CN1681938A - 基于阻抗的检测装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测电极表面的细胞和/或分子的装置。该装置通过测量由细胞和/或分子导致的阻抗的改变来检测细胞和/或分子。装置的一个公开的实施方案包括一个带有沿着长轴的两个相对末端的基片。多个电极阵列(100)被定位于基片上。每个电极阵列包括至少两个电极(110，120)，并且在电极阵列中，每个电极通过绝缘材料区域与至少一个相邻的电极分开。电极在它的最宽点的宽度为绝缘材料区域宽度的约1.5倍到10倍。装置也包括导电迹线(125。130)，它们基本沿长轴延伸到基片的两个相对末端中的一个，并且与其它导电迹线(125，130)是互不交错的。每条迹线与至少一个电极阵列电连通。

Description

基于阻抗的检测装置和方法
[0001]本专利申请以参考文献的方式将以下专利申请整合到本申请文本中，包括美国临时申请号60/397,749(于2002年7月20号递交)，美国临时申请号60/435,400(于2002年12月20号递交)，美国临时申请号60/469,572(于2003年5月9号递交)；本专利申请还以参考文献的方式将以下PCT专利申请整合到本申请文本中，包括PCT申请号PCT/US03/22537，题目是“Impedance Based Apparatuses andMethods for Analyzing Cells and Particles”，专利代理人编号为ACEA-0203。
发明背景
技术领域
[0002]本发明一般涉及到用于基于细胞与分子的检测的传感器领域。本发明尤其是提供了一种传感器装置，用以检测电极间的阻抗变化，通过阻抗的变化，可以确定细胞或分子在样品溶液中的存在，行为，数量及变化情况。这个传感器装置可以监测细胞或颗粒的贴附，生长，迁移；也可以确定细胞贴附，生长与迁移的调节因子。这个传感器装置也可以用于分子的分析与检测。
背景技术
[0003]随着可用于往微滴定孔板的孔中加样的自动化仪器的出现，人们做出了一系列的努力以开发特定的微滴定孔板。这种板包括所有必需的部件，可实现对板中的细胞或小分子进行一步检测。例如，在Ehret，et，al.，Biosensors and bioelectronics，12：29-41(1997)中，作者描述了一种以电阻抗为基础的装置来测量在被分析液体样品中的细胞。靶细胞的存在可通过由于细胞贴附在具有均匀大小及均匀间隔的电极上面造成的电极间的阻抗的变化来检测。美国专利号6,376,233，描述了如何以微量滴定板的形式制造这种装置与其它传感器的组合，该形式使用半导体材料做为“板”以提供测量电极用的基片。电导线可从专利6,376,233所述的装置上的电极从不同平面或不同方向上延伸出来并可穿过半导体(基片)。
[0004]其他的一些研究人员探索了利用电子学的方法来检测与分析生物分子与细胞的技术。例如，美国专利号3,890,201描述了一种多腔室组件-盖组合装置，其中腔室底部的导电条被用于检测样品的阻抗，样品是其中生长了需氧微生物的营养培养基。美国专利4,072,578描述了一种与绝缘基片连接的多腔室组件，所述基片内的电导线被完全包埋，电导线的平的末端部分成对出现于腔室中，它们彼此处于有间隔的关系，以形成电极，用于培养微生物样品同时监测生长培养基的阻抗。
[0005]美国专利号5,187,096描述了一种具有多电极阵列的细胞基片电阻传感器。每个检测细胞基片阻抗的阻抗传感器内的每对电极都包含处于两个不同层面的一个小电极(测量电极)和一个大电极(参考电极)。电极大小的不同，确保检测到的相对于没有细胞存在于电极上时阻抗的改变与附着或生长在测量电极上的细胞数量及大小直接相关：通常来说20-50个细胞，甚至是单个细胞附着或生长在测量电极上。这种细胞传感器的应用包括监测生物反应器内的状况，细胞培养物状态，检测化合物的细胞毒性，细胞生物学的研究以检测细胞动力学，代谢活动，细胞贴附与铺展等。然而，这种两层结构的阻抗传感器有些复杂，包括一层检测电极，和另一层的参考电极。选择的小电极面积限制了该传感器内最多可监测50个细胞。
[0006]使用大电极(参考电极)与小电极(测量电极或活性电极)来检测细胞电极阻抗在许多出版物上得到了报道，包括，Giaever I.和Keese C.R.，“Monitoring fibroblast behavior in tissue culturewith an applied electric field”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1984，vol.81，pp3761-3764；Giaever I.和Keese C.R.，“Micromotion of mammalian cells measured electrically”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，Tiruppathi C.et al，“Electrical methodfor detection of endothelial cell shape change in real time：assessment of endothelial barrier function”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1992，vol.89，pp7919-7923；Lo C.M.et al.，“Monitoring motion of confluent cells in tissue culture”，Experimental cell research，1993，vol.204，pp102-109；Lo C.M.et al，“Impedance analysis of MDCK cells measured by electriccell-substrate impedance sensing”，Biophys.J.，1995，vol.69，pp.2800-2807；Lo C.M.et al，“pH change in pulsed CO2incubators cause periodic changes in cell morphology”，Experimental cell research，1994，vol.213，pp.391-397；MitraP.et al.，“Electric measurements can be used to monitor theattachment and spreading of cells in tissue culture”，BioTechniques，1991，vol.11，pp.504-510；Kowolenko M.et al，“Measurement of macrophage adherence and spreading with weakelectric fields”，J.Immunological Methods，(1990)vol.127，pp.71-77；Luong J.H.et al，“Monitoring motility，spreading，and mortality of adherent insect cells using an impedancesensor”，Anal.Chem.；2001；vol：73，pp1844-1848.例如：在细胞电极阻抗检测的第一篇文章中(Giaever I.and Keese C.R.，“Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with anapplied electric field”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1984，vol.81，pp3761-3764)，大电极具有约2cm2的面积，小电极具有3×10-4cm2的面积。
[0007]PCT申请号US01/46295(WO 02/42766)和美国专利申请公开号2002/0086280描述了一种类似的适于监测细胞运动的系统。一个孔中含有至少有一个传感电极(测量电极)和一个反电极，该孔中加入生物相容的具有化学梯度稳定培养基，并加入迁移细胞。到达传感电极上的迁移细胞可以通过阻抗的改变被检测，该阻抗的改变产生于细胞和传感电极的接触，传感电极小于反电极。该系统可用于测定被测化合物对细胞迁移的刺激效应或抑制效应，通过比较被测化合物存在时迁移细胞到达传感电极的时间(通过检测电阻的改变)与无被测化合物时迁移细胞到达传感电极的时间来检测。
【0008】美国专利号5,981,268和6,051,422揭示了一种类似的检测单个细胞的混合传感器。在这些专利中，一个阵列测量电极共享一个参考电极。为了检测单个细胞的反应，检测电极的直径比细胞的直径小。传感器可以被用来检测和监测由于细胞对周围环境改变及化学药物刺激的反应造成的细胞的改变。然而，该阻抗传感器仅可以监测单个细胞的反应。而且，这种装置的敏感度直接依赖于细胞相对电极的位置。
【0009】美国专利申请号2002/0150886和2002/0076690揭示了使用固定在交错电极上的抗体检测病原体的方法。这种交错电极存在于一个通过流体样品的流体通道的表面，当病原体结合在抗体包被的电极上时，可以通过电极间阻抗的增加来检测。
【0010】以下文章中报道了使用在硅或蓝宝石或玻璃基片上构造的交错电极作为阻抗传感器来监测细胞贴附：Ehret et al.(Biosensors and Bioelectronics 12：29-41(1996)；Med.Biol.Eng.Computer.36：365-370(1998))，Wolf et al.(Biosensorsand Bioelectronics 13：501-509(1998))，和Henning et al.Anticancer Drugs 12：21-32(2001)).这些方法使用昂贵的基片如硅和蓝宝石来构成电极，且由于电极的结构，(电极宽度与间隙都约为50微米)，远没有达到最佳检测效率，平均只有约50％的细胞可以产生阻抗信号。
【0011】美国专利号6,280,586揭示了一种装置，可用于监测分析物是否存在一种组分，该装置具有至少一个参考传感器和至少一个检测传感器，并且每个传感器都具有测量输出可连接到一个评估仪器上。具有电检测结构的参考传感器交错式电容和参考电极都位于共同的基片上。电传感器的检测结构与作为生物传感器的至少一种功能特殊的植物或动物受体细胞相连，在这里，每个电传感器通过测量受体细胞形态学或生理学特性的改变来检测分析物。一种结构化的生物相容的多微孔夹层处于受体细胞与测量结构间。受体至少部分贴附到多微孔夹层上。参考传感器的测量结构不含有特殊功能的受体细胞的连接。检测到性质的变化预示了分析物中化合物的存在。
【0012】美国专利号5,810,725揭示了一种平面电极阵列，用于刺激和记录神经细胞，在包含1.4％NaCl的电极溶液中，单个的电极阻抗在1kHz的频率时为1ohm到100k-ohm。美国专利号6,132,683揭示了一种电极阵列，包含多个测量电极与参考电极，用于检测和监测神经细胞样品的电位，在其中，参考电极的电阻要小于测量电极的电阻。然而，这些电极不能够最佳地定量测量细胞与微电极界面的阻抗。
【0013】在另一类的应用中，直流(DC)电场被用于电子测量颗粒大小，特别用于生物细胞的测量(使用众所周知的“coulter”计数原则)。在这里，直流电流被加到一个微米或倍数微米尺寸的孔上。当细胞或其他颗粒在压力的作用下通过该孔时，电压的变化得到测量。尽管，“coulter”计数原理非常成功，这种装置被它的敏感性以及计数和测量生物细胞大小的动态范围所局限。参见美国专利号2,656,508和3,259842，和Larsen et al.，“Somatic Cell Counting withSilicon Apertures”，Micro Tatal Analysis Systems，2000，103-106，edited by A.Van den Berg et al.，2000 Kluwer AcademicPublishers.
