JP2022137243A - 集積型アレイを使用する核酸ハイブリダイゼーション熱力学の多重分析 - Google Patents
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- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Abstract
【課題】 集積型アレイを使用する核酸ハイブリダイゼーション熱力学の多重分析の提供。【解決手段】 本開示は、固体表面へと付着させた、核酸プローブのアドレス可能なアレイを含む、単一の試料チャンバー内で、複数の標的核酸配列を同時に識別するための方法およびデバイスを提供する。システムの温度を変動させながら、アレイ内の個々のプローブ位置における、標的配列のハイブリダイゼーションの際に、リアルタイムで、アドレス可能なシグナルを、発生させ、測定することができる。次いで、このようにして発生させたシグナルであって、温度の関数としてのシグナルを使用して、各アドレス可能な位置における、核酸ハイブリダイゼーションの特性を算出することができ、最終的に、これを利用して、標的核酸の配列を推定する。特に、集積型半導体バイオセンサーアレイデバイスを使用して、アドレス可能なシグナルを測定することができる。【選択図】なし
Description
(相互参照)
本出願は、2015年3月23日に出願された米国特許出願第14/665,904号の利益を主張しており、この出願は、全体が参考として本明細書中に援用される。
本出願は、2015年3月23日に出願された米国特許出願第14/665,904号の利益を主張しており、この出願は、全体が参考として本明細書中に援用される。
(背景)
DNA-DNAハイブリダイゼーションは、デオキシリボ核酸(DNA)ポリマー(ポリヌクレオチド)間の配列類似性の程度を測定する分子生物学技法である。基礎となる原理は、DNAポリマーの構成ブロック、すなわち、ヌクレオチドが、水素結合(A-T間の2つの水素結合およびC-G間の3つの水素結合)を形成する相補的な核酸塩基との対合(AのTとの対合およびCのGとの対合)が可能な特異的な窒素含有核酸塩基(グアニン「G」、アデニン「A」、チミン「T」、およびシトシン「C」)を含むことである。したがって、相補的な配列を伴うDNA部分は、互いと結合し(ハイブリダイズし)、DNA二量体(二本鎖DNA構造)を形成するアフィニティーを有する。ハイブリダイゼーションの熱力学的特徴は、主に、DNA部分の間に形成される、水素結合の総数および強度に依存し、これは、相補的な核酸塩基(塩基)のストレッチ、非相補的なギャップ、ならびに環境内のアニオンおよびカチオンの濃度および種類など、複数のパラメータの関数である数量である。
DNA-DNAハイブリダイゼーションは、デオキシリボ核酸(DNA)ポリマー(ポリヌクレオチド)間の配列類似性の程度を測定する分子生物学技法である。基礎となる原理は、DNAポリマーの構成ブロック、すなわち、ヌクレオチドが、水素結合(A-T間の2つの水素結合およびC-G間の3つの水素結合)を形成する相補的な核酸塩基との対合(AのTとの対合およびCのGとの対合)が可能な特異的な窒素含有核酸塩基(グアニン「G」、アデニン「A」、チミン「T」、およびシトシン「C」)を含むことである。したがって、相補的な配列を伴うDNA部分は、互いと結合し(ハイブリダイズし)、DNA二量体(二本鎖DNA構造)を形成するアフィニティーを有する。ハイブリダイゼーションの熱力学的特徴は、主に、DNA部分の間に形成される、水素結合の総数および強度に依存し、これは、相補的な核酸塩基(塩基)のストレッチ、非相補的なギャップ、ならびに環境内のアニオンおよびカチオンの濃度および種類など、複数のパラメータの関数である数量である。
DNA-DNAハイブリダイゼーションの熱力学的特徴は、参与部分に関する配列情報を推定するのに強力なツールである。このような情報を抽出する「ゴールドスタンダード」の方法は、段階的加熱工程における、二本鎖DNA二量体およびハイブリダイズしたDNA二量体の解離特徴を検出する融解曲線解析(MCA)である。温度を上昇させると、DNA-DNA複合体(複数の水素結合を介してアセンブルされる)は、安定的でなくなり、鎖は、解離し始める。したがって、ハイブリダイズした複合体の濃度を、温度と対比してモニタリングすることにより、複合体の安定性を、温度の関数として査定し、これを、標的配列(および水素結合)内の変更と相関させ、例えば、一塩基多型(「SNP」)または挿入/欠失(「indel」)を識別することができる。
(要旨)
本明細書では、現行および従来のMCA技法に付随する多様な制限が認識される。MCAは、元来当初はUV吸光度測定値を使用することで可能となった(Ansevinら、Biopolymers、1976年)が;今日では、SYBR Greenなど、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)挿入型フルオロフォアを使用する、蛍光測定に基づく技法が、より一般的である(Wittwer C. T.ら、BioTechniques、22巻:130~138頁、1997年、Ririe K. M.ら、Anal. Biochem、245巻:154~160頁、1997年、Lipsky, R. H.ら、Clin. Chem.、47巻:635~644頁、2001年、およびWittwer C.
T.ら、US7,785,776)。
本明細書では、現行および従来のMCA技法に付随する多様な制限が認識される。MCAは、元来当初はUV吸光度測定値を使用することで可能となった(Ansevinら、Biopolymers、1976年)が;今日では、SYBR Greenなど、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)挿入型フルオロフォアを使用する、蛍光測定に基づく技法が、より一般的である(Wittwer C. T.ら、BioTechniques、22巻:130~138頁、1997年、Ririe K. M.ら、Anal. Biochem、245巻:154~160頁、1997年、Lipsky, R. H.ら、Clin. Chem.、47巻:635~644頁、2001年、およびWittwer C.
T.ら、US7,785,776)。
MCAベースの方法は、ハイブリダイゼーションの熱力学を測定する手法をもたらすが、マルチプレックス化能、すなわち、単一の反応チャンバー内で同時に生じる、複数のDNAハイブリダイゼーション反応を解析する能力は、極めて限定されている。インターカレーティング色素の場合、例えば、測定された蛍光シグナルは基本的に、反応チャンバー内の、個々のハイブリダイゼーションイベントに由来する、全てのシグナルの総計であり、したがって、DNA部分が、類似する熱力学的特徴を有するか、または1つの部分が、他の部分と比較して、有意に高い濃度および有意に大きなシグナルを有する場合は、解読が困難である。
一定温度におけるDNAハイブリダイゼーションのレベルの検出もまた、特異的な配列の識別において使用されている。場合によって、GeneChipと称するDNAマイクロアレイプラットフォームは、典型的に、この原理に基づき作動する(Schena M.、Shalon D.、Davis R. W.、Brown P. O.、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science、1995年;270巻(5235号):467~470頁、およびStoughton RB、「Applications of DNA microarrays in biology」、Annu Rev Biochem.、2005年;74巻:53~82頁)。マイクロアレイの利点は、DNAハイブリダイゼーションの熱力学的解析を利用して、配列を、大規模に並列的に識別することである。しかし、マイクロアレイは、MCA方法の特異性を欠く。これは、根本的な限界であり、マイクロアレイは、単一の温度点、すなわち、洗浄およびイメージングの前に、試料を、アレイ上で、一定の時間にわたりインキュベートするときの温度において、ハイブリダイゼーションを測定しうるという事実に根ざしている。マイクロアレイからのデータは、SNPまたはindelを識別するのには、依然として有用であるが、熱力学的解析との関連では完全ではない。一般的に述べると、また、単一の温度点において核酸標的の間を適正に区別しうるマイクロアレイのために、多数の固定化プローブをデザインすることも困難である。標的のCG含量が大きなばらつき(>20%)を示すか、または標的が、高度に安定的なヘアピン単量体構造を含む場合、この問題は、特に、難題となる。
ハイブリダイゼーションの熱力学的測定は、ハイブリダイゼーション反応が、平衡に達した後で形成される、ハイブリダイズした複合体の熱力学的解離特性についての解析を伴いうる。一部の例では、温度の関数としての、ハイブリダイズした複合体の存在または非存在と関連する発光シグナルの強度を記録することにより、熱力学的測定を行う。熱力学的測定値は、ハイブリダイズした複合体の安定性に関しうる。このような測定値は、安定平衡または準安定平衡にあるシステムに適用可能でありうる。
ハイブリダイゼーションの熱力学的測定は、ハイブリダイゼーション反応が、平衡に達した後で形成される、ハイブリダイズした複合体の熱力学的解離特性についての解析を伴いうる。一部の例では、温度の関数としての、ハイブリダイズした複合体の存在または非存在と関連する発光シグナルの強度を記録することにより、熱力学的測定を行う。熱力学的測定値は、ハイブリダイズした複合体の安定性に関しうる。このような測定値は、安定平衡または準安定平衡にあるシステムに適用可能でありうる。
これに対し、ハイブリダイゼーションの反応速度の測定は、ハイブリダイゼーション反応の反応速度についての解析を伴う場合があり、一定温度における温度の関数としての、ハイブリダイズした複合体の存在または非存在と関連する発光シグナルの強度を記録することにより達することができる。反応速度の測定値は、ハイブリダイズした複合体を形成するためのプローブと核酸標的との反応性に関係しうる。このような測定値は、非平衡から、平衡への遷移の下にあるシステムに適用可能でありうる。
Wittwer C. T.ら、BioTechniques、22巻:130~138頁、1997年
Ririe K. M.ら、Anal. Biochem、245巻:154~160頁、1997年
Lipsky, R. H.ら、Clin. Chem.、47巻:635~644頁、2001年
Schena M.、Shalon D.、Davis R. W.、Brown P. O.、Science、1995年;270巻(5235号):467~470頁
Stoughton RB、Annu Rev Biochem.、2005年;74巻:53~82頁
本開示は、単一の反応チャンバー内でリアルタイムに同時に起こる、複数の核酸ハイブリダイゼーション反応の熱力学的特徴を測定する方法、デバイス、およびシステムを提供する。本明細書で提供される多様な実施形態を使用して、数例を挙げると、分子的診断法、核酸(例えば、DNA)法医学解析、および病原体遺伝子型決定などの適用のための、固有の核酸検出プラットフォームを創出することができる。半導体集積型バイオセンサーアレイを利用して、要求される検出デバイスを小型化し、かつ、組み込みうる、さらなる実施形態も提供される。
本開示の態様は、試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、(a)試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、試料チャンバーが、標的核酸分子を有する試料を保持するように構成され、集積型センサーが、(i)標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、少なくとも1つのシグナルが標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップを提供するステップと;(b)試料を、プローブが標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で試料チャンバー内に提供するステップと;(c)試料を試料チャンバー内にある間に、表面を温度変化下に置くステップと;(d)表面を温度変化下に置いている間に、少なくとも1つのシグナルを、リアルタイムで測定するステップと;(e)その温度変化での少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップとを含む方法を提供する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、プローブは、オリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、試料を、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子とハイブリダイズすることを可能とする条件下で試料チャンバー内に提供する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、標的核酸分子の配列は、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイは、少なくとも約100個の集積型センサー、少なくとも約500個の集積型センサー、少なくとも約1,000個の集積型センサー、少なくとも約2,000個の集積型センサー、少なくとも約5,000個の集積型センサー、または少なくとも約10,000個の集積型センサーを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルは、光シグナル、電気化学シグナル、および静電シグナルからなる群から選択される。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルは、エネルギーアクセプターと、エネルギードナーとの対の間の相互作用を示す光シグナルである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、エネルギードナーの光学活性をクエンチングする。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターを、標的核酸分子の、1または複数のヌクレオチドとカップリングさせる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、クエンチャーである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーをプローブとカップリングさせる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーは、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、相互作用は、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ではない。