TW389791B - Assaying nucleotides in solution using pna probes - Google Patents

Description

經濟部个央樣隼局只工消费合作社印袈 年月 88. 1.29^)Μ 五、發明説明（） 發明背景 發明範噫 本發明係關於包含肽類核酸（p N A s )之探針 (probes)，以及關於使用P N A探針來定序或分析溶液中的 核苷酸，在不需固體的支持物或鄰近雙股核苷酸構築體不 存在的情形下。 -相關技蕤說明 P N A係爲D N A和R N A的聚胺類似物(polyamide analogs)，參見給予Nielsen et al.之美國專利案號5，5 3 9，0 8 2，其中Nielsen et al.揭示P N A s藉著結合 互補的單股(ss)D ΝΑ和R ΝΑ鏈而模仿自然的聚核苷酸， P N A s —般包含連接至一肽類支架之配位體(ligands)， 代表性的配位體包括四個主要之自然發生的DΝΑ鹽基（ 即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鳥糞嘌呤）或是其他自然 發生的核苷酸鹽基（即纖維核l^inosine)，尿嘧啶，5 -甲基胞嘧啶或硫尿嘧啶）或是人工合成的鹽基（即溴胸腺 嘧啶，氮雜腺嘌呤（azadenines)或氮雜鳥糞嘌呤 (azaguanines)，及其他），其經由一適合的連接子（linker) 而連接至一肽類支架上。 包含P N A序列之探針已被使用在偵測標的核苷酸序 列’給予Cantor之美國專利案號5，5 0 3，9 8 0中建 議使用P N A探針於一定序核酸的方法上，其藉由將該核 酸與一組的P N A探針雜交（hybridize)，該等p N A探針 邻1閱讀背而之注念肀項再填寫本頁) ，裝. *1Τ 本紙張尺度適用中國國家栉準（CNS ) 吡枯（21()/2^^-了 經濟部个央樣隼局只工消费合作社印袈 年月 88. 1.29^)Μ 五、發明説明（） 發明背景 發明範噫 本發明係關於包含肽類核酸（p N A s )之探針 (probes)，以及關於使用P N A探針來定序或分析溶液中的 核苷酸，在不需固體的支持物或鄰近雙股核苷酸構築體不 存在的情形下。 -相關技蕤說明 P N A係爲D N A和R N A的聚胺類似物(polyamide analogs)，參見給予Nielsen et al.之美國專利案號5，5 3 9，0 8 2，其中Nielsen et al.揭示P N A s藉著結合 互補的單股(ss)D ΝΑ和R ΝΑ鏈而模仿自然的聚核苷酸， P N A s —般包含連接至一肽類支架之配位體(ligands)， 代表性的配位體包括四個主要之自然發生的DΝΑ鹽基（ 即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鳥糞嘌呤）或是其他自然 發生的核苷酸鹽基（即纖維核l^inosine)，尿嘧啶，5 -甲基胞嘧啶或硫尿嘧啶）或是人工合成的鹽基（即溴胸腺 嘧啶，氮雜腺嘌呤（azadenines)或氮雜鳥糞嘌呤 (azaguanines)，及其他），其經由一適合的連接子（linker) 而連接至一肽類支架上。 包含P N A序列之探針已被使用在偵測標的核苷酸序 列’給予Cantor之美國專利案號5，5 0 3，9 8 0中建 議使用P N A探針於一定序核酸的方法上，其藉由將該核 酸與一組的P N A探針雜交（hybridize)，該等p N A探針 邻1閱讀背而之注念肀項再填寫本頁) ，裝. *1Τ 本紙張尺度適用中國國家栉準（CNS ) 吡枯（21()/2^^-了 經濟部中央樣卑局只工消资合作社印裝 Λ7 ______ H7 五、發明説明（） 包括在與一雙股部分相鄰的單股部分內之隨機但可測定的 鹽基，其中該組之單股部分較好地包含超過一預定範圍的 序列之每一個可能的組合。雜交係藉由以該探針的單股部 分來進行互補識別一標的物的單股部分而發生，並且在該 探針的相鄰雙股之存在下爲熱力學上有利的。 即使如此，雖然Cantor揭示了該核苷酸可爲P N A s ，但卻沒有揭示或建議在固體支持物不存在的情況下使用 這-種探針。此外，本發明不需要被測試的DN A物質之相 鄰構築體。 除了教導如Cantor, Perry-O’Keefe et al.之實體支持物 的使用以外，“肽類核酸前膠質之雜交法：一種替代南方 雜交法的方法 ” （Peptide Nucleic Acid Pre-Gel

Hybridization: An Alternative to Southern Hybridization), 93

Proc· Natl. Acad. Sci. USA 14670 (1996 年 12 月）也教 導P ΝΓΑ—般不會良好地與雙股D N A ( d s D N A )結 合，可參見Perry-O’Keefe et al.在第1 4 6 7 3頁上的註 腳所示。此外，已發現與d s D ΝΑ良好地結合之同嘧啶 (homopyrimidine)的Ρ Ν Α構築體在作爲探針使用上並不有 效，申請人已發現祇有同嘧啶可藉著鏈倒位（strand inversion)而與雙股D Ν A結合所建議之限制是不正確的， 並且其係由所使用的雜交條件而產生的。

Smulevitch et al.在“藉由支架電價之操作以寡核苷 酸增進鏈倒位（Enhancement of Strand Inversion by Oligonucleotides Through Manipulation of Backbone _____,4_ _ _____________________________

本紙張尺度適用中國國家榡年（CNS ) /\4说格（21 ϋ X /M (¾先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) •裝·

,1T 經濟部中央標赛历月工消资合作社印鉍 Λ7 1!7 五、發明説明（）

Charge)，” 14 Nature Biotechnology 1700 (Dec.-1996)(揭示於 Landsdrop, “PNA 種類之近遇（Close Encounters of the PNA kind)，” 14 Nature Biotechnology 1653 (Dec. 1996))揭示了使 用P N A引子來與d s D N A雜交，但是，Smulevitch et al.教導使用凝膠在偵測雜交上，並不建議使用螢光標記 (marker)。 樣本分析之許多形式係仰賴一染料的螢光性質，螢光 係發生在當一受到某一波長光所激發的分子藉由放射一更 長波長的光而回復至未激發(基礎)狀態之時，該具有不同 波長的激發及放射之光可使用濾光器、照相機或C C D而 彼此被分開，螢光已被使用於使特定分子(以及其結構)藉 由光顯微術而可見許多年，並且亦使用在其他分析技術上 ，例如流體細胞計數法(flow cytometry)。更進一步，顯示 不同的顏色的螢光之放射可藉著人類的眼睛、照相機或電 荷偶極裝置(charge coupled device; C C D )而被偵測到。 舉例來說，給予Dykstra et al.之美國專利案號5，5 9 4，1 3 8揭示一種螢光偵測核酸的方法，該方法包括 使該核酸與一種爲雙一二陽離子性芳基夫喃化合物之螢光 標記接觸，並且使該核酸暴露於在一誘發螢光標記的螢光 之頻率的光下，該螢光標記可結合至作爲探針的核苷酸序 列上以用於雜交之硏究，或者是其可結合至數個試劑上以 用於原位(in situ)的標定硏究。 給予T c h e η之美國專利案號4，9 6 3，4 7 7 揭示一種具有高敏感性之包含一調整的核酸之探針，其可 (1Α-1Μ讀背而之注念事項再填鸿本頁) 裝.

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本紙張尺度適闲中國國家標準（CNS ) Λ4規梢（2IOx2>m>;tM A7 »7 五、發明説明（ 經濟部中史標挲局只工消费合作社印^ 藉由特定的抗體而被識別。 螢光原位雜交（Fluorescent In Situ Hybridization ; F I S H)爲一種包括藉著將DNA連接到一固體支持物， 如一玻璃載片，而偵測到結合在人類基因組之螢光探針， 參見如K. H. Andy Choo, Ed.，“原位雜交的實驗步驟(In Situ Hybridization Protocols)，” 第二及第四章（Human Press, Totowa，NJ，1994)。如同所有其他包括以探針進行的雜交 之-方法，此方法倚賴固體支持物來保持D N A的兩個互補 之股彼此分開，在當該探針與該兩股之一進行雜交時，另 外，F I S Η方法需要一複雜的緩緩液以及溫度來控制實 驗流程，以隔夜培養的方式。 然而，直到本發明之前，仍沒有可能快速地使用一種 不破壞樣本的方法來測試在溶液中核苷酸序列的存在，該 方法比起雷射爲主的分析較不會對於實驗室人員有害’不 需要製備固體支持物的費用和延遲，並且易於自動化。突 變株遺傳序列之時間及花費上有效的偵測已爲在使突變株 的基因型與改變的表型相關連上的速率限制步驟（rate limiting step)，雖然習知的D ΝΑ定序方法已被認爲鑑定 突變之最精確的方法，但是這些方法已是相當慢且需要大 量勞力，並且並不特別適合於快速篩選大量數目的基因組 (genomic)D Ν Α 樣本。 發明摘沭 本發明係提供偵測核酸序列以及/或測定由核酸而來 (請t閱讀背而之注念事項孙填寫本S ) Γ 、-β Γ

