％)和-0.08mAmp(降低70％)，而在65℃进行的试验对同样3个组产生的平均电流值分别为-0.31mAmp，-0.14mAmp(降低55％)，以及-0.10mAmp(降低68％)(图1D)。对于所有上述试验而言，在dsDNA与反平行的PNA1号探针杂交形成三链体之前dsDNA没有变性。
在杂交混合物加热到65℃并且立即冷却以后，在不同温度进行类似的试验。冷却到室温(23℃)以后，向完全匹配的样品(SEQ ID NO：1+1号探针)施加1V的电压15秒钟产生-0.18μAmp的平均电流强度。相比之下，对1bp错配的dsDNA：PNA三链体杂交体(SEQ ID NO：2+1号探针)和2bp错配的dsDNA：PNA三链体杂交体(SEQ ID NO：3+1号探针)分别观察到-0.06μAmp(降低67％)和-0.05μAmp(降低72％)的平均电流值(数据未显示)。当样品从65℃冷却到50℃时，随后施加1V的电压15秒钟，观察到类似的结果。完全匹配的样品(SEQ IDNO：1+1号探针)产生-0.23μAmp的平均电流强度，相比之下，1bp和2bp的错配样品分别为-0.11μAmp(降低52％)和-0.01μAmp(降低96％)(数据未显示)。当冷却到23℃或50℃以后施加5V的电压时，完全匹配的杂交体(SEQ ID NO：1+1号探针)，1bp错配的三链体杂交体(SEQ ID NO：2+1号探针)和2bp错配的三链体杂交体(SEQ IDNO：3+1号探针)产生的平均电流强度在23℃分别为：-0.15mAmp，-0.09mAmp(降低40％)，以及-0.07mAmp(降低53％)，在50℃分别为-0.23mAmp，-0.09mAmp(降低61％)，以及0.09mAmp(降低61％)(数据未显示)。
当在23℃或者50℃(没有在65℃预热)直接测定，并使用反平行的PNA探针时，在65℃(50聚体dsDNA序列的解链温度)随后冷却的杂交混合物的预处理没有显著影响在完全互补的dsDNA：PNA三链体和那些含有1或者2bp错配的三链体之间观察到的电导率差异。显而易见，在存在DNA嵌入剂YOYO-1的情况下反平行的PNA探针能够与dsDNA靶形成三链体结构。施加低水平的电压(诸如1V或者5V)能够在不对序列事先变性的情况下从那些含有1bp或2bp突变的三链体中区分出完全匹配的dsDNA：PNA三链体。
实施例2
图2表明当使用的PNA探针与靶DNA序列方向平行时，本发明的电流分析方法也能够区分完全匹配的dsDNA：PNA三链体和含有1bp或2bp错配的三链体。2号探针是在序列上与1号探针相同的15聚体，但是合成为匹配靶DNA的平行方向，而非传统的反平行的方向。2号探针具有下列结构(SEQ ID NO：9)：
5’-H-TAT AGT AGA AAC CAC-Lys-CONH2-3’
用与实施例1描述的相同分析条件进行试验，唯一的区别在于2号探针代替1号探针使用。当施加1伏电压时，1bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+2号探针)和连续2bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+2号探针)的平均电流强度比在匹配温度下由完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：1+2号探针)所观察到的在23℃分别低25％和32％，在50℃分别低30％和23％，以及在65℃分别低28％和53％(图2A)。
当施加5V(而非1V)的电压15秒钟时，获得类似的结果。完全匹配dsDNA：PNA杂交体在23℃，50℃和65℃分别产生-0.15mAmp，-0.24mAmp以及-0.17mAmp的平均电流强度(图2B)。带有1bp错配和2bp错配的不完全互补三链体产生的平均电流比完全匹配的杂交样品获得的平均电流在23℃分别低27％(-0.11mAmp)和53％(-0.07mAmp)，在50℃分别低21％(-0.19mAmp)和46％(-0.13mAmp)，以及在65℃分别为未改变(-0.17mAmp)和低18％(-0.14mAmp)(图2B)。
在图2A和2B中显示的结果表明当使用平行PNA2号探针时，在完全匹配的dsDNA：PNA三链体和那些含有1bp或2bp错配的三链体之间获得的电导率的差异显著低于用反平行的PNA1号探针获得电导率差异(图1)。
但是，包括平行2号探针和在将样品加热到65℃然后立即冷却后施加5V电压的实验中公开了电流的测定，所述测定值表明在完全匹配的dsDNA：PNA三链体和含有1bp或2bp错配的dsDNA：PNA三链体之间信号差别的增加(图2C)。完全匹配的杂交体(SEQ ID NO：1+2号探针)，1bp错配的杂交体(SEQ ID NO：2+2号探针)和2bp错配的杂交体(SEQ ID NO：3+2号探针)产生的平均电导率值在23℃分别为：-0.19mAmp，-0.08mAmp以及-0.06mAmp，在50℃分别为-0.17mAmp，-0.09mAmp以及0.07mAmp，以及在65℃分别为-0.23mAmp，-0.13mAmp以及0.08mAmp。1bp和2bp错配的样品当与完全互补样品获得的值相比，解释为导电率在23℃分别降低58％和68％，在50℃分别降低47％和59％，以及在65℃分别降低43％和65％(图2C)。
因此，在电流分析方法中，反平行和平行的PNA探针均能够区分完全互补的dsDNA靶和含有1bp或2bp突变的不完全互补的dsDNA靶。
实施例3
探针3号为15聚体ssDNA探针，其在序列和方向上与15聚体的反平行的PNA1号探针(SEQ ID NO：8)相同。3号探针具有如下结构：
5’-CAC CAA AGA TGA TAT-3’。
在不存在事先变性的条件下，通过ssDNA探针3号与50聚体野生型和突变dsDNA靶序列的反应，进一步研究电流分析的特异性。分析条件与实施例1中所述的相同。
