CN101495655A - 用于分子诊断的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及其中使用电传感器和可编程加热元件进行解链曲线分析的生物检测装置。该装置任选地还包含用于光学地检测该装置中核酸的构件。

Description

用于分子诊断的装置
发明领域
本发明涉及用于确定双链核酸的解链温度用作特定DNA序列的传感器的装置和方法。
发明背景
当两种或多种可能的核苷酸在基因组中特定作图位置处存在时，SNP(单核苷酸多态性)出现(个体基因组中碱基对之间的错配)。它们在人类基因组中以估计每1200-1500个碱基对(bp)中1个的频率出现。特定SNP已经相关于疾病(即胃溃疡或消化性溃疡、癌症等)并且甚至已经显示来预测药物应答。通常，患者的已知SNP图谱与来自对照组的相同SNP图谱比较。若来自患者的谱形变化，则这些差异可能指明一种遗传性因素，其可能潜在地与疾病或该患者对特定治疗的易感性关联。
产生有用图谱所需的SNP的估计数目为100,000(每30kb DNA出现一个SNP)至一百万(每3kb或更少kb出现一个SNP)。一般而言，图谱上的SNP越多越好，并且理想数目可能在600,000与1百万之间。然而，图谱上SNP的数目必须与鉴定这些SNP的成本平衡。
SNP可以通过完全互补的双链DNA(dsDNA)与包含错配的dsDNA之间解链温度的差异来检测。通常使用所谓解链曲线分析(MCA)确定解链温度。通过缓慢地加热双链DNA片段进行MCA，其中所述双链DNA片段中的一条一般用荧光染料标记。当加热DNA时，荧光在达到解链温度及双链变性时迅速下降[Akey等(2001)Biotechniques.30，358-362]。其中存在错配的dsDNA将在较低的温度变性。在Bennett等(2003)Biotechniques 34，1288-1294中描述了用于在96孔或384孔微量培养板上对SNP作基因型分型的荧光解链曲线分析。
纳米管传感器装置通过如此方式检测生物分子的结合，即通过所述结合经纳米结构元件进行电子转导，避免需要标记。WO2006024023披露用于DNA检测的纳米管传感器装置。该专利提出通过在结合时改变严格性(例如使用不同的pH或温度)而检测SNP。然而不清楚这些变化条件何种程度影响纳米管的电响应并且这是否提供可靠的检测。
发明简述
本发明的目的是提供用于鉴定核苷酸序列中的差异如SNP的方法和装置。
本发明披露其中使用电传感器进行解链曲线分析(MCA)的装置和方法，任选地与光学检测方法组合。
本发明的优势在于经电测量法的MCA确定可以无需用光学标记物标记样品。
本发明具体实施方案的优势在于MCA可以在同一装置内使用两种不同检测方法(电测量法和光学检测法)进行。
本发明具体实施方案的又一个优势在于所提供的装置和方法可以用来使用电学方法与光学方法组合确定给定双链(ds)核酸的准确解链温度。此参考值随后可以用在将来检测所述给定核酸中，并且可以仅使用所述电学方法提供可靠的检测。
本发明的又一个优势在于所述装置和方法可以用来确定电学方法中所得的结果与通过MCA所得的结果之间的关联性，其中所述的关联性针对核酸中出现的不同SNP。此信息可以存贮于一个库内并用作参考以便仅使用所述电学方法提供SNP的可靠测定。
本发明的第一方面涉及生物传感器装置(100)，该装置包含微室(101)，包含置于该微室内的电传感器的电检测构件(102)，其中所述传感器能够检测存在于该传感器表面上的双链核酸的电特性改变，和能够加热该微室的可编程加热元件(103)。
在一个实施方案中，电传感器包含纳米结构物如碳纳米管。在另一个实施方案中，至少一种单链核酸存在于该装置的电传感器上。
在具体实施方案中，该装置的微室包含至少一个半透明或透明部分。
在又一个实施方案中，该装置包含光学检测构件(例如荧光检测器)，其能够通过所述微室的所述至少一个半透明或透明部分检测在该微室中产生的信号。
在一个具体实施方案中，该装置包含布置的至少两个电传感器。
在又一个实施方案中，该装置还包含支撑所述电传感器的第一基片。
本发明的另一个方面涉及一种用于实行解链曲线分析的方法，所述方法包括：在微室中的电传感器表面上提供单链核酸探针，使包含单链核酸靶的样品与所述微室中的电传感器接触，从而允许所述单链核酸探针与所述单链核酸靶杂交为双链核酸，并且逐步加热所述微室和基于电传感器上的变化电信号而检测所述双链核酸的解链温度。
在该方法的一个实施方案中还包括步骤：基于变化的光学信号而检测所述双链核酸的解链温度并且比较从光学信号获得的值与从电信号获得的值。
本发明的又一个方面涉及用于使用电检测方法确定样品内的基因核酸片段中存在一种或多种核苷酸多态性的方法，该方法包括步骤：使用电检测构件确定所述基因的核苷酸多态性库的解链温度；对于这些核苷酸多态性中的每一种，同时使用光学检测构件确定所述解链温度；使得用电检测构件获得的值与用光学检测构件获得的那些值关联，从而基于电检测法获得解链温度值的库；使用电检测方法确定样品中核酸片段的解链温度并且比较用该库获得的值，从而获得存在一种或多种多态性的可靠指示。
本发明的另一个方面涉及一种用于校准本发明装置的方法，包括步骤：使用电测量方法确定双链核酸的解链温度；通过同时使用光学方法确定解链温度而一次或多次验证如此获得的解链温度；并且定义与光学方法确定的双链核酸解链温度相对应的电测量值。
本发明的又一个方面涉及一种用于测量样品核酸与核酸探针之间杂交的方法，包括步骤：给电传感器提供单链核酸探针；在样品核酸可以与所述的核酸探针杂交的条件下施加含有所述样品核酸的样品；以受控方式逐步加热在电传感器上的杂交核酸，并通过电传感器确定杂交核酸的解链温度。