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本紙張尺度適用中國國家枕專（CNS ) AdUM 210x2yr.:.MM Λ7 1.17 經濟部中*樣參历只工消费合作社印装 五、發明説明（） 的序列訊息，根據本發明的探針係包括PNA。 本發明係提供一種用於偵測在一液態培養基中至少一 單股或雙股核苷酸序列之方法，該方法包括在該液態培養 基中加入Ρ Ν Α探針，該探針具有至少一個標記(marker)， 每一個探針與在該培養基中至少一個核苷酸序列形成至少 —個雜交複合物(hybridization complex);偵測該至少一個 核苷酸序列，其係藉由偵測與在該液態培養基中該至少一 假雜交複合物之量有關的至少一個訊息(signal)。 本方法可以在不需使該Ρ ΝA探針、核苷酸序列或雜 交複合物與一固體支持物或膠體結合的情形下進行。 圖式簡iTlt 本發明將會連同下列圖式一起敘述，圖式中代表的參 考符號係標示代表的元件並且其中： 圖1係爲根據本發明的裝置之圖解說明；以及 圖2係爲雜交體之螢光強度對雜交時間之圖。 圖3 A係爲單一探針之螢光光譜。 圖3 B係爲野生型DN A在3 0°C下雜交一小時之螢 光光譜β 圖3 C係爲突變的D N A ( Q )在3 0 °C下雜交一小 時之螢光光譜。 圖4 A係爲單一探針之螢光光譜。 圖4 B係爲野生型DN A在2 5 °C下雜交3 0分鐘之 螢光光譜。 ___ _7 * (諳先閱讀背而之注念事項再填寫本頁) Γ -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4叱枯（> 經濟部中央標準局只工消费合作社印裝 A7 _______ H7 __ 五、發明説明（） 圖4 C係爲突變的D N A ( R )在2 5 °C下雜交3 0 分鐘之螢光光譜。 圖5 A係爲野生型DN A在4 5 °C下雜交2 0分鐘之 螢光光譜。 圖5 B係爲突變的DNA ( AAG)在4 5°C下雜交 2 0分鐘之螢光光譜。 圖6 A係爲野生型DN A在5 0°C下雜交二小時之螢 光光譜。 圖6 B係爲突變的D N A ( G C G )在5 0 °C下雜交 二小時之螢光光譜。 圖7 A係爲野生型D N A在2 5 °C下雜交一小時之螢 光光譜。 圖7 B係爲突變的DNA (TAC )在2 5°C下雜交 —小時之螢光光譜。 圖8 A係爲當電源開或關時在5 2 5 nm下所記錄之 野生型D N A(SeQ ID No ·1 )之螢光光譜。 圖8 B係爲當電源開或關時在5 2 5 n m下所記錄之 突變的DNA(Seq ID Νο·2)之螢光光譜。 圖8 C係爲當電源開或關時在5 2 5 n m下所記錄之 突變的DNA(Secj ID Ν ο · 3 )之螢光光譜。 圖9A係爲野生型DNA ( S e q ID N o · 7 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 圖9 B係爲突變的DNA ( S e q ID N o · 8 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 本紙張尺度適用巾關家料（CNS ) Λ4 ( 210 X29^ ϊ Ί —" {誚^?間讀背而之ίί4事項再填ϊΐ?本頁) Γ 裂_ 訂 經濟部中央橾羋局只工消费合作社印製 Λ7 _ Η 7 五、發明説明（） 圖9 C係爲突變的DNA ( S e q ID Νο·9 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 圖9 D係爲負控制組DNA ( S e q ID No· 1 0 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 圖1 0 A係爲與樣本1在2 5 °C下雜交一小時的探針 (5， CAT TCC GCT CTC)之螢光光譜。 圖1 0 B係爲與樣本2在2 5 °C下雜交一小時的探針 (-5， CAT TCC GCT CTC)之螢光光譜。 圖1 1 A係爲野生型單股DNA ( S e q ID N 〇 · 1 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 圖1 1 B係爲突變的單股DNA ( S e q ID N o _ 2 )在2 5 °C下雜交一小時之螢光光譜。 圖1 2 A係爲與樣本1在2 5 °C下雜交一小時之探針 (5， CAT TCA GCT CTC)之螢光光譜。 圖12 B係爲與樣本1在2 5 °C下雜交一小時之探針 (5， CAT TCC GCT CTC)之螢光光譜。 圖1 3 A係爲與探針Ν ο · 1在2 5°C下雜交3 0分 鐘之DNA(Seq ID Νο·11)之螢光光譜。 圖1 3 B係爲與探針Ν ο · 2在2 5t下雜交3 0分 鐘之DNA(SeQ ID Νο_11)之螢光光譜。 圖1 3 C係爲與探針Ν ο ♦ 1及探針Ν ο · 2在2 5 °C下雜交3 0分鐘之D NA(SeQ ID Ν ο · 1 1 )之營光光譜。 圖1 4 A係爲與鹼性蕊香紅標定的ρ ΝΑ探針雜交之 —---------------------------- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) 彳Μ 210x297^1 請1"讀背而之注念事項再填'Λ?本页) •裝. Λ7 Η 7 經濟部中央橾挲局只工消费合作社印" 五、發明説明（） DNA之螢光光譜。 圖1 4 B係爲與鹼性蕊香紅標定的P NA探針（探針 N 〇 · 3 )及螢光索標定的P NA探針（探針Ν ο · 1 ) 之混合探針雜交的D NA之螢光光譜。 圖1 5 A係爲與鹼性蕊香紅標定的P ΝA探針（探針 Ν 〇 . 3 )雜交之D ΝA之螢光光譜。 圖1 5 B係爲與探針N ◦ . 2及Ν 〇 · 3雜交的D N A-之螢光光譜。 圖1 6 A係爲單一探針之螢光光譜。 圖1 6 B係爲探針Ν 〇 . 1與負控制組D N A ( S e q ID Ν ο · 1 〇 )之螢光光譜。 圖1 6 C係爲探針Ν ο . 2與負控制組DNA ( S e Q I D Ν o . 1 〇)之螢光光譜。 圖1 6 D係爲探針Ν ο · 3與負控制組D N A ( S e Q I D N o . 1 〇 )之螢光光譜》 圖1 7 A係爲與探針Ν ο . 2雜交之D ΝΑ ( S e q ID Ν o · 1 2 )之螢光光譜》 圖1 7 B係爲與探針Ν ο · 1雜交之D N A ( S e q ID Ν 〇 · 1 2 )之螢光光譜。 圖1 7 C係爲與探針ν ο . 1及探針Ν ο . 2雜交之 DNA(SeQ ID No.12)之螢光光譜。 圖1 8 A係爲與探針Ν ο · 3雜交之D N A ( S e q ID N 〇 . 1 2 )之螢光光譜。 圖1 8 B係爲與探針ν ο · 2及Ν ο . 3雜交之D Ν {訢1閲讀背而之注意事項再填寫本頁) .裝- 、1Τ. 1 本紙張尺度適财:辦.（CNS ) 210X2^：^ 7~一 經濟部中央標準局s=c.t.消费合作社印製 Λ7 Η 7 五、發明说明（） A ( S e q ID N〇. 12)之螢光光譜。 圖1 9 A係爲與探針N ο . 1雜交之DNA (Seq ID N o . 1 3 )之螢光光譜。 圖1 9 B係爲與探針N ο . 2雜交之DNA (SeQ ID N o . 1 3 )之螢光光譜。 圖1 9 C係爲與探針N ο ♦ 4雜交之D NA ( S e q ID N o · 1 3 )之螢光光譜》 -圖1 9 D係爲與探針N ο . 1及N ο · 2雜交之D N A ( S e q ID Ν〇·13)之螢光光譜。 圖1 9 E係爲與探針N ο.1，Νο.2&Νο·4 雜交之QR D N A ( S e q ID N o · 1 3 )之螢 光光譜。 較佳县髂窗施例之詳沭 本發明係利用P NA探針來偵測及/或特徵化在一樣 本中的核苷酸序列，PNA探針可藉由與一股結合而識別 d s DNA，藉此可能與其它股雜交而產生一PNA —D N A複合物，這種識別可發生在d s DNA標的序列2 0 個或更長的鹽基對上，具有任何8至2 0個鹽基長度之探 針序列爲較佳的，因爲這是在原核生物及真核生物中所發 現最小獨特D N A序列之範圍，具有1 2至1 8個鹽基長 的探針爲特別較佳的，因爲這是在人類基因中最小長度的 獨特序列。無論如何，許多較短的探針可被使用在偵測其 中具有許多非獨特的標的序列之核苷酸序列，其與結合以 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) ( 2丨0X297分々） 一' -- 請先閱讀背而之注意事項再填ΪΪ?本頁) 裝. 訂 經濟部中央橾苹扃®c工消费合作社印聚 Λ7 __— Η 7 —> -- ......—.,. ..... ..... 五、發明説明（） 獨特地識別該核苷酸序列。 本發明的探針可以與d s D N A形成三體(triplex)複 合物以及與RN A或s s DN A形成雙體(duplex)複合物， 本發明的化合物也可以形成三體複合物，其中第一P N A 探針會與RNA或s s DNA結合以及第二s S DNA股 會與所得到的雙體複合物結合，參見例如Egholm et al.的 “遵守華生-克拉克的氫鍵法則之Ρ ΝΑ與互補的寡核苷酸 雜交（PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson-Crick Hydrogen-Bonding Rules),365 Nature兄6 (I993)，Tomac et aL的“對於多肽類核酸複合 物的穩定及結構之離子效應(Ionic Effects on the Stability and Conformation of Peptide Nucleic Acid Complexes),M 118 J. Am Chem. Soc. 5544 (1996)。 在根據本發明的P ΝΑ探針中，連接在聚胺支架上的 鹽基主要爲自然發生之連接在製造探針所需的位置上之核 苷鹽基(micleobase)，或者，該等鹽基可能爲非自然發生的 核苷鹽基（核苷鹽基的類似物），其他鹽基結合部分，芳 基部分，（C 1 — C 4 )烷醯基(alkanoyl)，羥基或甚至氫 ，將會了解者爲核苷鹽基一詞係包括攜帶有可移除的保護 基之核苷鹽基。此外，至少一個在聚胺支架上的鹽基可被 D N A 插入劑（intercalator)，報導配位體(reporter ligand) ’ 例如螢光基團（fluorophore)、放射性標記、旋轉標記（spin label)、半抗原(hapten)，或是蛋白質識別配位體例如生物 素(biotin)所替換或取代，較好之可偵測的標記包括放射性 (請t閱讀背面之注念事項4填寫本页) ,Γ 裝. *1Τ Τ

Xkifr ( CNS ) Λ4Ϊλ'.1Γ( 210 x 2^：'> X； ") ~ …… 經濟部中央標羋局β工消费合作社印裝 Λ7 H7 五、發明説明（） 同位素、穩定的同位素、酵素、螢光化學品、發光的化學 品、有色的化學品、金屬、電荷或空間性的結構。 在特別較佳的具體實施例中，Ρνα探針包含一個共 價性地結合於一螢光標記的ρ Ν Α序列，該螢光標記會在 當受到雷射的照射而放出螢光’較好的螢光標記包括生物 素、鹼性蕊香紅(rhodamine)以及螢光素(fluoroscein)。 本發明較好地是提供螢光標記在具有一短的連接子 (linker)之PN A的5’末端上，以使得與P NA相互作用降 低至最小。 爲了使一突變株核苷酸序列與一參考核苷酸序列可區 別，其中該兩個序列的不同如單一鹽基般之小’因此較好 地是設計該ρ ΝΑ探針以使得該突變株核苷酸的突變部分 相對應於該Ρ Ν Α探針的中央’此設計會得到一更高的雜 交產量以及一個比當該核苷酸的突變部分相對應於該探針 的末端時更穩定的雜交體(hybrid)，因爲在探針與核苷酸之 間結合的錯誤配對是位在該探針的中央。 Ρ ΝA探針被加入一個疑含有至少一個核苷酸序列以 及/或該至少一個序列之突變株形式之液態培養基中，該 液態培養基可爲任何習知適合用於保存核苷酸的培養基， 參見例如 Sambrook et al·的 “Molecular Cloning: A Lab Manual，” 2d (1989)，舉例來說，該液態培養基可包括核苷 酸、水、緩衝液以及界面活性劑。 液態培養基中的核苷酸可藉由任何習知方法包括自動 化的方法在臨床樣本中得到，這種方法的實例摘錄於例如 本紙張尺度適用中國國家掠準（CNS ) Λ4規#, ( 210.x ) (""閲讀背而之注念市項·"填寫本頁)

經滅部中央標準局只工消费合作社印裝 Λ7 __ _ H7 五、發明説明（) ^

Sambrook et al·，Vol· 2，ρρ· 9·16-9·19 and 7·6 to 7·7. 一種 自動化核酸純化裝置的實例爲Quiagen所製造的Bi〇R〇bot 9600。 舉例來說，許多的疾病已知與在個體基因的突變D N A之存在有關連，若是野生型D NA和突變D NA的序列 爲已知的，則有可能使用習知方法在臨床樣本中分離出這 些核苷酸序列，P C R爲一種由臨床樣本中分離核苷酸的 較好方法，P C R係使用一種可以擴增野生型D NA和突 變D N A的引子(primer)來進行。 核苷酸序列以一已知濃度加入液態培養基中，因爲其 濃度可影響在該發明性方法的連續步驟中產生之訊息的大 小程度（例如螢光強度），核苷酸濃度可藉由例如測量在 2 6 0微毫米的U V吸收量而測定。 分離出的核苷酸在被偵測之前加入液態培養基中並且 變性(denatured)，較好地，變性作用是在P N A探針的存 在下於約9 0°C至約1 0 〇°C下約3 0秒到約5小時而 完成。 較好地，PNA探針以一爲將被偵測核苷酸序列的濃 度之1至2 0倍的濃度被加入。 互補鹽基間的雜交是在具有溫度、鹽濃度、靜電強度 、以及緩衝液組成物的變化之多種不同的情況形下所發生 的，這些情況以及其被應用的方法之實例在此技藝中爲熟 知的，參見例如 Perry-O’Keefe et al.，Egholm et al.，Tomac et al” Sambrook et al” Vol. 2 pp. 9.47-9.55 以及 Perspective 本紙張尺度適用中國國家摞隼（CNS ) Λ復匕（210/2:7¾] 一 U川尤閱讀背而之注念事項孙填寫本s )

Λ7 137 濟 部 中 λ 標 局 Fi X. 消 费 合 作 社 印 % 五、發明説明（） Biosystems Magazine Vol· 4, No. 3所教示的前膠質雜交技 術（Pre-Gel Hybridization Technique) 0 較好爲雜交複合物在約4°C至約7 5°C的溫度下約 2分鐘到2 4小時而形成，特別較好爲在P NA探針的存 在下進行變性不超過6 0分鐘，之後溫度會被動地被冷卻 至室溫下而不消失。 藉由使用特定的試劑來促進在溶液中雜交的進行是可 能的，這些試劑的較好實例包括單股結合蛋白質如RecA 蛋白質，T4基因32蛋白質，E. col i單股結合蛋 白質，主要或次要的核酸溝(groove)結合蛋白質，雙價離子 ，多價離子，以及插入物質（intercalating substances)例如 溴化乙錠（ethidium bromide)，放射菌素D，補骨脂素 (psoralen)，以及血管素(angelicin)。 在本發明性方法的具體實施例中，在偵測已雜交的P NA探針之訊息前，雜交複合物會與未雜交的P NA探針 分離，該分離是藉由過濾、離心、沉澱、離子交換樹脂分 離以及游離溶液電泳（即與膠質電泳法相反之在液態培養 基中的電泳法）中至少一種而達成的。 分離可藉著G 5 0管柱來達成，在雜交之後，雜交複 合物和未雜交的D N A及P N A之混合物被轉移至一G 5 0管柱中，該管柱會在5 0 0至1 0 〇 〇 r pm下離心1 至2分鐘，未結合的Ρ ΝΑ被過濾並保留在管柱中，使含 有P N A — D Ν Α的雜交體之溶液通過管柱並且在一分光 度管(cuvette)中被收集。 (請尤閱讀背而之注Jl-.li·事項再填埒本頁) ”裝. ,ιτ -I t 本紙張尺度適用中國國家枕隼（CNS > ( 210X1^7, 經濟部中央標珞局β工消费合作社印奴 Μ ___Η7 五、發明説明（） 事實上，離心是可以被避免的，溶液可藉著重力或藉 使用額外大量的水沖洗而流經該管柱，但是，離心係爲了 減少分離的次數以及避免樣本被稀釋之目的。 分離可藉由離心來達成，經過雜交之後，樣本(未轉移 )會藉著在1 0 0 0至1 0 0 0 0 r pm下4到2 0小時 而被分離成兩層(梯度）’較輕的未雜交P N A富含於上層 中，而較重的雜交複合物則被濃縮於下層中。 在一些具體k施例中’若是電學方法被用來濃縮雜交 的P N A時，一過濾步驟是可避免的’在這些具體實施例 中，在偵測所欲的核苷酸序列之前或同時，一電場被施用 於該液態培養基，並且爲電場一函數的螢光放射強度之變 化被偵測，作爲該P NA探針是否雜交到一完全互補的核 苷酸序列以及一不完全互補的核苷酸序列的至少之一之指 標。 用於本發明的較好檫記爲螢光基團，如將被熟於此技 藝人士所知悉者，較好地選擇以誘導螢光標記之螢光的波 長在此技藝中已知爲“激發最高値（excitation maximum)” ，也就是說，波長被一分子所吸收並且激發該分子至一更 高電子態，當標記分子由較高通至較低的電子態時，該分 子會在一種稱爲“發射最高値(emission maximum)”之波長 下放射一種可見光雷射之形式，即螢光，在本發明中所偵 測到的即爲螢光，該化合物所放射出之可偵測的訊息可使 用此技藝中所熟知的技術來偵測，例如藉著以人類的眼睛 來觀察、使用電子裝置來偵測一產生的波長（如照相機及 (^-5t閲讀背而之注.*-«-事項再填寫本頁) η, 訂