通过DNA嵌入剂YOYO-1的促进，dsDNA：ssDNA三链体在30℃到65℃之间的温度下形成。在1伏电压处理后，由SEQ ID NO：1+3号探针组成的完全匹配的DNA三链体产生最高的导电率值(图3A)。相比之下，产生1bp错配(SEQ ID NO：2+3号探针)，和连续2bp错配(SEQ ID NO：3+3号探针)的不完全互补的探针和靶结合产生的平均电导率值比在匹配温度下由完全互补的序列观察到的在23℃分别低14％和64％，在50℃分别低30％和70％，以及在65℃分别低25％和72％(图3A)。向这些样品施加更高的电压(5V)导致完全匹配和错配的样品之间所观察到的电流分析差异比在1V电压，尤其是在低温下获得的差异更大。当5V处理15秒钟以后，1bp错配的DNA三链体和2bp错配的DNA三链体的平均电流强度比在匹配温度下由完全匹配的DNA三链体所观察到的，在23℃分别低54％和78％，在50℃分别低68％和70％，以及在65℃分别低33％和61％(图3B)。
在类似的电学实验中，杂交混合物加热到65℃，并在施加1V或者5V的电压之前保持在这个温度或者立即冷却到50℃或者23℃。对完全匹配的DNA三链体序列(SEQ ID NO：1+3号探针)进行15秒钟的1伏电压处理，在23℃，50℃和65℃产生最高的电导率值(图3A)。含有1bp错配(SEQ ID NO：2+3号探针)或者2bp错配(SEQ ID NO：3+3号探针)的DNA三链体的导电率值在23℃分别低21％和63％，在50℃分别低18％和74％，以及在65℃分别低12％和106％(图3A)。同样，当向预处理的样品施加的5V电压15秒钟时，1bp错配的DNA三链体和2bp错配的DNA三链体的平均电导率值比完全匹配的DNA三链体所产生的平均电导率值，在23℃分别降低24％和104％，在50℃分别降低42％和44％，以及在65℃分别降低38％和102％(图3B)。
反平行的PNA探针(图1)和ssDNA探针(图3)在电流分析中表现出类似的方式，此观察结果显示用作探针的核酸实体并非特别重要。YOYO-1的存在使得dsDNA靶和ssDNA探针形成能够根据溶液中靶和探针之间序列互补性的水平产生不同电荷的三螺旋构型。随着探针和靶之间错配水平的增加，导电率的水平降低，证明在不存在事先变性的条件下使用天然DNA探针时电流分析方法可靠。
实施例4
在实施例1到3所述的电流分析中，向含有杂交混合物的溶液中加入DNA嵌入剂YOYO-1。YOYO-1的嵌入促进了dsDNA：PNA三链体和dsDNA：ssDNA三链体的形成。在电流分析中，利用共价结合到ssDNA探针的嵌入剂部分的可能性在实施例4中进行评价。
吖啶是一种可替代的dsDNA嵌入剂，也具有嵌入三链体核酸结构的能力，从而稳定三链体螺旋的形成。参见例如，Kukreti等人的“适用于三螺旋形成的DNA序列范围的延伸：通过含吖啶寡核苷酸稳定错配的三链体(Extension of the range of DNA sequences available fortriple helix formation：stabilization of mismatched triplexes by acridine-containing oligonucleotides)”，25 Nucleic Acids Research 4264-4270(1997)。共价结合到3’末端的含有吖啶分子(Glen Research，Sterling，VA，USA)的ssDNA探针在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptiveBiosystems)上合成并通过HPLC纯化。
探针4号为15聚体ssDNA探针，在序列和方向上与15聚体的3号探针相同(因此在序列和方向上也与15聚体的反平行的PNA1号探针(SEQ ID NO：8)相同)，只是在3’位置加入吖啶部分。该探针具有如下结构：
5’-CAC CAA AGA TGA TAT-吖啶-3’。
杂交反应混合物(80μl)含有如下成分：2pmole的靶dsDNA，2pmole的ssDNA4号探针及0.5×TBE。样品放置在3mm的石英比色杯中，然后在23℃进行5伏的DC加电11秒钟。如实施例1所述监控电流和温度。
如图4所示，由于稳定嵌入共价结合的吖啶部分，ssDNA4号探针能够与50聚体完全匹配的dsDNA靶(SEQ ID NO：1)杂交，产生-0.53mAmp的平均电流。通过比较，含有1bp错配(SEQ ID NO：2+4号探针)或者2bp错配(SEQ ID NO：3+4号探针)的较不稳定的DNA三链体产生的平均电流比完全匹配的DNA三链体产生的平均电流值，当用对照(不含靶DNA的4号探针)归一化时，分别低52％和66％。
因此，在形成三重DNA螺旋的过程中，连接到ssDNA探针的吖啶与未束缚的YOYO-1一样有效，所述三重DNA螺旋根据在电流分析中靶和探针之间序列互补性的水平产生不同的电流。
实施例5
有义和反义15聚体ssDNA靶序列衍生自人囊性纤维化基因的外显子10，如实施例1所述加以合成，纯化并退火。把dsDNA寡核苷酸以浓度1pmole/μl溶解在ddH2O中。
SEQ ID NO：4为15-聚体的dsDNA靶序列，来自SEQ ID NO：1，设计为与1号探针完全互补。
野生型靶DNA的有义链序列(SEQ ID NO：4)为：5′-ATA TCA TCTTTG GTG-3′。
野生型靶DNA的反义链序列(SEQ ID NO：4)为：5′-CAC CAA AGATGA TAT-3′。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：4)解链温度(Tm)为40.0℃。
