JP7123560B2 - 集積型アレイを使用する核酸ハイブリダイゼーション熱力学の多重分析 - Google Patents

Description

（相互参照）
本出願は、２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６５，９０４号の利益を主張しており、この出願は、全体が参考として本明細書中に援用される。

（背景）
ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマー（ポリヌクレオチド）間の配列類似性の程度を測定する分子生物学技法である。基礎となる原理は、ＤＮＡポリマーの構成ブロック、すなわち、ヌクレオチドが、水素結合（Ａ－Ｔ間の２つの水素結合およびＣ－Ｇ間の３つの水素結合）を形成する相補的な核酸塩基との対合（ＡのＴとの対合およびＣのＧとの対合）が可能な特異的な窒素含有核酸塩基（グアニン「Ｇ」、アデニン「Ａ」、チミン「Ｔ」、およびシトシン「Ｃ」）を含むことである。したがって、相補的な配列を伴うＤＮＡ部分は、互いと結合し（ハイブリダイズし）、ＤＮＡ二量体（二本鎖ＤＮＡ構造）を形成するアフィニティーを有する。ハイブリダイゼーションの熱力学的特徴は、主に、ＤＮＡ部分の間に形成される、水素結合の総数および強度に依存し、これは、相補的な核酸塩基（塩基）のストレッチ、非相補的なギャップ、ならびに環境内のアニオンおよびカチオンの濃度および種類など、複数のパラメータの関数である数量である。

ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションの熱力学的特徴は、参与部分に関する配列情報を推定するのに強力なツールである。このような情報を抽出する「ゴールドスタンダード」の方法は、段階的加熱工程における、二本鎖ＤＮＡ二量体およびハイブリダイズしたＤＮＡ二量体の解離特徴を検出する融解曲線解析（ＭＣＡ）である。温度を上昇させると、ＤＮＡ－ＤＮＡ複合体（複数の水素結合を介してアセンブルされる）は、安定的でなくなり、鎖は、解離し始める。したがって、ハイブリダイズした複合体の濃度を、温度と対比してモニタリングすることにより、複合体の安定性を、温度の関数として査定し、これを、標的配列（および水素結合）内の変更と相関させ、例えば、一塩基多型（「ＳＮＰ」）または挿入／欠失（「ｉｎｄｅｌ」）を識別することができる。

（要旨）
本明細書では、現行および従来のＭＣＡ技法に付随する多様な制限が認識される。ＭＣＡは、元来当初はＵＶ吸光度測定値を使用することで可能となった（Ansevinら、Biopolymers、１９７６年）が；今日では、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）挿入型フルオロフォアを使用する、蛍光測定に基づく技法が、より一般的である（Wittwer C. T.ら、BioTechniques、２２巻：１３０～１３８頁、１９９７年、Ririe K. M.ら、Anal. Biochem、２４５巻：１５４～１６０頁、１９９７年、Lipsky, R. H.ら、Clin. Chem.、４７巻：６３５～６４４頁、２００１年、およびWittwer C. T.ら、ＵＳ７，７８５，７７６）。

ＭＣＡベースの方法は、ハイブリダイゼーションの熱力学を測定する手法をもたらすが、マルチプレックス化能、すなわち、単一の反応チャンバー内で同時に生じる、複数のＤＮＡハイブリダイゼーション反応を解析する能力は、極めて限定されている。インターカレーティング色素の場合、例えば、測定された蛍光シグナルは基本的に、反応チャンバー内の、個々のハイブリダイゼーションイベントに由来する、全てのシグナルの総計であり、したがって、ＤＮＡ部分が、類似する熱力学的特徴を有するか、または１つの部分が、他の部分と比較して、有意に高い濃度および有意に大きなシグナルを有する場合は、解読が困難である。

一定温度におけるＤＮＡハイブリダイゼーションのレベルの検出もまた、特異的な配列の識別において使用されている。場合によって、ＧｅｎｅＣｈｉｐと称するＤＮＡマイクロアレイプラットフォームは、典型的に、この原理に基づき作動する（Schena M.、Shalon D.、Davis R. W.、Brown P. O.、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science、１９９５年；２７０巻（５２３５号）：４６７～４７０頁、およびStoughton RB、「Applications of DNA microarrays in biology」、Annu Rev Biochem.、２００５年；７４巻：５３～８２頁）。マイクロアレイの利点は、ＤＮＡハイブリダイゼーションの熱力学的解析を利用して、配列を、大規模に並列的に識別することである。しかし、マイクロアレイは、ＭＣＡ方法の特異性を欠く。これは、根本的な限界であり、マイクロアレイは、単一の温度点、すなわち、洗浄およびイメージングの前に、試料を、アレイ上で、一定の時間にわたりインキュベートするときの温度において、ハイブリダイゼーションを測定しうるという事実に根ざしている。マイクロアレイからのデータは、ＳＮＰまたはｉｎｄｅｌを識別するのには、依然として有用であるが、熱力学的解析との関連では完全ではない。一般的に述べると、また、単一の温度点において核酸標的の間を適正に区別しうるマイクロアレイのために、多数の固定化プローブをデザインすることも困難である。標的のＣＧ含量が大きなばらつき（＞２０％）を示すか、または標的が、高度に安定的なヘアピン単量体構造を含む場合、この問題は、特に、難題となる。
ハイブリダイゼーションの熱力学的測定は、ハイブリダイゼーション反応が、平衡に達した後で形成される、ハイブリダイズした複合体の熱力学的解離特性についての解析を伴いうる。一部の例では、温度の関数としての、ハイブリダイズした複合体の存在または非存在と関連する発光シグナルの強度を記録することにより、熱力学的測定を行う。熱力学的測定値は、ハイブリダイズした複合体の安定性に関しうる。このような測定値は、安定平衡または準安定平衡にあるシステムに適用可能でありうる。

これに対し、ハイブリダイゼーションの反応速度の測定は、ハイブリダイゼーション反応の反応速度についての解析を伴う場合があり、一定温度における温度の関数としての、ハイブリダイズした複合体の存在または非存在と関連する発光シグナルの強度を記録することにより達することができる。反応速度の測定値は、ハイブリダイズした複合体を形成するためのプローブと核酸標的との反応性に関係しうる。このような測定値は、非平衡から、平衡への遷移の下にあるシステムに適用可能でありうる。

米国特許第７，７８５，７７６号明細書

Wittwer C. T.ら、BioTechniques、２２巻：１３０～１３８頁、１９９７年 Ririe K. M.ら、Anal. Biochem、２４５巻：１５４～１６０頁、１９９７年 Lipsky, R. H.ら、Clin. Chem.、４７巻：６３５～６４４頁、２００１年 Schena M.、Shalon D.、Davis R. W.、Brown P. O.、Science、１９９５年；２７０巻（５２３５号）：４６７～４７０頁 Stoughton RB、Annu Rev Biochem.、２００５年；７４巻：５３～８２頁

本開示は、単一の反応チャンバー内でリアルタイムに同時に起こる、複数の核酸ハイブリダイゼーション反応の熱力学的特徴を測定する方法、デバイス、およびシステムを提供する。本明細書で提供される多様な実施形態を使用して、数例を挙げると、分子的診断法、核酸（例えば、ＤＮＡ）法医学解析、および病原体遺伝子型決定などの適用のための、固有の核酸検出プラットフォームを創出することができる。半導体集積型バイオセンサーアレイを利用して、要求される検出デバイスを小型化し、かつ、組み込みうる、さらなる実施形態も提供される。

本開示の態様は、試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、（ａ）試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、試料チャンバーが、標的核酸分子を有する試料を保持するように構成され、集積型センサーが、（ｉ）標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、（ｉｉ）試料からの少なくとも１つのシグナルを検出し、少なくとも１つのシグナルが標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップを提供するステップと；（ｂ）試料を、プローブが標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で試料チャンバー内に提供するステップと；（ｃ）試料を試料チャンバー内にある間に、表面を温度変化下に置くステップと；（ｄ）表面を温度変化下に置いている間に、少なくとも１つのシグナルを、リアルタイムで測定するステップと；（ｅ）その温度変化での少なくとも１つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップとを含む方法を提供する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、プローブは、オリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、試料を、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子とハイブリダイズすることを可能とする条件下で試料チャンバー内に提供する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、標的核酸分子の配列は、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイは、少なくとも約１００個の集積型センサー、少なくとも約５００個の集積型センサー、少なくとも約１，０００個の集積型センサー、少なくとも約２，０００個の集積型センサー、少なくとも約５，０００個の集積型センサー、または少なくとも約１０，０００個の集積型センサーを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、光シグナル、電気化学シグナル、および静電シグナルからなる群から選択される。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、エネルギーアクセプターと、エネルギードナーとの対の間の相互作用を示す光シグナルである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、エネルギードナーの光学活性をクエンチングする。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターを、標的核酸分子の、１または複数のヌクレオチドとカップリングさせる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、クエンチャーである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーをプローブとカップリングさせる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーは、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、相互作用は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ではない。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、光学活性分子種の活性を示す光シグナルである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光学活性分子種は、インターカレーターである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光学活性分子種は、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、検出するステップは、少なくとも１つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、検出するステップは、少なくとも１つのシグナルの、バックグラウンドと比べた減少を測定することを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、光検出器をさらに含み、（ｄ）において、少なくとも１つのシグナルを、光検出器で測定する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、試料は、複数の標的核酸分子を含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、複数の集積型センサーのアレイの一部であり、それらの各々は、複数の標的核酸分子のうちの少なくとも１つを検出する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップが、１個の集積型センサーと、さらなる集積型センサーとを含み、試料が、１つの標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含む場合、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子を検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子と選択的にカップリングする、さらなるプローブを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子の存在または非存在を示す少なくとも１つのさらなるシグナルを検出する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、クエンチャーである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーは、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、プローブは、表面へとリンカーを介して固定化されている。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される分子種を含む。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルを、標的核酸分子を含む試料をチップと流体接触させている間に検出する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、複数のシグナルを含む。複数のシグナルは、複数の時点および／または複数の温度におけるシグナルでありうる。例えば、温度を、時間の線形関数または非線形関数である速度で変化させることができ、シグナルを測定することができる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、温度変化は、第１の温度から、第１の温度より高温である第２の温度への温度変化である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、シグナル対温度データは、融解曲線の一部である。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光検出器は、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）集積回路（ＩＣ）デバイスを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、（ａ）の前に、（ｉ）標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、鋳型核酸分子と相補的な少なくとも１つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、（ｉｉ）反応混合物を、試料中の標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、標的核酸分子の配列内の一塩基多型（ＳＮＰ）を識別するように選択される配列を有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、核酸増幅は、非対称的核酸増幅である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーから少なくとも１つのシグナルを電気的に受け取り、標的核酸分子の存在または非存在を、少なくとも１つのシグナルから決定するコンピュータプロセッサーへと、チップを電気的にカップリングさせてある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、コンピュータプロセッサーは、シグナル対温度データを発生させる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、シグナル対温度データを、電子報告書に出力するステップをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、電子報告書を、ユーザーの電子デバイスのユーザーインターフェースに出力する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、（ｃ）において、表面を、約１℃／分～約２０℃／分の平均速度で、温度変化下に置く。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、（ｃ）において、表面と熱伝導する温度制御装置により、表面を温度変化下に置く。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つのシグナルが、標的核酸分子の存在を示す場合、標的核酸分子を、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％の感度で検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、シグナル対温度データを使用して、標的核酸分子の配列内の一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するステップをさらに含む。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、対照プローブと関連する少なくとも１つの対照シグナルまたは複数の対照シグナルを測定するステップをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、シグナル対温度データを、少なくとも１つの対照シグナルの測定値に照らして標準化する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、さらなる集積型センサーを含み、試料が、さらなる標的核酸分子を含む場合、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子を検出する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、表面の下方の発光層と、発光層の下方の光検出器とをさらに含み、ステップ（ｄ）において、光検出器は、試料からの少なくとも１つのシグナルを、発光層を通る透過の際に測定する。