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルは、光学活性分子種の活性を示す光シグナルである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光学活性分子種は、インターカレーターである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光学活性分子種は、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、検出するステップは、少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、検出するステップは、少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた減少を測定することを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、光検出器をさらに含み、(d)において、少なくとも1つのシグナルを、光検出器で測定する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、試料は、複数の標的核酸分子を含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、複数の集積型センサーのアレイの一部であり、それらの各々は、複数の標的核酸分子のうちの少なくとも1つを検出する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップが、1個の集積型センサーと、さらなる集積型センサーとを含み、試料が、1つの標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含む場合、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子を検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子と選択的にカップリングする、さらなるプローブを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子の存在または非存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギーアクセプターは、クエンチャーである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、エネルギードナーは、フルオロフォアである。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、プローブは、表面へとリンカーを介して固定化されている。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される分子種を含む。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルを、標的核酸分子を含む試料をチップと流体接触させている間に検出する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルは、複数のシグナルを含む。複数のシグナルは、複数の時点および/または複数の温度におけるシグナルでありうる。例えば、温度を、時間の線形関数または非線形関数である速度で変化させることができ、シグナルを測定することができる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、温度変化は、第1の温度から、第1の温度より高温である第2の温度への温度変化である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、シグナル対温度データは、融解曲線の一部である。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、光検出器は、相補型金属酸化物半導体(CMOS)集積回路(IC)デバイスを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、(a)の前に、(i)標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、鋳型核酸分子と相補的な少なくとも1つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、(ii)反応混合物を、試料中の標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのプライマーは、標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)を識別するように選択される配列を有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、核酸増幅は、非対称的核酸増幅である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーから少なくとも1つのシグナルを電気的に受け取り、標的核酸分子の存在または非存在を、少なくとも1つのシグナルから決定するコンピュータプロセッサーへと、チップを電気的にカップリングさせてある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、コンピュータプロセッサーは、シグナル対温度データを発生させる。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、シグナル対温度データを、電子報告書に出力するステップをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、電子報告書を、ユーザーの電子デバイスのユーザーインターフェースに出力する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、(c)において、表面を、約1℃/分~約20℃/分の平均速度で、温度変化下に置く。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、(c)において、表面と熱伝導する温度制御装置により、表面を温度変化下に置く。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つのシグナルが、標的核酸分子の存在を示す場合、標的核酸分子を、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約99.9%、または少なくとも約99.99%の感度で検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、シグナル対温度データを使用して、標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)を決定するステップをさらに含む。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、対照プローブと関連する少なくとも1つの対照シグナルまたは複数の対照シグナルを測定するステップをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、シグナル対温度データを、少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、さらなる集積型センサーを含み、試料が、さらなる標的核酸分子を含む場合、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子を検出する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、表面の下方の発光層と、発光層の下方の光検出器とをさらに含み、ステップ(d)において、光検出器は、試料からの少なくとも1つのシグナルを、発光層を通る透過の際に測定する。
集積型センサーは、標的核酸分子と選択的にハイブリダイズするプローブ、または標的核酸分子と選択的にハイブリダイズしない対照プローブなどのプローブを有する表面と一体化された検出器(例えば、光検出器)を含みうる。一部の例では、集積型センサーは、検出器と、表面とを、単一のユニットとして含む。
本開示の別の態様は、試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、(a)少なくとも1つの集積型センサーを有するハイブリダイゼーションアレイを、温度変化下に置くステップと、(b)少なくとも1つの集積型センサーにより、ハイブリダイゼーションアレイからのシグナルを、複数の温度点において測定するステップと、(c)標的核酸分子の解離特徴を、温度変化の間に、複数の温度点において評価することにより、標的核酸分子の存在について、少なくとも約90%の感度でアッセイするステップとを含む方法を提供する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、感度は、少なくとも約95%である。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイは、複数の集積型センサーを有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、少なくとも1つの集積型センサーは、光学センサーである。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイが、第1の集積型センサーと、第2の集積型センサーとを含む場合、標的核酸分子は、第1の標的核酸分子と、第2の標的核酸分子とを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、第1の集積型センサーが、第1の標的核酸分子と関連するシグナルを測定する場合、第2の集積型センサーは、第2の標的核酸分子と関連するシグナルを測定する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイは、対照センサーをさらに含み、対照センサーは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、方法は、(i)対照センサーにより、複数の温度点において、対照シグナルを測定するステップと、(ii)複数の温度点において、標的核酸分子の解離特徴を対照シグナルに照らして評価するステップとをさらに含む。
本開示の別の態様は、試料中の標的核酸分子の存在についてアッセイするためのシステムであって、試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、試料チャンバーが、標的核酸分子を有する試料を保持するように構成され、集積型センサーが、(i)標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、少なくとも1つのシグナルが標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップと;チップへとカップリングさせたコンピュータプロセッサーであって、(i)試料を試料チャンバー内にある間に、表面を温度変化下に置き;(ii)表面を温度変化下に置いている間に、少なくとも1つのシグナルを測定し;(iii)その温度変化での少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるようにプログラムしたコンピュータプロセッサーとを含むシステムを提供する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、集積型センサーは、チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、試料チャンバーと隣接する対照センサーをさらに含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、対照センサーは、標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、対照センサーは、少なくとも1つの対照シグナルを検出する。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、コンピュータプロセッサーを、(iv)対照プローブを温度変化下に置いている間に、少なくとも1つの対照シグナルを測定し、(v)シグナル対温度データを、少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するように、さらにプログラムする。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、チップは、さらなる集積型センサーを含み、試料は、さらなる標的核酸分子を含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、さらなる集積型センサーは、さらなる標的核酸分子の存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する。
本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイは、少なくとも約100個の集積型センサー、少なくとも約500個の集積型センサー、少なくとも約1,000個の集積型センサー、少なくとも約2,000個の集積型センサー、少なくとも約5,000個の集積型センサー、または少なくとも約10,000個の集積型センサーを含む。本明細書で提供される態様についての一部の実施形態では、アレイの、個々の集積型センサーは、個別にアドレス可能である。
本開示の例示的な実施形態だけを示し、記載する、以下の詳細な記載から、当業者には、本開示のさらなる態様および利点も、たやすく明らかとなり得る。認識される通り、本開示は、他の異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの詳細は、全て、本開示から逸脱しない限り、多様かつ明らかな点において、改変が可能である。したがって、図面および記載は、例示的な性格のものとして考えるべきであり、制限的なものとして考えるべきではない。
(参照による組込み)
(参照による組込み)
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的、かつ、個別に、参照により組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において、詳細に呈示される。本発明の特色および利点についての、より良好な理解は、本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載と、添付の図面(本明細書ではまた、「図(FIG)」および「図(FIGs)」とも称する)とを参照することにより得られ得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、
(a)試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、(i)前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)前記試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、前記少なくとも1つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップを提供するステップと;
(b)前記試料を、前記プローブが前記標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供するステップと;
(c)前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置くステップと;
(d)前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つのシグナルを、リアルタイムで測定するステップと;
(e)前記温度変化での前記少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップと
を含む方法。
(項目2)
前記プローブが、オリゴヌクレオチドである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試料を、前記オリゴヌクレオチドが前記標的核酸分子とハイブリダイズすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供する、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記標的核酸分子の配列が、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記少なくとも1つのシグナルが、エネルギーアクセプターと、エネルギードナーとの対の間の相互作用を示す光シグナルである、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記エネルギーアクセプターが、前記エネルギードナーの光学活性をクエンチングする、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記エネルギーアクセプターを、前記標的核酸分子の、1または複数のヌクレオチドとカップリングさせる、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記エネルギードナーを前記プローブとカップリングさせる、項目6に記載の方法。