SEQ ID NO：5为15-聚体的突变体dsDNA靶序列相同于野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)，除了有一个碱基对的突变(下划线)，在此序列TTT变为T AT。
突变体靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：5)为：
5′-ATA TCA TCT  ATG GTG-3′。
突变体靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：5)为：
5′-CAC CA T AGA TGA TAT-3′。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：5)解链温度(Tm)为40.0℃。
SEQ ID NO：6为15-聚体的突变体dsDNA靶序列相同于野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)，除了有连续两个碱基对的突变(下划线)，在此序列ATC变为 GGC。
突变体靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：6)为：
5′-ATA TC G  GCT TTG GTG-3′。
突变体靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：6)为：
5′-CAC CAA AG C  CGA TAT-3′。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：6)解链温度(Tm)为44.0℃。
SEQ ID NO：7为15-聚体的突变体dsDNA靶序列相同于野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)，除了有三个单独的碱基对的突变(下划线)，其中三个1bp的突变分别被三个碱对彼此分开。序列ATC，TCT和TGG分别变为A CC，T AT和T AG。
突变体靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：7)为：
5′-ATA  CCA T AT TT A GTG-3′。
突变体靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：7)为：
5′-CAC  TAA A TA TG G TAT-3′。
预测的dsDNA(SEQ ID NO：7)解链温度(Tm)为38.0℃。
杂交反应混合物(80μl)含有如下成分：2pmole的靶dsDNA，2pmole平行PNA 2号探针，0.5×TBE和250nM的DNA嵌入剂YOYO-1。反应混合物在95℃下温育5-10分钟进行变性，然后保持在65℃直至分析。将样品放置在石英比色杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且在65℃检测荧光辐射。将软件控制的温度探头直接放入每个样品中，获得即时的温度测定值。最大荧光强度发生在在536nm波长处，指示YOYO-1嵌入到PNA：DNA杂交体中。作为在每种样品的最初激光照射以后的第二个分析，相同的样品利用1V DC加电4秒钟。在加电的最后一秒期间，样品用氩离子激光第二次照射，并且在65℃检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。
由完全互补序列(SEQ ID NO：4+2号探针)组成的ssDNA：PNA杂交体使得最大化嵌入YOYO-1，产生最高的荧光强度(图5A)。1bp错配的ssDNA：PNA杂交体(SEQ ID NO：5+2号探针)，连续2bp错配的ssDNA：PNA杂交体(SEQ ID NO：6+2号探针)以及分隔的3bp错配的ssDNA：PNA杂交体(SEQ ID NO：7+2号探针)的荧光强度都比完全匹配的ssDNA：PNA杂交体在65℃观察到的荧光强度低(图5，数据未显示)。随着探针和靶之间错配率的增加，YOYO-1的嵌入水平降低，并因此荧光强度的水平降低。当没有DNA或者PNA存在时(只有YOYO-1)，仅仅观察到背景水平的荧光(图5A)。
当对完全匹配的ssDNA：PNA杂合体在65℃施加1V的电压4秒钟时，荧光强度保持相对稳定，仅仅降低2％(图5A)。相反，对含有1bp错配(图5B)，2bp错配(图5C)和3bp错配(数据未显示)的不完全互补的双链体施加1V电压产生的荧光强度比在缺乏电流的情况下用相同的样品获得的荧光强度分别低18％，39％和71％。用低水平电流(如1V)处理进一步减少了含有bp错配的ssDNA：PNA杂合体的稳定性。随着在探测和靶之间序列互补性程度的降低，在施加电压的情况下荧光强度的水平剧烈减少，提供了高度可靠的和准确的第二种分析方法以将完全配对序列和那些含有1bp，2bp或者3bp突变的序列区分开来。
实施例6
实施例5中的杂交分析在dsDNA靶序列变性以后进行，并且在高于dsDNA靶的解链温度(Tm)的温度下测量ssDNA：PNA形成。实施例6将阐述不需要事先变性作用，在不存在和存在施加电压的情况下将完全匹配和碱基对错配区分开的荧光强度分析的可靠性。
杂交反应混合物(80μl)含有如下成分：4pmole的靶dsDNA，4pmole的反平行PNA1号探针，0.5×TBE和250nM的DNA嵌入剂YOYO-1。将样品放置在石英比色杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射80msec，并且在23℃检测荧光辐射。将软件控制的温度探头直接放入每个样品中，获得即时的温度测定值。最大荧光强度发生在在536nm波长处，指示YOYO-1嵌入到PNA：DNA杂交体中。作为在最初激光照射每种样品以后的第二个分析，相同的样品利用20VDC加电4秒钟。在加电后的3秒，样品立即用氩离子激光第二次照射样品80msec，并且在23℃检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。