集積型センサーは、標的核酸分子と選択的にハイブリダイズするプローブ、または標的核酸分子と選択的にハイブリダイズしない対照プローブなどのプローブを有する表面と一体化された検出器（例えば、光検出器）を含みうる。一部の例では、集積型センサーは、検出器と、表面とを、単一のユニットとして含む。

本開示の別の態様は、試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、（ａ）少なくとも１つの集積型センサーを有するハイブリダイゼーションアレイを、温度変化下に置くステップと、（ｂ）少なくとも１つの集積型センサーにより、ハイブリダイゼーションアレイからのシグナルを、複数の温度点において測定するステップと、（ｃ）標的核酸分子の解離特徴を、温度変化の間に、複数の温度点において評価することにより、標的核酸分子の存在について、少なくとも約９０％の感度でアッセイするステップとを含む方法を提供する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、感度は、少なくとも約９５％である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイは、複数の集積型センサーを有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも１つの集積型センサーは、光学センサーである。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイが、第１の集積型センサーと、第２の集積型センサーとを含む場合、標的核酸分子は、第１の標的核酸分子と、第２の標的核酸分子とを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、第１の集積型センサーが、第１の標的核酸分子と関連するシグナルを測定する場合、第２の集積型センサーは、第２の標的核酸分子と関連するシグナルを測定する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイは、対照センサーをさらに含み、対照センサーは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、（ｉ）対照センサーにより、複数の温度点において、対照シグナルを測定するステップと、（ｉｉ）複数の温度点において、標的核酸分子の解離特徴を対照シグナルに照らして評価するステップとをさらに含む。

本開示の別の態様は、試料中の標的核酸分子の存在についてアッセイするためのシステムであって、試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、試料チャンバーが、標的核酸分子を有する試料を保持するように構成され、集積型センサーが、（ｉ）標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、（ｉｉ）試料からの少なくとも１つのシグナルを検出し、少なくとも１つのシグナルが標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップと；チップへとカップリングさせたコンピュータプロセッサーであって、（ｉ）試料を試料チャンバー内にある間に、表面を温度変化下に置き；（ｉｉ）表面を温度変化下に置いている間に、少なくとも１つのシグナルを測定し；（ｉｉｉ）その温度変化での少なくとも１つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるようにプログラムしたコンピュータプロセッサーとを含むシステムを提供する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、試料チャンバーと隣接する対照センサーをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、対照センサーは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、対照センサーは、少なくとも１つの対照シグナルを検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、コンピュータプロセッサーを、（ｉｖ）対照プローブを温度変化下に置いている間に、少なくとも１つの対照シグナルを測定し、（ｖ）シグナル対温度データを、少なくとも１つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するように、さらにプログラムする。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、さらなる集積型センサーを含み、試料は、さらなる標的核酸分子を含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子の存在を示す少なくとも１つのさらなるシグナルを検出する。

本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイは、少なくとも約１００個の集積型センサー、少なくとも約５００個の集積型センサー、少なくとも約１，０００個の集積型センサー、少なくとも約２，０００個の集積型センサー、少なくとも約５，０００個の集積型センサー、または少なくとも約１０，０００個の集積型センサーを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイの、個々の集積型センサーは、個別にアドレス可能である。

本開示の例示的な実施形態だけを示し、記載する、以下の詳細な記載から、当業者には、本開示のさらなる態様および利点も、たやすく明らかとなり得る。認識される通り、本開示は、他の異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの詳細は、全て、本開示から逸脱しない限り、多様かつ明らかな点において、改変が可能である。したがって、図面および記載は、例示的な性格のものとして考えるべきであり、制限的なものとして考えるべきではない。
（参照による組込み）

本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的、かつ、個別に、参照により組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において、詳細に呈示される。本発明の特色および利点についての、より良好な理解は、本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載と、添付の図面（本明細書ではまた、「図（ＦＩＧ）」および「図（ＦＩＧｓ）」とも称する）とを参照することにより得られ得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、
（ａ）試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、（ｉ）前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、（ｉｉ）前記試料からの少なくとも１つのシグナルを検出し、前記少なくとも１つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップを提供するステップと；
（ｂ）前記試料を、前記プローブが前記標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供するステップと；
（ｃ）前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置くステップと；
（ｄ）前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも１つのシグナルを、リアルタイムで測定するステップと；
（ｅ）前記温度変化での前記少なくとも１つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記プローブが、オリゴヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料を、前記オリゴヌクレオチドが前記標的核酸分子とハイブリダイズすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記標的核酸分子の配列が、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１つのシグナルが、エネルギーアクセプターと、エネルギードナーとの対の間の相互作用を示す光シグナルである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記エネルギーアクセプターが、前記エネルギードナーの光学活性をクエンチングする、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記エネルギーアクセプターを、前記標的核酸分子の、１または複数のヌクレオチドとカップリングさせる、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記エネルギードナーを前記プローブとカップリングさせる、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも１つのシグナルが、光学活性分子種の活性を示す光シグナルである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記光学活性分子種が、インターカレーターまたはフルオロフォアである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記検出することが、前記少なくとも１つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記検出することが、前記少なくとも１つのシグナルの、バックグラウンドと比べた減少を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記集積型センサーが、光検出器をさらに含み、（ｄ）において、前記少なくとも１つのシグナルを、前記光検出器で測定する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記試料が、前記標的核酸分子を含む、複数の標的核酸分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記集積型センサーが、複数の集積型センサーのアレイの一部であり、前記複数の集積型センサーの各々が、前記複数の標的核酸分子のうちの少なくとも１つを検出する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と選択的にカップリングする、さらなるプローブを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在または非存在を示す少なくとも１つのさらなるシグナルを検出する、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記エネルギーアクセプターが、クエンチャーである、項目６に記載の方法。
（項目２１）
前記エネルギードナーが、フルオロフォアである、項目６に記載の方法。
（項目２２）
光検出器が、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）デバイスを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記プローブが、前記表面へとリンカーを介して固定化されている、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記リンカーが、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される分子種を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも１つのシグナルを、前記標的核酸分子を含む前記試料を前記チップと流体接触させている間に検出する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記シグナル対温度データが、融解曲線の一部である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
（ａ）の前に、（ｉ）前記標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、前記鋳型核酸分子と相補的な少なくとも１つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、（ｉｉ）前記反応混合物を、前記試料中の前記標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記少なくとも１つのプライマーが、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型（ＳＮＰ）に対して選択的な配列を有する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸増幅が、非対称的核酸増幅である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記集積型センサーから前記少なくとも１つのシグナルを電気的に受け取り、前記標的核酸分子の前記存在または非存在を、前記少なくとも１つのシグナルから決定するコンピュータプロセッサーへと、前記チップを電気的にカップリングさせてある、項目１に記載の方法。
（項目３１）
（ｃ）において、前記表面を、約１℃／分～約２０℃／分の平均速度で、前記温度変化下に置く、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記標的核酸分子を、少なくとも約９０％の感度で検出する、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記シグナル対温度データを使用して、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記チップが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目１に記載の方法。
（項目３５）
（ｉ）前記対照プローブと関連する少なくとも１つの対照シグナルを測定するステップと、（ｉｉ）前記シグナル対温度データを、前記少なくとも１つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するステップとをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
（ａ）において、前記集積型センサーが、前記表面の下方の発光層と、前記発光層の下方の光検出器とをさらに含み、（ｄ）において、光検出器が、前記試料からの前記少なくとも１つのシグナルを、前記発光層を通る透過の際に測定する、項目１に記載の方法。
（項目３８）
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、（ａ）少なくとも１つの集積型センサーを有するハイブリダイゼーションアレイを、温度変化下に置くステップと、（ｂ）前記少なくとも１つの集積型センサーにより、前記ハイブリダイゼーションアレイからのシグナルを、複数の温度点において測定するステップと、（ｃ）前記標的核酸分子の解離特徴を、前記温度変化の間に、前記複数の温度点において評価することにより、前記標的核酸分子の前記存在について、少なくとも約９０％の感度でアッセイするステップとを含む方法。
（項目３９）
前記感度が、少なくとも約９５％である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ハイブリダイゼーションアレイが、複数の集積型センサーを有する、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記少なくとも１つの集積型センサーが、光学センサーである、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記少なくとも１つの集積型センサーが、第１の集積型センサーと、第２の集積型センサーとを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記第１の集積型センサーが、前記標的核酸分子と関連するシグナルを測定し、前記第２の集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と関連するシグナルを測定する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ハイブリダイゼーションアレイが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目３８に記載の方法。
（項目４５）
（ｉ）前記対照センサーにより、前記複数の温度点において、対照シグナルを測定するステップと、（ｉｉ）前記複数の温度点において、前記標的核酸分子の前記解離特徴を前記対照シグナルに照らして評価するステップとをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
試料中の標的核酸分子の存在についてアッセイするためのシステムであって、
試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、（ｉ）前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、（ｉｉ）前記試料からの少なくとも１つのシグナルを検出し、前記少なくとも１つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップと；
前記チップへとカップリングさせたコンピュータプロセッサーであって、（ｉ）前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置き；（ｉｉ）前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも１つのシグナルを測定し；（ｉｉｉ）前記温度変化での前記少なくとも１つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるようにプログラムしたコンピュータプロセッサーと
を含むシステム。
（項目４７）
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目４６に記載のシステム。
（項目４８）
前記チップが、前記試料チャンバーと隣接する対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを含み、前記対照センサーが、前記試料からの少なくとも１つの対照シグナルを検出する、項目４６に記載のシステム。
（項目４９）
前記コンピュータプロセッサーを、（ｉｖ）前記対照プローブを前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも１つの対照シグナルを測定し、（ｖ）前記シグナル対温度データを、前記少なくとも１つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するように、さらにプログラムした、項目４８に記載のシステム。
（項目５０）
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、さらなる標的核酸分子を含む、項目４６に記載のシステム。
（項目５１）
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在を示す少なくとも１つのさらなるシグナルを検出する、項目５０に記載のシステム。
（項目５２）
前記アレイが、少なくとも約１００個の集積型センサーを含む、項目４７に記載のシステム。
（項目５３）
前記アレイの、個々の集積型センサーが、個別にアドレス可能である、項目４７に記載のシステム。