線_ C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Λ4岘格（210x297 :Mi 1

經濟部中央慄苹局β工消"合作社印狀 五、發明説明（） C C D s )以及其類似方法。較優地，螢光的波長充分地 由激發光的波長中移除以藉著濾光器使該兩波長得到良好 的分離。 激發波長係被選擇(藉由一般實驗以及/或習知的知識 )以相對應於所使用的標記之此激發最高値，且其較好爲4 0 0到1 0 0 0微毫米，更好爲4 0 0到7 5 0微毫米， 舉例來說，當標記爲螢光素時，激發之較好的波長爲約4 8_8微毫米。 在較佳的具體實施例中，一氬離子雷射係被使用在以 具有4 0 0到5 2 0微毫米的範圍內的波長之光來照射’ 並且螢光放射係在5 0 0到7 5 0微毫米的範圍內被偵測 ，照射的時間較好爲約1 0毫秒到約1分鐘。 一種實施本發明性方法之裝置可包括一個液態培養基 容器，用以容納液態培養基；一雷射，用以照射核苷酸； 一螢光偵測器，用以偵測被該雷射所誘導的螢光；一個資 料分析裝置，用以分析由螢光偵測器所產生的資料；以及 一個輸出裝置，其報導由資料分析裝置所得到的資料之分 析。參見例如圖1，其顯示一種適合與本發明方法一同使 用的螢光偵測系統之綱要圖。 在一些具體實施例中，以一光源照射雜交的p N A探 針所產生的螢光放射可與未雜交的p NA探針所產生的螢 光放射來區分，而不會將雜交與未雜交的Ρ Ν Α探針分開 。在一些具體實施例中，與一核苷酸序列雜交的一頬型P N A探針之螢光放射會和與非第一核苷酸序列之核苷酸序 邻尤間讀背而之注;&事項/}-填寫本页) r 線 本紙張尺度適用中國國家枕準（CNS )，\4叱枯（ 經濟部中失搮4·-局只工消费合作社印裝 Λ7 __H7 五、發明説明（） 列雜交的另一類型P NA探針之螢光放射區分出來，舉例 來說，有如單一核苷酸之小的不同兩個核苷酸序列任一個 的存在可以基於精確地與兩個核苷酸之一互補的螢光P N A探針將會比結合不精確的互補體(complement)更有效地 結合精確的互補體，因而在移除未雜交的P NA探針後提 供在溶液中一更高濃度的雜交複合物以及一更高的螢光強 度。 多種的P NA探針可被同時使用以達到不同的效果， 一些目標在單一核苷酸序列的不同片段之探針可被使用以 增進偵測方法的可靠性，相似地，一個探針可以d s D N A的一股爲目標，而另一個探針可以d s D ΝΑ的互補股 爲目標。 一種偵測是否D ΝΑ爲突變型或相對的野生型之較好 的方法包括同時使用（a ) —種第一型式的P N A探針’ 其目標在一存在於野生型以及突變型兩者D N A中否則爲 獨特之序列，以及（b ) —種第二型式的P N A探針’其 目標在一突變型D N A上獨特的序列，其中第一和第二型 式的P NA探針具有產生可區別訊息之不同的標記。因此 ，第一探針訊息的偵測係顯示該測試爲適當地進行(也就是 說，該第一探針作爲一正控制組），並且第二探針訊息的偵 測係顯示突變型D N A的存在。舉例來說，一個探針可具 有在5 2 5微毫米下表現螢光放射強度峰(peak)之螢光素 標記，而另一個探針可具有在5 8 0微毫米下表現螢光放 射強度峰之鹼性蕊香紅(rhodamine)標記。 (誚尤間讀背而之注念事項再填寫本1)

本紙張尺度適用中國國家標專（CNS ) /\4現估（2Ι0χ 297公於） 經濟部中央樣準局K工消f合作社印敦 Λ7 _________ Η 7 五、發明説明（) 與先前技藝之偵測方法相反地，本發明使得限制在特 定的具體實施例中的液態培養基(即將被分析的樣本）之所 有體積不超於約2 0 0微升成爲可能，亦可能限制在特定 具體實施例中的所有體積不超過約1 〇微升。 當使用P N A來測試突變d s D N A時，若是所得到 的結果仍存有疑慮，則進一步的測試可能立即在樣本上進 行，其藉由加入互補P N A探針以測試D N A的互補之股 。.若是如同第一測試中的一部分被離心，該樣本會被移至 一個新的管子並且與互補P N A雜交，或者，該P N A測 試可在該P NA和互補P NA探針兩者在第一情形下以及 相同的時間雜交至變性D NA股的每一股上來完成。 就討論的應用上而言，樣本可被測試、儲存以及接著 再測試，因爲P NA會由雜交中被除去經過幾天，並且D NA會再結合一段時間且不因爲此步驟而被分解，因此， 一個在測試後被冷凍之樣本可以接續地在相同的管中再測 試數次。 圖2顯示DMA雜交經過一段時間。一種PNA探針 係被允許與野生型DNA(WT DNA)以及突變DNA (MT DNA)雜交，該探針與該DNA之間的雜交一段 時間接著測量螢光強度’圖2顯示P N A探針與D N A的 雜交最終會降低一段時間’其暗示D N A會藉由取代P N A而恢復其原來的結構一段時間。 臨床樣本可使用至少1 0 〇倍少於典型習知方法中所 使用的化學品或遺傳物質（1 〇 〇微升相對於1 〇微升） ---^-------木-- 对尤間讀背而之注^事項件填涔本页) 訂 .^1 本紙張尺度適用中國國家樣專（CNS ) A4AL枯（210x »7公# 1 Μ Η 7 ____ 五、發明説明（） 而測試，因此，即使是使用1 0或2 0倍習知所使用的P ΝΑ濃度，當得到一個非常決定性的結果時，該測試仍祇 消耗1/5到1/1 0的Ρ Ν Α量。 本發明將會更詳細地以參考下列實例來說明之，但是 所需瞭解的是本發明並非認爲被限制於其中。 奮例1 .由野生型p53(SEQ ID NO:1)而來的基 因組(gen〇mic)DN A之1 5 0 b ρ (鹽基對）的片段是 藉著P C R而擴增，P C R係使用由Perkin Elmer公司之 GeneAmp P C R系統2 4 0 0來進行，其具有在9 5 0 C 下5分鐘的熱起始，在加入T a q酵素之後，3 5循環如 下述進行： 變性(Denaturing) : 94。C 30 分鐘。 融接(Annealing) : 4 5 ° C 4 5 分鐘。（4 5 0 C 爲比引子Tm低5°C) 延長(Extension) : 7 2 ° C 3 0 分鐘。（1 K b /m i η ) X 3 5 〇 Ρ C R係爲使用一種包含在1 〇 〇微升體積1 〇 χ反 應緩衝液（1 0微升）中，20 mMMgCl2(l〇微 升），10 mM的dNT P混合物（2 )，2 5 p m 〇 微升的引子1 (1微升），25 pmol/微升的弓丨 子2 (1微升），1〇〇微克/微升的DNA模板 (template) ( 1 )，d d Η 2 Ο ( 7 4 微升）以及 T a q 聚 订 Γ 嫁

經^-部中央操準局只工消费合作社印K 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 210 X 2y·? :.ul 1 經漓部中央揼隼局βχ消fr合作社印^ Λ7 117 五、發明説明（） 合每（1微升）（5單位/微升）之混合物而進行。 相似地，相同基因1 5 0 b ρ片段的一個突變片段（ SEQ I D N0 : 2 )也是藉由P CR而擴增，該突變 的片段與野生型片段相同，除了在氨基酸位置3 4 4上的 一點突變，在其上該DNA野生型序列CTG變成爲CA G。 —個 1 2— me r 的 PNA 探針是由 PerSeptive Biosystem，Inc. (Framingham, MA，USA)得到的，並且被 設計爲與150 bp的ρ 5 3野生型片段（SEQ ID N 0 : 1 )之1 2個核苷酸片段互補。該探針具有下列結 埋 · 稱· 5 ’ Η - F 1 u 0 CAT TCA GCT CTC Lys- CON H2 用於雜交的緩衝溶液爲10 mM的Tris—HC 1，Ρ Η 7 · 1，重量比1 %的B S A (牛血淸白蛋白 )，0·1 % Triton X—100 (三級辛基苯 氧基聚乙氧基乙醇），50pmol的野生型基因組DN A加入3 0 0 pm ο 1的Ρ ΝΑ探針並混合在1 0 0微升 的緩衝液中。 每一個樣本在9 5°C下加熱3 0分鐘，每一個樣本 接著被加入預熱至3 0°C的緩衝液中並使其雜交1小時。 每一個樣本的成份係藉著G 5 0旋轉管柱（Pharmacia Biotech，Uppsala, Sweden)以 6 0 0 g 的速度旋轉 2 分鐘 來分離，未結合的Ρ ΝΑ會被過濾並保留在管柱中，帶有 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) 估（2Η>χ 247.公//.) -=* (誚宄閱讀1Ϊ-而之注念事項/>)-填寫本I)

經濟部中央搮準局月工消费合作社印裝 五、發明説明（） P N A - R N A雜交體的溶液通過該管柱並收集於分光度 管中以用於螢光偵測，該石英管接著被置於螢光分光計中 以進行雷射誘導螢光（在所有實例中的雷射波長爲4 8 8 微毫米）以及偵測連接於目標基因組D N A的營光探針。 如圖3 B和3 C中所示，野生型基因組DNA樣本（圖3 B )在5 2 5微毫米下的相對螢光強度是四倍高於突變樣 本（圖3 C )的強度，使得突變基因組DNA樣本可與野 生_型基因組D N A樣本區分出來，圖3 A顯示單獨探針之 螢光強度》 眘例2 此實例與實例1相似，除了下列細節外。突變基因組 D N A樣本（S E Q I D N 0 : 3 )具有在氨基酸位置 3 4 4上由野生型序列C T G改變爲C G G之鹽基序列， 兩種樣本在9 4 °C下加熱2 0分鐘，緩衝液被預熱到2 5 °(：並且使得該等樣本雜交3 0分鐘，每一個樣本的成份係 使用G50旋轉管柱並旋轉在8 0 0 0 r .pm下1 · 5分 鐘，由野生型基因組DNA樣本（圖4 B )所偵測到的螢 光在5 2 5微毫米下之相對強度是六倍高於突便基因組D NA樣本（圖4 C)的強度，使得該野生型基因組樣本可 與該突變的基因組樣本區分出來，圖4 A顯示在溶液中單 獨探針的螢光強度。 寶例3 此實例與實例1及2相似，除了下列細節以外。突變 基因組DNA樣本（SEQ ID NO:4)係由野生型 本紙掁尺度適用中國國家榡準（CNS ) Λ4現仿（2丨0x ?V7 ) _' (J).?t閱讀背而之注念事項再填寫本I ) 訂 ( 線 經漓部中央標挲局βχ消费合作社印狀 Λ 7 117 五、發明説明（） 基因組DΝΑ在氨基酸位置3 4 4上有2個鹽基的改變， 由C TG變成AAG，每一個樣本最初在1 0 0°C下加熱 4 5分鐘，緩衝液被預熱至4 5°C並且使得每一個樣本雜 交2 0分鐘，每一個樣本的成份係藉著使用G 7 5旋轉管 柱並在1 0 0 0 r p m下旋轉1分鐘而被分離，由野生型 基因組DNA樣本（圖5 A)所偵測到的螢光在5 2 5微 毫米下之相對強度係爲八倍高於突變基因組樣本（圖5 B )_的強度，使得野生型基因組樣本可與突變基因組樣本區 分出來。 實例4 此實例與實例3相似，除了下列細節以外。突變基因 組DNA樣本（SEQ I D N0 : 5 )係由野生型基因

