CN101981445B - 电学地检测生理活性物质的方法和用于该方法的生物芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测生理活性物质的存在和/或反应的方法，其通过精确地检测由生理活性物质的生物学、生物化学或化学反应产生的电学性质的变化，并且提供了用于所述方法的生物芯片。用于检测的样品的反应在一般的反应性溶液中进行，并且反应之前，反应腔室填充诸如水的具有大介电常数的参考流体，用于测量阻抗值或电容值。所述反应性溶液在所述反应完成之后移除，并且所述反应腔室重新填充具有大介电常数的参考流体以测量阻抗值或电容值。随后，比较反应之前和之后的阻抗值或电容值以检查用于检测的样品中生理反应性物质的存在和/或反应。

Description

电学地检测生理活性物质的方法和用于该方法的生物芯片
发明领域
本发明涉及通过精确地监测生物分子的生物学、生物化学或化学反应之后电学性质的变化而检测所述生物分子的存在和/或反应的方法，和为此提供的生物芯片。
特别地，本发明涉及灵敏地检测所述生物分子的生物学、生物化学或化学反应之后反应腔室中电学性质的变化、特别地阻抗或电容值的变化的方法，其通过使用安装于所述反应腔室中的感应电极，和本发明涉及为此目的提供的生物芯片。
更特别地，本发明涉及在固定于反应腔室的感应电极上的受体与作为靶向分子的生物分子反应之后，灵敏地检测电学性质变化例如阻抗或电容值的变化的方法和用于为此目的的生物芯片。
发明背景
生物芯片是可以大规模自动地分析遗传信息和蛋白质信息，或容易地和快速地检测生物分子的存在和功能的装置。该生物芯片被积极地应用于多个领域包括基因和蛋白质研究、医学、和农业、环境和化学工业等。
生物芯片大体地分类为基因分型芯片、表达芯片和微流体芯片：所述基因分型DNA芯片是通过使用探针检测特定基因的存在；所述表达DNA芯片是监测与特定疾病相关的基因表达谱；和所述微流体芯片是检测包括血液和尿的样本中生物分子的存在和/或反应。目前，基因分型DNA芯片是商业化的并广泛应用于研究领域和医学诊断领域。
通常，术语微阵列芯片定义为通过使用微阵列装置阵列数百至数万种固定于玻璃板的基因或蛋白质的芯片。在这些之中，DNA芯片是将寡核苷酸作为探针微阵列在玻璃板上，以用荧光扫描仪鉴定特定基因的存在。
所述DNA芯片实践上被用于研究和诊断领域。特别地，该芯片通过使用基因表达谱和基因分型技术等，应用于阐明基因功能包括细胞代谢、生理现象和基因间相互关系。所述DNA芯片也被广泛用于诊断以检验导致诸如癌症的特定疾病的机制、预兆诊断和药物功能，从而鉴定导致疾病的微生物的遗传信息和筛选突变等。
诊断性DNA芯片已被Affymetrix Co.Ltd.的Steve Fodor博士于1994年开发，并且首个HIV基因芯片开始在市场中商业化。现在，人们积极地尝试诊断性DNA芯片研究以诊断慢性疾病包括HIV、风湿病、自身免疫疾病、慢性肾炎、动脉粥样硬化、特应性皮炎和变态反应等。特别地，在DNA芯片上面的近期研究趋向于开发用于诊断用途的芯片而不是用于研究用途的芯片。此外，对比可用于诊断基因型、病原体和病毒的基因分型芯片，能诊断多种疾病包括癌症和白血病的基因表达谱方法正在完成。
最近，通过引入IT和纳米技术，可以从一次测试同时检测许多疾病和从个体的遗传信息预测疾病的爆发的微流体芯片(芯片实验室)吸引了注意力。所述微流体芯片也被称为生物芯片。该芯片被用于在微小量的被分析靶物质(DNA、RNA、肽、蛋白质等)被引入至反应腔室后，在芯片中分析多个生物分子的反应谱。该生物芯片是通过在与反应腔室中生物分子反应后，监测安装于芯片中的电极的电学性质变化，而检测生物分子的存在和/或反应。
这类生物芯片对于医学诊断是高度合适的，由于其可以通过检测电学信号而比上述任何其他DNA芯片更容易地和快速地鉴定生物分子的存在和/或反应。
例如，HPV DNA芯片是制备HPV寡核苷酸探针并微阵列这些探针于玻璃板上以诊断HPV这一导致宫颈癌的致病病毒是否阳性的装置。尽管如此，不可能在可疑样品收集之后立即诊断HPV的阳性状态。这就是说，以荧光标记的用于扩增HPV病毒基因的引物应被预先制备。然后，所述收集的样本应通过进行PCR扩增，固定于HPV DNA芯片并被监测而以荧光扫描仪检测荧光信号。然而，用于通过使用DNA芯片(激光引发的荧光)检测杂交物的该系统不便于操作并耗费大量时间。因此，该方法具有多种问题和不利。由于以荧光物质标记DNA样品，其需要很高的成本，并且由于使用昂贵的荧光扫描仪而不便于携带。
相比之下，所述生物芯片可以通过检测电学信号相对容易地和快速地鉴定生物分子的存在和/或反应。特别地，所述生物芯片可以通过使用电学信号而不是荧光信号检测生物分子(例如，DNA)的存在和/或反应。更特别地，所述生物芯片采用电学地检测变化的系统，其中在生物分子与固定于电极上的受体反应后监测阻抗值(或电容值)的变化，或在芯片腔室中生物分子之间反应后监测阻抗值(或电容值)的变化。
例如，有报道在PCR过程中dNTP应降解为dNMP和二磷酸，并且所得dNMP同时地自互补于DNA模板序列的引物聚合以合成DNA。因此，随着DNA浓度增加，PCR试剂中阻抗值增加(见，韩国专利公开号：10-2004-0042021)。因此，当PCR反应腔室被制造为具有生物芯片结构并且试剂中阻抗值的变化被安装于这类生物芯片中的电极电学地检测时，可以确定所述PCR反应是否进行和特定DNA序列是否存在。
另外，当诸如引物或探针的寡核苷酸被固定于生物芯片的电极上，进行PCR反应或杂交反应，并且然后以固定有寡核苷酸的电极测量阻抗或电容值变化时，可以电学地检测PCR反应或杂交反应是否完成和/或靶核苷酸序列是否存在。