図１は、マルチプレックス解析システムについての例示的な概略図を示す図である。

図２は、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターを伴う、プローブと標的との相互作用についての例示的な概略図を示す図である。

図３は、インターカレーターを伴う、プローブと標的との相互作用についての例示的な概略図を示す図である。

図４は、標的の標識化を伴う、プローブと標的との相互作用についての例示的な概略図を示す図である。

図５は、融解曲線解析についての例示的な概略図を示す図である。

図６は、バイオセンサーアレイについての例示的な画像および概略図を示す図である。

図７は、バイオチップアレイ回路についての例示的な概略図を示す図である。

図８Ａは、バイオチップアレイについての例示的な画像を示す図である。

図８Ｂは、温度制御および融解曲線解析についての例示的なグラフを示す図である。

図８Ｃは、例示的なプローブ配列および標的配列を示す図である。

図９は、融解曲線解析についての例示的なグラフと、例示的なプローブ配列および標的配列とを示す図である。

図１０Ａは、融解曲線解析についての例示的なグラフを示す図である。

図１０Ｂは、例示的な、フルオロフォア－クエンチャー型の標的配列およびプローブ配列を示す図である。

図１１は、本明細書で提供される方法を実装するように、プログラムされるか、または他の形で構成されたコンピュータ制御システムについての例示的な概略図を示す図である。

（詳細な説明）
本明細書では、本発明の多様な実施形態を示し、これらについて記載しているが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提供されていることが明らかである。本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到しうるで。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する、多様な代替物も、利用しうることを理解すべきである。

本明細書で使用される「プローブ」という用語は一般に、特定の標的核酸配列に結合しうる、分子種または他のマーカーを指す。プローブは、任意の種類の分子または粒子でありうる。プローブは、分子を含む場合があり、基質または他の固体表面に、直接結合させることもでき、リンカー分子を介して結合させることもできる。

本明細書で使用される「検出器」という用語は一般に、シグナルを検出しうる、光学構成要素および／または電子構成要素を一般に含むデバイスを指す。

本明細書で使用される「突然変異」という用語は一般に、点突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、置換、転位、転座、コピー数変異などの、遺伝子突然変異もしくは配列バリエーション、または別の遺伝子突然変異、変更、もしくは配列バリエーションを指す。

本明細書で使用される「約」または「ほぼ」という用語は一般に、指定される量の±１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内を指す。

本明細書で使用される「標識」という用語は、標的分子へと付着させて、標的分子に内在しない固有の特徴をもたらすことにより、標的分子を識別可能かつ追跡可能としうる、特定の分子構造を指す。

本明細書で使用される「ヘアピン」という用語は一般に、「ループ」と呼ばれる一本鎖領域、および「ステム」と呼ばれる二本鎖領域の両方を呈する核酸（例えば、デオキシリボ核酸）ストランドを指す。「ヘアピンループ構造」という用語は、共有結合により連結される、相補的なポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される、分子的ステムおよびループ構造を指す。ステムは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的なポリヌクレオチドを共有結合によって連結する領域である。

本明細書で使用される「感度」という用語は一般に、アッセイ（例えば、方法、試験）の性能についての統計学的尺度であって、正確に識別された標的の数を、試料中に存在する標的の総数で除することにより計算される統計学的尺度を指す。言い換えると、本開示における感度とは、試料中のこれらの標的核酸分子全てを正確に識別するアッセイの能力を指す。

本開示は、核酸ハイブリダイゼーション反応のマルチプレックス検出であって、リアルタイムで、温度の関数としての検出を可能とする、方法、デバイス、およびシステムを提供する。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、以下を含むがこれらに限定されない構成要素を含みうる：
１．解析される複数の遊動核酸標的が存在する水性環境を含みうる試料チャンバー；
２．固体表面上の独立に（または個別に）アドレス可能な位置において、複数の核酸プローブを含みうるプローブアレイ。プローブアレイは、試料チャンバーと相互接続することができる。各アドレス可能な位置（本明細書では、「ピクセル」と称する）は、特異的な標的と特異的にハイブリダイズしうる、複数の同一の核酸配列（本明細書で「プローブ」と称する）を含みうる；
３．試料チャンバーの温度を測定し、間の所定の値または特異的な値へと調整しうる温度制御装置；ならびに
４．ピクセル毎に発生するシグナルを、並列的に測定しうる検出器。ハイブリダイゼーションイベントが、温度の関数として進行するので、シグナルは、分子標識の存在およびそれらの近傍における活性と関連しうる。シグナルは、離散的（例えば、個別に解像可能な）シグナルでありうる。

プローブアレイは、各々が１または複数のプローブを有する、独立にアドレス可能な位置を含みうる。アレイの所与の独立にアドレス可能な位置におけるプローブは、アレイの他の独立にアドレス可能な位置におけるプローブと異なりうる。場合によって、アレイの位置の群のプローブは同じである。位置の群のプローブは、アレイの他の全ての位置のプローブと異なりうる。

本開示の方法、デバイス、およびシステムは、併せて組み立てられた、上記の構成要素の改変形を利用して、核酸ハイブリダイゼーション反応を並列して測定することが可能なシステムを創出することができる。図１は、マルチプレックス解析システムの例を示す。核酸は、試料チャンバー（または反応チャンバー）内にあり、ここで、それらは拡散およびドリフト過程により移動して、アドレス可能なアレイの個々のピクセルにおいてプローブと相互作用し、熱力学的に好適な場合は、これらとハイブリダイズしうる。温度制御装置は、ハイブリダイゼーションイベントのための、異種の条件および／または時間と共に変化する条件を創出するように、反応チャンバーの温度を、あらかじめ規定された多様な値に設定しうる。この間、検出器は、ピクセル毎の、温度を変動させるときの、ハイブリダイゼーションインシデントの数量（または大きさ）も、リアルタイムで測定しうる。収集されたデータを、その後使用して、プローブ核酸と標的核酸との相互作用の熱力学的特徴について評価する。
（反応チャンバー）

反応チャンバーは、密閉型のレザバーを含みうる。反応チャンバーは、約１０ナノリットル（ｎＬ）～１０ミリリットル（ｍＬ）の容量を有しうる。場合によって、反応チャンバー容量は、約１マイクロリットル（μＬ）～１００μＬである。反応チャンバー容量は、少なくとも約１０ｎＬ、１００ｎＬ、１μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１ｍＬ、または１０ｍＬでありうる。

反応チャンバーは、水溶液を含有しうる。反応チャンバー内の水溶液は、弱酸とそのコンジュゲート塩基との混合物、またはこの逆を含む水溶液など、緩衝化生理食塩水ベースの溶液を含みうる。溶液は、本明細書で「標的」と称する、複数の標的核酸配列を含みうる。この文脈で使用される「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、その存在または量を知ることが所望される、ヌクレオチドの所与の配列を伴う核酸分子を指す。ヌクレオチド配列は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはＤＮＡ、またはＲＮＡもしくはＤＮＡに由来する配列を含みうる。ヌクレオチド配列の例は、ゲノムＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡを含む、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡに対応する配列である。配列の長さは、核酸増幅産物またはアンプリコンへと増幅されうる任意の長さ、例えば、最大で約２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１，０００、１，２００、１，５００、２，０００、５，０００、１０，０００または１０，０００ヌクレオチドを超える長さでありうる。