在该方法的具体实施方案中，在加热杂交的核酸期间，通过光学检测法检测杂交核酸的解链温度。在该方法的具体实施方案中，样品核酸用光学标记物标记。
在该方法的一个实施方案中，加热以每秒至少1℃的速度进行。在具体实施方案中，仅通过电测量法，使用由上文提及的校准方法确定的电测量值进行检测。
本发明的又一个方面涉及本发明装置和本发明方法用于确定双链核酸中错配的用途。
本发明的又一个方面涉及纳米传感装置的反应室，其包含至少一个电传感器和支撑所述电传感器的基片，其中该基片是导热的并且其中所述微室包含至少一个(半)透明部分。
在具体实施方案中，该反应室还包含能够加热所述微室的可编程加热元件。
结合通过举例方式说明本发明原理的附图，本发明的上述及其它特征、特点和优势将因以下详细描述而变得明显。给出这种说明，其目的仅在于举例，而不限制本发明的范围。下文所引用参考图指的是附图。
附图简述
图1显示根据本发明一个实施方案的纳米传感器的示意性布局的侧视图1：基片；2：纳米结构物；3：绝缘层；4：电极(源极和漏极)；5：门电极。
图2显示根据本发明一个实施方案布置的纳米传感器的示意性布局的俯视图，所述布置的纳米传感器带有内建加热元件(6)，(3)是覆盖所述加热元件并提供隔离的任选材料；2：纳米结构物，4：电极。
图3显示根据本发明一个实施方案布置的纳米传感器的示意性布局的俯视图，所述布置的纳米传感器带有内建加热元件(6)和透明或半透明部分(7)；2：纳米结构物，3：绝缘层，4：电极。
图4显示根据本发明一个实施方案的MCA的理论性实例。A：互补双链核酸，B：具有一个错配的双链核酸，C：在A和B中的双链核酸的理论解链曲线。
图5显示根据本发明一个实施方案的生物传感器装置100的元件，其中101：微室，102：电检测构件，103：加热元件，104：光学检测构件，105：供给构件，106：源，107：控制及分析电路元件，108：输入/输出构件。
在不同的图中，相同的附图标记指的是相同或类似的元件。
实施方案详述
本发明将参考具体的实施方案并参考某些附图加以描述，但是本发明不受其限制而仅由权利要求书限制。权利要求书中的任何参考标示不应当解释为限制本发明的范围。所述附图仅是示意性的和非限制性的。在图中，出于说明目的，可以将某些部件的尺寸放大并且不按比例画出。在术语“包含”用于本说明书和权利要求书中的情况下，不排除其它元件和步骤。在指称单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“一个(a)”或“一个(an)”、“该(the)”的情况下，这包括该名词的复数，除非另有说明。
此外，在本说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等用于相似元件之间的区分并且不必然用于描述依次顺序或时间顺序。应当理解如此所用的术语在适宜的环境下是可互换的并且本文中所述的本发明实施方案能够以本文中所述或所例示的其它顺序操作。
提供以下术语或定义仅意在辅助理解本发明。这些定义不应当解释为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
术语“多态性”如本文中所用，通常指生物体或基因以两种或多种不同形式存在的能力。在本发明中，“多态性”特别指相同基因的两种或多种不同形式。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”如本文中所用，指因单个核苷酸差异产生的多态性。
术语“等位基因”通常指给定基因或核酸节段的一种或多种可选形式中的任一形式；给定基因的两种或全部等位基因与同一种性状或特征有关，但是由一个特定等位基因所编码的产物或功能在质或量方面不同于由该基因的其它等位基因所编码的产物或功能。给定基因的三种或多种等位基因构成等位基因系列。在双倍体细胞和生物体中，等位基因对的成员(即给定基因的两个等位基因)占据一对同源染色体上的相应位置(基因座)；若这些等位基因是遗传相同的，则称该细胞或生物是纯合的。若所述等位基因是遗传不同的，则称该细胞或生物关于特定基因是杂合的。野生型等位基因是编码在给定生物体的野生型株系中找到的特定表型特征的等位基因。
在“解链曲线”中，将参数(X)对温度(T)作图，其中所述的参数(X)受双链核酸转变至单链核酸影响。传统上，此参数是通过一种标记物确信的光学信号(如荧光(F))，其中所述的标记物仅在双链核酸中存在或是双链核酸的特征(如与所述双链中的一条链结合的嵌入剂和标记物，如本文中所述)。
术语“解链温度”或“Tm”指这样的温度，在该温度50％的双链核酸已经变性成单链核酸。Tm对应于解链曲线中最小信号与最大信号之间的中点并且对应于在核酸解链曲线的负一阶导数(-d(X)/dT)中的峰顶。
术语“核酸”如本文中所用，包括脱氧核糖核酸、核糖核酸(oxyribonucleic acid)、寡核苷酸、多核苷酸、核糖核酸、信使核糖核酸、转移核糖核酸和肽核酸以及其它合成性对应物。
术语“单链(ss)核酸”指如上文定义的核酸的单条链。
术语“双链(ds)核酸”如本文中所用，指上文所述的核酸的双链，包括杂合双链核酸如RNA/DNA。该术语包括杂合体，从而一条或两条链的仅一部分(至少10个核苷酸)互补并且形成双链。
术语“核酸探针”指在杂交和检测之前存在于传感器(如纳米管)表面上的核酸。通常，如此选择核酸探针以允许与据信存在于样品中的特定靶核酸杂交。
术语“样品核酸”如本文中所用，指在样品中存在的核酸。
术语“电传感器”如本文中所用，指传感器，该传感器能够检测存在于其表面上的双链核酸的电特性改变。此类电特性的实例包括电阻、阻抗、电导率。