通常，所述生物芯片采用通过在使生物分子与其他试剂(例如，固定于电极上的受体)反应之后，以装备于生物芯片中的电极监测阻抗变化而确定特定生物分子的反应和存在的系统。因此，为了保证生物芯片的可靠性，精确地测量所述阻抗值的变化十分重要。通常，阻抗(Z)表示作为实数部分的电阻(R)和作为虚数部分的电抗(X)之和(见随后的数学公式1)，并且阻抗的模值相当于电阻值(R)和电抗值(X)的平方根(见随后的数学公式2)。
数学公式1
Z = R + jX
= R + j ( X L - X C )
= R + j ( ωL - 1 ωC ) [ Ω ]
数学公式2
| Z | = R 2 + X 2
= R 2 + ( ωL - 1 ωC ) 2 [ Ω ]
因此，使得阻抗(Z)值与电抗(X)有关联。同样地，电抗(X)与电容(C)值有关联由于其是ωL-1/ωC。因此，根据生物学、生物化学或化学反应而改变的电容(C)值的变化，通过阻抗值的变化而反映，其在被测量之后能够检查生物分子的反应和/或存在。最后，经证实，电容值的变化应改变生物芯片中的阻抗值并且影响所述生物芯片的灵敏度。
在使生物分子与其它试剂(例如，固定于电极的受体)反应后，阻抗值的变化可以被两种电容值影响。特别地，当电容值的变化是通过生物芯片的电极测量时，生物芯片中电容值总变化(CT)可以包括在使生物分子与固定于电极的受体反应后感应电极表面的电容值变化(Cd)，和与电容值变化(Cd)不同的虚拟电极板(imaginary electrode plate)与另一感应电极之间的电容值(Ct)(见随后的数学公式3)。
数学公式3
C T = 1 1 C t + 1 C d
在生物芯片中，所述生物分子在填充反应腔室的试剂下反应并且所述试剂通常包含缓冲溶液或电解液。所述缓冲溶液和电解液包含影响生物芯片的感应电极之间电导的离子。对感应电极之间电导的该缓冲效应影响包含于作用为介电质的缓冲液中的虚拟电极板和另一感应电极之间的电容值(Ct)。最后，该影响完全改变电容值(CT)。
另一方面，电容值如在随后的数学公式4中定义的取决于电极之间物质的介电常数。经证实，当电极之间物质的介电常数小时，所述电容值变小。
数学公式4
C = Q V = ϵ A t
A：电极面积
T：电极之间间隔
ε：电极之间物质介电常数
然而，诸如上述缓冲液的试剂由于离子导电性而具有小介电常数，并且因此，在数学公式3中包含电容值总变化(CT)的元素1/Ct变大。因此，当所述生物分子在填充生物芯片反应腔室的缓冲溶液下反应时，由于感应电极与所述生物分子之间反应而改变的电容值(Cd)可以被吸收入包含在作用为介电质的缓冲液中的虚拟电极板和另一感应电极之间的电容值(Ct)。特别地如在数学公式3中示出的，感应电极表面的通过使生物分子与固定于电极上的受体反应而改变的电容值(Cd)不影响电容值总变化(CT)，这是因为填充作为介电质的包含缓冲液离子的试剂的虚拟电极板和另一感应电极之间的电容值(Ct)的倒数(1/Ct)是大的。因此，通过使用生物芯片的感应电极的电学检测确定生物分子的存在和/或反应是成问题地困难的。
针对这点，图1示出观察到相对于频率而不同的阻抗值曲线在PCR反应之前和之后具有相同的趋势，即使作为诊断样品的特定靶DNA模板存在。如果常规生物芯片可以使用特定靶DNA模板作为生物分子精确地测量PCR反应，感应电极表面的电容值(Cd)变化可以在模板ssDNA和固定于感应电极上的引物之间的PCR反应后被电学地检测。阻抗曲线的变化模式也在PCR反应之前和之后被观察到，这是因为在通过PCR反应扩增DNA之后应反映感应电极表面上的电容值(Cd)的变化。
然而，由于在使生物分子与感应电极反应后改变的电容值(Cd)可以被如上描述的虚拟电极板和另一感应电极之间的电容值(Ct)忽略，因而，当以生物芯片连接的监测阻抗值的装置测量时，阻抗曲线并不变化并且仅仅观察到在PCR反应之前和之后是单一曲线(见图1)。因此，在现有技术的生物芯片中，由于使生物分子和固定于电极的受体反应而改变的电容值(Cd)，被包含作为介电质的缓冲溶液的虚拟电极板和另一感应电极之间的电容值(Ct)忽略，并且因此，意味着电容值总变化(CT)的阻抗值变化的两条曲线没有被测量。成问题地，在实践中监测所述生物分子是否反应和/或存在是困难的。
特别地，在美国专利公开号2004/0110277中，公开了用于感应杂交反应的系统，其中探针DNA被固定于生物传感器中的传感器单元的电极上并且与靶DNA杂交以改变电容值，和最终地晶体管电流值。然而，其没有以解决随后的问题为焦点：因为由于使生物分子与固定于电极上的受体反应而改变的电容值(Cd)被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略，所述作为靶物质的生物分子与固定于电极上的受体的反应不能被电学地检测。
此外，在美国专利公开号2006/0226030中，公开了通过以包含板、电极和固定于板上的捕捉器(catcher)分子的传感器检测电容值以感应杂交反应的技术，其中所述捕捉器分子与以金属球(其具有与其他材料不同的介电常数)标记的DNA单链杂交，并且作为结果，所述标记包围所述电极以改变关于电极阻抗值的电容值的一部分。然而，其未注意去克服随后的问题：因为由于使生物分子与固定于电极上的受体反应而改变的电容值(Cd)被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略，因而，在实际反应时，电学性质的变化不能被灵敏地检测。