通过嵌入剂YOYO-1的促进，在23℃形成dsDNA：PNA三链体。当野生型50聚体的dsDNA靶序列(SEQ ID NO：1)与15聚体的反平行的PNA 1号探针杂交时，产生最高的荧光强度(图6)。通过比较，1bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)，以及连续2bp错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)的荧光强度比完全匹配的dsDNA：PNA三链体在23℃观察到的荧光强度分别低60％和91％(图6)。当没有DNA或者PNA存在于含YOYO-1的反应混合物中时，仅仅观察到背景水平的荧光。
由完全互补的三链体和那些含有1bp或2bp错配的三链体获得的荧光强度的差别远远大于完全匹配的双链体和不完全互补的双链体获得的结果(比较图5和6)。显然，三链体形成的荧光强度分析具有很强的分辨率能够检测碱基的错配。
此外，通过第二次施加电压甚至有可能进一步区分野生型和突变序列。对完全匹配的dsDNA：PNA三链体施加20V的电压3秒钟产生的荧光强度光谱大体上与未施加电压的同样样品所产生的荧光强度相同(图6)。但是，对不完全互补的含有1bp错配和2bp错配的三链体施加20V的电压3秒钟，产生的荧光强度比在缺乏电压的情况下用相同样品获得的荧光强度分别低23％和71％(图6)。20电压的处理没有影响完全互补三链体的稳定性，但是根据探针和靶之间序列互补性的水平削弱了含有碱基对错配的dsDNAP：PNA三链体的稳定性。因此，向荧光强度的分析中施加电压，提供了不需事先对序列进行变性的更高度可靠的分析方法，以将野生型序列和那些含有1bp或者2bp突变的序列区分开来。
当本发明参照其特定的实施例已详细加以描述后，在不背离本发明实质和范围的情况下，本领域的专业技术人员可作出各种各样的变化和修改将是一目了然的。
                           序列表
<110>英詹尼斯公司(INGENEUS CORPORATION)
<120>在不同条件下通过多重测定对生物聚合物结合进行匀相分析
     (HOMOGENEOUS ASSAY OF BIOPOLYMER BINDING BY
     MEANS OF MULTIPLE MEASUREMENTS UNDER VARIED CONDITIONS)
<130>SCT040188-47
<140>
<141>
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>1
tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>2
tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>3
tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>4
atatcatctt tggtg 15
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>5
atatcatcta tggtg 15
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>6
atatcggctt tggtg 15
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>7
ataccatatt tagtg 15
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：ssDNA探针，其中各个碱基的3′端与赖氨酸N-端共价结合，留下游
     离羧基
<400>8
 caccaaagat gatat 15
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：ssDNA探针，其中各个碱基的3′端与赖氨酸N-端共价结合，留下游
     离羧基
<400>9
tatagtagaa accac

Claims (29)

1.一种分析序列特异性杂交的方法，所述方法包括：
提供一种包括至少一个靶生物聚合物序列的靶；
提供一种包括至少一个探针生物聚合物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入到结合介质以提供一种试验样品；
向所述试验样品施加第一个刺激以提供第一个刺激的试验样品；
从所述第一个刺激的试验样品检测第一个信号，其中所述第一个信号与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关；
向所述第一个刺激的试验样品施加第二个刺激以提供第二个刺激的试验样品；
从所述第二个刺激的试验样品检测第二个信号，其中第二个信号与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关；以及
比较所述第一个信号和所述第二个信号以完成所述分析；
其中在所述试验样品中提供至少一种标记，并且所述第一个刺激，所述第二个刺激，所述第一个信号和所述第二个信号为电磁辐射，前提是当所述第一个刺激和所述第二个刺激为光子辐射时，在所述第一个刺激以后和所述第二个刺激以前向所述试验样品施加中间电子刺激，并且当所述第一个刺激和所述第二个刺激为电子辐射时，所述第一个信号和所述第二个信号为电流。
2.权利要求1的方法，其中所述第一个刺激为光子的，而所述第二个刺激为电子的。
3.权利要求1的方法，其中所述第一个刺激为光子的，以及所述第二个刺激为光子的。