(項目10)
前記少なくとも1つのシグナルが、光学活性分子種の活性を示す光シグナルである、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記光学活性分子種が、インターカレーターまたはフルオロフォアである、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記検出することが、前記少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記検出することが、前記少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた減少を測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記集積型センサーが、光検出器をさらに含み、(d)において、前記少なくとも1つのシグナルを、前記光検出器で測定する、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記試料が、前記標的核酸分子を含む、複数の標的核酸分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記集積型センサーが、複数の集積型センサーのアレイの一部であり、前記複数の集積型センサーの各々が、前記複数の標的核酸分子のうちの少なくとも1つを検出する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と選択的にカップリングする、さらなるプローブを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在または非存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記エネルギーアクセプターが、クエンチャーである、項目6に記載の方法。
(項目21)
前記エネルギードナーが、フルオロフォアである、項目6に記載の方法。
(項目22)
光検出器が、相補型金属酸化物半導体(CMOS)デバイスを含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記プローブが、前記表面へとリンカーを介して固定化されている、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記リンカーが、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される分子種を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記少なくとも1つのシグナルを、前記標的核酸分子を含む前記試料を前記チップと流体接触させている間に検出する、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記シグナル対温度データが、融解曲線の一部である、項目1に記載の方法。
(項目27)
(a)の前に、(i)前記標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、前記鋳型核酸分子と相補的な少なくとも1つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、(ii)前記反応混合物を、前記試料中の前記標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記少なくとも1つのプライマーが、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)に対して選択的な配列を有する、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記核酸増幅が、非対称的核酸増幅である、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記集積型センサーから前記少なくとも1つのシグナルを電気的に受け取り、前記標的核酸分子の前記存在または非存在を、前記少なくとも1つのシグナルから決定するコンピュータプロセッサーへと、前記チップを電気的にカップリングさせてある、項目1に記載の方法。
(項目31)
(c)において、前記表面を、約1℃/分~約20℃/分の平均速度で、前記温度変化下に置く、項目1に記載の方法。
(項目32)
前記標的核酸分子を、少なくとも約90%の感度で検出する、項目1に記載の方法。
(項目33)
前記シグナル対温度データを使用して、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)を決定するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記チップが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目1に記載の方法。
(項目35)
(i)前記対照プローブと関連する少なくとも1つの対照シグナルを測定するステップと、(ii)前記シグナル対温度データを、前記少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するステップとをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目35に記載の方法。
(項目37)
(a)において、前記集積型センサーが、前記表面の下方の発光層と、前記発光層の下方の光検出器とをさらに含み、(d)において、光検出器が、前記試料からの前記少なくとも1つのシグナルを、前記発光層を通る透過の際に測定する、項目1に記載の方法。
(項目38)
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、(a)少なくとも1つの集積型センサーを有するハイブリダイゼーションアレイを、温度変化下に置くステップと、(b)前記少なくとも1つの集積型センサーにより、前記ハイブリダイゼーションアレイからのシグナルを、複数の温度点において測定するステップと、(c)前記標的核酸分子の解離特徴を、前記温度変化の間に、前記複数の温度点において評価することにより、前記標的核酸分子の前記存在について、少なくとも約90%の感度でアッセイするステップとを含む方法。
(項目39)
前記感度が、少なくとも約95%である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記ハイブリダイゼーションアレイが、複数の集積型センサーを有する、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記少なくとも1つの集積型センサーが、光学センサーである、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記少なくとも1つの集積型センサーが、第1の集積型センサーと、第2の集積型センサーとを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含む、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記第1の集積型センサーが、前記標的核酸分子と関連するシグナルを測定し、前記第2の集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と関連するシグナルを測定する、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記ハイブリダイゼーションアレイが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目38に記載の方法。
(項目45)
(i)前記対照センサーにより、前記複数の温度点において、対照シグナルを測定するステップと、(ii)前記複数の温度点において、前記標的核酸分子の前記解離特徴を前記対照シグナルに照らして評価するステップとをさらに含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
試料中の標的核酸分子の存在についてアッセイするためのシステムであって、
試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、(i)前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)前記試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、前記少なくとも1つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップと;
前記チップへとカップリングさせたコンピュータプロセッサーであって、(i)前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置き;(ii)前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つのシグナルを測定し;(iii)前記温度変化での前記少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるようにプログラムしたコンピュータプロセッサーとを含むシステム。
(項目47)
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目46に記載のシステム。
(項目48)
前記チップが、前記試料チャンバーと隣接する対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを含み、前記対照センサーが、前記試料からの少なくとも1つの対照シグナルを検出する、項目46に記載のシステム。
(項目49)
前記コンピュータプロセッサーを、(iv)前記対照プローブを前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つの対照シグナルを測定し、(v)前記シグナル対温度データを、前記少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するように、さらにプログラムした、項目48に記載のシステム。
(項目50)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、さらなる標的核酸分子を含む、項目46に記載のシステム。
(項目51)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する、項目50に記載のシステム。
(項目52)
前記アレイが、少なくとも約100個の集積型センサーを含む、項目47に記載のシステム。
(項目53)
前記アレイの、個々の集積型センサーが、個別にアドレス可能である、項目47に記載のシステム。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、
(a)試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、(i)前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)前記試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、前記少なくとも1つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップを提供するステップと;
(b)前記試料を、前記プローブが前記標的核酸分子と選択的にカップリングすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供するステップと;
(c)前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置くステップと;
(d)前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つのシグナルを、リアルタイムで測定するステップと;
(e)前記温度変化での前記少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるステップと
を含む方法。
(項目2)
前記プローブが、オリゴヌクレオチドである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試料を、前記オリゴヌクレオチドが前記標的核酸分子とハイブリダイズすることを可能とする条件下で前記試料チャンバー内に提供する、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記標的核酸分子の配列が、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ヘアピンループ構造を形成する、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記少なくとも1つのシグナルが、エネルギーアクセプターと、エネルギードナーとの対の間の相互作用を示す光シグナルである、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記エネルギーアクセプターが、前記エネルギードナーの光学活性をクエンチングする、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記エネルギーアクセプターを、前記標的核酸分子の、1または複数のヌクレオチドとカップリングさせる、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記エネルギードナーを前記プローブとカップリングさせる、項目6に記載の方法。
(項目10)
前記少なくとも1つのシグナルが、光学活性分子種の活性を示す光シグナルである、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記光学活性分子種が、インターカレーターまたはフルオロフォアである、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記検出することが、前記少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた増大を測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記検出することが、前記少なくとも1つのシグナルの、バックグラウンドと比べた減少を測定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記集積型センサーが、光検出器をさらに含み、(d)において、前記少なくとも1つのシグナルを、前記光検出器で測定する、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記試料が、前記標的核酸分子を含む、複数の標的核酸分子を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記集積型センサーが、複数の集積型センサーのアレイの一部であり、前記複数の集積型センサーの各々が、前記複数の標的核酸分子のうちの少なくとも1つを検出する、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と選択的にカップリングする、さらなるプローブを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在または非存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記エネルギーアクセプターが、クエンチャーである、項目6に記載の方法。