場合によって、標的は、本明細書で「標識」と称するレポーター分子を含みうる。標識は、核酸配列へと付着させると、これらの核酸分子に固有ではない、顕著に異なる特徴をもたらす分子構造を含みうる。例は、固有の光学特徴を創出する標識である。

一部の例では、光学標識を使用する。光学標識は、二重分子レポーターの、エネルギードナーまたはエネルギーアクセプターの役割における、単一シグナル発生実体または単一シグナル発生部分として使用することができる。

アクセプターおよびドナーはいずれも、フルオロフォア分子でありうる。フルオロフォアが、ドナーであるのか、アクセプターであるのかは、その励起スペクトルおよび発光スペクトル、ならびにそれが対をなすフルオロフォアに基づきうる。

エネルギードナー／エネルギーアクセプターフルオロフォア対の例は、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）；Ｃｙ３およびＣｙ５；フルオレセインおよびテトラメチルローダミン；ＩＡＥＤＡＮＳおよびフルオレセイン；ＥＤＡＮＳおよびダブシル；フルオレセインおよびＱＳＹ７またはＱＳＹ９色素；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、５５５、５６８、５９４、または６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、５９４、または６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４または６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７；ならびにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ８５を含むがこれらに限定されない。

クエンチャー分子は、本開示の方法と共に、二重レポーター構造のアクセプターとして使用することができる。クエンチャーの例は、限定なしに述べると、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３、ＢＨＱ－１０などのＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｄｙｅ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５などのＱＳＹ Ｄｙｅ蛍光クエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ならびにＤａｂｃｙｌおよびＤａｂｓｙｌ；Ｃｙ５ＱおよびＣｙ７ＱおよびＤａｒｋ Ｃｙａｎｉｎｅ色素（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）など、他のクエンチャーを含む。上記のクエンチャーと共に使用しうるフルオロフォアドナー分子の例は、限定なしに述べると、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３、またはＣｙ５などのフルオロフォア（fluors）；ＤＹＱ－６６０およびＤＹＱ－６６１などのＤＹ－Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）；ならびにＡＴＴＯ ５４０Ｑ、５８０Ｑ、６１２ＱなどのＡＴＴＯ蛍光クエンチャー（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を含む。クエンチャーは、アクセプターでありうる。

光学標識はまた、本明細書でインターカレーターと称する、核酸インターカレーター色素でもありうる。例は、臭化エチジウム、ＹＯＹＯ－１、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、およびＥｖａＧｒｅｅｎを含むがこれらに限定されない。エネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の近接場相互作用、インターカレーターとエネルギードナーとの間の近接場相互作用、またはインターカレーターとエネルギーアクセプターとの間の近接場相互作用は、固有のシグナルまたはシグナル振幅の変化の発生を結果としてもたらしうる。例えば、このような相互作用は、クエンチング（すなわち、非発光性のエネルギー減衰を結果としてもたらす、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動）またはフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（すなわち、発光性のエネルギー減衰を結果としてもたらす、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動）を結果としてもたらしうる。

標識の他の例は、電気化学的標識、静電標識、比色標識、および質量タグを含む。このような標識は、本開示のデバイス、方法、およびシステムと共に使用することができる。

標識は、標的分子へと、直接的な付着によりカップリングさせることもでき、１または複数のリンカー（例えば、リンカー分子）を介する付着によりカップリングさせることもできる。場合によって、標識は、標的分子へと、静電相互作用によりカップリングするが、これは、標的分子との共有結合の形成を伴わない場合がある。

標的分子（標的）の標識化を、様々な方法を使用して実施しうる。一部の例では、標識プライマーを使用して、核酸標的をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増幅（例えば、ＰＣＲにより）する間に、標識を、化学的に付着させる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、非対称的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、およびメチル化特異的ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、多数の異なる分子複製手法または分子増幅手法を含みうる。増幅は、ループ媒介型等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、およびニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を含むがこれらに限定されない化学反応を伴う等温増幅でありうる。増幅の間に、標識プライマーは伸長されて、アンプリコンとなり、アンプリコン、すなわち、標識されている標的をもたらす。このような標識を付着および／またはコンジュゲートさせる方法は、限定なしに述べると、ライゲーション、ビオチン－ストレプトアビジンコンジュゲーション、ヒドラゾン結合、アミン反応性標識のアミノアリルｄＵＴＰとの反応、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を含む。他の例では、標識を、増幅工程の間にアンプリコンを作出するために使用される修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）へと付着させる。このような方法では、１種または複数種のｄＮＴＰの一部が、それらに付着する標識を有するか、または伸長させた核酸鎖へとｄＮＴＰを組み込んだ後に、標識が付着しうる化学結合部位を含むように化学修飾される。場合によって、標識は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合分子である。

場合によって、増幅は、ＰＣＲにより実施しうる。ＰＣＲは、ポリヌクレオチドの融解およびポリヌクレオチドの酵素的複製のための、反応の加熱および冷却の反復の１または複数のサイクルを含むサーマルサイクリングに依拠しうる。標的ポリヌクレオチドの標的領域と相補的な配列を、重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）と共に含むプライマー（短い核酸断片）により、標的ポリヌクレオチドの選択的増幅および反復的増幅をもたらすことができる。プライマーは、突然変異を伴う配列、または対象に、所与の疾患（例えば、がん）の素因を与えることが識別されている配列など、目的の配列と相補的な配列を有しうる。ＰＣＲが進行するにつれ、作出されたポリヌクレオチドはそれ自体、複製のための鋳型として使用されることから、標的ポリヌクレオチド鋳型を指数関数的に増幅する連鎖反応が開始される。

代替法として、増幅は、二本鎖ポリヌクレオチド鋳型内の一方のポリヌクレオチド鎖を優先的に増幅しうる、非対称的ＰＣＲでありうる。この手法は、２つの相補的な鎖のうちの一方だけの増幅が要求される手法でありうる。非対称的ＰＣＲでは、ＰＣＲを、上記で記載した通りであるが、増幅のためにターゲティングされる鎖に対する配列相補性を有する、過剰量のプライマーにより実行する。律速プライマーが消尽した後の、反応の後期における、緩徐な（算術的）増幅のため、ＰＣＲの追加のサイクルが要求されうる。反応中期では、律速プライマー濃度が低下するので、場合によって、非対称的増幅では、反応効率を維持するのに、過剰量のプライマーより融解温度（Ｔｍ）の高い律速プライマーを使用することもできる。

増幅は、等温増幅でありうる。等温増幅方法の例は、ＳＤＡともまた称する、鎖置換増幅であり、これは、標的配列の対向鎖に対するプライマー配列対のアニーリングサイクル、二重鎖ヘミホスホロチオエートプライマー伸長産物を産生する、ｄＮＴＰの存在下におけるプライマー伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位の、エンドヌクレアーゼ媒介型ニッキング、ならびに既存の鎖を置換し、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキング、および鎖置換のための鎖を産生する、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介型プライマー伸長を使用して、産物の幾何学的増幅を結果としてもたらすことが可能である。例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２７０，１８４号および米国特許第５，４５５，１６６号を参照されたい。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法において、より高い温度で、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用しうる。例えば、参照により全体において本明細書に組み込まれる、欧州特許第０６８４３１５号を参照されたい。

他の増幅方法の例は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Lizardi、「Rolling Circle Replication Reporter Systems」、米国特許第５，８５４，０３３号）；ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（例えば、Kongら、「Helicase Dependent Amplification Nucleic Acids」、米国特許出願公開第ＵＳ２００４－００５８３７８Ａ１号）；およびループ媒介型等温増幅（ＬＡＭＰ）（例えば、Notomiら、「Process for Synthesizing Nucleic Acid」、米国特許第６，４１０，２７８号）を含む。場合によって、等温増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーへと組み込まれうるプロモーター配列などのプロモーター配列からの、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を利用する。転写ベースの増幅方法は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、ＮＡＳＢＡともまた称する核酸配列ベースの増幅（例えば、米国特許第５，１３０，２３８号）であって、プローブ分子自体を増幅するＲＮＡレプリカーゼであり、一般にＱβレプリカーゼと称するＲＮＡレプリカーゼの使用に依拠する方法である増幅（例えば、Lizardi, P.ら（１９８８年）、Bio Technol.、６巻、１１９７～１２０２頁）；自己持続配列複製（例えば、Guatelli, J.ら（１９９０年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻、１８７４～１８７８頁；Landgren（１９９３年）、Trends in Genetics、９巻、１９９～２０２頁；およびLee, H. H.ら、「Nucleic Acid Amplification Technologies」（１９９７年））；およびさらなる転写鋳型を作出するための方法（例えば、米国特許第５，４８０，７８４号および米国特許第５，３９９，４９１号）を含みうる。等温核酸増幅の他の方法は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、非カノニカルヌクレオチド（例えば、ウラシルまたはＲＮＡヌクレオチド）を含むプライマーの使用であって、非カノニカルヌクレオチドにおいて核酸を切断して、さらなるプライマーのために結合部位を露出する酵素（例えば、ＤＮＡグリコシラーゼまたはＲＮアーゼＨ）と組み合わせた使用（例えば、米国特許第６，２５１，６３９号、米国特許第６，９４６，２５１号、および米国特許第７，８２４，８９０号）を含む。等温増幅工程は、線形的増幅工程の場合もあり、指数関数的の場合もある。
（プローブアレイ）