【0014】美国专利号6,169,394揭示了一种用于测量微通道中的待检测样品的基于电导率或阻抗的微电子检测器。该检测器包括由一对位于微通道相反侧壁上的电极所构成在微通道内位于电极之间并与之相连的检测区域。与此类似的，Song at al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 97(20)：10687-90(2000)证明了可使用这种微电极来检测细胞的DNA含量，其方法是测量当细胞从位于微流体通道两侧壁上相对的电极通过时所产生的电容的变化。
【0015】美国专利号5,643,742，6,235,520和6,472,144揭示了一种用于电监测与记录细胞培养，及高通量筛选的系统。这个系统由许多孔组成，细胞接种于孔内，并且孔中放置有一对电极。这个系统可以测量每个孔的电导，将低电压交流信号加到孔内的一对电极上，并且监测跨电极的电导，以监测检测每个孔中细胞的生长水平及代谢活力。
[0016]还有其他不同的利用阻抗的测量来检验样品中的分子的方法。例如，Ong，et al.，Sensors，2：219-232(2000)，利用一个电路中阻抗的改变来探测食物中是否存在细菌。在德国的公开专利申请DE 39 15 290和PCT申请WO 96/01836中揭示了利用基片上所带电极来检测小分子，尤其是多核苷酸的装置。然而，这些装置只限于一些特殊的应用，不能适用于普遍的实验室应用。
[0017]其他的生物电传感器依赖于电容或其他信号的改变来获得检测结果。例如，美国专利号6,232,062揭示了一种用来测定核酸样品中是否存在目标序列的方法。这种方法包括施加最初的一个输入信号到杂交复合体，该信号包括交流电及非零的直流电所组成。上述的杂交复合体包含至少一个目标序列和作为探针的单链核酸；该杂交复合体通过共价结合方式与包括一个电极的第一个电子转移实体及第二个电子转移实体结合。通过检测上述杂交复合体的存在与否来检测上述的目标序列是否存在。第二个电子转移实体的例子包括过度金属配合物，有机电子转移实体，金属茂。
[0018]另一个例子，Patolsky et al，Nature Biotechnology，19，253-257，(2001)，描述了一种检测DNA中单碱基突变的方法。利用电化学的氧化还原标记，他们检测一个电极的Faradic阻抗频谱，在这个电极上组装了引物巯基化的寡核苷酸分子并且目标DNA分子的杂交也发生在该电极上。这个技术对DNA检测样品的敏感度达到了10-14mol/ml。
[0019]生物电传感器也被应用于检测细胞迁移。例如，由Cramer(美国专利4,686,190)发明的一种装置，可以用传感器检测通过膜的细胞。然而，Gramer的装置的有效性因为一些设计的局限性而被局限，包括：在一种实施方案中，传感器活性表面被膜覆盖了。
[0020]本发明的目的是为了扩大电场阻抗测量和其他的电子方法的使用和应用，以便测量和分析细胞和分子，非细胞的颗粒，以及细胞的生物的，生理学的，病理学的状态，并且提供用于这些分析的装置，仪器，和系统。
发明内容
[0021]一方面，本发明涉及一种用于检测靶小分子，例如多核苷酸和多肽的装置。这个装置包括绝缘的基片，在基片上放置有多个传感器，每个传感器包括排列好的电极。暴露的电极表面带有细胞可以粘附并且/或小分子也可结合的捕捉分子。
[0022]这种粘附或结合导致了电极间阻抗的变化，这样的变化产生了一个信号，说明粘附或结合到电极上，阻抗的进一步的变化是粘附的细胞群或结合的分子发生改变所导致的，例如细胞生长或结合分子组成的改变(如：通过杂交)。
[0023]为了测量与这些事件相关的阻抗改变，本发明将提供装置的使用方法。装置的一个实施方案是利用一个类似微量滴定板的设计，它很适应于自动化的检测仪器。这个实施方案的装置，是绝缘的基片板形式，在这个基片板上放有一个或更多的适应放置细胞或小分子样品的容器，这些容器在优选的情况下，与基片板呈垂直关系。在基片板的一个或更多的层内放有电导线管，用来将活性传感器连到阻抗信号处理仪上。这些导线管的设计定位保证了最小的背景噪声和导线管与导线管间的干扰电位。
[0024]一方面，本发明提供了一种装置，通过测量由细胞和/或分子导致的阻抗变化来检测电极表面的细胞和/或分子。这个装置包括一种基片，它有一个顺着纵轴方向的两个相对的末端，在基片上排列有多个电极阵列。每个电极阵列包括至少两个电极，在电极阵列上，每个电极与至少一个相临近的电极间由绝缘材料相间隔。电极在最宽点的宽度为绝缘材料区域宽度的1.5倍到10倍。装置也包括基本上沿着纵轴方向延伸的导电迹线(electrically conductive trace)，它们延伸至基片的两个相对的末端中的一个，且不与另一个导电迹线相交错。每个迹线都与至少一个电极阵列电连通。
[0025]所提及的“纵轴”是指沿着基片表面的一条轴。例如，纵轴可以与基片两个最长维度(如长和宽)的中心线相平行。同样的，“基本上沿着纵轴方向”是指基本沿着纵轴的方向。
[0026]基片可能包括玻璃，蓝宝石，在硅上的二氧化硅，或一种聚合物。基片可以构造为一块板。在一个优选的实施方案中，装置包括多个容器，每个容器都被垂直放置在绝缘的基片上并形成一个不漏液的容器，该容器与基片上至少一个电极阵列相连。
[0027]多至一半的电迹线可以延伸到基片的一个末端上，同时多至另一半的电迹线延伸到基片的另一末端。
[0028]这个装置也可以包括处在相邻的一对电极阵列之间的电迹线。
[0029]每个电极阵列的电极可以有相同的宽度。在优选的实施方案中，每个电极在其最宽点的宽度为80微米。另一个更优选的实施方案中相邻电极间的间隔在最宽点为20微米。
[0030]每个电极阵列可以包括许多均匀间隔的电极对。每多个电极可以交错的方式组构在一起。在一个实施方案中，至少一个总线将包围每个电极阵列多至一半的多个交错电极。
[0031]或者，每多个电极可以以同心的，正弦形的或齿形的方式组构。在一个实施方案中，至少一个总线将包围每个电极阵列中多至一半的多个以同心方式组构的电极。
[0032]设置于距离多个电极最近处的电极总线由绝缘基片区域与多个电极分开。总线可以包括一对电极，其中的每一个围绕电极阵列一半直径延伸。在一个实施方案中，装置也包括多个容器，其中每个容器都被垂直安置在绝缘基片上，并围绕总线形成不漏液的容器。在一个实施方案中，容器以蜂巢形式安置在基片上。
[0033]在一优选的实施方案中，装置包括一个阻抗分析仪，它与全部或多个导电迹线的处于基片至少一个末端上的电导线末端电连接。阻抗在一个从约1Hz到约1MHz的频率范围内被检测。
[0034]在一末选的实施方案中，装置包括一种或多种固定在每个电极阵列中至少两个电极的表面上的捕捉试剂。捕捉试剂可以结合靶细胞和/或分子。
[0035]在一个实施方案中，装置包括在导电迹线与阻抗分析仪之间建立电连通的连接工具。在一优选的实施方案中，这种连接工具包括一个适于稳固啮合基片并与导电迹线形成电接触的机械夹子。
附图说明
[0036]图1A是一个装置100的图示，其中两个具有相同或相似面积的电极结构位于基片上。第一个电极结构具有电极部件110a，110b，110c；第二个电极结构具有电极部件120a，120b，120c和120d.电极结构内的电极部件通过弧形的连接电极总线125彼此相连。与电极部件一样，连接总线(125)也是由导电材料制作的(如金薄膜，铂薄膜，金薄膜覆盖于铬或钛薄膜之上)。这些导电连接通路或连接总线(125)可具有一个绝缘涂层。电极部件110a-110c和120a-120d包括电极线，该线上有连接的圈。电极部件和电极部件间隙的总面积可能符合，或者稍大于，或稍小于孔(如：园柱形孔，园锥形孔，立方形孔)底，可以使用例如：24，96，或384孔板。孔的全部表面可被电极覆盖，以确保在孔底部表面上的分子相互作用导致阻抗的变化。这样的排列具有一个优点，即在孔底表面发生的不均匀的分子相互作用，只会造成电极结构110和120间测量的阻抗的小差异。150是可与外部阻抗测量电路相连的连接垫。130是连接电极结构110和120与连接垫的电连接迹线。所述连接迹线可在电极平面上以任意方向延伸。图1B是装置200的图示，其基片上有两个面积相似的电极结构。电极结构210和220包含多个相互连接的电极部件。电极部件(210a-210c，220a-220d)是矩形直线，共同组成一个交错式的电极结构单元。类似于图1A，每个电极结构内的电极部件(210a-210c，220a-220d)通过弧形的导电通路或电极总线(225)彼此相连。连接垫250通过电连接迹线230连接到电极结构上。图1C是一个装置300的图示，其基片上有两个面积相似的电极结构。电极结构310和320包含多个相互连接的电极部件(310a-310f，320a-320f)。电极部件(310a-310f，320a-320d)是矩形线，共同组成一个交错的电极结构单元，与图1A和1B不同，具有电极部件310a-310c和320a-320c的电极结构连接到连接垫350上。
[0037]图2图示了监测阻抗变化的系统，阻抗变化是由于靶分子被捕捉到或结合到电极表面所造成的。图示中的“Y”符号表示了电极表面上的捕捉的分子。图示中的“△”符号表示了可以结合到捕捉分子上的靶分子。左图显示了结合靶分子前的背景阻抗(Z0)，右图显示了捕捉分子结合靶分子之后的测量阻抗(Z分子结合)。用阻抗分析仪或阻抗检测电路监测阻抗。本领域技术人员对阻抗分析仪都很熟悉。