4.权利要求1的方法，其中所述第一个刺激为电子的，而所述第二个刺激为光子的。
5.权利要求1的方法，其中所述第一个刺激为电子的，以及所述第二个刺激为电子的。
6.权利要求1的方法，其中施加所述第二个刺激与施加所述第一个刺激至少部分是同延的。
7.权利要求1的方法，其中所述第一个信号为光子的，而所述第二个信号为电子的。
8.权利要求1的方法，其中所述第一个信号为光子的，以及所述第二个信号为光子的。
9.权利要求1的方法，其中所述第一个信号为电子的，而所述第二个信号为光子的。
10.权利要求1的方法，其中所述第一个信号为电子的，以及所述第二个信号为电子的。
11.权利要求1的方法，其中所述电磁辐射选自光子辐射和电子辐射。
12.权利要求11的方法，其中所述光子辐射为激光束。
13.权利要求11的方法，其中所述电子辐射为电压。
14.权利要求1的方法，其中所述至少一种标记转移能量到至少一种其它标记以产生所述第一个信号和所述第二个信号中的至少一种。
15.权利要求1的方法，其中所述至少一种标记为化学发光或者电化学发光的。
16.权利要求1的方法，其中所述至少一种标记为电子自旋标记。
17.权利要求1的方法，其中所述探针生物聚合物序列和所述靶生物聚合物序列含有核碱基并且所述探针与所述靶特异性杂交形成双链体。
18.权利要求1的方法，其中所述探针生物聚合物序列和所述靶生物聚合物序列含有核碱基并且所述探针与所述靶特异性杂交形成三链体。
19.权利要求1的方法，其中所述探针生物聚合物序列和所述靶生物聚合物序列含有核碱基并且所述探针与所述靶特异性杂交形成四链体。
20.权利要求1的方法，其中所述探针为含有至少一种下列成员的核酸类似物：不带电荷的主链，部分带电荷的主链，阳离子部分，交联剂，交联侧链和核碱基类似物。
21.权利要求1的方法，其中所述探针生物聚合物序列和所述靶生物聚合物序列中的至少一种包括氨基酸序列。
22.权利要求1的方法，进一步包括：
向所述第二个刺激的试验样品施加至少一种其他刺激以提供一种附加刺激的试验样品；
从所述附加刺激的试验样品检测至少一种额外的信号，其中所述至少一种其他信号与所述探针和所述靶之间的所述亲和力相关；以及
比较所述第一个信号，所述第二个信号和所述至少一种其他信号以完成所述分析。
23.权利要求22的方法，其中所述第一个刺激，所述第二个刺激和所述至少一个其他刺激彼此不同。
24.权利要求22的方法，其中所述第一个信号，所述第二个信号和所述至少一种其他信号中至少一种的施加是非连续的。
25.权利要求1的方法，其中所述第一个信号和所述第二个信号中至少一种的施加是非连续的。
26.权利要求1的方法，其中所述探针和所述靶中的至少一种结合到基片，表面，分隔物，膜或者电极上。
27.一种分析序列特异性杂交的方法，所述方法包括：
提供一种靶；
提供一种探针，其中所述探针和所述靶中的至少一种包括至少一种生物聚合物序列；
向结合介质加入所述探针和所述靶以提供试验样品；
向所述试验样品施加第一个刺激以提供第一个刺激的试验样品；
从所述第一个刺激的试验样品检测第一个信号，其中所述第一个信号与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关；
向所述第一个刺激的试验样品施加第二个刺激以提供第二个刺激的试验样品；
从所述第二个刺激的试验样品检测第二个信号，其中所述第二个信号与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关；以及
比较所述第一个信号和所述第二个信号以完成所述分析；
其中在所述试验样品中提供至少一种标记，并且所述第一个刺激，所述第二个刺激，所述第一个信号和所述第二个信号为电磁辐射，前提是当所述第一个刺激和所述第二个刺激为光子辐射时，在所述第一个刺激以后和所述第二个刺激以前向试验样品施加中间电子刺激，并且当所述第一个刺激和所述第二个刺激为电子辐射时，所述第一个信号和所述第二个信号为电流。
28.权利要求27的方法，其中所述探针和所述靶中的至少一种为蛋白，肽或者脂重膜。
29.权利要求27的方法，其中所述探针或所述靶中的一种不是生物聚合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108646809A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 复旦大学 温控设备及温控光化学系统

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7052844B2 (en) * 1999-12-21 2006-05-30 Ingeneus, Inc. Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism
US7220541B2 (en) * 2000-01-24 2007-05-22 Ingeneus, Inc. Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions
DE10251757B4 (de) * 2002-11-05 2006-03-09 Micronas Holding Gmbh Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen Liganden
WO2004050915A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-17 Solexa Limited Determination of methylation of nucleic acid sequences
US20040142329A1 (en) * 2003-01-17 2004-07-22 Ingeneus Corporation Probe conjugation to increase multiplex binding motif preference