术语“纳米结构物”如本文中所用，指这样的物体，其具有小于100nm的至少一个维度并包含至少一片具有石墨样化学键的晶体材料。
术语“纳米传感器”如本文中所用，是这样的检测装置，其中检测经作为纳米结构物或纳米结构物网络的传感器发生
术语“纳米管”如本文中所用，指直径1-2nm的纳米结构物的单个管形元件、多重管或互联管网络。
当本文中指称“电测量”时，意指对一种或多种电特性如电阻、阻抗、跨导、电容等的测量。
本发明涉及用于检测生物分子的、更具体地基于第二核酸杂交的强度而检测核酸的方法和工具。更具体地，本发明提供用于可靠地确定双链核酸解链温度(Tm)的方法和工具。
解链温度的值取决于多种因素，包括GC含量。更具体地，GC对在核酸中的比例与Tm相关。具有3个氢键的GC对相比仅具有2个氢键的AT对更稳定。因此，可以通过解链曲线分析(MCA)区分在GC/AT比率方面不同的DNA片段。解链曲线分析的概念在(上文引用的)Akey中详述。通过测量作为温度函数的参数(通常称作‘X’)实行解链曲线分析，其中所述的参数指示双链核酸减少(此双链核酸固有特性或因标记物存在所致)和/或单链核酸增加。在双链核酸的解链温度(Tm)达到时，此参数因双链核酸变性而受到影响。通过求得此参数的负一阶导数(-dX/dT)，可以容易地见到双链核酸的解链温度并进行比较，这简化了完全互补性双链核酸与具有一个或多个错配的双链核酸之间的区分。一般，在该参数是嵌入剂(见下文)的结合作用情况下，此参数是荧光并且使用了该荧光的负一阶导数(-dF/dT)(见图4)。
本发明涉及基于电传感器的检测装置，其中配备加热元件以按照可编程和可靠的方式逐步加热(和任选地冷却)存在于该电传感器上的样品。为确定双链核酸的解链温度，施加一个可控温度梯度(例如0.1℃/秒至1℃/秒)，其一般在约20-100℃的范围内，更具体在20-80℃之间。可以利用加热至多到100℃的较高温度以使核酸变性、破坏存在于样品中的蛋白质的活性或使(如核酸扩增或标记中)所用的酶变性。可以利用冷却至约4℃以使核酸复性或杂交或在分析前或之后贮存样品。
本发明装置的可控加热元件可以包括温度传感器。提供源自所述温度传感器的数据至数据分析仪以便与本文中所述电检测构件和/或光学检测构件的数据合并。任选地，提供用于检测微室内的温度的温度测量构件作为独立单元。
根据一个实施方案，该装置包含一个或多个加热元件，所述的加热元件提供受控地加热一个或多个传感器的表面和/或包含所述一个或多个传感器的微室。用于以本发明装置和方法中所用的可控及精确方式加热和冷却包含核酸样品的容器或腔室的加热元件是本领域已知的。此类加热元件包括电加热器、热电加热器和冷却器(Peltier装置)、电阻加热器、电容耦合型RF加热器、热阱(heat sink)，流体回路(fluidic circuit)加热器、热管、化学加热器和其它类型。在某些实施方案中，使用板外(off-board)加热机构进行加热。在其它实施方案中，加热机构不物理地接触于微流体装置。例如，可以使用电磁辐射(如处于微波波谱范围内或红外光谱范围内的辐射)来加热微室的内部。或者，使用与微室接触的外部加热机构，如用来诱导流体加热的(超)声波加热器。
如此放置一个或多个加热元件，从而确保适度地加热一个或多个传感器和/或在传感器和/或微室周围的区域。一般在提供必需隔离的基片中配置一个或多个加热元件。例如，通过熟知的半导体制造技术(如光刻和蚀刻)直接在基片中微机械加工出(micromachined)加热元件，例如电阻器。另外，相同技术任选地用来提供适合的隔离以使热限定于想要的传感器区域内。根据一个实施方案，加热元件被作为热阱元件发挥作用的材料沉积层包围。在具体实施方案中，加热元件是包埋于基片内并分布在纳米管下方的处于曲折线形式的电阻器并且受到适当隔离以避免电子干扰。
本发明还可以任选地在微室中包括冷却元件。作为实例，主动式冷却元件可以是Peltier元件。可以使用任何形式的微冷却装置。例如一个类型的冷却装置是微机电制冷系统。此类系统的一个实例可以是基于磁力制冷循环的制冷系统，从而微机电开关、微继电器、磁簧开关或门开关用于此种循环的吸收相与排热相间转换。此类装置在例如来自国际商业机械公司(International Business Machines Corporation)的美国专利6,588,215B1中详细描述。这种系统的另一个实例可以是基于使用压电驱动器提供跨板叠温差的热声制冷器。因而，生成了高频声波，该高频声波通过与板叠的一个或多个部分相互作用而产生温度梯度，因而导致冷却，如在例如犹他大学的美国专利6,804,967B中更详细地描述。这种系统的又一个实例可以是使用微机电阀门控制气体膨胀的一种微机电系统，如在TechnologyApplications，Inc.的美国专利6,804,967中更详细地描述。几种这些冷却装置的优势在于它们可以使用微机电技术、光刻或薄膜沉积技术而加以应用，从而可以在微室中整合它们并且它们的尺度紧凑。
本发明涉及基于电传感器的检测装置。因此，此类装置一般包括电检测构件(102)，后者能够寄存由电传感器生成的信号。根据本发明的一个实施方案，提供这样的装置，其中配置一个或多个电传感器。当需要在多重电传感器(如电传感器阵列)上独立检测的情况下，可以构思的是独立加热元件可以安置于每个电传感器附近，其中所述的独立加热元件可以以适宜的及任选地不同的速率送递热量。
根据一个实施方案，传感器是这样的电检测构件，其还包含源电极、漏电极和任选地门电极，例如在门电极存在时，电传感器连接源极和漏极以形成场效应晶体管。