組D NA在氨基酸位置3 4 4上有2個鹽基的改變，由C TG變成G C G，每一個樣本最初在1 〇 〇。(：下加熱1 5 分鐘，緩衝液被預熱至5 0°C並且使得每一個樣本雜交2 小時，每一個樣本的成份係藉著使用G 5 0旋轉管柱並在 1 2 0 0 r p m下旋轉1分鐘而被分離，由野生型基因組 DNA樣本所偵測到的螢光在5 2 5微毫米下之相對強度 係爲七倍高於突變基因組樣本的強度，使得野生型基因組 樣本（圖6 A)可與突變基因組樣本（圖6 B )區分出來 〇 實例5

此實例與其他實例相似，除了下列細節以外。D N A 334 4’，95oC30，25oC60，G50 本紙張尺度適用中國國家枕隼（CNS ) ( 2!0x^.：.> ;; T~ —— ("先閱讀背而之注"#項孙填寫本贫)

經濟部中央樣挲局β工消费合作社印製 Λ 7 )Μ 五、發明説明（） 此實例與實例3相似，除了下列細節以外。突變基因 組D N A樣本（S E Q I D N 0 : 6 )係由野生型基因組 D N A在氨基酸位置3 4 4上有3個鹽基的改變，由C T G變成T A C，每一個樣本最初在9 5°C下加熱3 0分鐘 ，緩衝液被預熱至2 5°C並且使得每一個樣本雜交6 0分 鐘，每一個樣本的成份係藉著使用G 5 0旋轉管柱並在7 5 0 r pm下旋轉2分鐘而被分離，如圖7A和7 B中所 示.，由野生型基因組DN A樣本（圖7 A )所偵測到的螢 光在5 2 5微毫米下之相對強度係爲十倍高於突變基因組 樣本（圖7 B)的強度，使得野生型基因組樣本可與突變 基因組樣本區分出來》 實例6 此實例與實例1相似，除了下列細節以外。1 0 0 pm Ο 1的實例1_中以營光素（PerSeptive Biosystem)標 定之 12 bp P N A > 2 5 pmol 的 150 bp 經 ?〇尺擴增的（13〇1^八，包括野生型（（：丁0)(3迟 Q I D N0 : 1 )及一個鹽基突變的DNA ( CAG， S E Q I D N 0 : 2，以及 CGG，SEQ ID NO :3 )以及1 1 5微升的緩衝液（〇 _ 5xTBE使用溶 液（0 · 0 2 2 5 M Trisborate/ 〇 . 〇 〇 〇 5 M EDTA) ，pH 6 · 5 )在室溫下被混合，該混合物接著在9 5° C下加熱3 0分鐘並且使之在室溫下雜交約1小時。 兩個作爲電極的金屬線被置於每一個樣本中，當在一 1〇mA的電流下的一5伏特之電壓被開啓及關閉以及電 ----------24. ___ 本紙張尺度適用中國國家枕專（CNS)A4^枯（2H)x247:,M; <誚1閱讀背而之注盘事項再填"本s )

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Y 經满部中央標奉局只工消费合作社印聚 A7 H7 __ 五、發明説明（） 極分離約7或8毫米時，螢光強度在5 2 5微毫米下偵測 ，當該電壓被施用時，DNA和DNA-P N A往陽極移 動，因爲D N A帶負電價，而未結合的p N A因爲爲中性 的所以不會移動。 圖8 A顯示野生型D N A的螢光光譜。在雜交於2 5 °C 1小時之後，溶液被轉移至一分光度管，該分光度管 被置於一螢光分光度計中並且兩個電極接著被置於該溶液 中_偵測以施用的電場下在5 2 5微毫米的波長時螢光強度 之變化，在5 2 5微毫米的螢光強度會隨著電壓的施用而 降低並且隨著電壓的移除而增加 。圖8 B和8 C顯示一個鹽基配對錯誤的DNA (分 別爲SEQ ID 1^0:2以及3£〇 ID NO: 3) 之螢光光譜，在2 5 °C下雜交1小時之後，突變的DNA 之螢光光譜顯示了與野生型DNA的光譜不同，當施用電 壓時，該強度會快速地增加，並且當電壓被移除時，該強 度會降低。 實例7 此實例與實例1相似，除了下列的細節以外。一 P 5 3野生型DNA(SEQ ID N0:7)之375 b P片段，一相對的375 bp突變型DNA片段（SEQ I D N 0 : 8 )，一相對的3 75 bp突變型DNA片 段（SEQ ID N0:9)以及633 bp的DNA 片段（S E Q I D N0 : 1 0 )是由P C R而得到的， 該3 7 5 b p野生型DNA包含一個DNA與來自實例1 ___ - HI 25…. — -- - 本紙張尺度適用中國國家栉準（CNS ) Λ4Α1,枯（>

(誚尤閱讀背而之注念狀項再填寫本TJO t 镍 經濟部中央橾隼局K工消f合作社印裝 Λ7 __H7 五、發明説明（） 之12個鹽基的PNA互補的目標序列，該633 bp的 D N A缺乏這種目標序列並被用作爲此實例中的負控制組 °SEQ I D N0 : 8與該野生型片段（S E Q ID NO : 7 )相同，除了在氨基酸位置3 4 4上D ΝΑ野生 型序列C T G改變爲C A G之點突變以外。S E Q ID N0:9與該野生型片段（SEQ ID NO:7)相同 ，除了在氨基酸位置3 4 4上D ΝΑ野生型序列C T G改 變_爲0 G G之點突變以外。 每一個樣本包括5 0 p m ο 1之各別的D Ν Α片段 ，200 pmol的PNA探針以及130微升的緩衝液 (pH 6·5之0·5χΤΒΕ)，每一個樣本在9 5° C下被加熱約3 0分鐘，接著每一樣本被允許在周圍溫度 (2 5 °C)下雜交1小時，在測量螢光之前，未結合的探 針會藉使用G 5 0管柱而由溶液中被過濾出來。 每一個樣本被置於一分光光度計中以偵測與目標基因 組D ΝA連接之螢光探針，如同先前的實例，對於包含完 全與該探針互補的DNA片段之樣本，在5 2 5微毫米下 的相對螢光強度是最高的，因此使得包含突變DNA片段 (圖9 B — 9 C )的樣本可與包含野生型D Ν A片段（圖 9 A )的樣本區分出來，如所預期的，該負控制組D Ν A 片段顯示了所有最低螢光強度（圖9D)。 實例8 一個臨床樣本是由一疑似患有已知在人類基因中已知 的區域(segment)內單一核苷酸突變所導致的疾病之個體中 .....- ______ 26 _—_一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4ί\νΐΜ 210x297^"! ' (誚尤閱靖背而之·江^^項4填is?本页)

經消·邓中央樣枣局K工消抡合作杜印裂 Λ 7 Η 7 _ 五、發明説明（） 所得到的，此基因區域的一片段係使用可以使該片段擴增 的引子來進行P C R而被擴增，不論該引子是否包括野生 型D N A或突變型D N A。 本發明提供一種1 2個鹽基的P NA探針，其與包含 突變核苷酸的突變型DNA片段之一部分互補，其中該突 變核苷酸具有一個與位於該探針中央的鹽基互補之鹽基， 該探針係以螢光素在其5 ’端上作標記。 .50 pm ο 1之由P CR所得到的DNA以及3 0 0 p m ο 1的P N A探針被加入1 〇 〇微升的緩衝溶液中 ，樣本接著被在9 5 °C下加熱3 0分鐘，然後該樣本被加 入預熱至3 0°C的緩衝液中並且允許雜交1小時。 樣本的成份係以G 5 0旋轉管柱藉由在6 0 0 r p m下旋轉2分鐘而分離，未雜交的Ρ ΝΑ是以一管柱來過 濾，並且包含雜交體和D Ν Α的液態培養基會通過該管柱 並被收集於一分光度管。 分光度管被置於一螢光分光計以偵測與該D Ν A連接 的螢光探針，若是該樣本在5 2 5微毫米下的螢光強度超 過預定的強度値時，則突變型D ΝA已在個體中被偵測到 ，若是該樣本在5 2 5微毫米下的螢光強度不超過預定的 強度値時，則突變型D Ν A不會在個體中被偵測到，該預 定強度値係先前使用負及正控制組樣本來校正分光計而測 得。 實例9 此實例與實例相似，除了下列細節以外。兩個未標定 — — —- — 27__ - ____— - — 本紙張尺度適用中國國家栉準（CNS )八规枯（2丨0χ·?Μϋ Ί 計先閱讀背而之注"事項"填寫本贫)

*1T Λ 7 Η7 * * **,__ I . ·. .Mil 五、發明説明（） 的D N A (―個爲野生型（SEQ ID N0:1)，另 —個爲突變型（SEQ ID N0:3))需要被鑑定， 一個探針被使用於鑑定該兩個未知的DNA，該探針係與 該突變型DNA(SEQ I D N0 : 3 )互補並具有下 列序列5’ CAT TCC GCT CTC (由 PerSeptive Biosystem 所合成）。 每一個樣本包括1 0 0 p m ο 1的探針，2 5 p m ο 1的DNA (野生型DNA或突變DNA)以及1 1 5 微升的緩衝液（0 · 5xTBE，pH6 . 5)在95°C 下被加熱3 0分鐘，接著使每一樣本在2 5 °C下雜交1小 時，在螢光測量之前，每一個樣本被轉移至一G 5 0管柱 中並在7 5 0 r p m下離心2分鐘，雜交體流經該管柱並 被收集在一分光度管中，而未雜交的探針則被過濾並保留 於該管柱中，該分光度管被置於螢光分光計中以作爲螢光 之測量。 如圖1 0 A和1 ο B中所示，在5 2 .5微毫米下的相 對螢光強度顯示在光譜上的顯著不同，具有較強螢光訊息 (圖1 0 A )的樣本被鑑定爲突變D N A ( S E Q ID N 0 : 3 ) ’具有較弱螢光強度的另一個樣本則爲野生型 D N A (SEQ ID N0:1)。 實例1 0 此實例與實例8相似，除了下列的細節以外。不同於 實例8中所使用的單一探針，在此實例中係使用兩個探針 ，第一探針爲實例8之探針，其係與該突變型D NA片段 "丨 —----- ^5L __ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) /\4叱枯（210X297^ ΐ . Γ 嫁 經滴部中央標嗥趵只工消费合作社印裝 經漪部中决搮擎局K工消资合作社印製 Λ 7 )\1 . — - — _____ „ ... ____ __ · 五、發明説明（〉 的一部分完全互補’第二探針與第一個探針相同，除了其 具有野生型核苷鹽基序列而非突變型核苷鹽基。該樣本的 第一部分根據實例8使用第一探針被釣得(probed)，與第一 部分大小相等的第二部分也類似地以第二探針被釣得，經 過變性、雜交以及分離之後，每一部分的螢光被測量，若 是該第一部分的螢光強度超過第二部分的強度時，則突變 型D NA已在個體中被偵測到，若是該第二部分的螢光強 度超過第一部分的強度時，則突變型D NA不會在個體中 被偵測到。 此實例的方法可適用於以包括一固體支持物之診斷裝 置，該固體支持物具有兩個結合於該支持物上不同區域之 相反型的P N A探針，該樣本不會分開，而是均勻地分散 於該支持物上以使其與兩種探針類型同等地接觸，該裝置 的兩個區域之螢光強度可以如實例9中的兩個分別的樣本 一般相同的方式比較之。 眚例1 1 生物素化(biotinylated)的雙股D N A ( S E Q ID N 0 : 1以及S E Q I D N 0 : 3 )是以P C R來擴增 ，單股DNA係使用Dynabeads (得自DYNAL公司） 如下所述而被製備。2 5微升的2 x結合及淸洗緩衝液（ 得自 Μ — 2 8 ◦ streptativan kit)以及 2 5 微升（2 5 pm ο 1 )的生物素化DNA ( S E Q ID NO: 2)被加 入2毫克的M — 2 8 Ostreptativan預先淸洗之dynabeads 中，混合物在室溫下培育1 5分鐘，並保持該玻璃珠懸浮 尺度適用中國國家彳:?:隼（CNS ) Λ4祕（210 — ("1閱讀背而之注念苹項4填寫本s )