US20040180345A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-16 Ingeneus Corporation Pre-incubation method to improve signal/noise ratio of nucleic acid assays
US8486622B2 (en) * 2004-09-24 2013-07-16 Ingeneus Inc. Genomic assay
JP4957069B2 (ja) * 2006-05-01 2012-06-20 ソニー株式会社 プローブ核酸配列設計方法、プローブ核酸、検出表面、プログラム、情報記憶媒体、並びにプローブ核酸設計システム
GB0701444D0 (en) * 2007-01-25 2007-03-07 Iti Scotland Ltd Detecting analytes
WO2008096146A1 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis
WO2010048337A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic dna methylation

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4220450A (en) 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
FR2558172B1 (fr) 1984-01-16 1986-06-13 Inst Nat Sante Rech Med Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue
US5011769A (en) 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4876187A (en) 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US5874555A (en) 1987-10-30 1999-02-23 California Institute Of Technology Triple helices and processes for making same
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
EP0440749B1 (en) 1988-08-31 1997-05-28 Aprogenex, Inc. Manual in situ hybridization assay
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5824477A (en) 1990-09-12 1998-10-20 Scientific Generics Limited Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid
WO1992011390A1 (en) 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5641625A (en) 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US6048690A (en) 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US6051380A (en) 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5558998A (en) 1992-02-25 1996-09-24 The Regents Of The Univ. Of California DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence
US5332659A (en) 1992-04-09 1994-07-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids
JPH06153997A (ja) 1992-11-27 1994-06-03 Canon Inc 検出信号増幅による標的核酸の検出方法
US6027880A (en) 1995-08-02 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis
US5861124A (en) 1993-07-15 1999-01-19 Hamamatsu Photonics Kk Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid
AU7487294A (en) 1993-08-18 1995-03-14 Id Biomedical Corporation Compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing flanking sequence enzyme molecules
CA2169645A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Nassim Usman Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AU8102694A (en) 1993-11-17 1995-06-06 Id Biomedical Corporation Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences
US5824473A (en) * 1993-12-10 1998-10-20 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US6071699A (en) * 1996-06-07 2000-06-06 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US5998193A (en) 1994-06-24 1999-12-07 Gene Shears Pty., Ltd. Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof
US6045995A (en) * 1994-08-24 2000-04-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Capillary electrophoretic detection of nucleic acids
JP3189000B2 (ja) 1994-12-01 2001-07-16 東ソー株式会社 特定核酸配列の検出方法
US6426407B1 (en) * 1995-06-07 2002-07-30 Codon Pharm. Residues for binding third strands to complementary nucleic acid duplexes of any base pair sequence
US5814516A (en) 1995-10-13 1998-09-29 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof
GB9604292D0 (en) 1996-02-29 1996-05-01 Hybaid Ltd Estimation of a nucleic acid
US5824557A (en) 1996-04-02 1998-10-20 Panvera Corporation Method for detecting and quantitating nucleic acid impurities in biochemical preparations
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US5948897A (en) 1996-06-14 1999-09-07 Simon Fraser University Method of binding two or more DNA double helices and products formed
US5912332A (en) 1996-07-26 1999-06-15 Hybridon, Inc. Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides
US5691145A (en) 1996-08-27 1997-11-25 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids using G-quartets
WO1998035012A2 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Chan Eugene Y Methods and products for analyzing polymers
US5846729A (en) 1997-02-27 1998-12-08 Lorne Park Research, Inc. Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect
US6251591B1 (en) 1997-02-27 2001-06-26 Lorne Park Research, Inc. Quantitative method for detecting nucleotide concentration
DK0975800T3 (da) * 1997-02-27 2003-09-22 Ingeneus Corp Analyse af nukleotider i opløsning under anvendelse af PNA-prober
US6060242A (en) 1997-02-27 2000-05-09 Lorne Park Research, Inc. PNA diagnostic methods
US6046004A (en) 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US6013442A (en) 1997-08-05 2000-01-11 Wisconsin Alumni Res Found Direct quantitation of low copy number RNA
GB9725197D0 (en) 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
DE19808936A1 (de) 1998-03-03 1999-09-16 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Photodetektor und seine Verwendung
US6017709A (en) 1998-04-29 2000-01-25 University Of Houston DNA replication templates stabilized by guanine quartets