根据本发明的一个实施方案，电传感器是纳米结构物，即具有至少一个小于100nm的维度的结构物。根据一个实施方案，该纳米结构物包含至少一层具有石墨样化学键的晶体材料，例如，单壁和/或多壁碳纳米管、双壁纳米管、多壁纳米管或包含此类纳米管的“洋葱状”和/或互联网络，其与多核苷酸相互作用从而充当感知元件。纳米结构物一般排列在可作为微室侧壁的基片(第一基片)上。
用于本发明中的纳米管可以是单壁碳纳米管(SWNT)，其直径是1-2nm。纳米管可以包含单个管、多个管或互联管网络。根据一个实施方案，纳米管是多壁纳米管(MWNT)。在一个实施方案中，多壁纳米管彼此在基片上平行地取向。或者，多个纳米管随机取向。纳米管在基片一个区域内的数目称作密度。在基片包含众多随机取向的纳米管时，该密度应当高到足以确保电流经纳米管网络从所定义区域的一侧通过至另一侧，如经过纳米管-对-纳米管触点。尽管纳米管大多由碳制成，然而也可以使用其它材料例如硅纳米线和氮化硼、二硫化钼、二硫化钨的无机纳米棒。根据纳米管的手性，纳米管可以具有半导性。生长纳米管网络的方法是技术人员已知的并且包括方法如化学蒸汽沉积法(CVD)加传统光刻法、溶剂悬浮沉积法、真空沉积法等(WO2004040671和Hu等(2004)Nano Lett.4，2513-2517)。在对置电极(opposing electrode)之间区域以外的区域内，可以使用合适的方法如等离子体蚀刻法从基片上除去过多纳米管。
根据又一个实施方案，电传感器包含一个或多个金属电极或金属合金电极。例如，电极可以是Ti、Pd、Au的。
对于所述传感器而言，为了将存在于该传感器表面上的核酸的电特性改变转换成可以加以检测的电信号，该传感器任选地经接触件连接于电路。接触件包括确保与传感器保持电通讯的导电元件。在传感器是纳米结构物的情况下，接触件可以直接安置在第一基片的表面上，其中所述的第一基片支撑该纳米结构物，或可选地，可以安置在纳米结构物上，例如安置在纳米管网上。可以通过使用至少两个接触件测量在纳米管网中流动的电流，其中所述的接触件放置在纳米管网的限定区域内，从而每个接触件与纳米管网保持电通讯。可以提供不与所述传感器保持电通讯的额外接触件作为门电极，从而在该电极与纳米管网之间存在一个电容。通常，将该门电极置于支撑传感器的基片下方。例如在US2004132070中提供此类纳米装置的实例。可以在所选或可变的门电压影响下测量传感器的不同电特性(包括电阻、阻抗和跨导)。也可以施加电压至一个或多个接触件以在传感器中诱导相对于门电极的电场，并且可以测量所述网络的电容。
本发明装置包含第一基片，其机械地支撑电传感器(通过悬浮作用或通过直接支撑)。
在电传感器是纳米结构物的情况下，该电传感器一般制造在基片的表面上，其中所述的基片是电绝缘材料，例如基于二氧化硅的电绝缘材料。被每种传感器覆盖的基片的表面积一般不超过约1cm2。更具体地，被每种传感器覆盖的基片的表面积是约1mm2至约0.01mm2。在特别优选的实施方案中，每种传感器覆盖约100μm2至约2,500μm2的基片表面。在具体实施方案中，将传感器安置为阵列(见下文)，其中该阵列包含在基片表面上的约3cm2或更小区域内。
或者，基片是导电性材料，例如硅或金属，前提是导电基片与电传感器之间存在电绝缘层。
合适的基片可以是二氧化硅、氮化硅、氧化铝、聚酰亚胺和聚碳酸酯的。在本文中所述的众多实例中，基片包括一个或多个层、膜或涂层，其在硅晶片或芯片上包含下列材料，如二氧化硅、SIO2、Si3N4等。根据一个实施方案，第一基片是透明材料，如SIO2或可以使其透明的材料。
如上所述，在电传感器安置于微室中的情况下，第一基片用来形成微室的一个或多个壁或作为一个或多个微室壁的涂层提供。
根据本发明的一个实施方案，所述装置的加热元件安置在第一基片的表面下或配置在第一基片表面顶部上，从而促进加热在该装置的微室中的电传感器、围绕该电传感器的区域和/或液体。
根据具体实施方案，本发明装置还包含一层沉积在电传感器的接触件上的绝缘材料。本领域已知多种合适的聚合物和树脂，包括环氧涂料。绝缘层可以是与第一基片的绝缘材料相似的材料。它可以选择性地施加在包含接触件的第一基片的某些区域上，或可以施加在整个基片上并且从传感器的运行区(如接触件之间)除去。绝缘层提供电绝缘作用，防止传感器在接触导电流体(如用于施加样品的缓冲液)时短路，或还保护该传感器不暴露于环境。该绝缘层也可以有助于控制其它材料沉积，所述的其它材料包括但不限于纳米管和DNA分子。可以使用任何数目的绝缘层。
本发明装置包括至少一个反应室或微室(101)，其包含用在电检测构件中的电传感器。一般，微室的大小是1-100μl。根据一个实施方案，一个微室包含多于一个电传感器，从而允许用不同核酸探针同时测量。根据具体实施方案，多个传感器布置于微室中。阵列可以是处在多个传感器的预定方式下的一维或二维布局。所述传感器可以布置于一个单一的反应室内。或者，传感器分布在不同反应室内。通常，一个阵列包含至少10个传感器。在具体实施方案中，该阵列包含至少约50个传感器、更特别地约100个传感器，最特别地超过103、104或105个传感器。
根据本发明的一个实施方案，微室的至少一个壁以具有上文所述特性的第一基片形成或以其涂敷。根据具体实施方案，微室由一个开口形成，其中所述的开口已经蚀刻在第一基片中。该微室任选进一步部分地用如上所述的一个或多个绝缘层涂敷。
额外或可选地，微室壁的至少一个部分包含能够在微室内、更具体在电传感器上进行光学检测的透明部分。通常，这由一种结构物确保，其中所述的结构物是材料如SiO2、塑料或PVC的。如上所述，该部分可以是第一基片的集成部分。或者，透明或半透明部分可以配置在反应室的任何壁内，前提是它允许光学地检测其中实行解链曲线分析的传感器区域。