(項目21)
前記エネルギードナーが、フルオロフォアである、項目6に記載の方法。
(項目22)
光検出器が、相補型金属酸化物半導体(CMOS)デバイスを含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記プローブが、前記表面へとリンカーを介して固定化されている、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記リンカーが、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される分子種を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記少なくとも1つのシグナルを、前記標的核酸分子を含む前記試料を前記チップと流体接触させている間に検出する、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記シグナル対温度データが、融解曲線の一部である、項目1に記載の方法。
(項目27)
(a)の前に、(i)前記標的核酸分子の前駆体としての鋳型核酸分子を有する生物学的試料と、前記鋳型核酸分子と相補的な少なくとも1つのプライマーと、ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップと、(ii)前記反応混合物を、前記試料中の前記標的核酸分子を生成する条件下で、核酸増幅反応に供するステップとをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記少なくとも1つのプライマーが、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)に対して選択的な配列を有する、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記核酸増幅が、非対称的核酸増幅である、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記集積型センサーから前記少なくとも1つのシグナルを電気的に受け取り、前記標的核酸分子の前記存在または非存在を、前記少なくとも1つのシグナルから決定するコンピュータプロセッサーへと、前記チップを電気的にカップリングさせてある、項目1に記載の方法。
(項目31)
(c)において、前記表面を、約1℃/分~約20℃/分の平均速度で、前記温度変化下に置く、項目1に記載の方法。
(項目32)
前記標的核酸分子を、少なくとも約90%の感度で検出する、項目1に記載の方法。
(項目33)
前記シグナル対温度データを使用して、前記標的核酸分子の配列内の一塩基多型(SNP)を決定するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目34)
前記チップが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目1に記載の方法。
(項目35)
(i)前記対照プローブと関連する少なくとも1つの対照シグナルを測定するステップと、(ii)前記シグナル対温度データを、前記少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するステップとをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含み、前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子を検出する、項目35に記載の方法。
(項目37)
(a)において、前記集積型センサーが、前記表面の下方の発光層と、前記発光層の下方の光検出器とをさらに含み、(d)において、光検出器が、前記試料からの前記少なくとも1つのシグナルを、前記発光層を通る透過の際に測定する、項目1に記載の方法。
(項目38)
試料中の標的核酸分子の存在をアッセイするための方法であって、(a)少なくとも1つの集積型センサーを有するハイブリダイゼーションアレイを、温度変化下に置くステップと、(b)前記少なくとも1つの集積型センサーにより、前記ハイブリダイゼーションアレイからのシグナルを、複数の温度点において測定するステップと、(c)前記標的核酸分子の解離特徴を、前記温度変化の間に、前記複数の温度点において評価することにより、前記標的核酸分子の前記存在について、少なくとも約90%の感度でアッセイするステップとを含む方法。
(項目39)
前記感度が、少なくとも約95%である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記ハイブリダイゼーションアレイが、複数の集積型センサーを有する、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記少なくとも1つの集積型センサーが、光学センサーである、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記少なくとも1つの集積型センサーが、第1の集積型センサーと、第2の集積型センサーとを含み、前記試料が、前記標的核酸分子と、さらなる標的核酸分子とを含む、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記第1の集積型センサーが、前記標的核酸分子と関連するシグナルを測定し、前記第2の集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子と関連するシグナルを測定する、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記ハイブリダイゼーションアレイが、対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを有する、項目38に記載の方法。
(項目45)
(i)前記対照センサーにより、前記複数の温度点において、対照シグナルを測定するステップと、(ii)前記複数の温度点において、前記標的核酸分子の前記解離特徴を前記対照シグナルに照らして評価するステップとをさらに含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
試料中の標的核酸分子の存在についてアッセイするためのシステムであって、
試料チャンバーと隣接して、集積型センサーを含むチップであって、前記試料チャンバーが、前記標的核酸分子を有する前記試料を保持するように構成され、前記集積型センサーが、(i)前記標的核酸分子と選択的にカップリングするプローブを含む表面を有し、(ii)前記試料からの少なくとも1つのシグナルを検出し、前記少なくとも1つのシグナルが前記標的核酸分子の存在または非存在を示す、チップと;
前記チップへとカップリングさせたコンピュータプロセッサーであって、(i)前記試料を前記試料チャンバー内にある間に、前記表面を温度変化下に置き;(ii)前記表面を前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つのシグナルを測定し;(iii)前記温度変化での前記少なくとも1つのシグナルについての測定値を使用して、シグナル対温度データを発生させるようにプログラムしたコンピュータプロセッサーとを含むシステム。
(項目47)
前記集積型センサーが、前記チップ内の複数の集積型センサーのアレイ内にある、項目46に記載のシステム。
(項目48)
前記チップが、前記試料チャンバーと隣接する対照センサーをさらに含み、前記対照センサーが、前記標的核酸分子と選択的にカップリングしない対照プローブを含み、前記対照センサーが、前記試料からの少なくとも1つの対照シグナルを検出する、項目46に記載のシステム。
(項目49)
前記コンピュータプロセッサーを、(iv)前記対照プローブを前記温度変化下に置いている間に、前記少なくとも1つの対照シグナルを測定し、(v)前記シグナル対温度データを、前記少なくとも1つの対照シグナルの測定値に照らして標準化するように、さらにプログラムした、項目48に記載のシステム。
(項目50)
前記チップが、さらなる集積型センサーを含み、前記試料が、さらなる標的核酸分子を含む、項目46に記載のシステム。
(項目51)
前記さらなる集積型センサーが、前記さらなる標的核酸分子の存在を示す少なくとも1つのさらなるシグナルを検出する、項目50に記載のシステム。
(項目52)
前記アレイが、少なくとも約100個の集積型センサーを含む、項目47に記載のシステム。
(項目53)
前記アレイの、個々の集積型センサーが、個別にアドレス可能である、項目47に記載のシステム。
(詳細な説明)
本明細書では、本発明の多様な実施形態を示し、これらについて記載しているが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提供されていることが明らかである。本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到しうるで。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する、多様な代替物も、利用しうることを理解すべきである。
本明細書では、本発明の多様な実施形態を示し、これらについて記載しているが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提供されていることが明らかである。本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到しうるで。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する、多様な代替物も、利用しうることを理解すべきである。
本明細書で使用される「プローブ」という用語は一般に、特定の標的核酸配列に結合しうる、分子種または他のマーカーを指す。プローブは、任意の種類の分子または粒子でありうる。プローブは、分子を含む場合があり、基質または他の固体表面に、直接結合させることもでき、リンカー分子を介して結合させることもできる。
本明細書で使用される「検出器」という用語は一般に、シグナルを検出しうる、光学構成要素および/または電子構成要素を一般に含むデバイスを指す。
本明細書で使用される「突然変異」という用語は一般に、点突然変異、一塩基多型(SNP)、挿入、欠失、置換、転位、転座、コピー数変異などの、遺伝子突然変異もしくは配列バリエーション、または別の遺伝子突然変異、変更、もしくは配列バリエーションを指す。
本明細書で使用される「約」または「ほぼ」という用語は一般に、指定される量の±15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%以内を指す。
本明細書で使用される「標識」という用語は、標的分子へと付着させて、標的分子に内在しない固有の特徴をもたらすことにより、標的分子を識別可能かつ追跡可能としうる、特定の分子構造を指す。
本明細書で使用される「ヘアピン」という用語は一般に、「ループ」と呼ばれる一本鎖領域、および「ステム」と呼ばれる二本鎖領域の両方を呈する核酸(例えば、デオキシリボ核酸)ストランドを指す。「ヘアピンループ構造」という用語は、共有結合により連結される、相補的なポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される、分子的ステムおよびループ構造を指す。ステムは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み、ループは、2つの相補的なポリヌクレオチドを共有結合によって連結する領域である。
本明細書で使用される「感度」という用語は一般に、アッセイ(例えば、方法、試験)の性能についての統計学的尺度であって、正確に識別された標的の数を、試料中に存在する標的の総数で除することにより計算される統計学的尺度を指す。言い換えると、本開示における感度とは、試料中のこれらの標的核酸分子全てを正確に識別するアッセイの能力を指す。
本開示は、核酸ハイブリダイゼーション反応のマルチプレックス検出であって、リアルタイムで、温度の関数としての検出を可能とする、方法、デバイス、およびシステムを提供する。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、以下を含むがこれらに限定されない構成要素を含みうる:
1.解析される複数の遊動核酸標的が存在する水性環境を含みうる試料チャンバー;
2.固体表面上の独立に(または個別に)アドレス可能な位置において、複数の核酸プローブを含みうるプローブアレイ。プローブアレイは、試料チャンバーと相互接続することができる。各アドレス可能な位置(本明細書では、「ピクセル」と称する)は、特異的な標的と特異的にハイブリダイズしうる、複数の同一の核酸配列(本明細書で「プローブ」と称する)を含みうる;
3.試料チャンバーの温度を測定し、間の所定の値または特異的な値へと調整しうる温度制御装置;ならびに
4.ピクセル毎に発生するシグナルを、並列的に測定しうる検出器。ハイブリダイゼーションイベントが、温度の関数として進行するので、シグナルは、分子標識の存在およびそれらの近傍における活性と関連しうる。シグナルは、離散的(例えば、個別に解像可能な)シグナルでありうる。
1.解析される複数の遊動核酸標的が存在する水性環境を含みうる試料チャンバー;
2.固体表面上の独立に(または個別に)アドレス可能な位置において、複数の核酸プローブを含みうるプローブアレイ。プローブアレイは、試料チャンバーと相互接続することができる。各アドレス可能な位置(本明細書では、「ピクセル」と称する)は、特異的な標的と特異的にハイブリダイズしうる、複数の同一の核酸配列(本明細書で「プローブ」と称する)を含みうる;
3.試料チャンバーの温度を測定し、間の所定の値または特異的な値へと調整しうる温度制御装置;ならびに
4.ピクセル毎に発生するシグナルを、並列的に測定しうる検出器。ハイブリダイゼーションイベントが、温度の関数として進行するので、シグナルは、分子標識の存在およびそれらの近傍における活性と関連しうる。シグナルは、離散的(例えば、個別に解像可能な)シグナルでありうる。
プローブアレイは、各々が1または複数のプローブを有する、独立にアドレス可能な位置を含みうる。アレイの所与の独立にアドレス可能な位置におけるプローブは、アレイの他の独立にアドレス可能な位置におけるプローブと異なりうる。場合によって、アレイの位置の群のプローブは同じである。位置の群のプローブは、アレイの他の全ての位置のプローブと異なりうる。
本開示の方法、デバイス、およびシステムは、併せて組み立てられた、上記の構成要素の改変形を利用して、核酸ハイブリダイゼーション反応を並列して測定することが可能なシステムを創出することができる。図1は、マルチプレックス解析システムの例を示す。核酸は、試料チャンバー(または反応チャンバー)内にあり、ここで、それらは拡散およびドリフト過程により移動して、アドレス可能なアレイの個々のピクセルにおいてプローブと相互作用し、熱力学的に好適な場合は、これらとハイブリダイズしうる。温度制御装置は、ハイブリダイゼーションイベントのための、異種の条件および/または時間と共に変化する条件を創出するように、反応チャンバーの温度を、あらかじめ規定された多様な値に設定しうる。この間、検出器は、ピクセル毎の、温度を変動させるときの、ハイブリダイゼーションインシデントの数量(または大きさ)も、リアルタイムで測定しうる。収集されたデータを、その後使用して、プローブ核酸と標的核酸との相互作用の熱力学的特徴について評価する。
(反応チャンバー)
(反応チャンバー)
反応チャンバーは、密閉型のレザバーを含みうる。反応チャンバーは、約10ナノリットル(nL)~10ミリリットル(mL)の容量を有しうる。場合によって、反応チャンバー容量は、約1マイクロリットル(μL)~100μLである。反応チャンバー容量は、少なくとも約10nL、100nL、1μL、10μL、100μL、1mL、または10mLでありうる。