US6287772B1 (en) 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
US6255469B1 (en) 1998-05-06 2001-07-03 New York University Periodic two and three dimensional nucleic acid structures
US6255050B1 (en) 1998-05-22 2001-07-03 Lorne Park Research, Inc. Dynamic hybridization system
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
EP1090286A1 (en) 1998-06-24 2001-04-11 Therasense, Inc. Multi-sensor array for electrochemical recognition of nucleotide sequences and methods
GB9821989D0 (en) 1998-10-08 1998-12-02 Hybaid Ltd Detection of nucleic acid polymorphism
US6656692B2 (en) * 1999-12-21 2003-12-02 Ingeneus Corporation Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US6420115B1 (en) 1999-12-21 2002-07-16 Ingeneus Corporation Cation mediated triplex hybridization assay
US6403313B1 (en) 1999-12-21 2002-06-11 Ingeneus Corporation Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization solution utilizing fluorescent intercalators
AU5459000A (en) * 1999-06-03 2000-12-28 Lockheed Martin Corporation Highly sensitive biological agent probe
US7097973B1 (en) * 1999-06-14 2006-08-29 Alpha Mos Method for monitoring molecular species within a medium
US6924108B2 (en) * 1999-12-21 2005-08-02 Ingeneus Corporation Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues
US7220541B2 (en) 2000-01-24 2007-05-22 Ingeneus, Inc. Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions
US6613524B1 (en) 2000-01-24 2003-09-02 Ingeneus Corporation Amperometric affinity assay and electrically stimulated complexes of nucleic acids
US6265170B1 (en) * 2000-01-24 2001-07-24 Ingeneus Corporation Homogenous assay of duplex of triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108646809A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 复旦大学 温控设备及温控光化学系统

Also Published As

Publication number Publication date
US7220541B2 (en) 2007-05-22
ZA200401363B (en) 2004-08-27
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WO2003010506A3 (en) 2004-07-22
BR0211350A (pt) 2005-05-17
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WO2003010506A2 (en) 2003-02-06
CA2454415A1 (en) 2003-02-06
JP2005527779A (ja) 2005-09-15
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KR100617427B1 (ko) 2006-08-30
RU2004105151A (ru) 2005-05-27
EP1461452A4 (en) 2006-06-21
IL159928A0 (en) 2004-06-20
US20020137056A1 (en) 2002-09-26
TWI274875B (en) 2007-03-01
MXPA04000735A (es) 2004-07-08
NZ531259A (en) 2008-04-30

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