[0038]图3图示了一个用于分子检测的96孔电极板，在相应于孔底面装配有的基片上装配或插入了检测微电极阵列。为了简明清晰，图中没有显示孔壁的结构。位于图3左面的电极线450是微电极阵列与外部阻抗检测电路间的连接垫。每个孔(或至少一些孔)都有两个电极结构，组成一个电极结构单元，这样每个孔使用两个连接垫，孔中包含用于装置中的电极结构。为了说明，图上显示了位于左上的两孔460和470的电极结构的电连接。一种构成这类96孔电极板的方法是将带有电极结构的基片结合到带有管阵列的板上，例如无底的微量滴定板(如微量滴定板)，以便基片形成孔或流体容器的底部，可用于监测分子的相互作用。
[0039]图4A示意了一种测量分子结合阻抗的装置，该阻抗在单一电极与其邻近电极之间。如图所示，圆盘状电极410有6个相邻的圆盘状电极520。可以测量圆盘状的电极410与所有电极420(它们在装置外相互连接)之间的阻抗。图4B图示了具有多个圆盘状电极的装置。
[0040]图5示意了具有两个不同面积的电极510和520的装置。
[0041]图6示意了具有9个电极结构单元的分子检测板，每个电极结构单元都有两个电极。一个阻抗测量分析仪可在9个单元之间转换进行阻抗测量。
[0042]图7示意了电极几何形状，在本发明中这些电极可用于检测或分析分子。7(A)，交错的，平行线电极阵列，电极宽度可以大于，等于或小于电极间隙；7(B)齿形，错位的电极结构；7(C)在电极线上加入圆盘电极的电极结构；7(D)齿形，直电极结构；7(E)正弦形电极结构；7(F)同心电极结构。电极的特征尺寸可以小至小于10微米，或者大至大于几百微米。总的活性电极面积可以有不同的形状例如规则的形状如矩形(图7(A)，7(B)，7(E))，或圆形(图7(C)，7(D))，或其它规则或不规则的形状。优选的是，电极区域总面积(所述面积，包括电极和电极间的间隙)覆盖了上室的几乎全部底面。电极结构经连接垫连接到阻抗检测电路(如阻抗分析仪)上(如图7(A)和7(B)所示)。连接垫可直接连接到电极部件上(图7(A)，7(C)和7(E))或通过附加的电连接结构连接到电极部件上(图7(B)和7(D))。在图7(A)，(C)和(E)中，连接垫也是连接到电极结构内的电极部件的导电连接迹线。
[0043]图8示意了分子探测中的信号放大，它是通过测量靶小分子参与的，由酶介导的催化反应的产物而实现的。如图所示，测量到的阻抗变化可说明在传感器表面有来自酶介导的反应的催化产物。在一种示范方法中，酶介导的反应发生在电极表面上，催化产物从溶液沉淀在传感器的表面上。对电阻的测量可以监测电极上催化反应产物的存在及数量。
[0044]图9示意说明了用本发明的装置动态监测催化反应产物沉淀。装置包括一个玻璃基片(1cm2见方)，上面装配一个微电极结构单元。金(约0.2微米)覆盖铬(约0.03微米)的薄膜镀在玻璃基片上。定制并装配具有“圆在线上”电极几何形状的微电极结构单元。为了使用装置，一个中空的圆柱形塑料孔被连接到微电极装置上，因此当样品加入到塑料孔中后，电极结构单元被暴露于实验液体孔中。微电极表面是用生物素化牛血清血蛋白(BSA)事先包被，再用含3％奶粉的溶液在室温下封闭30分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)简单清洗后，加入链霉亲和素碱性磷酸酶(AP，10ng/ml)室温培养30分钟，再用PBS充分清洗。碱性磷酸酶底物BCIP/NBT(来自Sigma，BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸；NBT：四锉氮蓝)再加入到溶液中，塑料孔中电极结构间的阻抗可用电阻分析仪检测。AP介导的反应(AP的底物BCIP/NBT被转化到沉淀物中)在电极结构单元表面产生沉淀(见图8)。这种沉淀导致电极结构单元之间的阻抗增加。随着时间的推移，越来越多的沉淀在电极表面产生，检测到越来越高的阻抗。通过测量电极结构单元间的时间依赖性阻抗，可以监测电极表面的时间依赖性AP活性。
[0045]图10显示使用本发明的装置通过阻抗分析来定量检测纤连蛋白。装置类似于在图9中使用的那种装置。装置包括一个玻璃基片(1cm2见方)，上面装配有一个微电极结构单元。金(约0.2微米)覆盖铬(约0.03微米)的薄膜镀在玻璃基片上。定制并装配具有“圆在线上”电极几何形状的微电极结构单元。为了使用装置，一个中空的圆柱形塑料孔被连接到微电极装置上。因此当样品加入到塑料孔中后，电极结构单元被暴露于实验液体样品中。不同数量的纤连蛋白(5ng，500pg和50pg)被加入到塑料孔中，并在室温下培养2小时。这个培养的步骤导致装置的表面包被上了一层纤连蛋白分子。装置的表面再用含3％奶粉的溶液在室温下封闭1小时。用PBS简单清洗后，鼠抗纤连蛋白(1∶200稀释)被加入到装置中4℃下培养过夜。过夜的培养导致装置表面的纤连蛋白与鼠抗纤连蛋白分子结合。清洗过后，碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠IgG被加入，在室温下培养1小时，然后充分清洗。这个1小时的培养的导致AP标记的山羊抗小鼠IgG与装置表面的小鼠抗纤连蛋白相结合。碱性磷酸酶的底物BCIP/NBT(来自Sigma，BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸；NBT：四锉氮蓝)再被加入到溶液中，塑料孔中电极结构间的阻抗可用电阻分析仪来测量。AP介导的反应(AP的底物BCIP/NBT已被转化到沉淀中)在电极结构单元表面产生沉淀(见图8)。这种沉淀导致电极结构单元之间阻抗的增加。随着时间的推移，越来越多的沉淀在电极表面产生，可检测到越来越高的阻抗。在图中显示了加入底物BCIP/NBT30分钟后阻抗的变化。如图所示这个装置可以检测到装置表面包被的少至50皮克(pg)的纤连蛋白。
[0046]图11图示了一种用于分子检测的微电极条带(或电极条带)。这种基片条带上装配有微电极结构单元。基片材料包括但不限于，玻璃，塑料薄片或薄膜，陶瓷，聚合物薄膜，半导体上的绝缘体(如硅上的二氧化硅)，玻璃纤维(如用于印刷电路板的那些)或其他绝缘材料。多种多样的微装配或微机械制造方法可以被用于装配或生产基片上的电极结构单元。在电极阵列的表面上，特殊的分子被锚定或结合或吸附。锚定的分子可以是核酸、肽、蛋白质和其他分子例如化学化合物。这些分子可以用不同的物理或化学方法被锚定，结合或吸附到表面。用于包被的物理方法包括但不局限于被动吸附、旋转涂布分子溶液并烘干、将分子溶液点样到指定的电极结构单元等。化学表面修饰的方法包括但不局限于分子自组装和表面的化学反应。这些物理或化学方法可用于修饰电极表面，使之锚定化学分子。一个单一的条带可以具有多个电极结构单元。不同电极结构的表面可以被修饰或包被不同的锚定分子，这样每个微电极结构单元表面都用独特类型的分子进行表面修饰。锚定、结合、吸附或以其它方法沉积到电极结构单元表面上的分子可被用作捕捉分子。样品溶液中的靶分子可以与捕捉分子结合或反应。靶分子结合到捕捉分子上后，电极结构单元内的微电极结构间的电阻将发生变化，这种变化可以被阻抗分析仪或阻抗检测电路检测或监测到。在一些情形下，靶分子被酶(例如，碱性磷酸酶，图11中的AP)标记。标记酶可被用于一个催化反应来使酶的底物(例如，图11中的BCIP)转变为产物。通过微电极结构间电阻可监测产物。例如，产物可以是不溶的，并且沉淀在微电极结构表面。在其他的一些情形下，靶分子被标记上某些特定的“标记”分子。这些标记分子可以参与特殊的化学反应，这种化学反应将产生产物，这些产物可以通过跨电极结构的阻抗检测被监测或测量到。例如，产物可以是不溶的，并且沉淀在电极结构表面。这类产物可以通过电阻测量而被检测或测量到，以提供关于样品溶液中靶分子定性或定量的信息。
[0047]图12(A)中显示了一种包含15X电极结构单元的装置，基片上的电极以2排，8列的形式排列。电极结构的细节未显示，只显示了每个电极结构单元的两个电连接(电极迹线)，用来连接电极结构到位于基片的两个末端的连接垫上。一个孔是“空”孔，指孔没有连接活性传感器。空孔被用作为对照孔。电极结构可以有不同的几何形状例如图1A，1B，1C，5，6，7A-7F所显示。
[0048]图12(B)中显示了一种在基片上排列有16X电极结构单元的装置。电极结构的细节不被显示，只显示了每个电极结构单元的两个电连接(电极迹线)，用来连接电极结构到位于基片的两个末端的连接垫。电极结构可以有不同的几何形状，如图1A，1B，1C，5，6，7A-7F所显示。
[0049]图12(C)中显示了一种在基片上排列有16X电极结构单元的装置。每个电极结构单元有一个交错式电极阵列。
[0050]图13(A)显示了一种小PCB板，它可与基片边缘的连接垫相连接，该基片上有如图12(A)所示的16X电极结构单元。PCB板具有16条矩形导线，它们以图12(A)中所示的连接垫的间距进行排列。
[0051]图13(B)显示了组装两个PCB板，使其与带有16X电极结构单元的基片相连接。
[0052]图13(C)显示了组装两个PCB板，使其与带有16x电极结构单元的基片相连接，其中具有针形的POGO-销钉从下面与导线相连。
[0053]图14(A)显示了一种柔性电路(flex circuit)，可用于连接到传感器板的边缘。柔性电路的两面具有多个矩形电导线，一面的电导线可以连接到如图12(A)所示的装置中的连接垫上，同时电导线可以连接到一个阻抗检测电路上。柔性电路的两面相应的电导线是相互连接的。
[0054]图14(B)显示了将柔性电路与如图12(A)所示的装置相连。柔性电路一面的电导线被连接到装置的连接垫上。
[0055]图14(C)显示了将两个柔性电路与带有16X电极结构单元的基片相连接，其中具有针形POGO-销钉从下面与导线相连。