此外，在常规技术中，公开了增加IDE感应灵敏度的系统，其通过减少传感器电极之间隔以改进生物芯片的感应灵敏度。但是，其没有认识到上述的问题：因为由于实际反应而改变的电容值(Cd)被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略，因而，电容值和阻抗值的变化不能被灵敏地检测。
因此，现有技术中公开的常规生物芯片和使用所述生物芯片以鉴定生物分子的反应和/或存在的方法应该被改进。
为了解决上述的问题，本发明人已经完成设计用于检测生物分子的方法和用于所述方法的生物芯片，其中使生物芯片的反应腔室中填充于电极之间的物质的介电常数大，当在感应电极的表面反应时其不畸变电容值的实际变化，并且因此，精确地反映反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应。
公开内容
目的
本发明旨在解决上述的现有技术中不能灵敏地监测在实际反应时生物传感器的电极中改变的电容值的不利。本发明的目的是提供通过精确地监测反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应之后电学性质的变化，来检测生物分子的存在和/或反应的方法，与为此提供的生物芯片。
特别地，本发明的目的是提供精确地检测反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应之后电学性质的变化、特别地阻抗或电容值的变化的方法，其通过使用安装于所述反应腔室的感应电极，和为此目的提供的生物芯片。
更特别地，本发明的目的是提供用于检测生物分子的方法和用于此目的的生物芯片，其中使生物芯片的反应腔室中填充于电极之间的物质的介电常数大，当在感应电极的表面上反应时其不畸变电容值的实际变化，并且因此，精确地反映反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应。
技术方案
为了克服常规方法的上述不利，需要区分由于使生物分子与固定于电极上的受体反应而改变的电容值(Cd)和缓冲溶液的电容值(Ct)，以便电容值(Cd)不应被电容值(Ct)忽略。因此，1/Ct值需要变得更小，并且即，Ct值需要变得更大。
同时，电容值如在数学公式4中所描述而定义。因此，电极的面积应该变得更大，电极之间间隔应该变得更窄，或填充于电极之间的物质的介电常数应该变得更大以增加Ct值。
在现有技术中，如上所述已经采用用于增加感应灵敏度的系统，其中生物芯片的IDE(交叉指形电极)中传感器电极的宽度被减少以增加Ct。然而，电极宽度的减少就成本和效率而言并非优选，这是因为其需要高度先进的微电极形成技术。
考虑到这个不利，本发明尝试用于增加生物芯片的反应腔室中填充于电极之间的物质的介电常数∈(或也称介电比)的系统。该方法不要求高度先进的微电极形成技术，也不在感应电极的表面反应时畸变电容值的实际变化，并且可以精确地反映反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应。
同时，所述生物芯片在反应腔室的电极之间填充用于反应靶样品的试剂。因此，需要增加该试剂的介电常数。但是，由于离子，该反应靶样品的试剂难以调节介电常数。
通常，介电常数定义为当介电质填充于电极之间时测量的电容与电极之间没有物质时测量的电容之比，并且任何介电质的介电比总是大于1。在液体中，水的介电常数已知为最大的并且在室温约为80。然而，为了测试靶样品，诸如蒸馏水或去离子水的水不能直接用于试剂用途。
因此，本发明提供用于检测靶样品中生物分子的存在和/或反应的方法，其中靶样品的反应在已知反应溶液下进行，其中在反应之前将诸如水的具有高介电常数的参考流体填充进反应腔室以测量阻抗值或电容值，在完成反应之后，移除反应溶液并将所述具有高介电常数的参考流体重新填充以测量阻抗值或电容值，然后相互比较反应之前和之后测量的阻抗值或电容值。
特别地，本发明提供用于电学地检测生物分子的方法，其包括：(a)提供电学检测装置，其包括接受靶样品的反应腔室，和位于反应腔室中用于检测靶样品中生物分子的多个感应电极；(b)向反应腔室引入具有高介电常数的参考流体后，测量感应电极之间的阻抗值或电容值；(c)从反应腔室移除具有高介电常数的参考流体后，向反应腔室提供反应溶液和靶样品；(d)在所述反应腔室中，在所述反应溶液下反应所述靶样品；(e)从所述反应腔室中移除所述反应溶液；(f)再次向反应腔室引入具有高介电常数的所述参考流体后，测量感应电极之间的阻抗值或电容值；和(g)比较步骤(b)中测量的阻抗值或电容值和步骤(f)中测量的阻抗值或电容值。
在本发明的实施方案中，阻抗值或电容值是根据步骤(b)和步骤(f)中的频率分别地通过使用交流电(AC)电源的测量装置测量的。在本申请中，所述测量阻抗值或电容值显示为相对于频率值的曲线。如果获自步骤(b)的阻抗值或电容值曲线与获自步骤(f)的阻抗值或电容值曲线有区别，该结果被判定为显示靶样品中靶生物分子的存在或靶生物分子至感应电极上的反应。
在本发明的另一实施方案中，所述具有高介电常数的参考流体优选地具有约大于4的介电常数，更优选地具有约大于80的介电常数。所述具有高介电常数的参考流体可以是蒸馏水或去离子水，但本发明并非仅限于此。任何流体可以是适用的，如果其具有如上所述的约大于4的介电常数。
在本发明的另一实施方案中，所述感应电极优选地由金、铬、铜或铝制成。优选地，所述感应电极由交叉指形电极形成，并且感应电极之间的每个间隔可以是约1-20μm，并且优选地，约1-4μm。
在本发明的另一实施方案中，多个感应电极可以结合有能够与生物分子相互作用的受体。