-1T 線 經濟部中央標挲局β工消费合作社印狀 Λ 7 __J17 五、發明説明（） ，該混合物接著在室溫下被置於磁性粒子濃縮器（MP C ，Dynal公司）上2分鐘，然後以吸量管將上淸液移除， 20微升新鮮配製的0·1Ν NaOH被加入並且該混合 物保持在室溫下5分鐘，dynabeads係藉著使用Μ P C與位 於管邊上的固定化之生物素化股一同被收集，並且該N a 0 Η上淸液與非生物素化的單股D N A—同被轉移至一乾 淨之管中，該N a 0 Η上淸液是以2 _ 5微升新鮮配製的 〇 · 2 N H C 1而中和的。 2 0 0 p m ο 1的探針以及1 5 ◦微升的0 · 5 X T B E緩衝液被加入包含單股Ό NA的上淸液中，混合物 在9 4 °C下被加熱5分鐘且接著在室溫下培育1小時，經 過G50管柱在6 5 0 r pm下2分鐘之分離後，未結合 的P NA在管柱中過濾且雜交體會通過該管柱並收集於一 分光度管中，樣本被置於一螢光分光計中以偵測螢光，如 圖1 1 A和1 1 B中所示，單股野生型DNA樣本（圖1 1 A )在5 2 5微毫米下的相對螢光強度係爲五倍高於野 生型單股D N A (圖1 1 B)的強度。 啻例1 2 每一個樣本包括400 pmol的探針，100 ρ mol的DNA(SEQ ID N〇：1)以及100微 升的緩衝液（0 · 5xTBE ’ pH6 . 5)在95°C下 被加熱3 0分鐘，接著使每一樣本在2 5 °C下雜交1小時 ♦在螢光測量之前，每一個樣本被轉移至一G 5 0管柱中 並在7 2 0 r pm下離心2分鐘，雜交體流經該管柱並被 __________30-- —___________ 本紙張尺度適用中國國家栉隼（CNS ) 枋（2丨(> X Μ 邻先間讀背而之注f項存填将本茛) 訂 Λ7 H7 五、發明説明（） 收集在一分光度管中，而未雜交的探針則被過濾並保留於 該管柱中，該分光度管被置於螢光分光計中以作爲螢光之 測量。 如圖1 2 A和1 2 B中所示，在5 2 5微毫米下的相 對螢光強度顯示在光譜上的顯著不同，具有較強螢光訊息 (圖1 2 A)的樣本顯示與野生型D N A ( S E Q ID NO : 1 )有完全配對之探針雜交，具有較弱螢光強度（ 圖1 2 B )的另一個光譜則顯示與野生型D N A ( S E Q I D N 0 : 1 )之探針雜交有一個鹽基對配對錯誤》 實例1 3 具有相同染料（螢光素）的PNA探針與兩個不同股 上的完全配對的目標雜交。 實例1 3 a : 一個完全與一目標序列配對之探針。 經漓部中央標準局β工消资合作社印裝 誚1間讀背而之注;&:事項再填^?本页) 一個來自突變型p 5 3 DNA ( S EQ ID NO :11)的基因組DNA之150 bp片段是藉由PCR 而擴增並且使用QIAquickP C R純化kit ( Q I A G E N 公司，Chatsworth，CA，USA)而被純化的，該突變的片段 係與野生型片段（S E Q I D N 0 : 1 )相同，除了在 氨基酸位置3 4 0 (即鹽基8 8 — 9 0 )上的兩個鹽基突 變以外，在該位置上D N A野生型序列A T G會轉變成G A G。 —個12—me r的P N A探針（探針N 〇 . 1 )是 由 Framingham，MA，USA 之 PerSeptive Biosystem 公司所 合成的，該探針具有如下之結構： :________31__________________ 本紙張尺度適用中國國家槐專（CNS ) Λ復#, ( 2丨 經满部中央橾準局只工消坨合作社印¾ Λ7 Η 7 五、發明説明（） 5’ H-Fluo-O-CAT TCA GCT CTC Lys-CONH2， 其被設計與150 bp的p53 ME DNA之1 2個核苷酸的片段互補，其起始於鹽基對位置9 5並結束 於鹽基對位置106(SEQ ID N〇：ll)。 0 . 5 x T B E 溶液（0 · 0 2 2 5 M Tris—硼酸鹽 /0.0005M EDTA，pH6.5)用於作爲雜交 緩衝液，5 pmol 的 DNA(SEQ ID Ν Ο ： 1 1 )被加入1 1 5微升的0 · 5 x Τ Β Ε緩衝液中，接著 2.5 pm ο 1的探針Νο . 1加入該溶液中，樣本在9 5°C下被加熱1 〇分鐘並且在2 5°C下雜交3 0分鐘》 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 (購自 Pharmacia Biotech, AB，Uppsala, Sweden)由該溶液 中過濾出來，具有P N A _ D Ν A的雜交體之溶液被置於 一分光度管中並受到螢光的測量。 圖13A顯示5 pmol的DNA(SEQ ID NO: 11)與2. 5 pmol的探針No · 1雜交的螢 光光譜，在5 2 5微毫米下有一波峰。 實例1 3 b : 一個完全與一目標序列配對之探針。 一個12—me r的PNA探針（探針No · 2)是 由PerSeptive Biosystem公司所合成的，該探針具有如下之 結構： 5’ H-Fluo-O-TCG AGG AGT TCC Lys-CONH2， 其被製備與Μ E DNA股的一目標完全互補，該Μ E DNA係與目標在實例13 a上的股互補，其起始於鹽 _____________32_________________...._

本紙張尺度適用中國國家榡隼（CNS ) Λ4Μ!,格（2I0X 2W公JIM (邻^閱请背而之注念事項再填巧本否)

經濟部中央樣隼局只工消费合作社印敕 Λ7 ___ J!7 五、發明説明（） 基對位置8 3並結束於鹽基對位置9 4 ( S EQ I D N 〇·· 1 1 )。 5 pmol的DNA(SEQ ID NO：11) 被加入1 1 5微升的〇 ♦ 5 x T B E緩衝液中，接著探針 加入該溶液中，樣本在9 5 °C下被加熱1 〇分鐘並且在2 5°C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P N A — D N A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量^ 圖13B顯示5 pmol的DNA(SEQ ID N〇：11)與5 pmol的探針Ν ο . 2雜交的螢光光 譜。

Mm i3c：一個完全與一目標序列配對之探針。 5 pmol的DNACSEQ ID NO：11) 被加入1 1 5微升的0 . 5 x T B E緩衝液中，接著2· 5 p m ο 1的探針Ν 〇 . 1以及5 p m 〇 .1的探針Ν 〇 . 2加入該溶液中，樣本在9 5 °C下被加熱1 〇分鐘並且在 2 5°C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的 探針藉著G 5 0旋轉管柱由該溶液中過濾出來，具有P N A — D ΝA的雜交體之溶液被置於一分光度管中並受到螢 光的測量。 圖13C顯示5 pmol的DNACSEQ ID 1^〇:11)與2.5 pmol 的探針Ν ο · 1 以及 5 —JL___________33. __________…___ 本紙張尺度適用中國國家打:專（CNS ) Λ4现彳ft ( 2]0乂；^公丨;，） (对尤閲讀背而之注^麥項#4{:ib本页)

Λ7 _________H7 —— — ______- 五、發明説明（） P m 0 1的探針N 0 . 2雜交的螢光光譜，如圖1 3 C中 所示’在5 2 5微毫米下的螢光強度大約是圖1 3 A和1 3 B中在5 2 5微毫米下強度之總合。 實例1 4 兩個具有不同染料（營光素及驗性蕊香紅(rhodamine) )的P N A探針，該等染料係與一完全配對的目標雜交。 窗例Ί 4 a 由野生型 p 5 3 D N A ( S E Q ID N 0 ： 1 ) 而來的基因組DNA之150 bp的片段係藉由PCR來 擴增並且藉著使用QIAquick P C R純化套組(kit)。 —個1 2 —m e r以鹼性蕊香紅標定之P NA探針（ 探針N 〇 . 3 )係由PerSeptive Biosystems公司所合成的 ，具有以下結構： 5’ H-Rho-CAT TCA GCT CTC L y s - C Ο N H2， 經消部中央標4*-局Η工消费合作社印¾ (对先間讀竹而之注&事項4填本頁)

C 其被設計爲與150 bp的p53 DΝΑ之12個 核苷酸片段互補，係由鹽基對位置9 5起始而在鹽基對位 置1 0 6 (參見 SEQ ID ΝΟ:1，11，以及1 2 )終止。 20 pmol 的DNA(SEQ ID Ν Ο ： 1 ) 被加入50微升的0.5χΤΒΕ緩衝液中，接著20 ρ m ο 1的探針Ν ο · 3加入該溶液中，樣本在9 5 °C下被 加熱1 0分鐘並且在2 5 下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 ______34-______________ 本紙伕尺度適用中國國家樣準（CNS ) AW.UM 2丨0><2^7公# ) 經滅部中央橾嗥跔只工消开合作社印¾ Λ 7 1Π _____ 五、發明説明（） 由該溶液中過濾出來，具有P N A - D N A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖1 4 A顯示與鹼性蕊香紅標定的P N A探針雜交的 D N A之螢光光譜，在螢光光譜中的放射波峰出現於5 8 0微毫米下。 啻例1 4 b 20 pmol 的DNA(SEQ ID Ν Ο ： 1 ) 加入5 0微升的0 _ 5 x T B E緩衝液，接著1 5 p m ο 1的鹼性蕊香紅標定之探針（探針Ν ο · 3)以及5 pm ο 1的螢光素標定之探針（探針Ν ο · 1 )被加入該溶液 中，樣本在9 5°C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P Ν A — D Ν A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖1 4 B顯示與鹼性蕊香紅標定的ρ Ν A探針（Ν 〇 .3 )以及螢光素標定的ρ Ν A探針（探針Ν 〇 . 1 )之 混合探針雜交的D Ν A之螢光光譜，一個在5 8 0微毫米 下出現的肩部(shoulder)係至少一部分由於該鹼性蕊香紅標 定與目標序列雜交之緣故，並且一個在5 8 0微毫米下出 現的波峰係部分由於該螢光素標定的探針與目標序列雜交 所致。 實例]5

兩個具有不同染料（螢光素以及鹼性蕊香紅）的P N 本紙張尺度適用中國國家栉準（CNS ) 210x^1 "- (Jl?5t間讀背而之注念事項再填寫本s ) *1Τ Γ ]17 .__ ]17 .__ 經漪部中央標挲局工消费合作社印裝 Λ7 五、發明説明（） A探針與兩個在兩股上完全配對的目標雜交。 啻例1 5 a 20 pmol的DNA(SEQ ID NO:11 )加入5 0微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著2 0 p m o 1的鹼性蕊香紅標定之探針（探針N o · 3 )被加入該 溶液中，樣本在9 5 ° C下加熱1 0分鐘並接著使該樣本在 25°C下雜交30分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有PNA — DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖1 5 A顯示與鹼性蕊香紅標定的P N A探針（N 〇 • 3 )雜交的DNA之螢光光譜，一個在5 8 0微毫米下 出現的寬廣波峰係由於被鹼性蕊香紅標定之雜交複合物所 致。 窗例1 b 20 pmol 的DNA(SEQ ID NO :11 )加入5 0微升的0 · 5 xTB E緩衝液，接著2 0 pm ο 1的鹼性蕊香紅標定之探針（探針N ο . 3)以及5 p m ο 1的螢光素標定之探針（探針N 〇 · 2 )被加入該溶 液中，樣本在9 5 °C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本在2 5°C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有PNA-DNA的雜交體之溶 本紙乐尺度適用中國國家榡準（CNS ) Λ4Α#,( 210x297^1 (請t閱讀开而之注念事項#填寫本頁)

經漭部中央標洚局只工消费合作社印聚 Λ7 _____Ii7 ____ 五、發明説明（) 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖1 5 B顯示與探針No . 2及No . 3雜交的DN A之螢光光譜，一個在5 8 0微毫米下出現的寬廣波峰係 由於被鹼性蕊香紅標定之探針所致，並且一個在5 2 5微 毫米下出現的波峰係由於被螢光素標定的探針所致。 窨例1 6 一個經P C R擴增以及純化的缺乏一目標序列之6 3 3bp DNA(SEQ ID Ν0:1〇)被用作爲探 針的負控制組。 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 1 〇 ) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著探針Ν ο s · 1 — 3被加入該溶液中，樣本在9 5°C下加熱1 〇分 鐘並接著使該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P ΝA — DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖1 6 A顯示單獨探針之螢光光譜（也就是說，沒有 DNA加入樣本中，其包括15 pmol的探針一5 p m ο 1之每一探針Ν 〇 s . 1，2及3)。 圖1 6 B顯示5 p m ο 1的探針Ν ο · 1以及負控 制組D NA(SEQ ID NO: 10)之螢光光譜。 圖16C顯示5 pm ο 1的探針Ν 〇 . 2以及負控 制組D NA(SEQ ID NO: 10)之螢光光譜。 圖1 6 D顯示5 pm ο 1的探針Ν 〇 . 3以及負控 ^^___三7一 __________________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 210λ ) 請尤間讀背而之注念卞項#填寫本S ) ,11 Λ7 Π7 五、發明説明（ 制組D NA(SEQ ID NO: 10)之螢光光譜。 ih 尤 閱 讀 背 而 之 注 事 項 η- 填 本 頁 所有光譜顯示在5 2 5微毫米以及5 8 0微毫米的背 景程度下之螢光強度》 實例1 7 兩個具有相同的染料（螢光素）之P NA探針與一個 單一鹽基錯誤配對的目標序列以及一個完全配對的目標序 列雜交。 實例1 7 a 訂 由p53 DNA基因MQ(SEQ ID N0:1 2)而來的基因組DNA之150 bp的片段是由PCR 所擴增並且藉著使用QIAquickP C R純化套組而被純化， 該突變的片段與Μ E D N A ( S E Q ID Ν Ο ： 1 1 )相同，除了一個在氨基酸位置3 40 (鹽基88 — 90 )上的單一鹽基突變以外，其D ΝA序列C T C變成G T C。 線 經濟部中央標4'·局β工消费合作社印製 5 pmol 的DNA(SEQ I D N 0 ： 12) 加入11 5微升的0.5xTBE緩衝液，接著5 pm 〇 1的探針No · 2(其與目標序列單一鹽基對有錯誤配對） 被加入該溶液中，樣本在9 5。(：下加熱1 〇分鐘並接著使 該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P Ν A — D Ν A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。