[0056]图14(D)显示了一类用金属丝制作的金属夹子，可用来将基片上一面的连接垫连接到基片的另一面。
[0057]图14(E)显示了一个金属夹子的横截面图，该夹子将基片边缘的连接垫连接到基片的另一面(即：基片的底面)。在基片的同一面有电极结构和连接垫。与阻抗分析仪电连接的(直接连接或通过电开关)针形POGO-销钉连接结构可与基片底面的金属夹子相连，这样一来，阻抗分析仪就与基片上的电极结构相连接。
[0058]图14(F)显示了另一类型的用金属线制作的金属夹子，可用于将基片一面的连接垫连接到基片另一面。这类型的金属夹额外的弯曲可以使它们连接到(例如，通过焊接剂)一块印刷电路板边缘的连接垫上。
[0059]图14(G)显示了一个金属夹子的横鞭面图，该夹子将基片边缘的连接垫连接到基片的另一面(即：基片的底面)。这种金属夹子连接到一块印刷电路板上，并且，阻抗分析仪可与该印刷电路板直接或间接(例如，经由电开关)相连。
[0060]图15(A)显示了一种96-孔板的底面视图，底面组装有6个装置。每个装置都具有16X电极-结构单元，并在装置边缘有连接垫。
[0061]图15(B)显示了一种96-孔板的底面视图，底面组装有6个装置。四个中间的装置都有16X电极-结构单元，且在装置边缘有连接垫。两个侧面的装置有14X电极-结构单元，且装置边缘有连接垫。
[0062]图16显示了一种POGO-销钉容纳物结构，可以容纳多个POGO-销钉，且可与图15A和15B所示的96孔板相连。
[0063]图17显示了一种多层的电极结构。
[0064]图18显示了一种用于分子分析的基于电极条带的装置。
[0065]图19图解了基于阻抗检测的，监测分子结合反应的工作原理。
[0066]图19(A，C，E和G)是本发明的一个装置的横截面图，显示了两个电极。“Y”符号表示的捕捉分子，是被锚定，放置，导入，或结合到电极表面的。捕捉分子可以是任何分子，它可以与样品溶液中的被测量或被监测的靶分子相互作用。捕捉分子可以是抗体，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与靶分子相互作用或结合的分子。图19(A，C，E和G)中显示的是检测背景阻抗Zo的方法，也就是测量电极上或覆盖有或包被有或修饰有捕捉分子时的阻抗。
[0067]图19(B)是本发明的一个装置的横截面图，显示了带有捕捉分子的两个电极。在电极表面的捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。靶分子可以是任何与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑含有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡聚苷酸，或任何可以与捕捉分子相结合或相互作用的分子。图B所示是阻抗Zm的测量，测量用结合靶分子的捕捉分子修饰的电极。图(A)和(B)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为Zm，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(A)和靶分子与捕捉分子结合后的情形(B)。
[0068]图19(D)是本发明的一个装置的横截面图，显示了带有捕捉分子的两个电极。在电极表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号表示。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Zo)，换句话说，可以放大检测信号。靶分子可以是任何与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑具有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相互作用或结合的分子。(D)显示的是检测电极的阻抗ZmL，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(C)和(D)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为ZmL，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(C)和靶分子与捕捉分子结合的情形(D)。图19(D)中的标记分子或标记颗粒被用于放大或进一步的增大阻抗的改变(ZmL-Zo)。标记分子的一个非受限的例子，是某些大有机分子，它在电极上出现后会影响电极表面的离子或电子通过，将导致测量的电极间阻抗的大的变化。标记颗粒的一个例子可以是纳米或微米级的电绝缘颗粒，半导体颗粒，或甚至导电颗粒。标记颗粒的另一例子是纳米或微米级的脂质体，在它们的表面有信号放大分子。这种标记颗粒在电极上出现将会影响电极表面的离子或电子通过，将导致电极间测量的阻抗的大的改变。
[0069]图19(F)是本发明的一个装置的横截面图，显示了含有捕捉分子的两个电极，在电极的表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号做表示。捕捉分子与靶分子形成了一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Z0)，换句话说，可以放大检测信号。在这里，由标记分子或颗粒所造成的信号放大是通过标记分子或颗粒与溶液中一些反应分子(R)发生特定反应实现的。反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，导致电极间的阻抗ZMP。靶分子是任何可以与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑具有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，多肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相互作用结合的分子。图19(F)显示的是检测电极的阻抗Zmp，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(E)和(F)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为Zmp，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(E)和靶分子与捕捉分子结合的情形(F)。图19(F)中的标记分子或标记颗粒被用于扩大或进一步的增大阻抗的改变(Zmp-Zo)。图19(F)中标记分子或颗粒的信号放大是通过标记分子或颗粒与溶液中某些反应(R)分子发生特定反应实现的，反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，将会影响电极表面的电子和/或离子通过，这导致了一个大的阻抗变化。图19(F)中显示的情形，可以被认为是图19(D)的一个特例。
[0070]图19(H)是本发明的一个装置的横截面图，显示了含有捕捉分子的两个电极，在电极的表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号做标记。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Z0)，换句话说，可以放大检测信号。在这里，标记分子是酶，标记分子的信号放大是通过酶介导或催化的溶液中底物分子(S)的反应所获得的。酶介导的反应产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，测量导致的电极的阻抗(ZMEP)。靶分子是任何可以与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑带有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相结合或相互作用的分子。图(H)显示的是检测电极的阻抗ZMEP，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(G)和(H)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为ZMEP，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(G)和靶分子与捕捉分子结合的情形(H)。图19(H)中的标记分子或标记颗粒被用于扩大或进一步的增大阻抗的改变(ZMEP-Zo)。在这里，标记分子是酶，信号放大是通过酶介导或催化的，溶液中底物分子(S)的反应所获得的。酶介导的反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，测量导致的电极的阻抗(ZMEP)。反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，将会影响电极表面的电子和/或离子通过，这将导致一个大的阻抗改变。图19(H)中显示的条件，可以被认为是图19(F)的一个特例。在图8中描述了以酶为基础的信号放大反应的一些例子。