在本发明的另一实施方案中，术语“生物分子”是与结合于感应电极上的受体相互作用的材料，并且可以包括包含一种或多种核苷酸的核酸、包含一种或多种肽的蛋白质、氨基酸、糖脂或小分子化合物，并且优选地，抗原、DNA、RNA或PNA(肽核酸)。
在本发明的另一实施方案中，术语“受体”是结合于感应电极上的材料，其与生物分子相互作用，并且可以包括包含一种或多种核苷酸的核酸、包含一种或多种肽的蛋白质、氨基酸、糖脂或小分子化合物，并且优选地，抗原、探针或引物。
另外，在本发明的另一实施方案中，所述受体的特征为寡核苷酸探针，所述生物分子为核酸，并且所述反应溶液是用于核酸杂交的溶液。另一方面，在本发明的另一实施方案中，所述受体的特征为寡核苷酸引物，所述生物分子为核酸，并且所述反应溶液是用于PCR扩增的溶液。
另外，所述方法中使用的用于检测生物分子的本发明的生物芯片可以以单板形式制造，但可以是以双板的结合形式。在本发明的实施方案中，该生物芯片可以包括DNA杂交芯片或PCR反应芯片。
在本发明的另一实施方案中，具有结合形式的双板的生物芯片包含具有结合有与生物分子相互作用的受体的多个感应电极的第一板，和通过以预定距离与第一板结合而相对于第一板形成反应腔室空间的第二板。
所述第一板具有多个形成于N-型或P-型硅板上的SiO2绝缘层上的感应电极，其进行电学检测以鉴定生物分子是否存在和/或反应。所述第二板防止所述第一板的感应电极接触外部环境以通过与第一板结合形成反应腔室空间。
所述反应腔室是在填充具有高介电常数的参考流体之后测量电极间阻抗值和/或电容值的空间。另外，所述反应腔室是在填充反应溶液和靶样品之后，靶样品中生物分子被反应的空间。如果所述受体固定于感应电极上，反应腔室中的生物分子与所述受体反应，并且作为结果，发生电极之间阻抗值和/或电容值的变化。
上述板可以具有多种大小，取决于适用的受体的种类和数量，例如探针和引物的种类和数量。另外，所述板可以具有正方形形状、矩形形状和圆形形状，但本发明中并不仅限于此。优选地，所述第一板可以是硅板，并且所述第二板可以是玻璃板。但是，这些板也可以通过选自玻璃、硅、熔融石英、聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、金、银、铜和铂的任一构成。
另外，所述形成反应腔室空间的第二板被穿孔以具有在厚度方向的流体入口，并且还被穿孔以在流体入口的相反侧具有在厚度方向的流体出口。所述入口及所述反应腔室，和所述出口及所述反应腔室互相连通以允许流体流动通过所述反应腔室。所述具有高介电常数的参考流体、反应溶液和靶样品通过所述入口被引入，并且所述具有高介电常数的参考流体、反应溶液和靶样品通过出口流出。
另外，可以通过将第三板叠置于第二板上而制成引导将流体引入入口的入口微管道和引导将流体从出口排出的出口微管道。所述入口微管道与具有高介电常数的参考流体、反应溶液和靶样品被注入的注入开口连通，并穿过第三板。所述出口微管道与具有高介电常数的参考流体、反应溶液和靶样品被排出的排出开口连通，并穿过第三板。
另外，在入口微管道和/或出口微管道可以提供可以控制流体注入至反应腔室空间和流体从反应腔室空间排出的阀结构。所述阀结构是通道，所述通道在沿厚度方向穿入第三板后延伸，介于所述注入开口与所述反应腔室空间之间，或介于排出开口与所述反应腔室空间之间，其中油被储存于所述通道。当氮气(N2)被注入阀结构的该通道中时，储存于通道的油膨胀并由于油膨胀而阻挡所述管道，以阻止流体自注入开口流入至反应腔室和流体自反应腔室流出至排出开口。优选地，所述第三板是由PDMS(聚二甲硅氧烷)制成。
上述微管道和阀结构可以通过领域内广泛使用的MEMS(微电子机械系统)技术以微米单位或纳米单位制备，并且其大小可以被控制，取决于受体大小、电极大小或反应条件。
所述管道结构和阀结构便于上述方法中随后的步骤：在反应前将具有高介电常数的参考流体填充入反应腔室；在反应时从反应腔室移除具有高介电常数的参考流体并且将反应溶液和靶样品填充入反应腔室；并且在反应后从反应腔室移除反应溶液及重新将具有高介电常数的参考流体填充入反应腔室。为此目的，所述生物芯片可以提供有注入泵和排出泵以注入和移除流体、反应溶液和靶样品。为驱动泵，所述生物芯片也可以提供有小马达或变速器。
另一方面，阻抗分析器可以被电学地连接至多个感应电极。当所述生物芯片是PCR反应芯片时，进行PCR反应的PCR设备可被制造以容纳生物芯片，并且因此所述生物芯片和PCR设备可以成套提供。优选地，当生物芯片和PCR设备成套提供时，使用具有阻抗测量装置的PCR设备并且所述阻抗测量装置是电学地连接于生物芯片的感应电极。
有利效果
如以上说明和确认的，本发明的方法可以根据反应腔室中生物分子的生物学、生物化学或化学反应精确地检测电学性质的变化，即使感应电极表面的改变的电容值(Cd)可能被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略。
特别地，本发明的优势在于使填充生物芯片的反应腔室中电极之间的材料的介电常数是大的，其在使靶样品中生物分子与固定于感应电极表面的受体反应时不畸变电容值的实际变化，并且可以精确地反映电容值总变化，并且因此，灵敏地检测生物分子的存在和/或反应。
附图简要说明
基于随后的详细说明结合附图，本发明的上述和其他对象、特点和其他优势可以被更清楚地理解，其中：
图1示出使用检测PCR反应的常规系统测量的阻抗值的变化。
图2是工艺流程图，其示出制备本发明中使用的DNA杂交芯片的方法。
图3是示出根据图2的工艺制造的DNA杂交芯片的电极部分的俯视图。