反応チャンバーは、水溶液を含有しうる。反応チャンバー内の水溶液は、弱酸とそのコンジュゲート塩基との混合物、またはこの逆を含む水溶液など、緩衝化生理食塩水ベースの溶液を含みうる。溶液は、本明細書で「標的」と称する、複数の標的核酸配列を含みうる。この文脈で使用される「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、その存在または量を知ることが所望される、ヌクレオチドの所与の配列を伴う核酸分子を指す。ヌクレオチド配列は、リボ核酸(RNA)もしくはDNA、またはRNAもしくはDNAに由来する配列を含みうる。ヌクレオチド配列の例は、ゲノムDNAおよびメッセンジャーRNAを含む、天然または合成のRNAまたはDNAに対応する配列である。配列の長さは、核酸増幅産物またはアンプリコンへと増幅されうる任意の長さ、例えば、最大で約20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000または10,000ヌクレオチドを超える長さでありうる。
場合によって、標的は、本明細書で「標識」と称するレポーター分子を含みうる。標識は、核酸配列へと付着させると、これらの核酸分子に固有ではない、顕著に異なる特徴をもたらす分子構造を含みうる。例は、固有の光学特徴を創出する標識である。
一部の例では、光学標識を使用する。光学標識は、二重分子レポーターの、エネルギードナーまたはエネルギーアクセプターの役割における、単一シグナル発生実体または単一シグナル発生部分として使用することができる。
アクセプターおよびドナーはいずれも、フルオロフォア分子でありうる。フルオロフォアが、ドナーであるのか、アクセプターであるのかは、その励起スペクトルおよび発光スペクトル、ならびにそれが対をなすフルオロフォアに基づきうる。
エネルギードナー/エネルギーアクセプターフルオロフォア対の例は、シアン蛍光タンパク質(CFP)および黄色蛍光タンパク質(YFP);Cy3およびCy5;フルオレセインおよびテトラメチルローダミン;IAEDANSおよびフルオレセイン;EDANSおよびダブシル;フルオレセインおよびQSY7またはQSY9色素;Alexa Fluor 350およびAlexa Fluor 488;Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 546、555、568、594、または647;Alexa Fluor 546およびAlexa Fluor 568、594、または647;Alexa Fluor 555およびAlexa Fluor 594または647;Alexa Fluor 568およびAlexa Fluor 647;ならびにAlexa Fluor 594およびAlexa Fluor 85を含むがこれらに限定されない。
クエンチャー分子は、本開示の方法と共に、二重レポーター構造のアクセプターとして使用することができる。クエンチャーの例は、限定なしに述べると、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BHQ-10などのBlack Hole Quencher Dye(Biosearch Technologies);QSY7、QSY9、QSY21、QSY35などのQSY Dye蛍光クエンチャー(Molecular Probes/Invitrogen製)、ならびにDabcylおよびDabsyl;Cy5QおよびCy7QおよびDark Cyanine色素(GE Healthcare)など、他のクエンチャーを含む。上記のクエンチャーと共に使用しうるフルオロフォアドナー分子の例は、限定なしに述べると、Cy3B、Cy3、またはCy5などのフルオロフォア(fluors);DYQ-660およびDYQ-661などのDY-Quencher(Dyomics);ならびにATTO 540Q、580Q、612QなどのATTO蛍光クエンチャー(ATTO-TEC GmbH)を含む。クエンチャーは、アクセプターでありうる。
光学標識はまた、本明細書でインターカレーターと称する、核酸インターカレーター色素でもありうる。例は、臭化エチジウム、YOYO-1、SYBR Green、およびEvaGreenを含むがこれらに限定されない。エネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の近接場相互作用、インターカレーターとエネルギードナーとの間の近接場相互作用、またはインターカレーターとエネルギーアクセプターとの間の近接場相互作用は、固有のシグナルまたはシグナル振幅の変化の発生を結果としてもたらしうる。例えば、このような相互作用は、クエンチング(すなわち、非発光性のエネルギー減衰を結果としてもたらす、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動)またはフェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)(すなわち、発光性のエネルギー減衰を結果としてもたらす、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動)を結果としてもたらしうる。
標識の他の例は、電気化学的標識、静電標識、比色標識、および質量タグを含む。このような標識は、本開示のデバイス、方法、およびシステムと共に使用することができる。
標識は、標的分子へと、直接的な付着によりカップリングさせることもでき、1または複数のリンカー(例えば、リンカー分子)を介する付着によりカップリングさせることもできる。場合によって、標識は、標的分子へと、静電相互作用によりカップリングするが、これは、標的分子との共有結合の形成を伴わない場合がある。
標的分子(標的)の標識化を、様々な方法を使用して実施しうる。一部の例では、標識プライマーを使用して、核酸標的をin vitroにおいて増幅(例えば、PCRにより)する間に、標識を、化学的に付着させる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、非対称的PCR、マルチプレックスPCR、ネステッドPCR、ホットスタートPCR、タッチダウンPCR、RT-PCR、およびメチル化特異的PCRを含むがこれらに限定されない、多数の異なる分子複製手法または分子増幅手法を含みうる。増幅は、ループ媒介型等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、およびニッキング酵素増幅反応(NEAR)を含むがこれらに限定されない化学反応を伴う等温増幅でありうる。増幅の間に、標識プライマーは伸長されて、アンプリコンとなり、アンプリコン、すなわち、標識されている標的をもたらす。このような標識を付着および/またはコンジュゲートさせる方法は、限定なしに述べると、ライゲーション、ビオチン-ストレプトアビジンコンジュゲーション、ヒドラゾン結合、アミン反応性標識のアミノアリルdUTPとの反応、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)を含む。他の例では、標識を、増幅工程の間にアンプリコンを作出するために使用される修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)へと付着させる。このような方法では、1種または複数種のdNTPの一部が、それらに付着する標識を有するか、または伸長させた核酸鎖へとdNTPを組み込んだ後に、標識が付着しうる化学結合部位を含むように化学修飾される。場合によって、標識は、一本鎖DNA(ssDNA)または二本鎖DNA(dsDNA)結合分子である。
場合によって、増幅は、PCRにより実施しうる。PCRは、ポリヌクレオチドの融解およびポリヌクレオチドの酵素的複製のための、反応の加熱および冷却の反復の1または複数のサイクルを含むサーマルサイクリングに依拠しうる。標的ポリヌクレオチドの標的領域と相補的な配列を、重合酵素(例えば、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ)と共に含むプライマー(短い核酸断片)により、標的ポリヌクレオチドの選択的増幅および反復的増幅をもたらすことができる。プライマーは、突然変異を伴う配列、または対象に、所与の疾患(例えば、がん)の素因を与えることが識別されている配列など、目的の配列と相補的な配列を有しうる。PCRが進行するにつれ、作出されたポリヌクレオチドはそれ自体、複製のための鋳型として使用されることから、標的ポリヌクレオチド鋳型を指数関数的に増幅する連鎖反応が開始される。
代替法として、増幅は、二本鎖ポリヌクレオチド鋳型内の一方のポリヌクレオチド鎖を優先的に増幅しうる、非対称的PCRでありうる。この手法は、2つの相補的な鎖のうちの一方だけの増幅が要求される手法でありうる。非対称的PCRでは、PCRを、上記で記載した通りであるが、増幅のためにターゲティングされる鎖に対する配列相補性を有する、過剰量のプライマーにより実行する。律速プライマーが消尽した後の、反応の後期における、緩徐な(算術的)増幅のため、PCRの追加のサイクルが要求されうる。反応中期では、律速プライマー濃度が低下するので、場合によって、非対称的増幅では、反応効率を維持するのに、過剰量のプライマーより融解温度(Tm)の高い律速プライマーを使用することもできる。
増幅は、等温増幅でありうる。等温増幅方法の例は、SDAともまた称する、鎖置換増幅であり、これは、標的配列の対向鎖に対するプライマー配列対のアニーリングサイクル、二重鎖ヘミホスホロチオエートプライマー伸長産物を産生する、dNTPの存在下におけるプライマー伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位の、エンドヌクレアーゼ媒介型ニッキング、ならびに既存の鎖を置換し、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキング、および鎖置換のための鎖を産生する、ニックの3’末端からのポリメラーゼ媒介型プライマー伸長を使用して、産物の幾何学的増幅を結果としてもたらすことが可能である。例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第5,270,184号および米国特許第5,455,166号を参照されたい。好熱性SDA(tSDA)は、本質的に同じ方法において、より高い温度で、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用しうる。例えば、参照により全体において本明細書に組み込まれる、欧州特許第0684315号を参照されたい。
他の増幅方法の例は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、ローリングサークル増幅(RCA)(例えば、Lizardi、「Rolling Circle Replication Reporter Systems」、米国特許第5,854,033号);ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)(例えば、Kongら、「Helicase Dependent Amplification Nucleic Acids」、米国特許出願公開第US2004-0058378A1号);およびループ媒介型等温増幅(LAMP)(例えば、Notomiら、「Process for Synthesizing Nucleic Acid」、米国特許第6,410,278号)を含む。場合によって、等温増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーへと組み込まれうるプロモーター配列などのプロモーター配列からの、RNAポリメラーゼによる転写を利用する。転写ベースの増幅方法は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、NASBAともまた称する核酸配列ベースの増幅(例えば、米国特許第5,130,238号)であって、プローブ分子自体を増幅するRNAレプリカーゼであり、一般にQβレプリカーゼと称するRNAレプリカーゼの使用に依拠する方法である増幅(例えば、Lizardi, P.ら(1988年)、Bio Technol.、6巻、1197~1202頁);自己持続配列複製(例えば、Guatelli, J.ら(1990年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻、1874~1878頁;Landgren(1993年)、Trends in Genetics、9巻、199~202頁;およびLee, H. H.ら、「Nucleic Acid Amplification Technologies」(1997年));およびさらなる転写鋳型を作出するための方法(例えば、米国特許第5,480,784号および米国特許第5,399,491号)を含みうる。等温核酸増幅の他の方法は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、非カノニカルヌクレオチド(例えば、ウラシルまたはRNAヌクレオチド)を含むプライマーの使用であって、非カノニカルヌクレオチドにおいて核酸を切断して、さらなるプライマーのために結合部位を露出する酵素(例えば、DNAグリコシラーゼまたはRNアーゼH)と組み合わせた使用(例えば、米国特許第6,251,639号、米国特許第6,946,251号、および米国特許第7,824,890号)を含む。等温増幅工程は、線形的増幅工程の場合もあり、指数関数的の場合もある。
(プローブアレイ)
(プローブアレイ)
プローブは、スポットアレイを創出するように沈着させた生物学的材料を含みうる。プローブは、他の技術に従い、アレイを形成するように合成、沈着、または配置された材料を含みうる。したがって、これらの技術のうちのいずれかに従い形成されたマイクロアレイを、本明細書の下記では、簡便さのために、総称的に、「プローブアレイ」と称することができる。「プローブ」という用語は、アレイフォーマットで固定化させたプローブに限定されない。そうではなく、本明細書で記載される機能および方法はまた、他の並列的アッセイデバイスに対しても利用することもできる。例えば、これらの機能および方法を、ビーズ、光ファイバー、または他の基質もしくは媒体の上または中に固定化させたプローブを識別しうる、プローブセットの識別子に対して適用することができる。多様なプローブアレイの構築については、本明細書でより詳細に記載する。
場合によって、プローブは、ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド(RNA)またはデオキシリボヌクレオチド(DNA)である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含みうる。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、三本鎖DNA、二本鎖DNA、および一本鎖DNAのほか、三本鎖RNA、二本鎖RNA、および一本鎖RNAも含みうる。この用語はまた、ポリヌクレオチドのメチル化および/またはキャッピングなどによる修飾のほか、非修飾形態も含みうる。さらに、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含む)、プリン塩基またはピリミジン塩基のNグリコシドまたはCグリコシドである、他の任意の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマーを含みうる。核酸は、ホスホジエステル結合(すなわち、天然の核酸)を含みうる。核酸は、例えば、ホスホルアミド(例えば、Beaucageら、Tetrahedron、49巻(10号):1925頁(1993年);および米国特