根据一个实施方案，微室是本发明装置的集成部分。或者提供该微室作为独立的、任选地可拆卸的盒或匣用在这样的装置中，其中所述的装置包含用于在电传感器表面上检测电信号和任选地光学信号的所需连接。根据一个实施方案，该微室包含括至少一个电传感器和机械地支撑该电传感器的基片，其中至少所述基片是导热的。更具体地，该微室允许通过安置在该微室外部(例如在检测装置内)的加热装置加热该微室。根据一个实施方案，此加热装置安置在微室壁内部，或微室壁包含能够以可控方式在微室内产生热的元件。任选地，当例如置于具备用于该加热元件的适度接触件的装置内时，此加热元件由检测装置的控制构件控制。
本发明装置的微室一般包含一个或多个出口及入口，用于导入和/或移出样品、缓冲液等。
一般而言，所述装置的微室整合于微流体系统中，其中所述的微流体系统使微量流体送递及流至/流出微室，并且更具体地流至/流出电传感器。因此，本发明装置还包括供给构件(105)用于从一个或多个源(106)提供样品、缓冲液、试剂和/或添加物至反应室和/或电传感器。该构件可以包括样品重力式输送并还可以包括一排管/导管、混合器和阀门(例如可选择和可控的阀门)以提供来自不同源的流体至微室并离开该腔室达到一个或多个收集器和/或废弃区。基于毛细作用的微流体装置的横截面一般是10-100μm。构思了由泵、阀门和通道系统组成的简单二维系统和更复杂的三维系统。
微流体系统或装置可以硅、玻璃和聚合物制造(MicrosystemTechnology：A Powerful Tool for Biomolecular Studies，Kohler，J.M.等，Edsl，Birkhauser Verlag，Boston(1999))。聚合物微流体如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)在制造新系统原型中是尤其引人注意的，原因是在PDMS中制造通道系统是简单的并且可以以亚0.1微米精度针对合适模具加以模塑(McDonald等(2002)Act.Chem.Res.35，491-499)。
根据一个实施方案，该装置中的机械微泵和阀门在微制造的装置中移动流体(如在例如US5271724和US5277556中描述)。
已经描述并且技术人员已知用于在这些微流体系统或装置中输送和导向流体(如样品、分析物、缓冲液和试剂)的可选方法。此类方法包括施加外部压力以推动所述装置中的流体(US5304487)、使用声能来通过声流效应推动装置中的流体(如在例如WO9405414中描述)。又一种方法使用电场来推动流体材料穿过微流体系统的通道(例如由Harrison等(1992)Anal.Chem.64，1926-1932及在US 5126022中描述)。
有益的是将微流体系统集成至以微升至纳升体积工作的生物传感器内，原因是使用小于10μl体积造成关于蒸发、分散次数(dispensing times)、蛋白质失活和测定适应性方面的严重问题。使测定法微型化至小于1μl体积显著地增加表面/体积比。此外，亚微升体积的溶液在接触空气时在数秒至几分钟内迅速蒸发。
一般，本发明装置还包含确保控制供给构件的控制电路元件。
根据具体实施方案，本发明的装置也允许使用光学检测法的MCA。因此，根据本发明此方面的装置包括微室，其中所述微室的至少一个壁具有允许在该微室中、更具体在传感器区域内检测光学信号的透明或半透明部分(或窗口)。或者，如此构思该装置，以至一种微室匣的引入确保有可能光学地检测该微室中的信号，其中所述的微室匣至少包含具有透明或半透明部分(或窗口)的一个壁。在需要光学检测的情况下，本发明装置包含光学检测构件(104)如荧光检测器。该检测工具的性质取决于所用染料或标记物的性质。合适的光学检测构件是技术人员熟知的。
根据本发明，光学检测构件允许针对核酸的MCA确定，其中所述的MCA确定与MCA的电检测法平行地进行或作为后者的校准。此外，构思所述光学检测构件可以用于鉴定和/或定量样品中的核酸。
电检测构件和光学检测构件均可以处于控制及分析电路元件(107)控制下。可以提交代表检测作用的信号至控制及分析电路元件，后者可以适应于实施上文所述的本发明任意MCA。
控制及分析电路元件常规地包含与检测构件和供给构件的连接，以评价与靶的Tm相对应的检测信号。该系统还可以提供对所得检测结果的统计学处理，例如使每种检测系统或不同检测系统之间的两种不同测量值相关。
控制及分析电路元件也可以包括这样的构件，其用以确定样品核酸已经被传感器上的核酸探针接受并且样品核酸量足够用于测试。该控制及分析电路元件可以包含处理装置(例如微处理器)和/或用于存贮所得或已处理的评价信息的记忆元件。
另外，本发明装置还可以包含常见输入/输出(108)装置。控制及分析电路元件可以使用执行评价步骤的合适软件或专用硬件处理工具进行控制。控制及分析电路元件可以因此以任何合适方式，例如专用硬件或适当编程的计算机、微控制器或嵌入式处理器(如微处理器)、可编程门阵列(如PAL、PLA或FPGA)或其它等执行。控制及分析电路元件一般会存储分析结果并将其显示在任何合适的显示装置(如视觉显示单元、绘图机、打印机等)上，或可以可选地提供数据至一个独立装置。控制及分析电路元件也可以连接到用于传输所述结果至远程位置的局域网或广域网。
控制及分析电路元件可以至少部分地作为包含一个微室的独立匣配置，或可以任选地处于该匣的外部并可以任选地配置以控制供给构件运行。控制及分析电路元件可以通过在所述匣表面上的合适接触件(例如接线柱)而连接于该供给构件。