图3(a)示出DNA杂交芯片的整体电极部分，图3(b)示意性描绘图3(a)电极的放大部分，并且图3(c)示出局部放大的具有指形状的电极对(20a，20b)。
图4是根据A-A’线剖开的图3(b)的金属电极(20)的横截面图。
图5是工艺流程图，其示出制备本发明中使用的PCR反应芯片的方法。图5(A)示出制备PCR反应芯片的硅板的工艺，图5(B)示出制备PCR反应芯片的玻璃板的工艺，并且图5(C)示出所述硅板和所述玻璃板的结合状态。
图6是基于PDMS的流体控制板附接的PCR反应芯片的剖面图。图6(A)示出附接在此前制造的PCR反应芯片的玻璃板上的流体控制板。图6(B)和图6(C)示出通过流体控制板的阀功能控制PCR反应芯片的流体流动的程序。
图7示出电极阵列型芯片。
图8示出使用本发明的检测DNA杂交反应的方法测量的阻抗值的变化曲线。
图9示出使用本发明的检测PCR反应的方法测量的阻抗值的变化曲线。
发明模式
本发明的实用的和当前优选的实施方案如在随后的实施例中更清楚地说明。
然后，本领域技术人员会意识到，根据本公开，可以在本发明的精神和范围中做出修改和改进。说明书中引用的参考文献被并入本发明。
实施例
实施例1：制备DNA杂交芯片
在本发明检测生物分子的方法中，当靶生物分子是DNA和结合于感应电极的受体是寡核苷酸探针时，用于杂交探针和作为生物分子的DNA的DNA杂交芯片得以制备。
所述DNA杂交芯片传感器是通过使用本领域中公开的一般技术制造的，包括二氧化硅薄膜形成技术、光刻术、曝光图案形成技术、显影技术、湿法和/或干法蚀刻技术等。特别地，具有IDE(交叉指形电极)的感应金属电极通过使用MEMS(微电子机械系统)形成于硅板上，并且然后，寡核苷酸探针被固定于所述感应电极。
制备本发明中使用的DNA杂交芯片的工艺根据阶段描述如下。
实施例1-1：电极成型于其上的硅板的构造
在下文中，参照图2，形成本发明中使用的DNA杂交芯片(100)的板(10)和电极(20)的程序会被简要地解释。
具有500μm的厚度的N-型硅晶圆(10)被热氧化以制造约
Figure BPA00001231137000131
的SiO2层(12)(氧化绝缘层)(见图2的步骤(a))。然后，所述绝缘层(12)以光刻胶AZ 5214(14)包被(见图2的步骤(b))。在光刻胶(14)上，安装具有金属电极图案的掩模(未显示)并且暴露于紫外线。之后，硅晶圆(10)被浸入AZ300MIF显影液以显影和蚀刻处理(见图2的步骤(c))。在被蚀刻的晶圆(10)上，沉积铬(Cr)
Figure BPA00001231137000141
和金(Au)薄膜(20)(见图2的步骤(d))。铬和金的薄膜(20)的沉积通过使用化学气相沉积(CVD)、真空蒸发或溅射进行。然后，残余光刻胶层(14)和在残余光刻胶层(14)上的薄膜的一部分通过使用已知的剥离工艺移除以制造金属电极(20)(见图2的步骤(e))。为了形成IDE(交叉指形电极)样式的金属电极，光刻胶AZ4620(16)被另外包被并且电极(20)通过使用本领域已知的光刻法程序图案化以形成良好的IDE(见图2的步骤(f))。
图3说明了制造的DNA杂交芯片(100)。图3(a)中描述的DNA杂交芯片(100)具有直径(R)约2.4mm的电极(20)，但更好地具有尽可能小的直径以制造电极阵列型DNA杂交芯片(见图7)。电极(20)的面积约为3.6mm2。
图3(b)中，图3(a)中描述的电极被局部地放大并且示意性地说明。为了易于理解，电极(20)的性状以矩形示出，但实际的电极(20)可以是圆形或椭圆形。如图3(b)中示出的，确认的是，用在本发明中的DNA杂交芯片(100)的感应电极(20)具有电极对(20a，20b)，其中它们以预定间隔以指样形状交替阵列。
另一方面，具有指样形状的电极对(20a，20b)被局部地放大，如图3(c)中示出的。每个电极(20a，20b)的宽度(t)约为10μm，电极之间间隔(d)约为4μm。
实施例1-2：寡核苷酸探针在电极上的固定化
首先，实施例1-1中制备的DNA杂交芯片(100)的电极(20)以氧等离子体(150W，100mtorr)冲洗10秒钟以完全移除电极(20)上的杂质。然后，探针DNA的一个末端(5’或3’)被固定于电极(20)。为了该固定，制备在探针寡核苷酸的5’末端，碳链(-CH2-)附接有硫醇基的探针5’-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3’并且通过使用SAM(自组装方法)将其固定于金属探针(20)表面。详细地，10pmol/μl的SH-ssDNA探针在MgCl2溶液条件下反应18小时。作为结果，探针的-SH基在金属表面上反应以固定所述探针DNA(22)于金属电极(20)的表面(见图4)。
同时，导电聚合物可代替硫醇基结合至探针DNA，并且所述结合至DNA的导电聚合物可以通过使用SAM方法(自组装方法)固定于金属电极表面。本领域中已知的所有导电聚合物，例如，特别地，高导电聚合物包括聚乙炔、聚对亚苯基(PPP)、聚吡咯(PPy)、聚苯胺、聚噻吩等可以被使用。所述导电聚合物可以通过使用已知的关于聚合物和DNA间结合的结合方法结合于探针DNA。
图4是图3(b)的金属电极(20)根据A-A’线剖开的横截面图并且说明DNA探针(22)固定于在硅板上形成的金属电极(20a，20b)上，其中氧化绝缘层(12)位于金属电极(20a，20b)和硅板(10)之间。
实施例2：使用DNA杂交芯片检测靶核苷酸序列