[0071]图20(A)显示了装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构(线宽＝30微米，线间隙＝80微米，圆直径＝90微米)在不同条件下测得的电阻的典型频谱。包含电极结构的玻璃基片组成电极装置。塑料孔组装到电极结构上构成了一个测试装置。电极结构的表面被固定上碱性磷酸酶分子，这是通过首先在电极上包被生物素标记的牛血清白蛋白，而后将电极培养在链霉亲和素的碱性磷酸盐中，以使链霉亲和素修饰的碱性磷酸盐(AP)与电极表面的生物素结合。在链霉亲和素修饰的碱性磷酸盐(AP)包被到电极表面上后，孔用Tris(pH＝7.6)缓冲液充分的洗涤。包含BCIP(17ul BCIP母液加到1.5ml Tris中，BCIP母液用25mg/ml浓度的DMSO配制)和NBT(33ul加到1.5ml Tris中，NBT母液用25mg/ml浓度的去离子水配制)的Tris溶液加入到孔中。阻抗测量在加入溶液后立即或在其后的不同时间进行。(a)符号◇，加入溶液后的即时，(b)符号X，□，▲对应在加入溶液后13(X)，28(□)和80(▲)分钟。
[0072]图20(B)显示了在与图20(A)相同条件下的同一电极结构的测量电抗频谱：(a)符号◇，加入溶液后的即时，(b)记号X，□，▲分别对应在加入溶液后13(X)，28(□)和80(▲)分钟。在图20(B)中显示的电抗是电抗的绝对值，换句话说，是指电抗的幅值。在加入溶液后即刻检测的电抗，在10Hz到500kHz之间为电容性和在792kHz到5MHz之间为电感性。对于其它的测量，电抗从10Hz到3.155MHz之间为电容性和在5MHz时为电感性。
[0073]图20(C)记录了溶液加入到孔后不同时间点测量的电阻与溶液加入到孔后即时测量的电阻值的比率。
[0074]图20(D)记录了溶液加入到孔后不同时间点测量的电抗与溶液加入到孔后即时测量的电抗值的比率。
[0075]图21图示了在ACEA装置上特异性检测和辨别DNA核苷酸取代。该ACEA装置具有一个玻璃基片(约18mm至78mm)，16个电极结构单元装配于其上，排列成一个2×8的构型，电极单元的间距为9mm。金(约0.2微米)覆盖铬(约0.03微米)的薄膜镀在玻璃基片上。电极结构单元具有“圆在线上”电极几何形状(线宽30微米；圆直径：90微米，线间隙：80微米)，利用薄膜光刻技术(感光耐蚀膜沉积，经掩膜板覆盖的UV或其他光源曝光，感光耐蚀膜熟化，感光耐蚀膜显影，湿蚀金，去除残留金或其他金属)模塑并装配。使用装置时，一个带有16个无底圆柱形圆孔的，中空的塑料孔条带，被固定到电极装置上，所以当样品加入到塑料孔中后电极结构单元被暴露到实验样品溶液中。传感器区域的直径约为3mm，塑料孔的直径约为6.5mm。在使用前，装置的表面用1N HCl处理15分钟，再用去离子水洗涤。为了实验，合成了沙眼衣原体16S核糖体RNA的三个特异寡核苷酸序列(获取号为D85722)。它们是(1)一个长度为40碱基对，5’末端巯基化修饰的捕捉寡核苷酸序列(5’-ZZZZGATTTGAGCGTACCAGGTAAAGAAGCACCG GCTAACTCCG)，(2)一个长度为20碱基对，野生型5’末端生物素化的靶序列(5’bio-CGGTGCTTCTTTACCTGGTA)和(3)一个长度为20碱基对，突变的5’末端生物素化的靶序列，其中单个核苷酸被取代(在9号位上的C被A替代)。在这个实验中，捕捉寡核苷酸溶解在去离子水中，浓度为2μM。Tonya M.Herne和Michael J.Tarlov报道了一种更有效的DNA包被方法(1M KH2PO4比H2O更好)(Herne TM and Tarlov MJ，Characterization of DAN Probes Immobilized on Gold Surfaces.J.Am.Chem.Soc.1997，119，8916-8920).为了将寡核苷酸序列包被到传感器表面，100ul，2μM的捕捉寡核苷酸被加入到每个传感器中，室温下孵育2小时，再用PBS进行清洗。清洗后，传感器表面用0.3％BSA封闭30分钟，再用PBS清洗。为实现DNA杂交，在杂交缓冲液(1.0M NaCl和10mM Tris缓冲液，pH7.4和1mM EDTA)中加入100μl，1nM野生型或1nM突变型寡核苷酸序列，而后加入到用捕捉寡核苷酸包被的传感器。阴性对照没有加入靶DNA。杂交在42℃进行30分钟，再用含50mMNaCl的磷酸缓冲液清洗。为了检测DNA杂交和辨别单核苷酸取代，100μl链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(Tris缓冲液中1∶2000稀释)被加入到每个传感器中，并在室温下孵育30分钟，再用Tris缓冲液清洗。清洗后，100μl碱性磷酸酶底物混合物，BCIP/BNT被加入到传感器上，在阻抗分析仪上实时监测反应。如图所示，在捕捉序列和野生型靶序列之间的特异性杂交可以在电装置上被稳定的检测到。在60分钟时，传感器上的信号比阴性对照传感器产生的信号高92.6倍。这里的信号是在5kHz下每个孔内的电极结构之间测量的电阻。与野生型的序列相比具有单核苷酸取代的突变序列仅产生非常微弱的信号。60分钟时，野生型序列与突变型序列的信号差是30倍。
[0076]图22图示了当细胞贴附到电极表面时监测阻抗变化的系统。
[0077]图23图示了一种仪器，其电极表面修饰有促进细胞贴附的分子。
[0078]图24是细胞迁移检测的图示，细胞最初生长在一个，由可移动孔板界定的生长区域上(图中未表示)。板上的孔壁的最初位于检测区域内或检测区域上。板随后被移去。细胞被允许铺展或迁移到由同心电极结构2410所确定的检测区域。
[0079]图25是神经突生长检测的图示。单个神经元最初位于神经元锚定区域。检测区域内同心电极结构2510间的阻抗的变化可以用来监测神经元生长。
[0080]图26显示了8种不同类型的电极在有或没有NIH 3T3细胞贴附时的电阻和电抗(主要是电容性电抗)。电阻和电抗的单位都是Ohm。电抗的幅值都被画在一张对数坐标图上。电抗的极性在大多数频率下都是负的(电容性电抗)。在图26到图32的结果中，不同种类的电极被装配在玻璃基片上(1cm×1cm×1mm)。实验装置都是通过将无底圆锥形或圆柱形的塑料管子胶粘到带有电极结构的玻璃基片上而制作的。典型地，在与玻璃基片相粘的一端，塑料管子的直径为4.5mm至6.2mm。玻璃基片形成了孔(或流体容器)的底，塑料管子形成孔(或流体容器)的壁。实验中，在培养基中的悬浮的细胞或培养基被加到孔(或流体容器)中。基片上的电极结构被用于检测细胞贴附到电极表面后所引起的阻抗变化，以此来监测孔(或流体容器)中的细胞贴附和/或生长。
[0081]图27图示了使用“3B”形状的电极结构来定量检测细胞。
[0082]图28图示了使用“3C”和“3B”形状的电极结构来实时监测NIH 3T3细胞和PAE细胞的增殖。
[0083]图29图示了使用“3B”形状的电极结构来实时监测紫外光(UV)导致的NIH 3T3细胞死亡。
[0084]图30图示了三苯氧胺在不同时间间隔的毒性效果的IC50值。
[0085]图31图示了使用“3C”形状的电极结构来比较四种不同细胞类型的阻抗值。
[0086]图32图示了阻抗的测量的可重复性。
[0087]图33图示了在基片上装配有电极结构的电细胞芯片的5种代表性设计。在玻璃基片的中心区域内装配了覆盖在铬镀层(厚度约30纳米)上的具有不同形状和大小的金电极(厚度约0.2微米)。玻璃基片的面积为1cm×1cm。基片上的电极结构可以经由玻璃基片面上的电极连接垫与电检测界面(即：阻抗测量电路或阻抗分析仪)相连。
[0088]图34图示了在测试装置上对四种不同类型的细胞检测或测量。这四种细胞是NIH 3T3细胞(小鼠的成纤维细胞)，PAE细胞(猪的主动脉内皮细胞)，HUVEC(人的内皮细胞)，和pHuhep(人的原代肝细胞)。对于NIH 3T3和pHuhep细胞，电极表面用纤连蛋白包被，对于PAE和HUVEC，电极表面用明胶包被。如图所示，两个装置用来测量每个细胞类型。在接种后的0、3和4小时检测阻抗。在3或4小时时，NIH 3T3细胞，HUVEC，PAE，和pHuhep细胞都观察到明显的电阻增加。与用于获得图26到图32的结果的测试装置相似，得到图34(和图35至图37)所示试验结果的实验装置，是通过将无底圆锥形或圆柱形的塑料管子胶粘到带有电极结构的玻璃基片上而制作的。玻璃基片形成了孔(或流体容器)底，塑料管子形成孔(或流体容器)的壁。实验中，在培养基的悬浮细胞或培养基被加入到孔(或流体容器)中。基片上的电极结构被用于检测细胞贴附到电极表面后所引起的阻抗变化，以此来监测孔(或流体容器)中的细胞贴附和/或生长。
[0089]图35图示了在测试装置上实时监测PAE细胞增殖的情况。细胞以不同的浓度(8,000个细胞和1,000个细胞)接种到有包被层的电极上。为了监测细胞增殖，电阻与电抗在不同的时间间隔上被检测。“t0”显示为接种细胞后的立即测定。在两种不同的细胞接种密度下，电阻值都随着培养时间的增加而增大，说明细胞处于增殖状态。接种密度高的细胞增殖速度明显高于接种密度低的细胞。Sd：细胞接种密度。
[0090]图36示意了用测试装置和MTT分析法对细胞进行定量检测的结果。系列稀释的NIH3T3细胞(10000，5000，2500，1250和625个细胞)被加到包被了纤连蛋白的测试装置或96孔板上。在使用装置的实验中，阻抗是在接种细胞后16小时测量的。在MTT检测中，细胞在接种后16小时用MTT染料染色，再在ELISA板读数器上540nm下读数。如图所示，装置可定量地检测细胞数目的变化。两种检测方法所得到的结果非常相近。