根据本发明，电传感器检测以存在于该传感器表面上的核酸从双链核酸转变至单链核酸时的变化特性为基础。构思使用本发明的电传感器检测不同的电特性，包括电阻、电导、电流、电压、电容、晶体管通电流(transistoron current)、晶体管断电流(transistor off current)或晶体管阈电压。它们可以在所选或可变门电压影响下受到测量。便利地，使用合适电路元件，可以使用以由电传感器(例如纳米管网)形成的通道为基础的晶体管的源极(和/或漏极)和门电极来测量所述通道相对于所述门的电容作为测量一种或多种通道跨导特性的可选或额外传感器信号。在又一个具体实施方案，门电极是接触导电液体的导电元件，其中所述的导电液体接触传感器。门电极的实例在Bradley等(2003)Phys.Rev.Lett.91，218301中描述。
在具体实施方案中，生物传感器装置包括晶体管。晶体管具有极大电导，所述的极大电导是用一定范围内门的电压测量的最大电导，并且具有极小电导，所述的极小电导是用一定范围内的门电压测量的最小电导。晶体管具有作为极大电导与极小电导之间比的通断率。
本发明提供用于使用电传感器检测核酸的电特性的方法和装置。根据一个实施方案，通过在电传感器表面上提供核酸探针确保选择性地检测核酸。核酸可以直接连接于电传感器，或可以在该电传感器附近的支撑该电传感器的第一基片的表面上存在。此外或可选地，在覆盖传感器的材料上提供核酸分子，前提是核酸的电特性可以传递至所述电传感器。在进行电测量时，核酸应当充分地靠近电传感器从而可以由传感器检测到(例如因双链核酸熔化至单链核酸引起的)一种或多种电特性的改变。
根据一个实施方案，仅在传感器区域上提供核酸探针并且在所述传感器区域上进行电检测和光学检测。或者，可以构思的是在所述传感器区域之外的第一基片区上提供核酸探针。尽管这种核酸探针对电信号无贡献，然而该核酸探针可以用于光学检测或有助于光学检测。
根据一个实施方案，在电传感器的表面上提供核酸，更具体是单链核酸并且最具体地是核酸探针。单链核酸可以结合至纳米结构物如纳米管而不活化此纳米结构物。用于在电传感器上提供单链核酸探针的方法可以包括以下步骤：将一滴核酸探针溶液滴在传感器区上；通过干燥蒸发此溶液；用水淋洗此电传感器并例如用氮气干燥传感器表面。可以通过淋洗和吹风除去过多的探针单链核酸。若过多探针核酸结合至不希望的区域(例如传感器区域之外的第一基片区)，则使用侵蚀性更强的方法，如蚀刻法。或者，过多的探针核酸可以留在原地，若它不破坏传感器运行，或若它为辅助性光学检测所需要。
根据具体实施方案，将一种或多种核酸如核酸探针固定在电传感器的表面上。用于固定核酸的几种方法已经描述用以制备DNA传感器，包括化学吸附法(Hashimoto，K.；等，Anal.Chim.Acta 1994，286：219；Zhao，Y.D.；等.J.Electroanal.Chem.1997，431：203)和共价结合法(Liu，等.Anal.Biochem.2000，283，56；Xu，C.等.Anal.Chem.2001，369，428；Steel，A.B.等.Bioconjug.Chem.1999，10：419))。已经证实是新固定技术如抗亲和素-生物素系统(Sun，X.Y.；Talata 1998，47：487)和壳聚糖改良电极(Berney，H.；等Sensors and Actuators B 2000，68：100)和通过分子自装配的共价结合(Hagenstrom，H.等Langmuir 200117，839)简单和通用的。自装配单层(SAM)改良电极建立了稳定、高密度和可取向的单链DNA修饰单层。从微阵列技术(例如适合的喷墨打印装置)中获知用于在基片上以阵列方式提供多个不同探针核酸的方法。
根据一个实施方案，在传感器表面上提供核酸后，用封闭剂(例如Triton X-100TM)处理传感器的表面以防止不相关的核酸或其它组分结合于该传感器。
本发明提供用于检测样品中核酸的方法和工具。
根据具体实施方案，所述样品是包含DNA的生物样品，更具体地，样品包含来自真核生物的基因组DNA。更具体地，用于MCA检测的目的样品是从相同物种的生物中获得的基因组DNA的样品，其中据信所述的生物在基因组中携带一种或多种核苷酸的一种或多种多态性。
根据一个实施方案，本发明的方法和装置用在核苷酸多态性检测中。在基因或基因片段中的核苷酸多态性可以通过完全互补性双链DNA(dsDNA)与包含错配的dsDNA之间针对DNA序列的解链温度的差异加以检测，其中所述的DNA序列包含5-100个核苷酸的错配。解链温度通常使用所谓解链曲线分析法(MCA)确定。通过缓慢地加热双链DNA片段进行MCA，其中所述双链DNA片段通过杂交对应于包含错配的样品核酸区域的探针与样品核酸而获得。在双链核酸对照(对照核酸，其不包含与核酸探针杂交的错配)与通过样品核酸与该核酸探针杂交所形成的双链核酸之间的Tm差异指示存在一种或多种核苷酸多态性。
在分析样品之前，样品中的核酸可以通过各种方法扩增。除了PCR之外，也可以使用本领域可获得其它扩增方法，包括但不限于靶多核苷酸扩增方法(如自持式序列复制法(3SR)和链置换扩增法(SDA))、以扩增连在靶核酸上的信号物为基础的方法(如“支链”核酸扩增法)、基于扩增探针核酸的方法(如连接酶链反应(LCR)和QB复制酶扩增(QBR))和多种其它方法，如连接活化/激活转录(LAT)、基于核酸序列的扩增(NASBA)修复链反应(RCR)和循环探针反应(CPR)。
根据一个实施方案，在本发明的方法和装置中对其实行MCA的核酸的长度是50-150碱基对。已知核酸的大小是MCA中的重要因素。更具体地，相差一个或多个SNP的较小核酸片段之间存在的Tm差异比在较大核酸片段之间存在的Tm差异更大。对核酸变性的理论研究和实验研究已经证实当核酸片段的大小增加时，因一个或多个SNP生成的Tm差异减少。