プローブは、スポットアレイを創出するように沈着させた生物学的材料を含みうる。プローブは、他の技術に従い、アレイを形成するように合成、沈着、または配置された材料を含みうる。したがって、これらの技術のうちのいずれかに従い形成されたマイクロアレイを、本明細書の下記では、簡便さのために、総称的に、「プローブアレイ」と称することができる。「プローブ」という用語は、アレイフォーマットで固定化させたプローブに限定されない。そうではなく、本明細書で記載される機能および方法はまた、他の並列的アッセイデバイスに対しても利用することもできる。例えば、これらの機能および方法を、ビーズ、光ファイバー、または他の基質もしくは媒体の上または中に固定化させたプローブを識別しうる、プローブセットの識別子に対して適用することができる。多様なプローブアレイの構築については、本明細書でより詳細に記載する。

場合によって、プローブは、ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含みうる。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、三本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡのほか、三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖ＲＮＡも含みうる。この用語はまた、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングなどによる修飾のほか、非修飾形態も含みうる。さらに、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮグリコシドまたはＣグリコシドである、他の任意の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマーを含みうる。核酸は、ホスホジエステル結合（すなわち、天然の核酸）を含みうる。核酸は、例えば、ホスホルアミド（例えば、Beaucageら、Tetrahedron、４９巻（１０号）：１９２５頁（１９９３年）；および米国特許第５，６４４，０４８号を参照されたい）、ホスホロジチオエート（例えば、Briuら、J. Am. Chem. Soc.、１１１巻：２３２１頁（１９８９年）を参照されたい）、Ｏ－メチルホスホロアミダイト（methylphosphoroamidite）連結（例えば、Eckstein、「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、Oxford University Pressを参照されたい）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格およびＰＮＡ連結（例えば、Carlssonら、Nature、３８０巻：２０７頁（１９９６年）を参照されたい）を含む代替的骨格を有しうる核酸類似体を含みうる。核酸は、正に帯電した骨格（例えば、Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９２巻：６０９７頁（１９９５年）を参照されたい）；非イオン性骨格（例えば、米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号；Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English、３０巻：４２３頁（１９９１年）；Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、１１０巻：４４７０頁（１９８８年）；Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide、１３巻：１５９７頁（１９９４年）；ASC Symposium Series、５８０巻、２および３章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編；Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.、４巻：３９５頁（１９９４年）；Jeffsら、J. Biomolecular NMR、３４巻：１７頁（１９９４年）；Tetrahedron、Lett.、３７巻：７４３頁（１９９６年）を参照されたい）、および非リボース骨格（例えば、米国特許第５，２３５，０３３号、および同第５，０３４，５０６号、ならびにASC Symposium Series、５８０巻、６および７章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編を参照されたい）を伴う類似体核酸を含む、他の核酸類似体を含みうる。核酸は、１または複数の炭素環糖（例えば、Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.（１９９５年）、１６９～１７６頁を参照されたい）を含みうる。リボース－リン酸骨格のこれらの修飾は、標識の付加、または生理学的環境における、このような分子の安定性の増大および半減期の延長を容易にしうる。

場合によって、オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用する。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖核酸を含みうる。オリゴヌクレオチドは、２～約１０００ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、２～約５００ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、約１０～約１００ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、約２０～約５０ヌクレオチドの長さでありうる。本開示の方法、デバイス、およびシステムでは、プローブを、固体基質へと付着させることができる。プローブは、基質へと直接結合させることもでき、リンカーを介して結合させることもできる。リンカーは、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含みうる。

固体基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのうちのいずれかの組合せでありうる。基質は、例えば、１または複数の粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、スフェア、容器、キャピラリー、パッド、薄片、薄膜、プレート、スライド、または半導体集積チップとして存在しうる。固体基質は、平面の場合もあり、代替的な表面構成を取る場合もある。例えば、固体基質は、合成または沈着が生じる、隆起領域または沈降領域を含有しうる。一部の例では、固体基質は、適切な光吸収特徴をもたらすように選び出すことができる。例えば、基質は、重合化ラングミュア－ブロジェット薄膜、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ_２、ＳｉＮ_４、修飾ケイ素、半導体集積回路（ＩＣ）チップの上部誘電層、または（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、もしくはこれらの組合せなど、様々なゲルもしくはポリマーのうちのいずれか１つでありうる。

複数のプローブは、固体基質上の１または複数のアドレス可能領域であって、本明細書で「ピクセル」と称するアドレス可能領域内に配置することができる。場合によって、固体基質は、少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ～１０、１０～５０、５０～１００、１００～５００、５００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１０，０００～５０，０００、５０，０００～１００，０００、１００，０００～５００，０００、５００，０００～１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。場合によって、固体基質は、最大で約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ～１０、１０～５０、５０～１００、１００～５００、５００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１０，０００～５０，０００、５０，０００～１００，０００、１００，０００～５００，０００、５００，０００～１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。場合によって、固体基質は、約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ～１０、１０～５０、５０～１００、１００～５００、５００～１，０００、１，０００～５，０００、５，０００～１０，０００、１０，０００～５０，０００、５０，０００～１００，０００、１００，０００～５００，０００、５００，０００～１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。

場合によって、プローブを含有しないピクセルを有することも有用である。このようなピクセルは、例えば、スポットへの結合を使用して、非特異的結合を推定し、これについて補正することにより、測定値の品質を増大させるための対照スポットとして作用しうる。

一部の例では、別のピクセルと同一なプローブ配列を有するが、他のピクセルと、物理的に隣接または近接しえない冗長ピクセルを有することも有用である。このようなプローブアレイにより収集されたデータは、製作の非理想性および測定誤差を受けにくい場合がある。

場合によって、標識を、標的へと組み込まれた標識に加えて、ピクセル内のプローブへも付着させる。このようなシステムでは、標的の捕捉は、２つの標識が、ピクセル内で、互いと緊密に近接する状態を結果としてもたらしうる。既に論じた通り、特異的な標識の間の相互作用は、固有の検出可能なシグナルを創出しうる。例えば、標的上の標識およびプローブが、それぞれ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象に参与しうる、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分である場合、ＦＲＥＴシグナルの増強またはＦＲＥＴシグナルのクエンチングを検出することができる。
（温度制御装置）

温度制御装置は、反応チャンバー内の溶液のために、特定の温度を確立することができ、かつ／または加熱および／もしくは冷却を要求する温度プロファイルを創出することができる。温度制御装置は、温度センサー（サーミスタまたは熱電対など）を使用して、温度を測定し、測定された温度に基づき、熱デバイス（ペルティエデバイスまたは抵抗ヒーターなど）を使用して、反応チャンバーへと熱を付加するか、またはこれから熱を除去するフィードバック制御システムを含みうる。温度制御装置は、熱を除去するための熱シンクを含みうる。温度制御装置は、アレイへと組み込むことができる。アレイの温度は、個々のピクセルごとに制御することもでき、アレイ領域またはアレイ部分領域ごとに制御することもでき、アレイワイドのスケールで制御することもできる。

温度制御装置は、基質、反応チャンバー、またはアレイピクセルの温度を変化させることができる。温度変化の速度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０℃／分でありうる。温度変化の速度は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０℃／分でありうる。温度変化の速度は、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０℃／分でありうる。温度制御装置は、温度を、線形速度（例えば、５℃／秒）で変化させることができる。代替的に、温度制御装置は、温度を、非線形速度で変化させることができる。温度制御装置は、温度を上昇させることもでき、低下させることもできる。
（検出器）

本開示は、シグナルを検出するのに使用しうる検出器を提供する。このようなシグナルは、融解曲線解析など、核酸ハイブリダイゼーションの熱力学的解析のために使用することができる。このような検出器は、光シグナルを測定するための光検出器、電気化学シグナルを測定するための電気化学検出器、または電荷を測定するための静電検出器でありうる。

検出器により検出されるシグナルは、全てのピクセルにおける標識の、増幅工程の間で、リアルタイムの活性レベルを含む、標識の存在、非存在、および／または数量についての情報を伝えるシグナルを含みうる。シグナルは、蛍光または化学発光などの光シグナルでありうる。シグナルは、電気化学シグナル、静電シグナル、抵抗、キャパシタンス、またはインダクタンスなどの電気シグナルでありうる。シグナルは、バックグラウンドシグナルに照らした標準化を含め、処理することができる。シグナルは、リアルタイムで検出することができる。

光検出器の例は、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ（冷却ＣＣＤを含む）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）イメージング装置、ｎ型金属酸化物半導体（ＮＭＯＳ）、能動ピクセルセンサー（ＡＰＳ）、または光電子増倍管（ＰＭＴ）を含むがこれらに限定されない。検出器はまた、選択的波長の測定を可能とする光学フィルターなどの波長選択的構成要素も含みうる。他の検出器の例は、電極を含む。

検出器は、１分間当たり、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、４００、５００、１０００、１０，０００回の速度で、試料をサンプリングしうる（例えば、測定値を収集しうる）。

検出器は、光源を含みうる。光源を使用して、例えば、蛍光標識および／または比色標識を励起することができる。光源は、白熱灯、ハロゲンランプ、蛍光灯、ガス放電灯、アーク灯、または発光ダイオード（ＬＥＤ）などの少なくとも１つのランプを含みうる。光源は、レーザーを含みうる。光源は、特異的な波長、またはある範囲の波長、例えばＵＶをもたらしうる。光源は、出力スペクトル、出力波長（複数可）を制御するためのフィルターを含みうる。光源は、個別に使用することもでき、組み合わせて使用することもできる、同じまたは異なる種類の、複数の光源を含みうる。