[0091]图37图示了测试装置上电阻测量的可重复性。重复性实验是在6个接种了人原代肝细胞的装置上进行。每个电极的电阻在接种后即刻(t0)和接种4小时后被检测。培养4小时后，所有的装置上都显示了明显的电阻值的增加，这标志着细胞在电极表面(和基片表面的其他区域)的贴附和铺展。右图显示了t0的CV是4.3％，t4h的CV是2.7％。
[0092]图38(A)显示在两种不同条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱。(a)空心符号，含HT1080细胞的组织培养基被添加于含电极结构的孔中不久后(10分钟以内，细胞尚未贴附电极和基片表面)测量的结果；(b)实心符号，含HT1080细胞的培养基加入到孔底面包含有电极结构的孔2小时40分钟后(细胞已经贴附到电极和基片表面)。在2小时40分钟的时间内，孔被放置于37℃含5％CO2的组织培养箱内。3B设计的电极结构中线宽为30微米，线间隔为80微米并且线上连续的圆圈直径为90微米。这个范例中，所有电极和电极间隙覆盖的总面积(区域)相当于一个3毫米直径的圆。玻璃基片上的电极结构构成了圆锥形孔的底，孔的顶端直径大约为6.5毫米而底部的直径约为5毫米。在实验中，含大约7000个HT1080细胞的，总体积100微升的组织培养基被加入到孔底有电极结构的孔中。
[0093]图38(B)所示为与图38(A)相同条件下，在相同电极所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对值被绘制为对数值(与图26中所示曲线相类似)。除了1MHz和580kHz的高频，在含有HT1080细胞的组织培养基被加入孔中不久后(10分钟内)测得的电极结构的电抗都为负值(电容电抗)。在细胞悬浮液加入含电极结构的孔中后2小时40分钟时测得的电抗，在测量的整个频率范围100Hz到1MHz内都为负值。
[0094]图38(C)显示了基于图38(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。
[0095]图38(D)显示了基于图38(B)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意在计算电抗比率时，电抗极性(电容和电感电抗)已被考虑在内。
[0096]图39(A)显示在两种不同条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱。(a)空心符号，含HT1080细胞的组织培养基被添加于含电极结构的孔中不久后(10分钟以内，细胞尚未贴附电极和基片表面)测量的结果；(b)实心符号，含HT1080细胞的培养基加入到孔底面包含有电极结构的孔2小时40分钟后(细胞已经贴附到电极和基片表面)。在2小时40分钟的时间内，孔被放置于37℃含5％CO2的组织培养箱内。3B设计的电极结构中线宽为30微米，线间隔为80微米并且线上连续的圆圈直径为90微米。这个范例中，所有电极和电极间隙覆盖的总面积(区域)相当于一个3毫米直径的圆。玻璃基片上的电极结构构成了圆锥形孔的底，孔的顶端直径大约为6.5毫米而底部的直径约为5毫米。在实验中，含大约3200个HT1080细胞的，总体积100微升的组织培养基被加入到孔底有电极结构的孔中。
[0097]图39(B)所示为与图39(A)相同条件下，在相同电极所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对值被绘制为对数值(与图26中所示曲线相类似)。除了1MHz和580kHz的高频，在含有HT1080细胞的组织培养基被加入孔中不久后(10分钟内)测得的电极结构的电抗都为负值(电容电抗)。在细胞悬浮液加入含电极结构的孔中后2小时40分钟时测得的电抗，在测量的整个频率范围100Hz到1MHz内都为负值。
[0098]图39(C)显示了基于图39(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。
[0099]图39(D)显示了基于图39(B)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意在计算电抗比率时，电抗极性(电容和电感电抗)已被考虑在内。
[00100]图40(A)显示在两种不同条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱。(a)空心符号，含HT1080细胞的组织培养基被添加于含电极结构的孔中不久后(10分钟以内，细胞尚未贴附电极和基片表面)测量的结果；(b)实心符号，含HT1080细胞的培养基加入到孔底面包含有电极结构的孔2小时40分钟后(细胞已经贴附到电极和基片表面)。在2小时40分钟的时间内，孔被放置于37℃含5％CO2的组织培养箱内。3B设计的电极结构中线宽为30微米，线间隔为80微米并且线上连续的圆圈直径为90微米。这个范例中，所有电极和电极间隙覆盖的总面积(区域)相当于一个3毫米直径的圆。玻璃基片上的电极结构构成了圆锥形孔的底，孔的顶端直径大约为6.5毫米而底部的直径约为5毫米。在实验中，含大约500个HT1080细胞的，总体积100微升的组织培养基被加入到孔底有电极结构的孔中。
[00101]图40(B)所示为与图40(A)相同条件下，在相同电极所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对值被绘制为对数值(与图26中所示曲线相类似)。除了1MHz和580kHz的高频，在含有HT1080细胞的组织培养基被加入孔中不久后(10分钟内)测得的电极结构的电抗都为负值(电容电抗)。在细胞悬浮液加入含电极结构的孔中后2小时40分钟时测得的电抗，在测量的整个频率范围100Hz到1MHz内都为负值。
[00102]图40(C)显示了基于图40(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。
[00103]图40(D)显示了基于图40(B)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意在计算电抗比率时，电抗极性(电容和电感电抗)已被考虑在内。
[00104]图41(A)显示了当不同数目的细胞加入到包含有相同类型“圆在线上”电极结构(电极形状3B)的孔中后，电阻比率的频谱。图41(A)为图38(C)，39(C)和40(C)中所示频谱的概括。一种计算“细胞数目指数”的方法是基于这些电阻比率的频谱，首先确定电阻比率的最大值，然后将最大值减“一”。通过此法计算的细胞数目指数在加入不同细胞数量7000，3200，和500时分别为5.17，1.82和0.17。显然，细胞数量越大，细胞数目指数越高。
[00105]图41(B)显示了不同数目的细胞加入到包含有相同类型的“圆在线上”电极(电极形状图3B)的孔中后，电抗比率的频谱。图41(A)是图38(D)，39(D)和40(D)中所示频谱的概括。
[00106]图42(A)比较了四种不同几何形状的交错式电极结构，在有或没有细胞贴附到电极表面时测量的电阻和电抗频谱，这些电极结构有不同的电极宽度对电极间隙比率。细胞未贴附时的电极结构的电阻与电抗频谱，是在含有3T3细胞的组织培养基加入到含有电极的培养孔中后短时间测得的(10分钟内，细胞未贴附到电极和基片表面)。细胞没有贴附到电极结构上时的阻抗和电抗频谱，是在含有3T3细胞的组织培养基加入到含有电极的培养孔中后3小时测得的。在这3小时的过程中，细胞放置在设置为37℃，5％CO2水平的组织培养箱内。几何形状为2AD，2BE和2CF的电极结构被装配在1cm×1cm的玻璃基片上，它们的电极宽度分别为50，48和48微米，电极间隙分别为10，18和28微米。覆盖几何形状为2AD，2BE与2CF电极及其间隙的区域了分别相当于1mm，3mm与6mm直径的圆。第四种电极结构的电极宽度和间隙都为50微米并被装配在Kapton(聚酰亚胺)基片上，覆盖电极与间隙的区域为6mm×5mm的矩形。在这些实验中，底面直径为4.5mm的的圆锥形塑料孔，被粘合到带有不同交错式电极的，玻璃基片或Kapton(聚酰亚胺)基片上。对于2AD和2BE几何形状的电极结构，电极结构位于孔底部的中心区域上。对于2CF几何形状的电极结构和Kapton基片，孔底部被电极和电极间隙所覆盖。实验前，电极和基片的表面都被彻底清洗并包被有纤连蛋白。显然，在孔中加入相同数量的3T3细胞(大约104个细胞)，对于宽度几乎恒定为50微米的电极，减少相邻电极间的间隙大小，将会导致细胞贴附后相对于没有细胞贴附在电极上的阻抗变化幅值的增加。
[00107]图42(B)显示了具有不同电极宽度与电极间隙比率的不同的交错电极的细胞数目指数间的关系。细胞数目指数的计算是通过最大电阻比率(在对应频率下有细胞贴附到电极表面时测量的电阻与没有细胞贴附到电极表面时测量的电阻之间的比率)减去1得来。显然，当对于宽度几乎恒定为50微米的宽度和加入孔中的相同数量的3T3细胞(大约104个细胞)，减少相邻电极间的间隙大小将会导致细胞数目指数的增加。从数据中可以看出，当宽度/间隙的比率为1.5或更大时，细胞数目指数(CI)有明显的增大。
[00108]图43图示了以微流体通道为基础的两电极传感。
[00109]图44图示了以微流体通道为基础的多电极传感。电极1(1’和1相连)和4(4’和4相连)被用于提供一个流过通道恒定的电流，而电极2(2’和2相连)和3(3’和3相连)被用于监测电压。当细胞通过电极2(2’)和3(3’)界定的区域时，阻抗被改变，这将导致电极2(2’)和3(3’)间电压的改变。
[00110]图45图示了当单个颗粒通过基片上的微孔时，对该颗粒进行阻抗分析。这里电极是集成在基片上的.