許第5,644,048号を参照されたい)、ホスホロジチオエート(例えば、Briuら、J. Am. Chem. Soc.、111巻:2321頁(1989年)を参照されたい)、O-メチルホスホロアミダイト(methylphosphoroamidite)連結(例えば、Eckstein、「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、Oxford University Pressを参照されたい)、ならびにペプチド核酸(PNA)骨格およびPNA連結(例えば、Carlssonら、Nature、380巻:207頁(1996年)を参照されたい)を含む代替的骨格を有しうる核酸類似体を含みうる。核酸は、正に帯電した骨格(例えば、Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92巻:6097頁(1995年)を参照されたい);非イオン性骨格(例えば、米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号、および同第4,469,863号;Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English、30巻:423頁(1991年);Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、110巻:4470頁(1988年);Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide、13巻:1597頁(1994年);ASC Symposium Series、580巻、2および3章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編;Mesmaekerら、Bioorganic
& Medicinal Chem. Lett.、4巻:395頁(1994年);Jeffsら、J. Biomolecular NMR、34巻:17頁(1994年);Tetrahedron、Lett.、37巻:743頁(1996年)を参照されたい)、および非リボース骨格(例えば、米国特許第5,235,033号、および同第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series、580巻、6および7章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編を参照されたい)を伴う類似体核酸を含む、他の核酸類似体を含みうる。核酸は、1または複数の炭素環糖(例えば、Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.(1995年)、169~176頁を参照されたい)を含みうる。リボース-リン酸骨格のこれらの修飾は、標識の付加、または生理学的環境における、このような分子の安定性の増大および半減期の延長を容易にしうる。
許第5,644,048号を参照されたい)、ホスホロジチオエート(例えば、Briuら、J. Am. Chem. Soc.、111巻:2321頁(1989年)を参照されたい)、O-メチルホスホロアミダイト(methylphosphoroamidite)連結(例えば、Eckstein、「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、Oxford University Pressを参照されたい)、ならびにペプチド核酸(PNA)骨格およびPNA連結(例えば、Carlssonら、Nature、380巻:207頁(1996年)を参照されたい)を含む代替的骨格を有しうる核酸類似体を含みうる。核酸は、正に帯電した骨格(例えば、Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92巻:6097頁(1995年)を参照されたい);非イオン性骨格(例えば、米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号、および同第4,469,863号;Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English、30巻:423頁(1991年);Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、110巻:4470頁(1988年);Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide、13巻:1597頁(1994年);ASC Symposium Series、580巻、2および3章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編;Mesmaekerら、Bioorganic
& Medicinal Chem. Lett.、4巻:395頁(1994年);Jeffsら、J. Biomolecular NMR、34巻:17頁(1994年);Tetrahedron、Lett.、37巻:743頁(1996年)を参照されたい)、および非リボース骨格(例えば、米国特許第5,235,033号、および同第5,034,506号、ならびにASC Symposium Series、580巻、6および7章、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook編を参照されたい)を伴う類似体核酸を含む、他の核酸類似体を含みうる。核酸は、1または複数の炭素環糖(例えば、Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.(1995年)、169~176頁を参照されたい)を含みうる。リボース-リン酸骨格のこれらの修飾は、標識の付加、または生理学的環境における、このような分子の安定性の増大および半減期の延長を容易にしうる。
場合によって、オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用する。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖核酸を含みうる。オリゴヌクレオチドは、2~約1000ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、2~約500ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、約10~約100ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、約20~約50ヌクレオチドの長さでありうる。本開示の方法、デバイス、およびシステムでは、プローブを、固体基質へと付着させることができる。プローブは、基質へと直接結合させることもでき、リンカーを介して結合させることもできる。リンカーは、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含みうる。
固体基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのうちのいずれかの組合せでありうる。基質は、例えば、1または複数の粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、スフェア、容器、キャピラリー、パッド、薄片、薄膜、プレート、スライド、または半導体集積チップとして存在しうる。固体基質は、平面の場合もあり、代替的な表面構成を取る場合もある。例えば、固体基質は、合成または沈着が生じる、隆起領域または沈降領域を含有しうる。一部の例では、固体基質は、適切な光吸収特徴をもたらすように選び出すことができる。例えば、基質は、重合化ラングミュア-ブロジェット薄膜、機能化ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾ケイ素、半導体集積回路(IC)チップの上部誘電層、または(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、もしくはこれらの組合せなど、様々なゲルもしくはポリマーのうちのいずれか1つでありうる。
複数のプローブは、固体基質上の1または複数のアドレス可能領域であって、本明細書で「ピクセル」と称するアドレス可能領域内に配置することができる。場合によって、固体基質は、少なくとも約2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ~10、10~50、50~100、100~500、500~1,000、1,000~5,000、5,000~10,000、10,000~50,000、50,000~100,000、100,000~500,000、500,000~1,000,000、または1,000,000を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。場合によって、固体基質は、最大で約2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ~10、10~50、50~100、100~500、500~1,000、1,000~5,000、5,000~10,000、10,000~50,000、50,000~100,000、100,000~500,000、500,000~1,000,000、または1,000,000を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。場合によって、固体基質は、約2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ~10、10~50、50~100、100~500、500~1,000、1,000~5,000、5,000~10,000、10,000~50,000、50,000~100,000、100,000~500,000、500,000~1,000,000、または1,000,000を超えるピクセルであって、プローブを伴うピクセルを含む。
場合によって、プローブを含有しないピクセルを有することも有用である。このようなピクセルは、例えば、スポットへの結合を使用して、非特異的結合を推定し、これについて補正することにより、測定値の品質を増大させるための対照スポットとして作用しうる。
一部の例では、別のピクセルと同一なプローブ配列を有するが、他のピクセルと、物理的に隣接または近接しえない冗長ピクセルを有することも有用である。このようなプローブアレイにより収集されたデータは、製作の非理想性および測定誤差を受けにくい場合がある。
場合によって、標識を、標的へと組み込まれた標識に加えて、ピクセル内のプローブへも付着させる。このようなシステムでは、標的の捕捉は、2つの標識が、ピクセル内で、互いと緊密に近接する状態を結果としてもたらしうる。既に論じた通り、特異的な標識の間の相互作用は、固有の検出可能なシグナルを創出しうる。例えば、標的上の標識およびプローブが、それぞれ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)現象に参与しうる、蛍光ドナー部分および蛍光アクセプター部分である場合、FRETシグナルの増強またはFRETシグナルのクエンチングを検出することができる。
(温度制御装置)
(温度制御装置)
温度制御装置は、反応チャンバー内の溶液のために、特定の温度を確立することができ、かつ/または加熱および/もしくは冷却を要求する温度プロファイルを創出することができる。温度制御装置は、温度センサー(サーミスタまたは熱電対など)を使用して、温度を測定し、測定された温度に基づき、熱デバイス(ペルティエデバイスまたは抵抗ヒーターなど)を使用して、反応チャンバーへと熱を付加するか、またはこれから熱を除去するフィードバック制御システムを含みうる。温度制御装置は、熱を除去するための熱シンクを含みうる。温度制御装置は、アレイへと組み込むことができる。アレイの温度は、個々のピクセルごとに制御することもでき、アレイ領域またはアレイ部分領域ごとに制御することもでき、アレイワイドのスケールで制御することもできる。
温度制御装置は、基質、反応チャンバー、またはアレイピクセルの温度を変化させることができる。温度変化の速度は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20℃/分でありうる。温度変化の速度は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20℃/分でありうる。温度変化の速度は、最大で約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20℃/分でありうる。温度制御装置は、温度を、線形速度(例えば、5℃/秒)で変化させることができる。代替的に、温度制御装置は、温度を、非線形速度で変化させることができる。温度制御装置は、温度を上昇させることもでき、低下させることもできる。
(検出器)
(検出器)
本開示は、シグナルを検出するのに使用しうる検出器を提供する。このようなシグナルは、融解曲線解析など、核酸ハイブリダイゼーションの熱力学的解析のために使用することができる。このような検出器は、光シグナルを測定するための光検出器、電気化学シグナルを測定するための電気化学検出器、または電荷を測定するための静電検出器でありうる。
検出器により検出されるシグナルは、全てのピクセルにおける標識の、増幅工程の間で、リアルタイムの活性レベルを含む、標識の存在、非存在、および/または数量についての情報を伝えるシグナルを含みうる。シグナルは、蛍光または化学発光などの光シグナルでありうる。シグナルは、電気化学シグナル、静電シグナル、抵抗、キャパシタンス、またはインダクタンスなどの電気シグナルでありうる。シグナルは、バックグラウンドシグナルに照らした標準化を含め、処理することができる。シグナルは、リアルタイムで検出することができる。
光検出器の例は、電荷結合素子(CCD)アレイ(冷却CCDを含む)、相補型金属酸化物半導体(CMOS)イメージング装置、n型金属酸化物半導体(NMOS)、能動ピクセルセンサー(APS)、または光電子増倍管(PMT)を含むがこれらに限定されない。検出器はまた、選択的波長の測定を可能とする光学フィルターなどの波長選択的構成要素も含みうる。他の検出器の例は、電極を含む。
検出器は、1分間当たり、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、90、120、150、180、210、240、270、300、400、500、1000、10,000回の速度で、試料をサンプリングしうる(例えば、測定値を収集しうる)。
検出器は、光源を含みうる。光源を使用して、例えば、蛍光標識および/または比色標識を励起することができる。光源は、白熱灯、ハロゲンランプ、蛍光灯、ガス放電灯、アーク灯、または発光ダイオード(LED)などの少なくとも1つのランプを含みうる。光源は、レーザーを含みうる。光源は、特異的な波長、またはある範囲の波長、例えばUVをもたらしうる。光源は、出力スペクトル、出力波長(複数可)を制御するためのフィルターを含みうる。光源は、個別に使用することもでき、組み合わせて使用することもできる、同じまたは異なる種類の、複数の光源を含みうる。
検出器は、フィルター、レンズ、コリメータ、鏡、反射器、ビームスプリッター、および拡散器を含むがこれらに限定されない、多様な光学的エレメントを含みうる。検出器は、波長フィルター(例えば、色フィルター、UVフィルター、IRフィルター)、二色性フィルター、および偏光フィルターを含むがこれらに限定されない、1または複数のフィルターを含みうる。フィルターは、個別に使用することもでき、組み合わせて使用することもできる、同じまたは異なる種類の、複数のフィルターを含みうる。検出器は、樽型歪曲収差もしくは魚眼型歪曲収差、陣笠型歪曲収差、糸巻型歪曲収差、単色収差(例えば、ピストン収差、ティルト収差、デフォーカス収差、球面収差、コマ収差、非点収差、像面湾曲収差、画像歪曲収差)、または色収差(例えば、軸上色収差、縦色収差、横色収差、倍率色収差)などの画像歪曲収差または画像収差を除去するためのエレメント(例えば、シグナル演算処理ユニット)を含みうる。このようなエレメントは、画像歪曲収差を、部分的または完全に補正するための命令を実装するようにプログラムされたコンピュータシステムを含みうる。例えば、ブラウン歪曲収差モデルまたはブラウン-コンラディーモデルを使用して、半径方向の歪曲収差および接線方向の歪曲収差について補正することができる。
一部の例では、検出器は、個々のピクセルから発光した光子を測定しうる。これらの光子は、その帯域内の光学標識の存在および/または活性と相関しうる。