圖 17A顯示5 pmol 的DNA(SEQ ID 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) ( 210/2们公# 經滴部中央標準局另工消费合作社印製 Λ7 ____H7 — ____ 五、發明説明（） N〇：12)與5 pmol的探針N 〇 · 2雜交之螢光光 譜，該光譜顯示在背景程度下的螢光強度。 眚例1 7 b 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 12) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著探針N ο • 1被加入該溶液中，該探針與D Ν Α目標完全配對，樣 本在9 5°C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本在2 5°t下 雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P ΝA-DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖 17B顯示5 pmol 的DNA(SEQ ID N〇：12)與5 pmol的探針No· 1雜交之螢光光 譜，在5 2 5微毫米下的正訊息(positive signal)淸楚地顯 示於圖1 7 B中。 實例1 7 c 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 12) 加入1 1 5微升的0 . 5 x T B E緩衝液，接著5 p m ο 1的探針No · 1以及5 pmo 1的探針No . 2被加入 該溶液中’樣本在9 5°C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本 在2 5°C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P NA — DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 --—________3-9-_____________________ 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Λ4Μ!,估（2丨0 X 2” ) ("1閱讀背而之注意事項4填将本茛)

117 _____ 117 _____ 經濟部中央橾4*'局只工消费合作社印裝 Λ 7 五、發明説明（） 圖17C顯示5 pmol的DNA(SEQ ID N〇：12)與5 p m ο 1的探針Ν ο . 1及5 ρ m ο 1的探針No·2雜交之螢光光譜，在525微毫米下的 螢光強度約與顯示於圖1 7 B中的強度相等。 實例1 8 兩個具有不同染料（螢光素以及鹼性蕊香紅）的Ρ N A探針與一個單一鹽基配對錯誤的目標以及一個完全配對 的目標雜交。 實例1 8 a 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 12) 加入11 5微升的0· 5 xTBE緩衝液，接著5 pm ο 1的鹼性蕊香紅標定之探針（探針Ν ο · 3 )被加入該溶 液中，該探針與目標序列完全配對，樣本在9 5 °C下加熱 1 0分鐘並接著使該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有PNA — DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖 18A顯示5 pmol 的DNA(SEQ ID NO :12)與5 pmol的探針Ν ο · 3雜交之螢光光 譜，在5 8 0微毫米下的正訊息(positive signal)淸楚地顯 示於圖1 8 A中。 實例1 8 b 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 12) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著5 p m ο - -——________________ __________40-- ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4蚍格（210χ … ("1閲讀背而之注&事項#填寫本莨) *1Τ Λ7 M7 _ 五、發明説明（） 1的探針N 〇 . 3 (其完全與目標序列配對）以及5 pm 〇1的探針No.2(其與目標序列有單一鹽基對錯誤配 對）被加入該溶液中，該探針與目標序列完全配對，樣本 在9 5°C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本在2 5°C下雜 交3〇分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P NA-DNA的雜交體之溶 液_被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖18B顯示5 pmol的DNA(SEQ ID N〇 : 1 2 )與5 pm ο 1 的探針Ν ο . 3及 5 ρ m ο 1的探針Ν ο · 2雜交之螢光光譜，在5 2 5微毫米下的 螢光強度約與顯示於圖1 8 Α中的強度相等。 實例1 9 三個具有相同的染料（螢光素）的PNA探針與兩個 單一鹽基對錯誤配對之目標序列以及一個完全配對的目標 雜交。 奮例1 Q a 經滴部中央樣準局月工消费合作社印鉍 (誚Jt間讀背而之注念事項·#填寫本页) 由P53 〇1^八基因〇尺（5£〇 ID N 0 ： 1

3 )而來的基因組DNA之1 5 Ό b ρ的片段是由P C R 所擴增並且藉著使用QIAquickP C R純化套組而被純化， 該突變的片段與ME DNA(SEQ ID NO: 11 )相同’除了一個在氨基酸位置3 4 〇 (鹽基8 5 - 8 7 )上的單一鹽基突變以外，其DNA序列CTG變成CG G。 本紙張尺度適财關緖準（CNS ) — ( 'ίί Ί —… 經漭部中央樣準局β工消费合作社印裝 Λ7 ........- ·__. - - ' '»' ·* 五、發明説明（） 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 13) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著5 p m ο 1的探針N ο · 1 (其與目標序列在鹽基對位置1 〇 1上有 單一鹽基錯誤配對)被加入該溶液中，樣本在9 5°C下加 熱1 0分鐘並接著使該樣本在2 5。(：下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P N A — D N A的雜交體之溶 液_被置於一分光度管中並受到螢光的測量。

圖 19A顯示5 pmol 的 DNA(SEQ ID NO: 13)與5 pmol的探針Ν ο . 1雜交之螢光光 譜，該光譜顯示在5 2 5微毫米的背景程度下的螢光強度 〇 實例1 Q b 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 13) 加入1 1 5微升的0 · 5 xTBE緩衝液，接著5 pm ο 1的探針No · 2(其與目標序列在鹽基對位置8 5上有單 一鹽基錯誤配對)被加入該溶液中，樣本在9 5 °C下加熱 1 0分鐘並接著使該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有P Ν A - D Ν A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖 19B顯示5 pmol 的DNA(SEQ ID NO: 13)與5 pmol的探針Ν ο . 2雜交之營光光 譜，該光譜顯示在5 2 5微毫米的背景程度下的螢光強度 ______42----------- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) ( 2IOX297公尨） (¾1間讀背而之注念事項'"填寫本页)

經滴部中央標準局β工消费合作社印製 Α7 Π7 五、發明説明（）

實例1 9 C 5 pmol的DNA(SEQ ID NO： 13) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，一個1 2 - m e r以螢光素標定之PNA探針（探針Ν ο · 4 )係由 PerSeptive Biosystems公司所合成的，具有以下結構： 5’ H-fluo-Ο — CAT TCC GCT CTC L y s - C 0 N H2， 其被設計爲與SEQ ID NO:13的12個核苷 酸片段互補，其係由鹽基對位置9 5起始而在鹽基對位置 1 0 6終止。此探針被加入該溶液中，樣本在9 5 °C下加 熱10分鐘並接著使該樣本在2 5 °C下雜交3 0分鐘》 在測量營光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有PNA-DNA的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量。 圖19C顯示5 pmol的DNA(SEQ ID NO:13)與5 pm ο 1的探針Νο · 4雜交之螢光光 譜，在5 2 5微毫米下的正訊息(positive signal)淸楚地顯 示於圖1 9 C中。 窗例1 9 d 5 pmol的DNA(SEQ ID NO：13) 加入1 1 5微升的0 · 5 x T B E緩衝液，接著5 P m ο 1的探針No . 1以及5 pm ο 1的探針No . 2被加入 該溶液中，樣本在9 5 °C下加熱1 〇分鐘並接著使該樣本 本紙張尺度適用中國國家掠隼（CNS > Λ4况枯（ Γ ,--0 (邻1閱讀背而之注念f項洱填寫本I)

經濟部中央標準局sc工消费合作社印¾ Λ7 __________ li7 五、發明説明（） 在2 5°C下雜交3 0分鐘。 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有Ρ Ν Α - D Ν Α的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到螢光的測量》 圖19 D顯示 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO :13)與5 pmol的探針No. 1以及5 pm ο 1的探針Ν ο · 2雜交之螢光光譜，該光譜顯示在5 2 5_微毫米的背景程度下的螢光強度。 實例1 9 e 5 pmol 的DNA(SEQ ID NO： 13) 加入11 5微升的0· 5xTBE緩衝液，接著5 pm ο 1的探針Ν ο . 1，5 ρ m ο 1的探針Ν ο · 2以及5

pm ο 1的探針Ν ο · 4被加入該溶液中，樣本在9 5 °C 下加熱1 0分鐘並接著使該樣本在2 5°C下雜交3 0分鐘 〇 在測量螢光之前，未結合的探針藉著G 5 0旋轉管柱 由該溶液中過濾出來，具有Ρ Ν A - D Ν A的雜交體之溶 液被置於一分光度管中並受到營光的測量。 圖 1 9 E 顯示Q R D N A ( S E Q ID Ν Ο ： 1 3)與ΡΝΑ探針Nos . 1，2以及4雜交之螢光光譜 ，在5 2 5微毫米下的螢光強度約與顯示於圖1 9 C中的 強度相等。 雖然本發明已參考其實例被詳細地敘述，但對於熟諳 此技藝人士而言明顯的是對本發明可有不同的改變以及修 本紙张尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4见格（2I0X 2们1 (計1間讀背而之注念事項再填寫本頁)

經满部中央標準局K工消费合作社印狀 Λ 7 Η7 五、發明説明（） 飾而不背離其精神及範疇。 SEQUENCE LISTING ⑴一般資料： (i) 申請人：Eileen Nie and Yuan Min Wu (ii) 發明名稱：PNA偵測方法 脚序列數目：13 (iv) 連絡地址： (A) 收件名：Caesar, Rivise，Bernstein，Cohen & Pokotilow，Ltd. (B) 街道：12th Floor, 7 Penn Center，1635 Market Street (C) 城市：費城(Philadelphia) (D) 州：賓州(Pennsylvania) (E) 國家：美國U. S. A. (F) 郵遞區號：19103-2212 (v) 電腦可讀取格式： (A) —般型式：磁片(Floppy disk) (B) 電腦：IBM PC 相容型(compatible)

(〇 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D)軟體：Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) 現在的申請資料： (A) 申請號碼： (B) 申請曰期： ⑽代理人/代辦人資料： (A)名稱：Tener，David M. 本紙張尺度適用中國國家榡挛（CNS ) Λ4况怙（2丨0X24957公)丨） (β1間讀背而之注&事項再填ft?本頁)

Λ7 \ΪΊ 五、發明説明（） (B) 登記號碼：37,054 (C) 參考/DOCKET 號碼：E1047/20001 (ix)電信撕： (A) 電話：215-567-2010 (B) 電訊傳真：215-751-1142 (2) SEQIDNO:l 的資料： (i)序列的特性： • (A)長度：150個鹽基 (B) 麵： (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 ⑼分子種類：基因組DNA ⑽序列說明：SEQIDNO:l : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG TTCCGAGAGC TGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AACH3ATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2)SEQIDNO:2 : (i)序列的特性： (A) 長度：150個鹽基 (B) 麵： (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態(TOPOLOGY):線型 (xi)序列說明：SEQIDNO:2 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4i见枯（210X297公JlTT 劝51閱讀背而之注¾亊項#填鸿本頁)

T 經洸部中央樣聿局β工消f合作·社印製 經濟部中央標隼局只工消费合作社印¾ Λ7 Η7 _五、發明説明（） CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG TTCCGAGAGC AGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2) SEQIDNO:3 的資料： ①序列的特性：(A) 長度：150個鹽基 (B) mm mm (c)股：雙股 -(D)拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQIDNO:3 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCC AAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG TTCCGAGAGC CXjAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150(2) SEQBDNO:4 的資料： (i)序列的特性： (A)長度：150個鹽基 (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態··線型⑽序列說明·_ SEQIDNO:4 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG 1TCCGAGAGA AGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150(2) SEQIDNO:5 的資料： (i)序列的特性： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 2ΙΟΧ2Μ公坏） 誚先閱讀背而之注意事項#填寫本頁)

T

*1T 線 經满部中央橾準局只工消费合作社印聚 Λ 7 ___ Η7 五、發明説明（） (A) 長度：150個鹽基 (B) 麵： (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQIDNO:5 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG TTCCGAGAGG CGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2) SEQIDNO:6 的槲： (i)序列的特性： (A) 長度：150個鹽基 (B) 種類：核苦酸 (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQIDNO:6 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCGTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG TTCCGAGAGT ACAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2) SEQIDNO:7 的搠： (0序列的特性： (A) 長度：375個嫌基 (B) mm · mm (c)股：雙股 (D)拓樸形態：線型 本紙張尺度適用中國國家掠準（CNS ) ( 210Χ ) (誚1閱讀背而之注念事項再填寫本頁) .