[00111]图46图示了同时检测阻抗变化(Z1)以监测细胞贴附和粘附到电极上，以及溶液中电导率的变化(由Z2检测的阻抗变化反映)。
关于本发明的详细描述
[00112]为了清楚地描述，而不是为了做作某种限制，本发明的细节在以下的描述被将分为多个章节。
A.定义
[00113]为了清楚地描述，而不是为了做作某种限制，本发明的细节在以下的描述被分为多个章节。
[00114]除非有另外的定义，在此使用的技术和科学词汇都与本发明所属技术领域内的词汇具有相同的含义。在此提及的所有的专利，专利申请，公开的申请，以及其他出版物都被以参考文献的形式整合到本发明的文本中。如若在本章内所阐述的定义与以参考文献的形式整合到本发明的文本中的专利，专利申请，公开的申请，以及其他出版物所阐述的定义出现矛盾或不一致，那么以本章所阐述的定义为准。
[00115]在此使用的“一个”指“至少一个”或“一个或多个”。
[00116]在此使用的“膜”，是指材料薄片。
[00117]在此使用的“生物相容性膜”指对细胞，包括存活力，贴附，铺展，运动，生长，分裂等功能无害的膜。
[00118]当含有活的，未受损害的，上皮细胞或内皮细胞的悬浮液被加入器皿中，器皿的表面“适于细胞贴附”是指12小时内有显著百分比的细胞粘附于器皿表面。优选的是，在12小时内至少50％的细胞粘附于器皿表面。更优选的是，一个适于细胞贴附的表面具有的表面性质使得铺板(即在细胞加入器皿后)12小时内至少70％的细胞粘附于表面。甚至更加优选的是，适于细胞贴附的表面的性质使至少90％的细胞在铺孔12小时内粘附表面。最优选的是，适于细胞贴附的表面的性质使至少90％的细胞在铺孔8，6，4，2小时内粘附表面。为了达到细胞贴附所需的表面性质，表面须经化学处理(如：用酸和/或碱处理)和/或物理处理(如：用血浆处理)，和/或生物处理(如：用一种或多种有利于细胞贴附的分子或生物分子包被。在此发明中，一个生物相容的表面(例如膜)，优选地，是适宜让在采用生物相容表面(例如膜)的检测中所使用的细胞类型贴附。最优选的是保证在检测中，90％与生物相容表面接触的细胞可贴附于其上。
[00119]“生物分子包被”是指在表面的分子包被，这些分子包括天然生物分子或生物化学分子，或由天然生物分子或生物化学分子衍生而来的分子。例如，生物分子包被可包括胞外基质成分(如纤连蛋白，胶原)，或其衍生物，也可包括生化分子，如聚赖氨酸或聚鸟氨酸，它们是天然生物化学分子赖氨酸和鸟氨酸的多聚分子。基于天然生化分子如氨基酸的多聚分子，可利用天然生化分子的异构体和对映异构体。
[00120]“胞外细胞基片成分”是指存在于动物细胞外基质中的分子。它可以是来源于任意物种和任意组织类型的细胞外基质成分。细胞外基质的成分包括但不局限于层粘连蛋白，胶原，纤连蛋白，其它糖蛋白，肽，糖胺聚糖，蛋白聚粘等。细胞外基质成分还可以包括生长因子。
[00121]“电极”是指一种高导电性的结构，它的电导率远远高于周围物质。
[00122]在此所指的“电极结构”是指单个电极，特别是一个具有复杂结构的电极(如一个螺旋型的电极结构)，或者是至少两个电连通的电极部件的结合体。所有在一个“电极结构”中的部件都是电连通的。
[00123]在此所指的“电极部件”是指电极结构中的单个构造，例如，交错电极结构中的指状突起结构。
[00124]在此所指的“电极结构单元”是指两个或多个电极结构所形成具有一定尺寸和间隔的结构，当连接于信号源时，可作为一个单元在电极结构周围的区域产生电场。本发明中优选的电极结构单元可测量由于细胞贴附在电极表面导致的阻抗变化。电极结构单元包括，但不局限于交错电极结构单元和同心电极结构单元。
[00125]“电极迹线”(electrode traces)是指由电极或电极部件或电极结构通向装置或仪器末端或边界的一个导电通路，以将电极，电极部件或电极结构与阻抗分析仪连接起来。装置的末端或边界可对应于装置或仪器上的连接垫。
[00126]“连接垫”是本发明的装置或仪器上的一个区域，它电连接到仪器或装置上至少一个电极结构内的至少一个电极或所有电极部件上，并且可以在使用时被连接到外部的电路上(如阻抗检测电路或信号源)。连接垫和阻抗检测电路或信号源之间的电连接可以是直接或间接的，可通过任何适当的导电工具例如导线或金属线来实现。这种导电工具也可以经过装置或仪器上其他区域的电极或电传导通路来实现。
[00127]“交错”是指一个方向的突起结构与来自另一个方向的突起结构以一种交叠手指状的方式相互错开(这样交错的电极部件之间优选不会相互接触)。
[00128]在此提及的“接触电极部件的可能性大”是指当细胞被随机的放到本发明的仪器或装置传感器区域时，细胞(或颗粒)接触电极部件的可能性(由在本发明的装置或仪器上或内使用的细胞的平均直径，电极部件的大小，电极部件的间隙大小计算而来)应大于约50％，更优选的情况下应大于约60％，更优选的情况下应大于约70％，甚至更优选大于约80％，约90％，或约95％。
[00129]“在所述基片上装配的至少两个电极”是指至少两个电极被装配或制作或生产在基片上。该至少两个电极可以处于基片的同一面或基片的不同面。基片可以有多层，该至少两个电极可以处于基片的同一层或基片的不同层。
[00130]“在所述基片同一面上装配的至少两个电极”是指至少两个电极被装配在基片的同一面上。
[00131]“在所述基片同一个层面上装配的至少两个电极”是指，如果绝缘基片是多层的，那么至少有两个电极被装配于基片的同一层上。
[00132]“所述...电极具有基本相同的表面积”是指所提到的电极的表面积没有很大的差别，从而，细胞在所述的任意一个电极上贴附或生长引起的阻抗变化将与细胞在另一个电极上贴附或生长引起的阻抗变化在总体的可检测的阻抗变化中占有具有相同或相似分量。换句话说，当电极具有基本相同的表面积时，任一电极上的细胞贴附或生长都会引起总体的阻抗变化。一般说来，“具有基本相同的表面积的”最大的电极和最小的电极间的表面积比率小于10。优选的是，最大的电极和最小的电极间的表面积比率小于5，4，3，2，1.5，1.2或1.1。更优选的是，所述电极结构的至少两个电极有近于等同或等同的面积。
[00133]“所述的装置具有适宜细胞贴附或生长的表面”是指装置上电极和/或非电极的区域具有合适的物理，化学或生物特性，以便感兴趣的细胞可以存活地贴附于该表面上，并且在细胞培养物生长后，新细胞可以继续贴附在装置的表面上。然而，在装置或其表面包含细胞生存或生长必要的物质不是必须的条件。这些必须的物质，例如营养物或生长因子，可以由培养基中提供。优选地，当活的，未受损伤的，上皮细胞或内皮细胞悬液加入到“适宜细胞贴附的表面”上时，12小时内至少有50％的细胞粘附到表面上。更优选地，一种适宜细胞贴附的表面具有表面性质，以致于铺板(即加入细胞到含所述装置的腔室或孔)12小时内至少有70％的细胞粘附到表面上。更加优选的是，适宜细胞贴附的表面性质将导致铺板12小时内至少有90％的细胞粘附到表面上。最优选的是，适宜细胞贴附的表面性质将会使至少有90％的细胞在铺板后的8，6，4，2小时内粘附到表面上。
[00134]“所述的电极间的可测量的阻抗变化”是指当分子结合反应在电极表面发生时，将导致电极间产生足够大的阻抗变化，该阻抗变化可被阻抗分析仪或阻抗测量电路测得。阻抗变化指在装置的电极表面上有分子结合反应与没有分子结合反应时阻抗值之间的差别。或者，阻抗变化指当有细胞在电极表面贴附时的阻抗和无细胞在电极表面贴附时的阻抗值之间的差别，或者是当贴附到装置上含有电极的表面的细胞数目、种类、活性、或形态发生变化时阻抗的变化。一般说来，阻抗改变超过0.1％即是可测量的。优选的是，可测量的阻抗值变化超过1％，2％，5％，8％。更优选的是，可测量的阻抗值变化超过10％。电极间的阻抗通常是所施加的电场频率的函数。“所述的电极之间的可测量的阻抗变化”并不要求在所有频率有可测得的阻抗变化，而只须阻抗的变化在一个(或多个频率)可被测得。此外，阻抗具有两个成分，即电阻和电抗(电抗可以分为两类，即电容性电抗和电感性电抗)。“所述的电极间的可测量的阻抗变化”仅要求在任意一个或多个频率下电阻和电抗之一具有可测量的变化。在本申请中，阻抗是电或电子阻抗。检测这种阻抗的方法是，(1)在所述电极之间提供一种特定频率(或多频率，或具有特殊的电压波形)的电压，并且测量在特定频率(或多频率，或具有特殊的电压波形)下通过上述电极的电流，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗值；(2)提供一种单频率成分电流(或多频率，或具有特殊的波形)通过上述的电极，测量在特定频率下(或多频率，或具有特殊的波形)，上述电极之间的电压，将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗值；(3)可以检测或测定电阻抗的其它方法。注意，在上述的“将电压振幅值除以电流振幅值来获得阻抗”，“除以”用作于相同的频率下的电流振幅值和电压振幅值。测量这种电阻抗是一种电子或电过程，它不需使用任何试剂。