場合によって、検出器は、CMOS集積回路(IC)加工工程(Plummer J.D.ら、「Silicon Technologies: Fundamentals, Practice, and Modeling」、Prentice Hall Electronics and VLSI Series、2000年)を使用して構築されうる、集積型バイオセンサーアレイを含む。本明細書で「CMOSバイオチップ」と称する、このようなシステムでは、プローブアレイを、CMOSバイオチップの上部に置くことができる。このようなシステムの例は、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2010/0122904号、同第2013/0345065号、同第2014/0001341号、同第2014/0318958号、同第2014/0011710号、同第2012/0168306号、同第2013/0225441号、同第2012/0077692号、同第2007/0099198号、同第2008/0081769号、同第2008/0176757号、および同第2008/0039339号、ならびに米国特許第8,637,436号、同第8,048,626号、および同第8,518,329号において見出すことができる。
(検出方法)
(検出方法)
温度の関数としての核酸(例えば、DNA)ハイブリダイゼーション反応の、リアルタイムにおける並行的検出であって、ハイブリダイゼーションの熱力学について査定する並行的検出は、特定のピクセルにおいて、エネルギードナー(例えば、フルオロフォア)で標識された固定化プローブと、反応チャンバー内に存在する、エネルギーアクセプター(例えば、クエンチャー)で標識された標的との間の相互作用により実施することができる。検出はまた、同様の状況下における、インターカレーターと、相互作用するプローブおよび標的との間の相互作用により実施することもできる。いずれの場合も、反応チャンバーの温度を変動させながら、光検出器により、シグナルを、リアルタイムで、持続的に測定して、個々のピクセルにおいて、ハイブリダイズした標的の量を捕捉し、ハイブリダイゼーション反応が、そのピクセル内のその所与の温度において好適であるのかどうかについて査定することが典型的である。
本開示の方法は、蛍光標識および/またはクエンチャー標識などの光学標識を使用して利用することができる。しかし、ハイブリダイゼーション反応を表すシグナルが、アドレス可能なアレイのピクセルだけで発生し、これらに限定される一方で、全ての標的を含む反応容量が創出するバックグラウンドの光シグナルは最小限である。この固有の特徴は、検出可能なシグナル対干渉(またはシグナル対ノイズ)を改善するだけでなく、また、ピクセルレベルの測定値が、互いに対して独立なままであるので、マルチプレックス化能も可能とする。これは、反応チャンバーおよび水性試料が、それらの全ての間で共有されているという事実に抗している。
(ドナープローブを伴う、標的の末端標識化)
(ドナープローブを伴う、標的の末端標識化)
プローブおよび標的はいずれも、末端標識することができる。例えば、図2は、一方の末端(例えば、5’末端)において、エネルギーアクセプター標識で標識した核酸標的を示す。このような標的は、例えば、プライマーをエネルギーアクセプター標識で標識するPCR反応の、1または複数のアンプリコンでありうる。図2に示される方法Aでは、結合の前に、プローブ上のドナーフルオロフォアは、波長がこのドナー分子の励起(吸収)スペクトルに合致する励起光源の存在下で、シグナルを能動的に発している。プローブが標的とハイブリダイズしたら、アクセプターは、ドナーと近接し、エネルギー移動を介して、ドナー標識化プローブから発生するシグナルを低減する。図2に示される方法Bでは、標的の、プローブとのハイブリダイゼーションは、ドナーとアクセプターとを特異的に緊密な近接下に置く、標的内で形成されるヘアピンループを伴う。これは、ドナーとアクセプターとの間の効率的な相互作用を確保するように施され、プローブ配列の3’末端を、アクセプター標識が存在する、標的の5’末端に部分的に合致させることにより達成することができる。これらの場合のいずれにおいても、標的がプローブとハイブリダイズする場合に結果として生じる、ドナーシグナルの低減を検出し、プローブと標的とのハイブリダイゼーション反応と相関させることができる。
一部の実施形態では、アクセプターは、クエンチャー分子などの非発光標識でありうる。
(標識されない標的)
(標識されない標的)
標的を標識しない、代替的な設定は、考え合わせることができる。例えば、図3は、波長がインターカレーターの励起(吸収)スペクトルに特異的な励起光源が存在する場合における、核酸標的およびプローブの、インターカレーターとの相互作用を示す。図3に示される方法Aでは、反応チャンバー内に存在し、自由に移動するインターカレーター分子は、標的に結合していないプローブの存在下では不活性であるが;標的がプローブとハイブリダイズすると、ハイブリダイズした複合体内のインターカレーターが活性化し、インターカレーターの発光スペクトルに合致するシグナルを発し、そのピクセルにおけるハイブリダイゼーションを指し示す。図3に示される方法Bでは、プローブを、インターカレーターからのエネルギーを受容することが可能なエネルギーアクセプターで標識するが;標的がプローブにハイブリダイズすると、活性化したインターカレーターからのエネルギーが、エネルギーアクセプターにより取り込まれる。アクセプターがフルオロフォアである場合、発せられるシグナルは、ハイブリダイゼーションを指し示す(Howell, WM、Jobs, M、およびBrooks, AJ、「iFRET: an improved fluorescence system for DNA-melting analysis」、Genome Res.、2002年9月、12巻(9号):1401~7頁)。いずれの場合も、標的の、プローブへの付着により誘発される、シグナル(インターカレーターまたはアクセプターフルオロフォアのそれぞれからの)の増大を検出し、特異的な温度における、プローブと標的とのハイブリダイゼーションと相関させる。
(標識された標的)
核酸標的は、複数のアクセプターにより標識することができる。このような標的は、例えば、アクセプターで修飾されたdNTPを使用するPCR反応の、1または複数のアンプリコンでありうる。図4は、ドナーで標識したプローブと、複数のエネルギーアクセプター標識を伴う標的とを示す。標的とのハイブリダイゼーションの前に、プローブ標識は、波長がドナーの励起(吸収)スペクトルに合致する励起光源の存在下で、シグナルを発している。ハイブリダイゼーションが生じたら、標的上のエネルギーアクセプターは、エネルギードナーからのエネルギーを受容し、ドナーを効率的に不活化させ、そのシグナルをクエンチングすることができる。プローブが標的に結合する場合に結果として生じる、エネルギードナーシグナルの低減を検出し、その温度における、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションと相関させることができる。
一部の実施形態では、アクセプターは、クエンチャー分子などの非発光標識でありうる。
(並列的融解曲線解析(MCA)についての結果の作成)
(並列的融解曲線解析(MCA)についての結果の作成)
本明細書で記載される検出方法を使用して、並列的DNA融解曲線解析(MCA)を行うことができる。本開示でさらに記載される通り、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間の結合またはハイブリダイゼーションは、個々のピクセル内のシグナルの変化を結果としてもたらしうる。このようなシグナルの変化は、使用される検出方法に応じて、シグナルの増大の場合もあり、シグナルの減少の場合もある。標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションの量または速度を変更するように、条件を制御し、変化させることができる。例えば、温度を上昇させて、標的とプローブとの間の結合を減少させる(すなわち、「融解させる」)ことができる。
MCAを使用して、標的の、異なるプローブとのハイブリダイゼーションの差違を検出することができる。例えば、核酸標的は、標的と、所与のプローブとの間の結合に影響を及ぼしうる、配列の差違(例えば、SNP)を含みうる。これらの差違は、異なるピクセルにおける融解曲線の差違、または単一ピクセルの異なる実験における融解曲線の差違として観察することができる。別の例では、2つの核酸標的は、挿入もしくは欠失(indel)または配列リピートの数の変動などにより、長さが異なりうる。この長さの差違は、例えば、標識と、標的核酸内の標的配列位置に結合するプローブとの間の長さを変動させることにより、MCAを介して検出することができる。
図5は、ドナープローブを伴う、標的の末端標識化の使用など、本開示の方法を使用して、どのようにしてMCAを並列的に実施するのかについての例を示す。この例では、3つのピクセルからのシグナルを示す。これらのピクセルのうちの2つは、反応チャンバー内の標的(標的1および標的2)に合致する、異種の合致配列を伴うプローブを含むのに対し、第3のピクセルは、試料中のいずれの配列にも特異的にハイブリダイズしないようにデザインされたプローブを含む。これらのピクセルから発生するシグナルは、それぞれ、シグナル1、シグナル2、および対照である。図5の測定シグナルに示される通り、温度を上昇させて、標的を、プローブから「融解」させるにつれ、生シグナルは、シグナル1およびシグナル2について、プロファイルは異なるが、非単調増加を示す。しかし、対照シグナルは、例えば、温度の関数としての、ドナーフルオロフォアの量子効率(例えば、明度)の低減に起因して、減少しうる。標準化シグナルのグラフにおいて明白である通り、対照を使用して、使用されるフルオロフォアの温度依存性を較正し分けたら、標的1および標的2いずれのハイブリダイゼーションによるMCAシグナルも、はるかにより明らかとなり、標的1が、標的2と比較して、より安定的な構造をかつて有したことを明瞭に示す。
(集積型検出器)
(集積型検出器)
本開示の方法は、集積型検出器を使用して実装することができる。従来の検出装置ではなく、集積型バイオセンサーを使用することの利点の例は、サイズの劇的な低減および費用の軽減である。さらに、集積型バイオセンサーアレイは、比類のない信頼性、大量生産および確実性をもたらしうる半導体集積回路(IC)マイクロ製作工程、例えば、相補型金属酸化物半導体(CMOS)を使用して製造することができる。本開示の集積型バイオセンサーアレイと共に使用されうるセンサーの例は、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2010/0122904号、同第2013/0345065号、同第2014/0001341号、同第2014/0318958号、同第2014/0011710号、同第2012/0168306号、同第2013/0225441号、同第2012/0077692号、同第2007/0099198号、同第2008/0081769号、同第2008/0176757号、および同第2008/0039339号、ならびに米国特許第8,637,436号、同第8,048,626号、および同第8,518,329号において提供されている。
このような配置では、各センサーエレメントは、アドレス可能でありえ、それ自体のプローブを含みうる。このようなセンサーエレメントは、バイオセンサーでありうる。アレイは、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、または100000個の集積型バイオセンサーなど、多数の個々のバイオセンサーを含みうる。アレイ内の個々のバイオセンサーの密度は、1mm2当たり、少なくとも約100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000のバイオセンサーピクセルでありうる。
アレイ内のバイオセンサーは、光ダイオードなどの光センサーを含みうる。各バイオセンサーにはまた、ヒーターおよび温度センサー(例えば、熱電対、サーミスタ)などの温度制御エレメントも付随しうる。バイオセンサーアレイは、光センサーと、反応チャンバーまたはアレイピクセルとの間の発光フィルターなどの光学フィルターであって、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2010/0122904号、同第2013/0345065号、同第2014/0001341号、同第2014/0318958号、同第2014/0011710号、同第2012/0168306号、同第2013/0225441号、および同第2008/0081769号、ならびに米国特許第8,637,436号および同第8,518,329号において記載されている光学フィルターを含みうる。
例えば、図6は、32×32アレイの光学的バイオセンサー(図6、右上)を含む、光学CMOS集積型バイオセンサー検出器(図6、左上)を示す。各光学バイオセンサーは、100μm×100μmの面積を占有する。光学バイオセンサーアレイは、3.2mm×3.2mmの総面積を有する。各バイオセンサーは、集積型CMOS光ダイオードセンサーを含み、発光フィルターは、CMOS集積型センサーと、関連するアレイピクセルを有する反応チャンバーとの間に配置される(図6、左下)。アレイの熱は、ヒーターにより制御することができる(図6、右下)。
図7は、光学CMOSバイオチップのための回路アーキテクチャーの例を示す。1024のピクセルの各々は、発光フィルターにより隔てられて、光ダイオード回路が付随する反応チャンバーを含む。各ピクセルは、ヒーター、ディジタル式制御装置、ならびに較正およびデータ回収のためのシグナル入力/出力装置をさらに含む。バイオチップは、ディジタル式制御装置をさらに含む。ディジタル式制御装置は、データを受け取るために、バイオチップピクセルの行/列選択が可能な、走査モジュールと相互接続されている。ディジタル式制御装置はまた、オンチップ温度を制御することが可能な熱制御装置とも相互接続されている。電源管理システムは、ピクセルおよび熱制御装置へと電力を供給する。 光学CMOSバイオチップの特色については、例えば、それらの各々が参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2010/0122904号、同第2013/0345065号、同第2014/0001341号、同第2014/0318958号、同第2014/0011710号、同第2012/0168306号、ならびに米国特許第8,518,329号において記載されている。
(コンピュータ制御システム)
(コンピュータ制御システム)
本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図11は、融解曲線解析などの化学的解析を行うようにプログラムされるか、または他の形で構成されたコンピュータシステム1101を示す。コンピュータシステム1101により、例えば、温度、試薬取扱い、および検出など、本開示の化学的解析(例えば、融解曲線解析)の多様な側面を調節することができる。コンピュータシステム1101は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔に配置されたコンピュータシステムでありうる。電子デバイスは、モバイル型の電子デバイスでありうる。