实施例1-2中制造的图4的DNA杂交芯片(100)被用于检验靶样品中是否发现靶核苷酸序列(5’-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAATGG-3’)。
首先，将具有高介电常数的作为参考溶液的去离子水引入至DNA杂交芯片(100)的电极(20)之间的反应空间，并且然后，在室温下通过使用交流电源测量电极(20)之间的阻抗值。测量阻抗值时，使用的交流电源幅度为100mV，并且其频率范围为1-32MHz。
之后，从DNA杂交芯片(100)移除参考溶液，并且然后，将包含靶核苷酸序列(10pmol/μl的ssDNA)靶样品和TE缓冲液引入至DNA杂交芯片(100)的反应空间。所得物在室温下孵育18小时，这取决于将固定于DNA杂交芯片(100)的电极(20)上的探针DNA(22)与靶核苷酸序列ssDNA(5’-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3’)杂交的杂交条件。
再次，将缓冲溶液从DNA杂交芯片(100)中移除并且引入去离子水。然后，通过使用交流电源在室温下测量电极(20)之间的阻抗值。测量阻抗值时，使用的交流电源幅度为100mV，并且其频率范围为1-32MHz。
如上所述，图8说明杂交反应之前测量的阻抗值和杂交反应之后测量的阻抗值。图8中，对比图1的常规方法情况，当该实验通过使用包含靶核苷酸序列的阳性靶样品进行时，观察到杂交反应之前测量的阻抗值和杂交反应之后测量的阻抗值具有两条不同的曲线。如图8所示，确认的是，在杂交反应期间，当靶DNA存在于反应溶液中时，阻抗值应该减少。因此，确认的是，阻抗值会随着由于杂交反应期间ss-DNA杂交成ds-DNA的电导值的增加而减少。
本发明的方法中，在靶ssDNA与固定于感应电极上的探针杂交之后电容值(Cd)的变化应该反映电容值总变化(CT)，这是由于其不被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略。因此，本发明的方法可以允许电学地监测以检测靶DNA的杂交反应和存在，这是由于如图8所示，杂交之前和之后观察到两条阻抗值变化曲线。
另一方面，如图8所示观察到从不具有靶核苷酸序列的阴性靶样品测量的阻抗值应该比阳性例的阻抗值小。
实施例3：PCR反应芯片的构造
在本发明检测生物分子的方法中，当靶生物分子是DNA和结合于感应电极的受体是寡核苷酸引物时，用于使用引物和PCR试剂扩增作为靶生物分子的DNA的PCR反应芯片得以制造。
如同DNA杂交芯片传感器，PCR反应芯片也是通过使用本领域中公开的一般技术制造的。硅板和电极部分可以通过使用二氧化硅薄膜形成技术、光刻技术、曝光图案形成技术、显影技术、湿法和/或干法蚀刻技术等制造。具有IDE(交叉指形电极)的感应金属电极通过使用MEMS(微电子机械系统)形成于硅板上，并且然后，寡核苷酸引物被固定于所述感应电极。另外，连接于硅板的玻璃板通过使用玻璃湿法蚀刻和喷沙技术制成。
制备本发明中使用的PCR反应芯片的工艺根据阶段描述如下。
实施例3-1：硅板、电极和玻璃板的构造
参照图5，制造本发明中使用的PCR反应芯片(200)的工艺将被如下说明。
1.硅板和金属电极的形成
具有500μm的厚度的N-型硅晶圆(10)被热氧化以制造约
Figure BPA00001231137000171
的SiO2层(12)(氧化绝缘层)(见图5A的步骤(a))。Ti/Au
Figure BPA00001231137000172
金属电极(20)通过使用常规光刻法工艺图案化，并且将从IDE排除出的电极的一部分，通过使用离子铣削以干法蚀刻移除，以形成良好的IDE(见图5A的步骤(b))。之后，具有至少1μm厚度的SiO2层(18)通过使用化学气相沉积(CVD)、真空蒸发或溅射等沉积于图案化的金属电极(20)(见图5A的步骤(c))。然后，通过使用化学机械抛光(CMP)使绝缘层的SiO2层(18)变平坦(见图5A的步骤(d))。之后，所述IDE只以干法蚀刻(RIE)或湿法蚀刻(BOE)处理，以暴露Au金属电极的表面。结果，形成下述的结合于玻璃板(30)的绝缘层(18)的一部分。
如图3(a)所示，金属电极(20)的图案与DNA杂交芯片(100)的相似，并且将电极对(20a，20b)以预定间隔以指样形状交替阵列。
电极(20)具有约8.6mm的直径，但更好地具有尽可能小的直径以制造电极阵列型PCR反应芯片(见图7)。每个电极(20a，20b)的宽度(t)约为20μm，电极之间间隔(d)约为20μm。
2.玻璃板的制备和PCR反应芯片的构造
如图5B所示，Cr/Au
Figure BPA00001231137000173
金属膜(32)通过使用化学气相沉积(CVD)、真空蒸发或溅射等沉积于用于半导体工艺的常规玻璃板(派热克斯产品)(30)的上和下表面(见图5B的步骤(a))。通过使用通常的光刻法，形成于上部分的薄金属膜(32)被图案化和湿法蚀刻以形成保护层(32)，其是保护随后加工的玻璃板部分的一部分。然后，湿法蚀刻玻璃板的未被保护层(32)保护的其他部分以形成PCR反应芯片的反应腔室空间(见图5B的步骤(c))。移除所有形成于上和下表面的薄金属膜，并且以蓝胶带(blue tape)(如果适用于图案化，任何蓝胶带都是可用的)图案形成(34)处理玻璃板的底部表面，以形成PCR反应芯片的入口/出口(36a，36b)(见图5B的步骤(d))。之后，通过进行本领域已知的喷砂工艺在玻璃板(30)的厚度方向制造包括入口/出口开口等的穿口(见图5B的步骤(e))。
此前制造的其上形成金属电极(20)的硅板(10)通过使用如图5C所示的阳极键合结合于玻璃板(30)。所产生的硅板(10)和玻璃板(30)被切割以获得最终的PCR反应芯片(200)。