根据又一个具体实施方案，添加去稳定剂至样品或至杂交的核酸探针/样品核酸。去稳定剂使双链核酸去稳定，因而降低Tm。添加去稳定剂可以确保核酸的Tm(正常高于100℃)处在实验期间所达到的温度范围内(即Tm＜100℃)。不同的去稳定剂对给定核酸的解链曲线的形状具有不同影响。例如，添加尿素作为去稳定剂导致Tm改变以及在检测参数的负一阶导数(例如对荧光-dF/dT)中所获得的峰变宽。尿素还减少标记样品的荧光。使用DMSO和甲酰胺导致与尿素相比更陡峭限定的峰。其它合适的去稳定剂包括通过改变其中双链核酸存在的缓冲液的盐浓度而使双链核酸变性的化合物。可以实验地或理论上确定添加去稳定剂的需要。对核酸Tm的理论预测已经成为多项研究的主题。常常计算解链温度以确定预期其中开展MCA的温度范围。使用盐调整公式(Rychlik和Rhoads(1989)Nucl.Acids Res.17，8543-8551；Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)或最近邻算法(Breslauer等(1986)Proc Natl Acad Sci.83，3746-3750)预测解链温度。
本发明的方法以检测在从双链转变至单链核酸时核酸的变化电特性为基础。更具体地，这种检测在双链核酸加热期间进行，从而确定双链核酸出现所述转变的温度，即解链温度。通过使用核酸探针，可以捕获样品中的单链核酸并且所形成双链核酸的电特性指示结合的单链的特性。
根据本发明的这个方面，开展对一种或多种核酸样品的解链温度的检测，这允许鉴定样品核酸，而无需标记。
根据发明的另一个方面，提供这样的装置和方法，其中核酸样品解链温度的电检测方法与光学检测法组合。根据本发明的这个方面，将标记的样品DNA导入反应室，此后施加用于(变性和)与核酸探针杂交的条件。在样品核酸与核酸探针杂交后，施加递增的温度梯度。在逐步递增的加热条件期间，检测已杂交双链核酸的电特性和光学特性。更具体地，监测双链核酸转变至单链核酸时的电特性及光学特性改变，从而确定双链核酸的解链温度。
无论本发明的方法和装置是否包括光学检测法，均以双链核酸和单链核酸的光学特性差异为基础。传统上，通过在260nm处检测核酸而实行解链温度分析，因为在该波长上的吸收可以区分双链核酸和单链核酸。然而，为提供更敏感和精确的解链温度确定，可以使用合适的染料或标记物，其产生针对双链核酸和单链核酸的差异性信号。
根据一个实施方案，利用非特异性结合至单链核酸或双链核酸的染料。合适的染料包括(但不限于)双链DNA特异性染料如溴化乙啶、SYBR GreenI或SYBR Green II(Molecular Probes，Eugene，OR)或单链DNA特异性染料。根据具体实施方案，染料是使用荧光检测工具进行检测的荧光染料。合适的染料可以添加到样品内或可以在杂交后添加至在传感器表面上的杂交双链DNA上。
可选地，利用例如与样品核酸结合的标记，从而与传感器上存在的核酸探针的杂交将在该传感器表面上生成信号。样品核酸可以在扩增步骤之前、期间(用标记的引物)或之后用标记物修饰。在某些实施方案中，两种不同的标记物可以出现。例如，样品和探针核酸可以含有在不同波长上发射光的标记物。根据一个实施方案，向样品和探针核酸提供标记物，所述的标记物在相互靠近时猝灭或增强由单一标记生成的信号。所用标记的性质将决定解链温度分析的性质，即所述解链温度分析可以通过测量双链核酸变性时光学信号的损失或光学信号的增益而进行。合适标记物的非限制性名单包括荧光染料，如5-(和6-)羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四-氯-荧光素和5-羧基荧光素、罗丹明染料如5-(和6-)羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明和6-羧基罗丹明X、酞菁如甲基酞菁、亚硝酰基酞菁、磺酰基酞菁和氨基酞菁、偶氮染料、偶氮甲碱、花青和黄嘌呤，如甲基、硝基、磺基(sulphano)和氨基衍生物和琥珀酰基荧光素。其它合适的标记是来自花青二聚体和单体，如TOTO、YOYO、TO-PRO、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7等的荧光团，或染料(如LCRed 705)可以用作荧光染料。
根据具体实施方案，使用解链温度标记(MPM)促进确定解链温度。MPM是包含在解链曲线分析中的特异性核酸片段。这些片段是在加热相期间也熔化的(克隆的，合成的或随测试基因座而共扩增的)小片核酸，其以类似于电泳中分子量标记的方式作为内标发挥作用。使用这些MPM，可以获得熔化过程的内部验证和旨在比较所测试片段的内部参考。
本发明的装置和方法提供了基于电测量和光学测量而同时及在相同条件下实行解链曲线分析。这提供了几种优势。例如这有可能校准在电测量中因pH或离子浓度波动所致的偏差。因此，本发明提供其中MCA测量及光学方法一起用来确认和校准电测量的方法。
根据具体实施方案，开展例如对(例如SNP的)样品文库的同时测量，其中校准了使用两种测量法所获得的数据，以便获得以信号的电测量为基础的SNP文库。这允许后续仅基于电检测而可靠地鉴定SNP，因而不再需要标记物。
根据另一个具体实施方案，连续地使用电检测方法和光学检测方法。根据一个实施方案，首先通过电传感器在未进行扩增和/或未标记的样品上确定样品核酸/核酸探针的解链温度。此后，进行一个或多个扩增步骤和/或标记步骤。在此阶段，可以仅使用光学方法或使用电方法和光学方法的组合进行解链温度确定，旨在从两个独立测量方法获得结果。