検出器は、フィルター、レンズ、コリメータ、鏡、反射器、ビームスプリッター、および拡散器を含むがこれらに限定されない、多様な光学的エレメントを含みうる。検出器は、波長フィルター（例えば、色フィルター、ＵＶフィルター、ＩＲフィルター）、二色性フィルター、および偏光フィルターを含むがこれらに限定されない、１または複数のフィルターを含みうる。フィルターは、個別に使用することもでき、組み合わせて使用することもできる、同じまたは異なる種類の、複数のフィルターを含みうる。検出器は、樽型歪曲収差もしくは魚眼型歪曲収差、陣笠型歪曲収差、糸巻型歪曲収差、単色収差（例えば、ピストン収差、ティルト収差、デフォーカス収差、球面収差、コマ収差、非点収差、像面湾曲収差、画像歪曲収差）、または色収差（例えば、軸上色収差、縦色収差、横色収差、倍率色収差）などの画像歪曲収差または画像収差を除去するためのエレメント（例えば、シグナル演算処理ユニット）を含みうる。このようなエレメントは、画像歪曲収差を、部分的または完全に補正するための命令を実装するようにプログラムされたコンピュータシステムを含みうる。例えば、ブラウン歪曲収差モデルまたはブラウン－コンラディーモデルを使用して、半径方向の歪曲収差および接線方向の歪曲収差について補正することができる。

一部の例では、検出器は、個々のピクセルから発光した光子を測定しうる。これらの光子は、その帯域内の光学標識の存在および／または活性と相関しうる。

場合によって、検出器は、ＣＭＯＳ集積回路（ＩＣ）加工工程（Plummer J.D.ら、「Silicon Technologies: Fundamentals, Practice, and Modeling」、Prentice Hall Electronics and VLSI Series、２０００年）を使用して構築されうる、集積型バイオセンサーアレイを含む。本明細書で「ＣＭＯＳバイオチップ」と称する、このようなシステムでは、プローブアレイを、ＣＭＯＳバイオチップの上部に置くことができる。このようなシステムの例は、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１０／０１２２９０４号、同第２０１３／０３４５０６５号、同第２０１４／０００１３４１号、同第２０１４／０３１８９５８号、同第２０１４／００１１７１０号、同第２０１２／０１６８３０６号、同第２０１３／０２２５４４１号、同第２０１２／００７７６９２号、同第２００７／００９９１９８号、同第２００８／００８１７６９号、同第２００８／０１７６７５７号、および同第２００８／００３９３３９号、ならびに米国特許第８，６３７，４３６号、同第８，０４８，６２６号、および同第８，５１８，３２９号において見出すことができる。
（検出方法）

温度の関数としての核酸（例えば、ＤＮＡ）ハイブリダイゼーション反応の、リアルタイムにおける並行的検出であって、ハイブリダイゼーションの熱力学について査定する並行的検出は、特定のピクセルにおいて、エネルギードナー（例えば、フルオロフォア）で標識された固定化プローブと、反応チャンバー内に存在する、エネルギーアクセプター（例えば、クエンチャー）で標識された標的との間の相互作用により実施することができる。検出はまた、同様の状況下における、インターカレーターと、相互作用するプローブおよび標的との間の相互作用により実施することもできる。いずれの場合も、反応チャンバーの温度を変動させながら、光検出器により、シグナルを、リアルタイムで、持続的に測定して、個々のピクセルにおいて、ハイブリダイズした標的の量を捕捉し、ハイブリダイゼーション反応が、そのピクセル内のその所与の温度において好適であるのかどうかについて査定することが典型的である。

本開示の方法は、蛍光標識および／またはクエンチャー標識などの光学標識を使用して利用することができる。しかし、ハイブリダイゼーション反応を表すシグナルが、アドレス可能なアレイのピクセルだけで発生し、これらに限定される一方で、全ての標的を含む反応容量が創出するバックグラウンドの光シグナルは最小限である。この固有の特徴は、検出可能なシグナル対干渉（またはシグナル対ノイズ）を改善するだけでなく、また、ピクセルレベルの測定値が、互いに対して独立なままであるので、マルチプレックス化能も可能とする。これは、反応チャンバーおよび水性試料が、それらの全ての間で共有されているという事実に抗している。
（ドナープローブを伴う、標的の末端標識化）

プローブおよび標的はいずれも、末端標識することができる。例えば、図２は、一方の末端（例えば、５’末端）において、エネルギーアクセプター標識で標識した核酸標的を示す。このような標的は、例えば、プライマーをエネルギーアクセプター標識で標識するＰＣＲ反応の、１または複数のアンプリコンでありうる。図２に示される方法Ａでは、結合の前に、プローブ上のドナーフルオロフォアは、波長がこのドナー分子の励起（吸収）スペクトルに合致する励起光源の存在下で、シグナルを能動的に発している。プローブが標的とハイブリダイズしたら、アクセプターは、ドナーと近接し、エネルギー移動を介して、ドナー標識化プローブから発生するシグナルを低減する。図２に示される方法Ｂでは、標的の、プローブとのハイブリダイゼーションは、ドナーとアクセプターとを特異的に緊密な近接下に置く、標的内で形成されるヘアピンループを伴う。これは、ドナーとアクセプターとの間の効率的な相互作用を確保するように施され、プローブ配列の３’末端を、アクセプター標識が存在する、標的の５’末端に部分的に合致させることにより達成することができる。これらの場合のいずれにおいても、標的がプローブとハイブリダイズする場合に結果として生じる、ドナーシグナルの低減を検出し、プローブと標的とのハイブリダイゼーション反応と相関させることができる。

一部の実施形態では、アクセプターは、クエンチャー分子などの非発光標識でありうる。
（標識されない標的）

標的を標識しない、代替的な設定は、考え合わせることができる。例えば、図３は、波長がインターカレーターの励起（吸収）スペクトルに特異的な励起光源が存在する場合における、核酸標的およびプローブの、インターカレーターとの相互作用を示す。図３に示される方法Ａでは、反応チャンバー内に存在し、自由に移動するインターカレーター分子は、標的に結合していないプローブの存在下では不活性であるが；標的がプローブとハイブリダイズすると、ハイブリダイズした複合体内のインターカレーターが活性化し、インターカレーターの発光スペクトルに合致するシグナルを発し、そのピクセルにおけるハイブリダイゼーションを指し示す。図３に示される方法Ｂでは、プローブを、インターカレーターからのエネルギーを受容することが可能なエネルギーアクセプターで標識するが；標的がプローブにハイブリダイズすると、活性化したインターカレーターからのエネルギーが、エネルギーアクセプターにより取り込まれる。アクセプターがフルオロフォアである場合、発せられるシグナルは、ハイブリダイゼーションを指し示す（Howell, WM、Jobs, M、およびBrooks, AJ、「iFRET: an improved fluorescence system for DNA-melting analysis」、Genome Res.、２００２年９月、１２巻（９号）：１４０１～７頁）。いずれの場合も、標的の、プローブへの付着により誘発される、シグナル（インターカレーターまたはアクセプターフルオロフォアのそれぞれからの）の増大を検出し、特異的な温度における、プローブと標的とのハイブリダイゼーションと相関させる。

（標識された標的）

核酸標的は、複数のアクセプターにより標識することができる。このような標的は、例えば、アクセプターで修飾されたｄＮＴＰを使用するＰＣＲ反応の、１または複数のアンプリコンでありうる。図４は、ドナーで標識したプローブと、複数のエネルギーアクセプター標識を伴う標的とを示す。標的とのハイブリダイゼーションの前に、プローブ標識は、波長がドナーの励起（吸収）スペクトルに合致する励起光源の存在下で、シグナルを発している。ハイブリダイゼーションが生じたら、標的上のエネルギーアクセプターは、エネルギードナーからのエネルギーを受容し、ドナーを効率的に不活化させ、そのシグナルをクエンチングすることができる。プローブが標的に結合する場合に結果として生じる、エネルギードナーシグナルの低減を検出し、その温度における、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションと相関させることができる。

一部の実施形態では、アクセプターは、クエンチャー分子などの非発光標識でありうる。
（並列的融解曲線解析（ＭＣＡ）についての結果の作成）

本明細書で記載される検出方法を使用して、並列的ＤＮＡ融解曲線解析（ＭＣＡ）を行うことができる。本開示でさらに記載される通り、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間の結合またはハイブリダイゼーションは、個々のピクセル内のシグナルの変化を結果としてもたらしうる。このようなシグナルの変化は、使用される検出方法に応じて、シグナルの増大の場合もあり、シグナルの減少の場合もある。標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションの量または速度を変更するように、条件を制御し、変化させることができる。例えば、温度を上昇させて、標的とプローブとの間の結合を減少させる（すなわち、「融解させる」）ことができる。

ＭＣＡを使用して、標的の、異なるプローブとのハイブリダイゼーションの差違を検出することができる。例えば、核酸標的は、標的と、所与のプローブとの間の結合に影響を及ぼしうる、配列の差違（例えば、ＳＮＰ）を含みうる。これらの差違は、異なるピクセルにおける融解曲線の差違、または単一ピクセルの異なる実験における融解曲線の差違として観察することができる。別の例では、２つの核酸標的は、挿入もしくは欠失（ｉｎｄｅｌ）または配列リピートの数の変動などにより、長さが異なりうる。この長さの差違は、例えば、標識と、標的核酸内の標的配列位置に結合するプローブとの間の長さを変動させることにより、ＭＣＡを介して検出することができる。

図５は、ドナープローブを伴う、標的の末端標識化の使用など、本開示の方法を使用して、どのようにしてＭＣＡを並列的に実施するのかについての例を示す。この例では、３つのピクセルからのシグナルを示す。これらのピクセルのうちの２つは、反応チャンバー内の標的（標的１および標的２）に合致する、異種の合致配列を伴うプローブを含むのに対し、第３のピクセルは、試料中のいずれの配列にも特異的にハイブリダイズしないようにデザインされたプローブを含む。これらのピクセルから発生するシグナルは、それぞれ、シグナル１、シグナル２、および対照である。図５の測定シグナルに示される通り、温度を上昇させて、標的を、プローブから「融解」させるにつれ、生シグナルは、シグナル１およびシグナル２について、プロファイルは異なるが、非単調増加を示す。しかし、対照シグナルは、例えば、温度の関数としての、ドナーフルオロフォアの量子効率（例えば、明度）の低減に起因して、減少しうる。標準化シグナルのグラフにおいて明白である通り、対照を使用して、使用されるフルオロフォアの温度依存性を較正し分けたら、標的１および標的２いずれのハイブリダイゼーションによるＭＣＡシグナルも、はるかにより明らかとなり、標的１が、標的２と比較して、より安定的な構造をかつて有したことを明瞭に示す。
（集積型検出器）