阳极键合是结合硅板和玻璃板的方法，其中使存在于玻璃板中的阳离子(例如，Na+离子)向相对于硅板和玻璃板接地位置的相反方向移动，以在硅板和玻璃板的表面形成氢键和以通过应用热和高电场结合两板。
在两板互相结合的PCR反应芯片(200)中，多个金属感应电极(20)形成于硅板(10)上(见图5和图6A)，并且靶DNA模板的引物(22)固定于所述电极(见图6A)。另外，该硅板(10)以预定距离结合于玻璃板(30)以形成反应腔室空间(46)(见图5和图6A)。
反应腔室空间(46)是在填充去离子水参考溶液后测量电极之间阻抗值的空间。并且，反应腔室(46)空间是容纳靶样品和PCR反应溶液以进行PCR反应的空间，其中存在于靶样品中的靶DNA模板互补地结合于固定于硅板(10)的金属电极(20)上的引物(22)以进行PCR反应。
因此，检测根据PCR反应的金属电极(20)之间的阻抗值的变化以监测靶样品中是否存在靶DNA模板。
玻璃板(30)起保护反应腔室(46)空间免于外部环境的作用。另外，玻璃板(30)被穿孔以具有在厚度方向的流体入口(36a)，并且还被穿孔以在流体入口(36a)的相反侧具有在厚度方向的流体出口(36b)(见图5和图6A)。如图5和图6A所示，入口(36a)与反应腔室空间(46)，和出口(36b)与反应腔室空间(46)是互相连通的，以允许流体流动通过反应腔室(46)。通过入口(36a)，引入去离子水参考溶液、PCR反应溶液和靶样品至反应腔室(46)，并且通过出口(36b)将去离子水参考溶液、PCR反应溶液和靶样品从反应腔室(46)排出。
3.基于PDMS的流体控制板的构造
为控制PCR反应芯片(200)中的流体流动，制备基于PDMS的流体控制板(40)并附加于此前制造的PCR反应芯片(200)的玻璃板(30)上。
本发明中使用的PCR反应芯片(200)的流体控制板(40)优选地以透明的聚合物制造，以允许芯片(200)的内部是可见的。特别地，更优选地以PDMS(聚二甲硅氧烷)制造。有利地，PDMS比硅树脂便宜和当结合于其他表面时容易操作、灵活和抗水。另外，由于PDMS的生物相容性质，其不引发对生物分子的负面效应。然而，其优选地以反应性包被材料沉积或以接枝共聚合处理。如果没有包被，可能会发生诸如蛋白质的细胞疏水组分的非特异吸附。例如，当流体控制板(40)中的注入开口(42)、管道(44a，44b)和排出开口(48)以牛血清白蛋白(BSA)包被时，所述疏水组分的非特异吸附可以被最小化。
首先，通过使用CAD(计算机辅助设计)程序设计流体控制板(40)。然后，打印作为结果的设计于光掩模上并移除杂质。负型光刻胶SU-8旋转涂覆于硅晶圆。使用具有注入开口(42)、阀结构(52)、微管道(44a，44b)和排出开口(48)图案的光掩模通过曝光和显影制造用于流体控制板(40)的模板。并且然后，流体相的PDMS被倒入SU-8模板，通过加热固化并且从模板分离。作为结果的PDMS流体控制板(40)根据PCR反应芯片(200)的尺寸切割并且在注入开口(42)和排出开口(48)等形成的位置使用穿孔机以所需尺寸穿孔。之后，如上制造的流体控制板(40)以等离子体氧化并且然后，附接于PCR反应芯片(200)的玻璃板(30)上的相应位置。
图6A说明最终制造的附接有流体控制板(40)的PCR反应芯片(200)的纵截面图。
当流体控制板(40)附着于玻璃板(30)上时，形成引导将流体引入至入口(36a)的入口微管道(44a)，和引导将流体从出口(36b)排出的出口微管道(44b)。通过穿入流体控制板(40)而在流体控制板上形成引入去离子水参考溶液、PCR反应溶液和靶样品的注入开口(42)。由于所述注入开口(42)与入口微管道(44a)连通，其可以将流体引入至反应腔室(46)。另外，通过穿入流体控制板(40)而在流体控制板中形成将去离子水参考溶液、PCR反应溶液和靶样品排出的排出开口(48)。由于所述排出开口(48)与出口微管道(44b)连通，其可以将流体从反应腔室(46)排出。
此外，在其以厚度方向穿入流体控制板(40)后纵向地延伸的、介于注入开口(42)和反应腔室(46)之间、或介于排出开口(48)和反应腔室(46)之间的通道(52)形成于流体控制板(40)中(见图6(A)和图6(B))。通道(52)起入口微管道(44a)和/或出口微管道(44b)的阀的作用。硅树脂油(50)储存于延伸的通道(52)。如图6C所述，如果氮气(N2)被注入至储存硅树脂油(50)的通道(52)，储存于通道(52)的油(50)膨胀并由于油膨胀而阻挡管道(44a，44b)。因此，流体控制板(40)可以阻挡和控制流体从注入开口(42)流入反应腔室(46)，和流体从反应腔室(46)流出至排出开口(48)。
实施例3-2：寡核苷酸引物在电极上的固定化
首先，在实施例3-1中制造的PCR反应芯片(200)的电极(20)通过使用Pirahna溶液(H2SO4和H2O270∶30的混合物)洗涤30分钟以完全移除电极(20)上的杂质。