*1T 經濟部中央標準局Μ工消费合作社印¾ Μ ____ Η7 _ 五、發明説明（） (xi)序列說明：SEQIDN0:7 : TTAATACGAC TCACTATAGG GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTCCCCTCT AGAAATAATT 60 TTGTTTAACT TTAAGAAGGA GATATACC AT GGGCC ATCAT CATC ATCATC ATC ATC ATCA 120 TCACAGCAGC GGCCATATCG ACGACGACGA CAAGCAAACA CCAGCTCCTC TCCCCAGCCA 180 AAGAAGAAAC CACTGGATGG AGAATATTTC ACCCTTCAGA TCCGTGGGCG TGAGCGCTTC 240 GAGATGTTCC GAGAGCTGAA TGAGGCCTTG GAACTCAAGG ATGCCCAGGC TGGGAAGGAG 300 CCAGGGGATC CGGCTGCTAA CAAAGCCCGA AAGGAAGCTG AGTTGGCTGC TGCCACCGCT 360 GAGCAATAAC TAGCA 375 (2) SEQIDNO:8 的資料： ⑴序列的特性： (A) 長度：375個鹽基 (B) mm ： mm (c)股：雙股 (D)拓樸形態：線型 ⑽序列說明：SEQIDNO:8 : TTAATACGAC TCACTATAGG GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTCCCCTCT AGAAATAATT 60 TTGTTTAACT TTAAGAAGGA GATATACCAT GGGCCATCAT CATCATCATC ATCATCATCA 120 TCACAGCAGC GGCCATATCG ACGACGACGA CAAGCAAACA CCAGCTCCTC TCCCCAGCCA 180 AAGAAGAAAC CACTGGATGG AGAATATTTC ACCCTTCAGA TCCGTGGGCG TGAGCGCTTC 240 GAGATGTTCC GAGAGCAGAA TGAGGCCTTG GAACTCAAGG ATGCCCAGGC TGGGAAGGAG 300 CCAGGGGATC CGGCTGCTAA CAAAGCCCGA AAGGAAGCTG AGTTGGCTGC TGCCACCGCT 360 GAGCAATAAC TAGCA 375 (2) SEQ ID NO:9 的資料： (i)序列的特性： 19 _______________ __ - 本紙张尺度適用中國國家桮準（CNS ) Λ4Μ1,枯（210x 公々) (誚1間®.背而之注意事項#填疼本頁)

經濟部中央樣準局只工消费合作社印製 Λ7 ___H7 ___ 五、發明説明（） (A) 長度：375個鹽基 (B) mm · mm (c)股：雙股 (D)拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQIDN0:9 : TTAATACGAC TCACTATAGG GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTCCCCTCT AGAAATAATT 60 TTGTTTAACT TTAAGAAGGA GATATACCAT GGGCCATCAT CATCATCATC ATCATCATCA 120 TCACAGCAGC GGCCATATCG ACGACGACGA CAAGCAAACA CCAGCTCCTC TCCCCAGCCA 180 AAGAAGAAAC CACTGGATGG AGAATATTTC ACCCTTCAGA TCCGTGGGCG TGAGCGCTTC 240 GAGATGTTCC GAGAGCGGAA TGAGGCCTTG GAACTCAAGG ATGCCCAGGC TGGGAAGGAG 300 CCAGGGGATC CGGCTGCTAA CAAAGCCCGA AAGGAAGCTG AGTTGGCTGC TGCCACCGCT 360 GAGCAATAAC TAGCA 375 (2) SEQIDNO:10 的資料： (i)序列的特性： (A) 長度：633個鹽基 (B) 麵：餅酸 (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO:10 : CCGGCGGCCC CTGCACCAGC CCCCTCCTGG CCCCTGTCAT CTTCTGTCCC TTCCCAGAAA 60 ACCTACCAGG GCAGCTACGG TTTCCGTCTG GGCTTCTTGC ATTCTGGGAC AGCCAAGTCT 120 GTGACTTGCA CGTACTCCCC TGCCCTCAAC AAGATGTTTT GCCAACTGGC CAAGACCTGC 180 CCTGTGCAGC TGTGGGTTGA TTCCACACCC CCGCCCGGCA CCCGCGTCCG CGCCATGGCC 240 ATCTACAAGC AGTCACAGCA CATGACGGAG GTTGTGAGGC GCTGCCCCCA CCATGAGCGC 300 _________s〇_______________________ _____ __________ 本紙張尺度適用中國國家枕準（CNS > 2I0X 2M7公) (讀尤閱讀背而之注意ΐ項再填ΪΪ?本頁)

經濟部中央橾麥为月工消费合作社印试

-SL Λ7 Η 7 五、發明説明（） TGCTCAGATA GCGATGGTCT GGCCCCTCCT CAGCATCTTA TCCGAGTGGA AGGAAATTTG 360 CGTGTGGAGT ATTTGGATGA CAGAAACACT TTTCGACATA GTGTGGTGGT GCCCTATGAG 420 CCGCCTGAGG TTGGCTCTGA CTGTACCACC ATCCACTACA ACTACATGTG TAACAGTTCC 480 TGCATGGGCG GCATGAACCG GAGGCCCATC CTCACCATCA TCACACTGGA AGACTCCAGT 540 GGTAATCTAC TGGGACGGAA CAGCTTTGAG GTGCGTGTTT GTGCCTGTCC TGGGCGCGCA 600 CGGCGCACAG AGGAAGAGAA TCTCCGCAAG 633 (2) SEQIDNO:ll 的資料： _(0序列的特性： (A) 長度：150個鹽基 (B) 麵：餅酸 (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 ⑽序列說明：SEQIDN〇:ll : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGGAG TTCCGAGAGC TGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2) SEQIDNO:12 的資料： (0序列的特性： (A) 長度·· 150個鹽基 (B) 麵：贿酸 (C) 股：雙股 (D) 拓樸形態：線型 (xi)序列說明：SEQ IDNO:12 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4坭栴（210X297公片 (請先閱讀背面之注意事項再填转本頁)

A1 暴7 五、發明説明（） CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCX3AGCAG TTCCGAGAGC TGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (2) SEQIDNO:13 的資料： ⑴序列的特性： (A) 長度：150個鹽基 (B) ^ ： mm (C) 股：雙股 -(〇)拓樸形態:顏 ⑽序列說明：SEQ IDNO:13 : AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT 60 CAGATCCGTG GGCGTGACK：G CTTCCAGGAG TTCCGAGAGC GGAATGAGGC CTTGGAACTC 120 AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 150 (諳先閱讀背面之注項再填寫本頁) 裝-

'1T 經濟部中央樣準局只工消费合作社印¾ 本紙張尺度適用中國國家棣率（CNS ) Λ4規格（210X297公棼）

Claims (1)

1. 公 申脅1專利範圍 A8 B8 C8 D8 1.一種用於偵測在一液態培養基中一個單股或雙股 核苷酸目標序列之方法，該方法包括： ‘在該液態培養基中加入一個可與該目標序列形成雜交 複合體之P NA探針，其中該探針包含一螢光標記； 由該雜交複合體中分離出未雜交的P NA探針，以形 成一測試培養基； 以一雷射光束照射該測試培養基，該雷射光束具有一 種襻發該螢光標記並使得該螢光標記放射螢光之波長； 測量該放射的螢光之強度；並且 與一正控制組序列之參考強度比較該測量的強度，以 偵測是否該液態培養基包括該目標序列， ，其中該測量的強度與該目標序列以及該P NA探針間 的鹽基錯誤配對之數目呈反比，其超過含有0個鹽基錯誤 配對到3個鹽基錯誤配對之範圍，並且其中除了該分離步 驟以外的該方法係完全不需結合該P N A探針、該核s，苦酸 序列或該雜交複合體至一固體支持物或膠體而進行。 經濟部中央揉率為貝工消费合作社印装 -----------II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- 2 ·根據申請專利範圔第1項之方法，其中該分離係 藉由過濾、離心、沉澱以及自由瑢液電泳而完成的。 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該雷射光 束具有4 5 0到5 3 0微毫米之波長。 4 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該放射的 〆 螢光係在4 0 0到1 0 0 0微毫米之範圍下被測！:、。 5\根據申請專利範圍第1項之方法，其中兩個不同 的可與該目標序列形成雜交複合體之P NA探針被加入該 本紙浪尺度逋用中因國家揉率（CNS >A4规格（210X297公釐） 公 申脅1專利範圍 A8 B8 C8 D8 1.一種用於偵測在一液態培養基中一個單股或雙股 核苷酸目標序列之方法，該方法包括： ‘在該液態培養基中加入一個可與該目標序列形成雜交 複合體之P NA探針，其中該探針包含一螢光標記； 由該雜交複合體中分離出未雜交的P NA探針，以形 成一測試培養基； 以一雷射光束照射該測試培養基，該雷射光束具有一 種襻發該螢光標記並使得該螢光標記放射螢光之波長； 測量該放射的螢光之強度；並且 與一正控制組序列之參考強度比較該測量的強度，以 偵測是否該液態培養基包括該目標序列， ，其中該測量的強度與該目標序列以及該P NA探針間 的鹽基錯誤配對之數目呈反比，其超過含有0個鹽基錯誤 配對到3個鹽基錯誤配對之範圍，並且其中除了該分離步 驟以外的該方法係完全不需結合該P N A探針、該核s，苦酸 序列或該雜交複合體至一固體支持物或膠體而進行。 經濟部中央揉率為貝工消费合作社印装 -----------II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- 2 ·根據申請專利範圔第1項之方法，其中該分離係 藉由過濾、離心、沉澱以及自由瑢液電泳而完成的。 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該雷射光 束具有4 5 0到5 3 0微毫米之波長。 4 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該放射的 〆 螢光係在4 0 0到1 0 0 0微毫米之範圍下被測！:、。 5\根據申請專利範圍第1項之方法，其中兩個不同 的可與該目標序列形成雜交複合體之P NA探針被加入該 本紙浪尺度逋用中因國家揉率（CNS >A4规格（210X297公釐） A8 B8 C8 D8 經濟部中央橾準局貞工消费合作社印製 六、申請專利範圍 液態培養基中，該兩個不同的P N A探針之第一探針係與 第一核苷酸目標序列之第一片段互補，該兩個不同的P N A探針之第二探針係與第二核苷酸目標序列之第二片段互 補，且該第一與第二片段彼此互不、相同。 6 ·根據申請專利範圍第5項之方法，其中該第一與 第二個探針係分別與該第一與第二片段完全互補v 7 ·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該第一核 苷酸序列係與該第二核苷酸序列互補。 8 ·根據申請專利範圍第7項之方法，其中該第一核 苷酸序列與第二核苷酸序列係偶合爲雙股DNA。 9 ·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該第一核 苷酸序列與第二核苷酸序列係位於不同的基因組上。 1 0 ·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該第一 探針具有一個在第一波長下有第一螢光放射強度之第一標 記，該第二探針具有一個在第二波長下有第二螢光放射強 度之第二標記，該第一與第二波長係爲不同，該第一核苷 酸序列係藉著在該第一波長下監測營光放射強度而被偵測 ，且該第二核苷酸序列係藉著在該第二波長下監測螢光放 射強度而被偵測。 1 1 ·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該第二 探針具有一個在第二波長下有第二螢光放射強度之第二標 記，該第一與第二波長係爲不同，該第一核苷酸序列係藉 著在該第一波長下監測螢光放射強度來偵測，且該第二核 苷酸序列係藉著在該第二波長下監測螢光放射強度來偵測 ___2____ 本纸張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------^-I.-IΛ 衮------t------f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉率局負工消费合作社印*. A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 〇 12.根據申請專利範圍第11項之方法’其中該第 一核苷酸序列係爲一正控制組，其預期爲出現在被分析的 該液態培養基中，該第一強度爲該參考強度’該第二強度 爲該被測量的強度，並且該第二核苷酸序列係藉由比較該 第一強度與該第二強度來偵測。 13·根據申請專利範圍第12項之方法’其中該第 二孩苷酸序列祇見於一突變基因組中，且該第一核苷酸序 列係見於該突變基因組中以及在一相對的野生型基因組中 〇 1 4 ·根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中該第 ~與第二標記係選自由螢光素（fluorescein)與鹼性蕊香紅 (rhodamine)所組成的組群中。 1 5 ·根據申請專利範圍第1 2項之方法，其中具有 一個在不同於第一和第二波長的第三波長下有第三螢光放 射強度之第三P NA探針被加入該液態培養基中以作爲一 負控制組，其不預期與任何核苷酸序列雜交，並且該第二 核苷酸序列係藉著比較第一、第二以及第三強度來偵測。 1 6 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該兩慨 不同的可與該目標序列形成雜交複合體之P N A探針被加 入該液態培養基中，該兩個不同的P NA探針之第一探針 係與該目標序列之第一片段互補，該兩個不同的ΡΝΑ探 針之第二探針係與該目標序列之第二片段互補，且該第一 與第二片段彼此互不相同。 3 本紙浪尺度逋用中國國家榣準（CNS ) A4规格（210X297公釐） T 3 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁)