本開示の方法は、集積型検出器を使用して実装することができる。従来の検出装置ではなく、集積型バイオセンサーを使用することの利点の例は、サイズの劇的な低減および費用の軽減である。さらに、集積型バイオセンサーアレイは、比類のない信頼性、大量生産および確実性をもたらしうる半導体集積回路（ＩＣ）マイクロ製作工程、例えば、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）を使用して製造することができる。本開示の集積型バイオセンサーアレイと共に使用されうるセンサーの例は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１０／０１２２９０４号、同第２０１３／０３４５０６５号、同第２０１４／０００１３４１号、同第２０１４／０３１８９５８号、同第２０１４／００１１７１０号、同第２０１２／０１６８３０６号、同第２０１３／０２２５４４１号、同第２０１２／００７７６９２号、同第２００７／００９９１９８号、同第２００８／００８１７６９号、同第２００８／０１７６７５７号、および同第２００８／００３９３３９号、ならびに米国特許第８，６３７，４３６号、同第８，０４８，６２６号、および同第８，５１８，３２９号において提供されている。

このような配置では、各センサーエレメントは、アドレス可能でありえ、それ自体のプローブを含みうる。このようなセンサーエレメントは、バイオセンサーでありうる。アレイは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５０００、または１０００００個の集積型バイオセンサーなど、多数の個々のバイオセンサーを含みうる。アレイ内の個々のバイオセンサーの密度は、１ｍｍ^２当たり、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００のバイオセンサーピクセルでありうる。

アレイ内のバイオセンサーは、光ダイオードなどの光センサーを含みうる。各バイオセンサーにはまた、ヒーターおよび温度センサー（例えば、熱電対、サーミスタ）などの温度制御エレメントも付随しうる。バイオセンサーアレイは、光センサーと、反応チャンバーまたはアレイピクセルとの間の発光フィルターなどの光学フィルターであって、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１０／０１２２９０４号、同第２０１３／０３４５０６５号、同第２０１４／０００１３４１号、同第２０１４／０３１８９５８号、同第２０１４／００１１７１０号、同第２０１２／０１６８３０６号、同第２０１３／０２２５４４１号、および同第２００８／００８１７６９号、ならびに米国特許第８，６３７，４３６号および同第８，５１８，３２９号において記載されている光学フィルターを含みうる。

例えば、図６は、３２×３２アレイの光学的バイオセンサー（図６、右上）を含む、光学ＣＭＯＳ集積型バイオセンサー検出器（図６、左上）を示す。各光学バイオセンサーは、１００μｍ×１００μｍの面積を占有する。光学バイオセンサーアレイは、３．２ｍｍ×３．２ｍｍの総面積を有する。各バイオセンサーは、集積型ＣＭＯＳ光ダイオードセンサーを含み、発光フィルターは、ＣＭＯＳ集積型センサーと、関連するアレイピクセルを有する反応チャンバーとの間に配置される（図６、左下）。アレイの熱は、ヒーターにより制御することができる（図６、右下）。

図７は、光学ＣＭＯＳバイオチップのための回路アーキテクチャーの例を示す。１０２４のピクセルの各々は、発光フィルターにより隔てられて、光ダイオード回路が付随する反応チャンバーを含む。各ピクセルは、ヒーター、ディジタル式制御装置、ならびに較正およびデータ回収のためのシグナル入力／出力装置をさらに含む。バイオチップは、ディジタル式制御装置をさらに含む。ディジタル式制御装置は、データを受け取るために、バイオチップピクセルの行／列選択が可能な、走査モジュールと相互接続されている。ディジタル式制御装置はまた、オンチップ温度を制御することが可能な熱制御装置とも相互接続されている。電源管理システムは、ピクセルおよび熱制御装置へと電力を供給する。 光学ＣＭＯＳバイオチップの特色については、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１０／０１２２９０４号、同第２０１３／０３４５０６５号、同第２０１４／０００１３４１号、同第２０１４／０３１８９５８号、同第２０１４／００１１７１０号、同第２０１２／０１６８３０６号、ならびに米国特許第８，５１８，３２９号において記載されている。
（コンピュータ制御システム）

本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図１１は、融解曲線解析などの化学的解析を行うようにプログラムされるか、または他の形で構成されたコンピュータシステム１１０１を示す。コンピュータシステム１１０１により、例えば、温度、試薬取扱い、および検出など、本開示の化学的解析（例えば、融解曲線解析）の多様な側面を調節することができる。コンピュータシステム１１０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔に配置されたコンピュータシステムでありうる。電子デバイスは、モバイル型の電子デバイスでありうる。

コンピュータシステム１１０１は、シングルコアプロセッサーの場合もあり、マルチコアプロセッサーの場合もあり、並列的演算処理のための、複数のプロセッサーの場合もある、中央演算処理装置（ＣＰＵ；本明細書ではまた、「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」とも称する）１１０５を含む。コンピュータシステム１１０１はまた、メモリまたはメモリロケーション１１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１１１５（例えば、ハードディスク）、１または複数の他のシステム、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶アダプターおよび／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺デバイス１１２５と通信するための通信インターフェース１１２０（例えば、ネットワークアダプター）も含む。メモリ１１１０、記憶装置１１１５、インターフェース１１２０、および周辺デバイス１１２５は、マザーボードなど、通信バス（実線）を介して、ＣＰＵ１１０５へと接続される。記憶装置１１１５は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリー）でありうる。コンピュータシステム１１０１は、通信インターフェース１１２０を一助として、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１１３０へと作動的にカップリングさせることができる。ネットワーク１１３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと接続された、イントラネットおよび／もしくはエクストラネットでありうる。ネットワーク１１３０は、場合によって、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１１３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能としうる、１または複数のコンピュータサーバーを含みうる。ネットワーク１１３０は、場合によって、コンピュータシステム１１０１を一助として、コンピュータシステム１１０１へとカップリングさせたデバイスが、クライアントとしてもサーバーとしても挙動することを可能としうる、ピアツーピアネットワークを実装しうる。

ＣＰＵ１１０５は、プログラムまたはソフトウェアで具体化されうる、マシン読取り命令列を実行しうる。命令は、メモリ１１１０などのメモリロケーションに保存することができる。命令は、ＣＰＵ１１０５へと下すことができ、その後、本開示の方法を実装するように、プログラムまたは他の形で、ＣＰＵ１１０５を設定することができる。ＣＰＵ１１０５によりなされる操作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含みうる。

ＣＰＵ１１０５は、集積回路など、回路の部分でありうる。システム１１０１の、１または複数の他の構成要素を、回路に組み入れることができる。場合によって、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

記憶装置１１１５は、ドライバー、ライブラリー、およびセーブされたプログラムなどのファイルを保存しうる。記憶装置１１１５は、例えば、ユーザー優先事項およびユーザープログラムなどのユーザーデータを保存しうる。コンピュータシステム１１０１は、場合によって、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム１１０１と接続された遠隔サーバー上に配置されたデータ記憶装置など、１または複数のさらなるデータ記憶装置であって、コンピュータシステム１１０１に対して外部のデータ記憶装置を含みうる。

コンピュータシステム１１０１は、ネットワーク１１３０を介して、１または複数の遠隔コンピュータシステムと通信しうる。例えば、コンピュータシステム１１０１は、ユーザー（例えば、実験室技官）の遠隔コンピュータシステムと通信しうる。遠隔コンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（例えば、携帯用ＰＣ）、スレートＰＣもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応型デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルディジタルアシスタントを含む。ユーザーは、ネットワーク１１３０を介してコンピュータシステム１１０１にアクセスしうる。

本明細書で記載される方法は、例えば、メモリ１１１０上または電子記憶装置１１１５上など、コンピュータシステム１１０１の電子メモリロケーション上に保存された、マシン（例えば、コンピュータプロセッサー）実行コードにより実装することができる。マシン実行コードまたはマシン読取りコードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用の間に、コードは、プロセッサー１１０５により実行することができる。場合によって、コードは、記憶装置１１１５から検索し、プロセッサー１１０５によるたやすいアクセスのために、メモリ１１１０上に保存することができる。一部の状況では、電子記憶装置１１１５は、除外することができ、マシン実行命令は、メモリ１１１０上に保存する。

コードは、そのコードを実行するように適合させたプロセッサーを有するマシンとの使用のために、あらかじめコンパイルかつ構成することもでき、ランタイムの間にコンパイルすることもできる。コードは、そのコードを、あらかじめコンパイルされた様式またはコンパイルされた通りの様式で実行することを可能とするのに選択されうるプログラム言語で供給することができる。