コンピュータシステム1101は、シングルコアプロセッサーの場合もあり、マルチコアプロセッサーの場合もあり、並列的演算処理のための、複数のプロセッサーの場合もある、中央演算処理装置(CPU;本明細書ではまた、「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」とも称する)1105を含む。コンピュータシステム1101はまた、メモリまたはメモリロケーション1110(例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ)、電子記憶装置1115(例えば、ハードディスク)、1または複数の他のシステム、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶アダプターおよび/または電子ディスプレイアダプターなどの周辺デバイス1125と通信するための通信インターフェース1120(例えば、ネットワークアダプター)も含む。メモリ1110、記憶装置1115、インターフェース1120、および周辺デバイス1125は、マザーボードなど、通信バス(実線)を介して、CPU1105へと接続される。記憶装置1115は、データを保存するためのデータ記憶装置(またはデータリポジトリー)でありうる。コンピュータシステム1101は、通信インターフェース1120を一助として、コンピュータネットワーク(「ネットワーク」)1130へと作動的にカップリングさせることができる。ネットワーク1130は、インターネット、インターネットおよび/もしくはエクストラネット、またはインターネットと接続された、イントラネットおよび/もしくはエクストラネットでありうる。ネットワーク1130は、場合によって、遠隔通信および/またはデータネットワークである。ネットワーク1130は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能としうる、1または複数のコンピュータサーバーを含みうる。ネットワーク1130は、場合によって、コンピュータシステム1101を一助として、コンピュータシステム1101へとカップリングさせたデバイスが、クライアントとしてもサーバーとしても挙動することを可能としうる、ピアツーピアネットワークを実装しうる。
CPU1105は、プログラムまたはソフトウェアで具体化されうる、マシン読取り命令列を実行しうる。命令は、メモリ1110などのメモリロケーションに保存することができる。命令は、CPU1105へと下すことができ、その後、本開示の方法を実装するように、プログラムまたは他の形で、CPU1105を設定することができる。CPU1105によりなされる操作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含みうる。
CPU1105は、集積回路など、回路の部分でありうる。システム1101の、1または複数の他の構成要素を、回路に組み入れることができる。場合によって、回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)である。
記憶装置1115は、ドライバー、ライブラリー、およびセーブされたプログラムなどのファイルを保存しうる。記憶装置1115は、例えば、ユーザー優先事項およびユーザープログラムなどのユーザーデータを保存しうる。コンピュータシステム1101は、場合によって、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム1101と接続された遠隔サーバー上に配置されたデータ記憶装置など、1または複数のさらなるデータ記憶装置であって、コンピュータシステム1101に対して外部のデータ記憶装置を含みうる。
コンピュータシステム1101は、ネットワーク1130を介して、1または複数の遠隔コンピュータシステムと通信しうる。例えば、コンピュータシステム1101は、ユーザー(例えば、実験室技官)の遠隔コンピュータシステムと通信しうる。遠隔コンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ(例えば、携帯用PC)、スレートPCもしくはタブレットPC(例えば、Apple(登録商標)iPad(登録商標)、Samsung(登録商標)Galaxy Tab)、電話、スマートフォン(例えば、Apple(登録商標)iPhone(登録商標)、Android対応型デバイス、Blackberry(登録商標))、またはパーソナルディジタルアシスタントを含む。ユーザーは、ネットワーク1130を介してコンピュータシステム1101にアクセスしうる。
本明細書で記載される方法は、例えば、メモリ1110上または電子記憶装置1115上など、コンピュータシステム1101の電子メモリロケーション上に保存された、マシン(例えば、コンピュータプロセッサー)実行コードにより実装することができる。マシン実行コードまたはマシン読取りコードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用の間に、コードは、プロセッサー1105により実行することができる。場合によって、コードは、記憶装置1115から検索し、プロセッサー1105によるたやすいアクセスのために、メモリ1110上に保存することができる。一部の状況では、電子記憶装置1115は、除外することができ、マシン実行命令は、メモリ1110上に保存する。
コードは、そのコードを実行するように適合させたプロセッサーを有するマシンとの使用のために、あらかじめコンパイルかつ構成することもでき、ランタイムの間にコンパイルすることもできる。コードは、そのコードを、あらかじめコンパイルされた様式またはコンパイルされた通りの様式で実行することを可能とするのに選択されうるプログラム言語で供給することができる。
コンピュータシステム1101など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。技術の多様な態様は、ある種のマシン読取りメディア上に保有されているか、またはこの中に具体化されている、マシン(またはプロセッサー)実行コードおよび/または関連するデータの形態であることが典型的な「製品」または「製造品」として考えることができる。マシン実行コードは、メモリ(例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ)またはハードディスクなどの電子記憶装置上に保存することができる。「保存」型メディアは、任意の時点において、ソフトウェアのプログラミングのために一時的でないメモリを提供しうる、多様な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなど、コンピュータ、プロセッサーなどの有形メモリまたはその関連モジュールのいずれかまたは全てを含みうる。ソフトウェアの全部または一部は、時折、インターネットまたは他の多様な遠隔通信ネットワークを介して通信することができる。このような通信は、例えば、ソフトウェアの、1つのコンピュータまたはプロセッサーから、別のコンピュータまたはプロセッサーへのローディング、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータから、アプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのローディングを可能としうる。したがって、ソフトウェアエレメントを保有しうる、別種のメディアは、有線ネットワークおよび光ケーブルネットワークを介する、ローカルデバイス間の物理インターフェース、および多様なエアリンクによる物理インターフェースにわたり使用されるメディアなどの、光学メディア、電気メディア、および電磁波メディアを含む。有線リンクまたは無線リンク、光学リンクなど、このような波を保有する物理エレメントもまた、ソフトウェアを保有するメディアとして考えることができる。本明細書で使用される、コンピュータ「読取りメディア」またはマシン「読取りメディア」などの用語は、一時的でない有形「記憶」メディアに限るのでない限り、プロセッサーに、実行のための命令を与えることに参与する任意のメディアを指す。
よって、コンピュータ実行コードなどのマシン読取りメディアは、有形記憶メディア、搬送波メディア、または物理的伝送メディアを含むがこれらに限定されない多くの形態を取りうる。非揮発性記憶メディアは、例えば、図面に示される、データベースなどを実装するのに使用しうるコンピュータなど、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのうちのいずれかなど、光学ディスクまたは磁気ディスクを含む。揮発性記憶メディアは、このようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形伝送メディアは、同軸ケーブル;コンピュータシステム内のバスを含む配線を含む銅線および光ファイバーを含む。搬送波伝送メディアは、ラジオ周波数(RF)データ通信時および赤外(IR)データ通信時に発生するシグナルまたは波など、電気シグナルもしくは電磁シグナル、または音響波もしくは光波の形態を取りうる。したがって、コンピュータ読取りメディアの一般的形態は、例えば、フロッピーディスク(登録商標)、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気メディア、CD-ROM、DVDもしくはDVD-ROM、他の任意の光学的メディア、パンチカード用紙テープ、穿孔パターンを伴う、他の任意の物理的記憶メディア、RAM、ROM、PROMおよびEPROM、FLASH-EPROM、他の任意のメモリチップもしくはメモリカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、このような搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび/もしくはデータを読み取りうる、他の任意のメディアを含む。コンピュータ読取りメディアのこれらの形態の多くは、1または複数の命令の、1または複数の列を、実行のために、プロセッサーへと伝えることに関与しうる。
コンピュータシステム1101に、例えば、温度値、温度制御、検出器データ、および流体操作を提供するためのユーザーインターフェース(UI)1140を含む電子ディスプレイ1135を組み入れることもでき、コンピュータシステム1101を、これらと接続することもできる。UIの例は、限定なしに述べると、グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)およびウェブベースのユーザーインターフェースを含む。
本開示の方法およびシステムは、1または複数のアルゴリズムを介して実装することができる。アルゴリズムは、実行時に、中央演算処理装置1105により、ソフトウェアを介して実装することができる。アルゴリズムは、例えば、アレイピクセルの温度を制御し、データを回収および処理することができる。
(実施例1)
集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
プローブのアレイを、第1標的および第2の標的と接触させ、そしてプローブと標的との間で結合が生じる(例えば、図8を参照されたい)。図8B(上グラフ)に示される通り、オンチップヒーターを使用して、t=0分後におけるT=40℃、t=10分後におけるT=48℃、t=15分後におけるT=57℃、t=20分後におけるT=67℃、t=25分後におけるT=76℃、およびt=30分後におけるT=85℃の時点を含む時間経過にわたり、温度を上昇させる(図8A)。集積型バイオセンサーアレイにより、励起シグナルを遮断し、アレイからの発光シグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第1の標的(シグナル(1))および第2の標的(シグナル(2))について、融解曲線を作成する(図8B、下グラフ)。使用されるプローブおよび標的配列を、図8Cに示す。
集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
プローブのアレイを、第1標的および第2の標的と接触させ、そしてプローブと標的との間で結合が生じる(例えば、図8を参照されたい)。図8B(上グラフ)に示される通り、オンチップヒーターを使用して、t=0分後におけるT=40℃、t=10分後におけるT=48℃、t=15分後におけるT=57℃、t=20分後におけるT=67℃、t=25分後におけるT=76℃、およびt=30分後におけるT=85℃の時点を含む時間経過にわたり、温度を上昇させる(図8A)。集積型バイオセンサーアレイにより、励起シグナルを遮断し、アレイからの発光シグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第1の標的(シグナル(1))および第2の標的(シグナル(2))について、融解曲線を作成する(図8B、下グラフ)。使用されるプローブおよび標的配列を、図8Cに示す。
この実験におけるドナー標識は、HEXであり、アクセプター(クエンチャー)は、Iowa Blackである。
(実施例2)
インターカレーターベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
(実施例2)
インターカレーターベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
プローブのアレイを、第1の標的および第2の標的と接触させ、そしてSYBR Greenインターカレーターの存在下で、プローブと標的との間で結合が生じる(例えば、図9、右側を参照されたい)。プローブと標的との間の結合の非存在下では、インターカレーターは、活性でなく、プローブと標的とが結合すると、インターカレーターが活性化し、シグナルを発する。オンチップヒーターを使用して、時間経過にわたり、温度を上昇させる。集積型バイオセンサーアレイにより、励起シグナルを遮断し、アレイからの発光シグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第1の標的(シグナル(1))および第2の標的(シグナル(2))について、融解曲線を作成する(図9、グラフ)。使用されたプローブおよび標的配列を、図9、下方に示す。
(実施例3)
フルオロフォア-クエンチャーベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
(実施例3)
フルオロフォア-クエンチャーベースの集積型バイオセンサーアレイ上の融解曲線解析(MCA)
第1、第2、第3、および第4のプローブのアレイを、第1、第2、第3、第4の標的と接触させ、そしてプローブと標的との間で結合が生じる(例えば、図10A、右側を参照されたい)。プローブを、エネルギードナーで末端標識し、標的を、エネルギーアクセプターで末端標識する。時間経過にわたり、温度を上昇させる。バイオチップセンサーにより、アレイからのシグナルを収集し、温度と比較して標準化されたシグナルにより、第1の標的(シグナル1)、第2の標的(シグナル2)、第3の標的(シグナル3)、および第4の標的(シグナル4)について、融解曲線を作成する(図10A、グラフ)。使用されたプローブおよび標的配列を、図10Bに示す。
この実験におけるドナー標識は、HEXであり、アクセプター(クエンチャー)は、Iowa Blackである。
本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、これらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提供されていることが明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される具体例により限定されることを意図するものではない。本発明について、前述の明細書に言及しながら記載してきたが、本明細書の実施形態についての記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。今や、本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到しうる。さらに、様々な条件および変数に依存する、本発明の全ての態様は、本明細書で明示される具体的な描示、構成、または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する、多様な代替物も、本発明の実施において利用しうることを理解すべきである。したがって、本発明はまた、任意のこのような代替物、改変、変更、または同等物も対象とすることが想定される。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を規定し、これにより、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造が対象とされることが意図される。
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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