   8 8 8 8 ABCD 經濟部t央搮率局Λ工消费合作社印策 六、申請專利範圍 1 7 ·根據申請專利範圍第1 6項之方法，其中該第 一探針具有一個在第一波長下有第一螢光放射強度之第一 標記，該第二探針具有一個在第二波長下有第二螢光放射 強度之第二標記，該第一與第二波長係爲不同，該第一片 段係藉著在該第一波長下監測螢光放射強度而被偵測，且 該第二片段係藉著在該第二波長下監測螢光放射強度而被 偵測。 1 8 ·根據申請專利範圍第1 7項之方法，其中該第 一核苷酸序列係爲一正控制組’其預期爲出現在被分析的 該液態培養基中’該第一強度爲該參考強度，該第二強度 爲該被測量的強度，並且該第二片段係藉由比較該第一強 度與該第二強度來偵測。 1 9 ·根據申請專利範圍第1 8項之方法，其.中具有 一個在不同於第一和第二波長的第三波長下有第三螢光放 射強度之第三P N A探針被加入該液態培養基中以作爲一 負控制組，其不預期與任何核苷酸序列雜交，並且該第二 片段係藉著比較第一、第二以及第三強度來偵測。 2 0 ·根據申請專科範獨第1項之方法，其单該雜交 複合體主要是由一個P NA序列’ 一螢光基團 (fluorophore)以及該核苷酸序列珩組成。 2 1 ·根據申請專利範圍第1之方法，其中所有使用 於該方法中的探針係由相同的序列和標記所組成’該標記 係爲惟一在該方法中所偵測到的標記。 2 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其、中該放射 ___|_4___;__ 本纸張尺1 適用中國B家棣準（CNS ) A4规格（210X297公釐飞― ------^------(束------訂------【 .(請先Η讀背面之注意1E項再填窝本頁) 8 88 8 ABCD 六、申請專利範園 螢光具有高於該雷射光束波長之波長。 2 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該核苷 酸序列爲雙股DNA。 2 4 · —種用於偵測在第一液態培養基中一個單股或 雙股核苷酸目標序列之方法，該方法包括： 提供包含樣本核苷酸序列之液態培養基 加入一個可與該核苷酸序列形成雜交複合體之P N A 琿針於該第一液態培養基中，其中該探針包含一螢光標記 I 以一雷射光束照射該第一液態培養基，該JI射光束具 有一種激發該螢光標記並使得該螢光標記放射蟹光之波長 偵測在該第一液態培養基中該螢光之第一強度；並且 測定是否該第一強度相等於包含與螯JLH A探針雜交 之核苷酸序列之第二液態培養基之第二強度，以值測是否 "··«.—»· ·»··' ............ 該核苷酸序列在該第一液態培養基中， 經濟部中央橾率局男工消費合作社印*. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中該P N A探針，該核苷酸序列以及該交複合體 不連接在一固體支持物或膠體上，並且該雜交複合體主要 是由一個P N A探針，一個螢光基團以及該核酸序列所 組成。 2 5 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該雷 射光束係由以具有4 5 0到5 3 0徽毫米波長放光照射該 標記之氬氣離子雷射所製造的》 2 6 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其f該螢 __ 5 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 光是在4 0 0到1 0 0 0微毫米之範圍內所偵測》 2 7 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中（i )該核苷酸序列係爲一突變型D N A，其與不同於該突變 型D N A之野生型D N A可區分出來，（i i )該P N A 探針與該突變型D N A的一片段完全互補且與該野生型D ΝΑ的一片段不完全互補，並且（i i i )若是該第一強 度與該第二強度相同時該突變型D ΝΑ被偵測到。 .2 8 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中（i )該核苷酸序列係爲一野生型D N A，其與不同於該野生 型DNA之突變型DNA可區分出來，（i i )該P NA 探針與該野生型D ΝΑ的一片段完全互補且與該突變型D ΝΑ的一片段不完全互補，以及（ i L i )若是該第一強 度與該第二強度相同時該野生型:D 现。 2 9 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該核 苷酸序列在該偵測步驟之前會在該液態培養基中被變性， 其係在8 5 °C到1 〇 〇°C之溫度下3 0秒到5小時。 '3 0 ·根據申請專利範圍第2 9項之方法，其中該雜 交複合體的形成係在4 °C到7 5 ° C之溫度下2分鐘到2 4小時而進行。 3 1 ·根據申請專利範圍第3 0項之方法，其中該變 性步驟之進行不超過6 0分鐘，在此之後該溫度係被動地 冷卻至室溫而不驟冷。 3 2 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該P N A探針係以一被認爲的該核苷酸序列濃度1至2 0倍之 本紙張尺度逋用中國國家標率（CNS > A4洗格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) Γ 經濟部中央搮隼局負工消费合作社印装 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 濃度被加入該第一液態培養基。 3 3 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中在該 偵測步驟中該第一液態培養基之總體積係少於5毫升。 3 4 ·根據申請專利範圍第3 3項之方法，其中該總 體積係少於10微升。 3 5 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該核 苷酸序列係爲雙股D NA。 .3 6 ·根據申請專利範圍第2 9項之方法，其中該P NA探針係在完成該變性步驟之前被加入該第一液態培養 基中。 3 7 _根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中使用 在該方法之所有探針係由相同的序列以及標記所組成，該 標記係爲在該方法中惟一被偵測到的探針。 3 8 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該被 偵測的螢光主要由該標記所放射之該螢光所組成。 3 9 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該P N A探針係與該核苷酸序列之一片段完全互補。 4 0 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該P N A探針係爲該核苷酸序列的一片段上之一個鹽基配對錯 誤者。 4 1 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該p NA探針係爲該核苷酸序列的一片段上之兩個鹽基配對錯 誤者。 4 2 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中該p _________7___ 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐) ' (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 裝- 訂 經濟部中央揉準局ec工消费合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 N A探針係爲該核苷酸序列的一片段上之三個鹽基配對錯 誤者。 4 3 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中（i )該樣本核苷酸序列與該核苷酸序列相同或是爲至少一個 鹽基不同於該核苷酸序列之一片段的類似物’（i i )該 P N A探針係與該核苷酸序列之一片段完全互補或是與該 類似物之一片段不互補，（i i i )若該第一強度與該第 二強度相同時，該核苷酸序列被偵測到以及（i v )若該 第一強度與該第二強度不相同時，該類似物被偵測到。 4 4 .根據申請專利範圍第4 3項之方法，其中該類 似物係有一個鹽基不同於該核苷酸序列。 4 5 ·根據申請專利範圍第4 3項之方法’其中該類 似物係有兩個鹽基不同於該核苷酸序列。 4 6 ·根據申請專利範圍第4 3項之方法’其中該類 似物係有三個鹽基不同於該核苷酸序列。 4 7 ·根據申請專利範圍第4 3項之方法’其中使用 在該方法之所有探針係由相同的序列以及標記所組成’該 標記係爲在該方法中惟一被偵測到的探針。 4 8 ·根據申請專利範圍第4 7項之方法’其中該被 偵測的螢光主要由該標記所放射之該螢光所組成。 4 9 .根據申請專利範圍第4 8項之方法’其中該類 似物係有一個鹽基不同於該核苷酸序列。 5 0 .根據申請專利範圍第2 4項之方法’其中（i )該樣本核苷酸序列與該核苷酸序列相同或是爲至少一個 ____J___ 本尺度ϋ中家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) •「裝. 訂 _^ 經濟部t央樣準局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 鹽基不同於該核苷酸序列的類似物，（ii)該PNA探 針係與該類似物之一片段完全互補或是與該核苷酸序列之 一片段不完全互補，（i i i )若該第一強度與該第二強 度相同時，該核苷酸序列被偵測到以及（i v )若該第一 強度與該第二強度不相同時，該類似物被偵測到。 5 1 ♦根據申請專利範圍第5 0項之方法，其中該類 似物係有一個鹽基不同於該核苷酸序列。 _ 5 2 ·根據申請專利範圍第5 0項之方法，其中該類 似物係有兩個鹽基不同於該核苷酸序列。 5 3 ·根據申請專利範圍第5 0項之方法，其中該類 似物係有三個鹽基不同於該核苷酸序列。 5 4 ·根據申請專利範圍第5 0項之方法，其中使用 在該方法之所有探針係由相同的序列以及標記所組成，該 標記係爲在該方法中惟一被偵測到的探針。 5 5 ·根據申請專利範圍第5 4項之方法，其中該被 偵測的螢光主要由該標記所放射之該螢光所組成。 5 6 ·根據申請專利範圍第5 5項之方法’其中該類 似物係有一個鹽基不同於該核苷酸序列。 5 7 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法’其中該被 偵測的螢光具有高於該雷射光束波長之一波長。 5 8 ·根據申請專利範圍第2 4項之方法’其中該第 —強度係與在該核苷酸序列以及該PNA探針間的鹽基錯 誤配對之數目成反比，超過包含0個鹽基錯誤配對到至少 3個錯誤配對之範,。 _____9_；__ 本紙張尺度適用中國國家榡率（CNS ) A4规格（210X297公釐） -----------f 裝------、tr------^ΐ (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局負工消費合作社印装 B8 C8 六、申請專利範圍 5 9 · —種用於偵測在第一液態培養基中一個單股或 雙股核苷酸目標序列之方法，該方法包括： 提供包含樣本核苷酸序列之液態培養基； 加入一個可與該核苷酸序列形成雜交複合體之P N A 探針於該第一液態培養基中，其中該探針包含一螢光標記 » 將未雜交的P N A探針由該雜交複合體中分離出來， 以形成第一測試培養基； 以一雷射光束照射該第一測試培養基，該雷射光束具 有一種激發該螢光標記並使得該螢光標記放射螢光之波長 t 直接偵測在該第一測試培養基中該放射螢光之第一強 度；並且 將該第一強度與一由正控制組序列爲探針所得到之參 考強度以及一由負控制組序列爲探針所得到之基線 (baseline)強度比較， 其中當該第一強度與該參考強度相同時，該核苷酸序 列會被偵測到，當該第一強度與該基線強度相同時，該核 苷酸序列不會被偵測到，並且當該第一強度介於該基線強 度與該參考強度時，一個至少有一鹽基不同於該核苷酸序 列之同源(homologous)序列會被偵測到，且其中除了該分 離步驟以外的該方法係在不需結合該PNA探針，該核苷 酸序列或該雜交複合體至一固體支持物或膠體上而完全地 進行。 _______10___ >紙银尺度適ϋ國两家梂準（CNS ) A4規格（2!ΟΧ297ϋ -------——装------訂------fS- .(請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 6 0 .根據申請專利範圍第5 9項之方法，其中該同 源序列係有一個鹽基不同於該核苷酸序列。 6 1 .根據申請專利範圍第6 0項之方法，其中該雜 交複合體主要是由一個P NA序列’ 一個螢光基團 (fluorophore)以及該核苷酸序列所組成。 6 2 ·根據申請專利範圔第5 9項之方法，其中所有 使用於該方法中的探針係由相同的序列和標記所組成，該 標記係爲惟一在該方法中所偵測到的標記。 6 3 .根據申請專利範圍第5 9項之方法，其中該被 偵測的螢光主要由該標記所放射之該螢光所組成。 6 4 ·根據申請專利範圍第5 9項之方法，其中該被 偵測的螢光具有一不超過該雷射光束波長之波長。 6 5 ·根據申請專利範圍第5 9項之方法，其中該第 一強度係與在該核苷酸序列以及該P NA探針間的鹽基錯 誤配對之數目成反比，其超過包含0個鹽基錯誤配對到至 少3個錯誤配對之範圍。 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 f碕先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) τ 6 6 ·—種在一液態培養基中偵測一個單股或雙股核 苷酸序列之方法，其包括： 提供包含與該核苷酸序列相同的第一核苷酸序列或有 至少一個鹽基不同於該核苷酸序列的第二核苷酸序列之液 態培養基； 加入與該核苷酸序列的一片段完全互補以及與該第二 核苷酸序列的一片段不完全互補之P N A探針於該液態培 養基中，其中每一個P NA探針包含一螢光標記； 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 以該第一或第二核苷酸序列與該P NA探針雜交； 以雷射照射該第一測試培養基，以使得p螢光標記放 射具有4 0 0到1 0 0 0微毫米波長之螢光；並且 偵測該螢光之強度， 其中一電場在該偵測步驟之前或同時被施於該液態培 養基中，並且作爲該電場一函數之該螢光的該強度之變化 被偵測，其係爲是否該P N A探針與該第一核苷酸序列或 該第二核苷酸序列雜交之指標。 6 7 ·如申請專利範圍第6 6項之方法，其中該第一 與第二核苷酸序列係有一個核苷酸不同。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· *1T 經濟部中央梂準局員工消费合作社印製 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（.210X297公釐）