之后，上游引物的一个末端(5’或3’)和下游引物的一个末端(5’或3’)固定于电极(20)上。上游引物和下游引物两者都可以固定于电极(20)上，或者，任一引物的一个末端可以固定于电极上并且另一引物的一个末端可以混合于PCR反应溶液，以进行PCR反应。为了固定，制备在引物寡核苷酸的5’末端，碳链(-CH2-)附有硫醇基的上游引物5’-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3’和下游引物5’-SH-(CH2)24-AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G-3’并且通过使用SAM(自组装法)固定于金属探针(20)表面。详细地，10pmol/μl的SH-ssDNA上游和/或下游引物在TE缓冲液中反应18小时。结果，引物的-SH基与金属表面反应以将引物ssDNA(22)固定于金属电极(20)的表面。本实施例中进行的在金属表面上的固定工艺，与在实施例1-2中的基本相同，如图4所示。
实施例4：使用PCR反应芯片分析PCR反应
使用如实施例3-2所制造的固定有引物的PCR反应芯片(200)(见图6)，以检验靶样品中是否发现靶DNA模板和是否进行PCR反应。
首先，将具有高介电常数的作为参考溶液的去离子水引入至PCR反应芯片(200)的反应腔室(46)，并且然后，在室温下通过使用交流电源测量电极(20)之间阻抗值。测量阻抗值时，使用的交流电源幅度为100mV，并且其频率范围为1-32MHz。
之后，从PCR反应芯片(200)移除参考溶液。然后，将Promega PCR核心系统II PCR试剂盒(Promega PCR Core System II PCR Kit)(可商购的PCR反应溶液以容易地进行PCR；Promega Co.Ltd.，USA)和DNA模板引入至PCR反应芯片(200)的反应腔室(46)。PCR反应如Promega所推荐的重复25-35循环，而在每次PCR循环期间调整PCR反应的时间和温度。
再次，从PCR反应芯片(200)完全地移除PCR反应溶液并将去离子水引入至反应腔室。然后，通过使用交流电源在室温下测量电极(20)之间阻抗值。测量阻抗值时，使用的交流电源幅度为100mV，并且其频率范围为1-32MHz。
结果，图9示出PCR反应之前和之后测量的阻抗值。图9中，对比图1的常规方法情况，当该实验通过使用包含靶DNA模板的阳性靶样品进行时，观察到PCR反应之前测量的阻抗值和PCR反应之后测量的阻抗值具有两条不同的曲线。如图9所示，确认的是，在PCR反应期间，当靶DNA模板存在于反应溶液中时，阻抗值应该减少。因此，确认的是，阻抗值会随着由于PCR反应期间ss-DNA PCR反应成ds-DNA的电导值增加而减少。
本发明的方法中，在以固定于感应电极上的PCR引物扩增靶DNA模板之后电容值(Cd)的变化应该反映电容值总变化(CT)，这是由于其不被缓冲溶液的电容值(Ct)忽略。因此，本发明的方法可以允许电学地监测以检测靶DNA模板的PCR反应和存在，这是由于如图9所示，PCR反应之前和之后观察到两条阻抗值变化曲线。
另一方面，如图9所示，观察到从不具有靶DNA模板的阴性靶样品测量的阻抗值应该比阳性例的阻抗值小。
本领域技术人员会意识到，公开于前述说明书的构思和具体实施方式可以容易地被作为修饰或设计其他实施方式的基础而利用，以实现与本发明相同的目的。
本领域技术人员也会意识到，这类等同实施方式不脱离如所附权利要求书所阐释的本发明的精神和范围。

Claims (9)

1.电学地检测生物分子的方法，其包括：
(a)提供电学检测装置，其包括接收靶样品的反应腔室，和位于所述反应腔室中用于检测所述靶样品内生物分子的多个感应电极；
(b)第一次向所述反应腔室引入具有高介电常数的参考流体，然后第一次测量所述感应电极之间的阻抗值或电容值；
(c)从步骤(b)的所述反应腔室移除所述具有高介电常数的参考流体，并向所述反应腔室引入反应溶液和所述靶样品；
(d)在步骤(c)中准备的所述反应腔室中使所述靶样品在所述反应溶液下反应；
(e)在步骤(d)之后，从所述反应腔室中移除所述反应溶液；
(f)第二次向步骤(a)中的所述反应腔室引入所述具有高介电常数的参考流体，然后第二次测量所述感应电极之间的阻抗值或电容值；和
(g)比较步骤(b)中测量的阻抗值或电容值和步骤(f)中测量的阻抗值或电容值。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述阻抗值或所述电容值通过使用交流电(AC)电源的测量装置分别地根据步骤(b)和步骤(f)中的频率而测量。
3.如权利要求2所述的方法，其中测量的所述阻抗值或所述电容值以相对于所述频率值的曲线示出，在获自步骤(b)的所述阻抗值或所述电容值曲线与获自步骤(f)的所述阻抗值或所述电容值曲线有区别的情况下，其确定所述靶样品中感应电极上生物分子的存在或生物分子的反应。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述具有高介电常数的参考流体具有至少4的介电常数。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述具有高介电常数的参考流体是蒸馏水或去离子水。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述感应电极由交叉指形电极形成。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述感应电极之间的每个间隔是1-4μm。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述感应电极结合有与所述生物分子相互作用的受体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述受体是探针或引物。
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