本发明描述其中使用光学方法和/或电学方法确定双链核酸的解链温度并且进行MCA的装置和方法。通过这些方法和装置确定解链温度具有众多优势。当样品核酸与探针核酸完全解离并与光学测量区域物理地分开时，通常仅观察到光学特性的改变。然而，在这种完全解离之前，双链核酸将局部地变性。使用电传感器，立即监测到这种初步变性。类似地，在双链核酸彻底变性时，立即检测到电信号的改变，不必等待物理地除去样品。因而，解链曲线更尖锐并更精确。出于相同原因，施加至电传感器的温度梯度可以更快地变化，因而缩短开展MCA所需的时间。
本领域技术人员显而易见体现本发明的系统和方法的其它布局。应当理解虽然具体的实施方案、特定构造和布局以及材料针对本发明的装置和方法在本文中加以讨论，然而可以在形式和细节方面进行多种变化或修改而不脱离本发明的范围和精神。
实施例：通过荧光监测确定解链温度
将包含针对血色素沉着病SNP(如上文Star等(上文引用，表2)中所述)的寡核苷酸探针点加在碳纳米管传感器上。在干燥后，将纳米传感器置于反应室中并添加含有先前用荧光标记物标记的样品单链核酸的缓冲液，其中所述的样品单链核酸疑似含有错配。反应室置于装置内，其中所述的装置配备在碳纳米管传感器上测量电导的电极和配备在碳纳米管传感器表面处检测荧光的光学器件。将反应室加热至100℃并逐步冷却下来以使探针和标记的样品核酸复性。随后将反应室以每秒0.1℃的速率逐步加热。在斜坡期间，(每5秒)测量碳纳米管的电导率并且光学地测量在纳米管传感器表面上存在的样品核酸/核酸探针的吸光度。原始数据首先通过求得荧光和电导值的负一阶导数进行转化。最终解链曲线因此报道为相对于温度的荧光与电导对温度的三点平滑负一阶导数，任选地扣除基线。通过从线性回归线中扣除斜率而计算针对每个数据点的基线校准，其中所述的线性回归线包括紧邻当前点之前或紧随其后的四个数据点。

Claims (21)

1.一种生物传感器装置(100)，其包含：
-微室(101)，
-电检测构件(102)，其包含置于该微室内的电传感器，其中所述传感器能够检测存在于该传感器表面上的双链核酸的电特性改变，和
-能够加热所述微室的可编程加热元件(103)。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述的电传感器包含纳米结构物。
3.权利要求2所述的装置，其中所述的纳米结构物是碳纳米管。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于至少一种单链核酸存在于所述电传感器上。
5.权利要求1所述的装置，其特征在于所述的微室包含至少一个半透明或透明部分。
6.权利要求5所述的装置，其包含光学检测构件，所述光学检测构件能够通过所述微室的所述至少一个半透明或透明部分检测所述微室中产生的信号。
7.权利要求4所述的装置，其中所述的光学检测构件是荧光检测器。
8.权利要求1所述的装置，其中布置了至少一个电传感器。
9.权利要求1所述的装置，还包含支撑所述电传感器的第一基片。
10.一种用于实行解链曲线分析的方法，所述方法包括：
-在微室中的电传感器表面上提供单链核酸探针，
-使包含单链核酸靶的样品与所述微室中的电传感器接触，从而允许所述单链核酸探针与所述单链核酸靶杂交为双链核酸，
-逐步加热所述微室，
-基于电传感器上的变化电信号而检测所述双链核酸的解链温度。
11.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括步骤：
-基于变化的光学信号而检测所述双链核酸的解链温度；和
-比较步骤(d)中获得的值与步骤(e)中获得的值。
12.一种用于使用电检测方法确定样品内的基因核酸片段中存在一种或多种核苷酸多态性的方法，所述方法包括：
-使用电检测构件确定所述基因的核苷酸多态性库的解链温度，
-同时使用光学检测构件确定所述基因的核苷酸多态性的解链温度，
-使步骤(a)中在电检测构件内获得的值与用步骤(b)的光学检测构件获得的那些值关联，从而基于电检测获得解链温度值的库，
-使用电检测方法确定样品中核酸片段的解链温度，
-比较步骤(d)中获得的值与步骤(c)中获得的所述库，从而获得一种或多种多态性存在的可靠指示。
13.一种用于校准权利要求1所述装置的方法，包括步骤：
-使用电测量方法确定双链核酸的解链温度，
-通过光学方法一次或多次验证由所述电测量法获得的所述双链核酸的解链温度，
-定义与所述双链核酸的解链温度相对应的电测量值。
14.一种用于测量样品核酸与核酸探针之间杂交的方法，包括步骤：
-给电传感器提供单链核酸探针，
-在样品核酸可以与所述核酸探针杂交的条件下施加含有所述样品核酸的样品，
-以受控方式逐步加热电传感器上的杂交核酸，
-通过电传感器确定杂交核酸的解链温度。
15.根据权利要求15所述的方法，还包括步骤：通过光学检测法在加热所述的杂交核酸期间检测此杂交核酸的解链温度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的样品核酸用光学标记物标记。
17.权利要求15所述的方法，其中所述的加热以每秒至少1℃的速度进行。
18.权利要求15所述的方法，其中所述的检测仅通过电测量法，使用以权利要求13的方法所确定的电测量值进行。
19.权利要求1所述装置或权利要求10所述方法的用途，用于确定双链核酸中的错配。
20.纳米传感装置的反应室，其包含：
-至少一个电传感器，
-支撑所述电传感器的基片，其中所述的基片是导热的，
其中所述的微室包含至少一个(半)透明部分。
21.权利要求20所述的反应室，还包含能够加热所述微室的可编程加热元件。
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