コンピュータシステム１１０１など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。技術の多様な態様は、ある種のマシン読取りメディア上に保有されているか、またはこの中に具体化されている、マシン（またはプロセッサー）実行コードおよび／または関連するデータの形態であることが典型的な「製品」または「製造品」として考えることができる。マシン実行コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置上に保存することができる。「保存」型メディアは、任意の時点において、ソフトウェアのプログラミングのために一時的でないメモリを提供しうる、多様な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなど、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリまたはその関連モジュールのいずれかまたは全てを含みうる。ソフトウェアの全部または一部は、時折、インターネットまたは他の多様な遠隔通信ネットワークを介して通信することができる。このような通信は、例えば、ソフトウェアの、１つのコンピュータまたはプロセッサーから、別のコンピュータまたはプロセッサーへのローディング、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータから、アプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのローディングを可能としうる。したがって、ソフトウェアエレメントを保有しうる、別種のメディアは、有線ネットワークおよび光ケーブルネットワークを介する、ローカルデバイス間の物理インターフェース、および多様なエアリンクによる物理インターフェースにわたり使用されるメディアなどの、光学メディア、電気メディア、および電磁波メディアを含む。有線リンクまたは無線リンク、光学リンクなど、このような波を保有する物理エレメントもまた、ソフトウェアを保有するメディアとして考えることができる。本明細書で使用される、コンピュータ「読取りメディア」またはマシン「読取りメディア」などの用語は、一時的でない有形「記憶」メディアに限るのでない限り、プロセッサーに、実行のための命令を与えることに参与する任意のメディアを指す。

よって、コンピュータ実行コードなどのマシン読取りメディアは、有形記憶メディア、搬送波メディア、または物理的伝送メディアを含むがこれらに限定されない多くの形態を取りうる。非揮発性記憶メディアは、例えば、図面に示される、データベースなどを実装するのに使用しうるコンピュータなど、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのうちのいずれかなど、光学ディスクまたは磁気ディスクを含む。揮発性記憶メディアは、このようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形伝送メディアは、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含む配線を含む銅線および光ファイバーを含む。搬送波伝送メディアは、ラジオ周波数（ＲＦ）データ通信時および赤外（ＩＲ）データ通信時に発生するシグナルまたは波など、電気シグナルもしくは電磁シグナル、または音響波もしくは光波の形態を取りうる。したがって、コンピュータ読取りメディアの一般的形態は、例えば、フロッピーディスク（登録商標）、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気メディア、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、他の任意の光学的メディア、パンチカード用紙テープ、穿孔パターンを伴う、他の任意の物理的記憶メディア、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップもしくはメモリカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、このような搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取りうる、他の任意のメディアを含む。コンピュータ読取りメディアのこれらの形態の多くは、１または複数の命令の、１または複数の列を、実行のために、プロセッサーへと伝えることに関与しうる。

コンピュータシステム１１０１に、例えば、温度値、温度制御、検出器データ、および流体操作を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）１１４０を含む電子ディスプレイ１１３５を組み入れることもでき、コンピュータシステム１１０１を、これらと接続することもできる。ＵＩの例は、限定なしに述べると、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースを含む。

本開示の方法およびシステムは、１または複数のアルゴリズムを介して実装することができる。アルゴリズムは、実行時に、中央演算処理装置１１０５により、ソフトウェアを介して実装することができる。アルゴリズムは、例えば、アレイピクセルの温度を制御し、データを回収および処理することができる。

（実施例１）
集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析（ＭＣＡ）
プローブのアレイを、第１標的および第２の標的と接触させ、そしてプローブと標的との間で結合が生じる（例えば、図８を参照されたい）。図８Ｂ（上グラフ）に示される通り、オンチップヒーターを使用して、ｔ＝０分後におけるＴ＝４０℃、ｔ＝１０分後におけるＴ＝４８℃、ｔ＝１５分後におけるＴ＝５７℃、ｔ＝２０分後におけるＴ＝６７℃、ｔ＝２５分後におけるＴ＝７６℃、およびｔ＝３０分後におけるＴ＝８５℃の時点を含む時間経過にわたり、温度を上昇させる（図８Ａ）。集積型バイオセンサーアレイにより、励起シグナルを遮断し、アレイからの発光シグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第１の標的（シグナル（１））および第２の標的（シグナル（２））について、融解曲線を作成する（図８Ｂ、下グラフ）。使用されるプローブおよび標的配列を、図８Ｃに示す。

この実験におけるドナー標識は、ＨＥＸであり、アクセプター（クエンチャー）は、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋである。
（実施例２）
インターカレーターベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析（ＭＣＡ）

プローブのアレイを、第１の標的および第２の標的と接触させ、そしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎインターカレーターの存在下で、プローブと標的との間で結合が生じる（例えば、図９、右側を参照されたい）。プローブと標的との間の結合の非存在下では、インターカレーターは、活性でなく、プローブと標的とが結合すると、インターカレーターが活性化し、シグナルを発する。オンチップヒーターを使用して、時間経過にわたり、温度を上昇させる。集積型バイオセンサーアレイにより、励起シグナルを遮断し、アレイからの発光シグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第１の標的（シグナル（１））および第２の標的（シグナル（２））について、融解曲線を作成する（図９、グラフ）。使用されたプローブおよび標的配列を、図９、下方に示す。
（実施例３）
フルオロフォア－クエンチャーベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析（ＭＣＡ）

第１、第２、第３、および第４のプローブのアレイを、第１、第２、第３、第４の標的と接触させ、そしてプローブと標的との間で結合が生じる（例えば、図１０Ａ、右側を参照されたい）。プローブを、エネルギードナーで末端標識し、標的を、エネルギーアクセプターで末端標識する。時間経過にわたり、温度を上昇させる。バイオチップセンサーにより、アレイからのシグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第１の標的（シグナル１）、第２の標的（シグナル２）、第３の標的（シグナル３）、および第４の標的（シグナル４）について、融解曲線を作成する（図１０Ａ、グラフ）。使用されたプローブおよび標的配列を、図１０Ｂに示す。

この実験におけるドナー標識は、ＨＥＸであり、アクセプター（クエンチャー）は、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋである。

本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、これらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提供されていることが明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される具体例により限定されることを意図するものではない。本発明について、前述の明細書に言及しながら記載してきたが、本明細書の実施形態についての記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。今や、本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到しうる。さらに、様々な条件および変数に依存する、本発明の全ての態様は、本明細書で明示される具体的な描示、構成、または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する、多様な代替物も、本発明の実施において利用しうることを理解すべきである。したがって、本発明はまた、任意のこのような代替物、改変、変更、または同等物も対象とすることが想定される。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を規定し、これにより、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造が対象とされることが意図される。

Claims (15)

1. 試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、
   （ａ）試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、（ｉ）前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブと、前記標的核酸分子にカップリングしない対照プローブとを含む表面であって、前記プローブ及び前記対照プローブはそれぞれエネルギードナーを含み、前記標的核酸分子はエネルギーアクセプターを含む、表面を有し、（ｉｉ）前記プローブからの少なくとも１つのシグナルと、前記対照プローブからの対照シグナルとを検出する、チップを提供するステップと；
   （ｂ）前記試料を、前記プローブが前記標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供するステップであって、前記プローブが前記標的核酸分子に選択的にカップリングすると、前記少なくとも１つのシグナルが、前記エネルギードナーと前記エネルギーアクセプターとの間のエネルギー移動に伴って減少する、ステップと；
   （ｃ）前記表面を温度変化下に置くステップであって、前記標的核酸分子が前記温度変化の間に前記プローブから解離する、ステップと；
   （ｄ）前記表面を前記温度変化下に置いている間に、（ｉ）前記少なくとも１つのシグナルにおける増加と、（ｉｉ）前記対照シグナルとを、リアルタイムで検出するために前記集積型センサーを使用するステップと；
   （ｅ）（ｄ）において検出された前記少なくとも１つのシグナルにおける前記増加を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップであって、これにより前記サンプルにおける前記標的核酸分子の前記存在を決定し、前記シグナル対温度データは前記対照シグナルを用いて較正される、ステップと
   を含む方法。
2. 前記プローブが、オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的核酸分子の配列が、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する、請求項２に記載の方法。
4. 前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つのシグナルが光シグナルであり、前記エネルギーアクセプターが、前記エネルギードナーの光学活性をクエンチングする、請求項１に記載の方法。
6. 前記エネルギードナーがフルオロフォアであり、前記エネルギーアクセプターがクエンチャーである、請求項１に記載の方法。
7. （ｄ）における前記少なくとも１つのシグナルを前記検出することが、前記少なくとも１つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記集積型センサーが、光検出器をさらに含み、（ｄ）において、前記少なくとも１つのシグナルを、前記光検出器で測定する、請求項１に記載の方法。
9. 前記少なくとも１つのシグナルを、前記標的核酸分子を含む前記試料を前記チップと流体接触させている間に検出する、請求項１に記載の方法。
10. 前記シグナル対温度データが、融解曲線の一部である、請求項１に記載の方法。
11. （ａ）の前に、（ｉ）前記標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、前記鋳型核酸分子と相補的な少なくとも１つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、（ｉｉ）前記反応混合物を、前記試料中の前記標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含み、（１）前記少なくとも１つのプライマーが、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型（ＳＮＰ）に対して選択的な配列を有するか、または（２）前記核酸増幅が、非対称的核酸増幅である、請求項１に記載の方法。
12. （ｃ）において、前記表面を、１℃／分－１５％～２０℃／分＋１５％の平均速度で、前記温度変化下に置く、請求項１に記載の方法。
13. （ａ）において、前記集積型センサーが、前記表面の下方の発光層と、前記発光層の下方の光検出器とをさらに含み、（ｄ）において、光検出器が、前記試料からの前記少なくとも１つのシグナルを、前記発光層を通る透過の際に測定する、請求項１に記載の方法。
14. 前記表面が、独立してアドレス可能な複数の位置を含み、前記独立してアドレス可能な複数の位置が複数のプローブを含み、複数のプローブのそれぞれが前記試料に含まれる異なる標的核酸分子にカップリングする、請求項１に記載の方法。
15. 前記独立してアドレス可能な複数の位置から並行してシグナルを検出するために前記集積型センサーを使用するステップと、前記検出されたシグナルを用いてシグナル対温度データを発生させるステップとをさらに含み、これにより前記試料に含まれる複数の異なる標的核酸分子の存在を決定する、請求項１４に記載の方法。
    

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