[00135]“所述的至少两个电极具有明显不同的表面积”是指任何电极的表面积彼此之间都是不相似的，由此，在大电极上细胞贴附或生长造成的阻抗变化，与在小电极上细胞贴附或生长造成的阻抗变化，在总体上可测得的阻抗变化中所占有的分量是不同或不相似的。优选的是，在大电极上细胞贴附或生长造成的任何阻抗变化会明显的小于小电极上细胞贴附或生长造成的阻抗变化。一般说，最大电极和最小电极的面积的比率大于10。优选的是，最大电极和最小电极的面积的比率超过20，30，40，50或100。
[00136]“多对电极或电极结构按照多孔微量滴定板上的孔进行空间排列”是指装置或仪器上的多对电极或电极结构，匹配多孔微量滴定板上的孔的空间构型进行空间排列，由此，装置可以在需要时被插入到，结合到，或附着到多孔板(例如，一个无底的多孔板)，而且微量滴定板中的多个孔将包括电极或电极结构。
[00137]“按行列构型排列”是指，就电连接来说，电极的位置，电极阵列的位置或一个可开关的电路位置是由一个行位置号和一个列位置号所确定的。
[00138]“每个孔都包含基本相同数目...的细胞”是指孔中细胞数目的最少值至少为孔中细胞数目最高值的一半。优选的是，孔中数目的最少值至少为细胞数目最高值的60％，70％，80％，90％，95％或99％。更为优选的是，每孔都包含相同的细胞数。
[00139]“每个孔都包含同样种类的细胞”是指，就特定的目的来说，每孔包含同样种类的细胞，但不必要每孔包含完全同一种类细胞。例如，如果特定的目的是每孔包含哺乳动物细胞，那么，每个孔可以包含相同种类的哺乳动物细胞，如人类细胞或不同的哺乳动物细胞如人类细胞，及其它非人类的哺乳动物细胞例如小鼠，山羊或猴细胞等。
[00140]“每孔包含...一系列不同浓度的测试化合物”是指每孔包含的测试化合物的浓度是系列稀释的，如10分之一系列稀释的浓度为1M，0.1M，0.01M等。
[00141]“剂量反应曲线”是指细胞反应对测试化合物剂量浓度的依赖关系。细胞的反应可以通过许多不同的参数进行检测。例如，测试化合物被怀疑具有细胞毒性，会导致细胞死亡，那么，细胞在测试化合物处理后的反应可以通过不存活(或存活)的细胞百分率来测得。
[00142]“电极沿着微通道的长轴所具有的长度要比所分析的颗粒的最大一维尺寸小得多”是指电极在沿着微通道的长轴方向上的长度，要小于所分析颗粒最大一维尺寸的90％。优选的是，电极在沿着微通道的长轴方向上的长度要小于所分析颗粒的最大一维尺寸的80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％。
[00143]“微电极跨微通道的整个高度”是指微电极至少跨微通道的整个高度的70％。优选的是，微电极至少跨微通道的整个高度的80％，90％，95％。更优选是，微电极至少跨微通道的整个高度的100％。
[00144]“孔具有相当于或稍大于所述颗粒大小的孔径”是指这个孔的孔径至少等于颗粒的大小，并且这个孔径小于颗粒大小的300％。这里孔径和颗粒的大小尺寸的测量仅限于一维数值。
[00145]“微电极条带或电极条带”是指一种绝缘基片条带，在它上面有装配或掺入的电极或电极结构单元。绝缘基片条带包括但不局限于聚合物膜，玻璃，塑料薄片，陶瓷，绝缘体-在-半导体上，玻璃纤维(象那种用于制造印刷电路板的材料)。电极结构单元具有不同的几何形状，可以通过任意适于微装配、微机械制造、或其他方法装配或制作在基片条带上。电极几何形状包括但不局限于交错的电极，“圆在线上”的电极，“菱形在线上”的电极，齿形电极或正弦形电极。这些电极的几何形状的特征尺寸可以小到少于5微米，或少于10微米，到大到大于200微米，大于500微米，大于1毫米。电极几何形状的特征尺寸是指电极部件的最小宽度，或相邻电极部件间的最小间隙，或电极几何形状上重复特征的尺寸。在本发明中，微电极条带可以是任何几何形状的。其中一个例子是矩形，条带的宽度为小于50微米到大于10毫米，条带的长度为小于60微米到大于15毫米。例如，一种电极条带可以具有200微米宽，20毫米长的几何形状。一个单一的微电极条带可以具有两个电极作为一个测量单元，或多个这种双电极作为多个测量单元，或单个电极结构单元作为一个测量单元，或多个电极结构单元作为多个测量单元。在一种实施方案中，当多个电极结构单元被装配在一个单一的微电极条带上，这些电极结构单元是沿着条带的长轴定位的。电极结构单元可以是正方形，矩形，或圆形。每个电极结构单元可能具有的尺寸从小于50um×50um，到大于2mm×2mm。
[00146]“样品”是指可以含有可用本发明所述的装置，微量滴定板或方法进行分离、操作、测量、定量、检测或分析的部分的任何物质。样品可为生物样品，如生物流体或组织，生物流体包括培养基，如细胞培养基中的细胞悬浮物，尿，血，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰，脑脊液，泪液，粘液，羊水等。生物组织是指形成人，动物，植物，细菌，真菌或病毒结构的结构物质之一的细胞(通常是特定类型)聚集体以及它们的细胞间物质，包括结缔组织，上皮组织，肌肉组织，和神经组织。生物组织也包括器官，肿瘤，淋巴结，动脉，和各个细胞。生物样品也可进一步包括细胞悬液，包含生物分子(如蛋白质，酶，核酸，碳水化合物，结合到生物分子的化学分子)的溶液。
[00147]“液体样品”为天然以液体或流体形态存在的样品，如生物流体。“液体样品”也可指天然以非液体状态，即固体或气体存在的样品，但被制成含固体或气体样品物质的液体，流体，溶液或悬浮液。如，液体样品可包括含生物组织的液体，流体，溶液，或悬浮液。
B.分析或检测分子和细胞的装置和方法
[00148]本发明中用于检测靶分子的装置，允许以简单自动的方式分析多种样品。通常地，这种装置包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在所述的基片上的至少两个电极，所述电极的表面上修饰有捕捉分子，溶液中的靶分子可以结合到捕捉分子上；c)所述的基片上的至少两个连接垫，所述至少两个电极分别以迹线连接到所述至少两个连接垫上。在使用中，生物样品(优选是在溶液中)中靶分子结合到电极表面的捕捉分子上，导致上述至少两个电极间可测量的阻抗变化。
[00149]另一方面，本发明涉及一种检测样品溶液中分子的装置，它包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在所述基片上的至少两个电极结构，其中i)所述两个电极结构中的一个结构具有至少两个电极部件；ii)所述的至少两个电极结构的表面修饰有捕捉分子，溶液中的靶分子或溶液中疑有的靶分子可以与其结合；c)在所述的基片上的至少两个连接垫，所述至少两个电极分别连接到所述的至少两个连接垫。溶液中的靶分子或溶液中疑有的靶分子与电极上的捕捉分子相结合，导致上述至少两个电极间可测量的阻抗变化。
[00150]另一方面，本发明是关于一种监测细胞-基片阻抗的装置，它包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在基片同一面的至少两个电极，其中所述至少两个电极有基本相同的表面积；c)所述基片上的至少一个连接垫，其中所述至少两个电极连接到所述的至少一个连接垫上。装置具有适应细胞贴附或生长的表面，装置上细胞的贴附或生长将导致所述至少两个电极间可测量的阻抗变化。
[00151]另一方面，本发明是关于一种监测细胞-基片阻抗的装置，该装置包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在基片同一面的至少两个电极，其中所述至少两个电极有基本相同的表面积；c)所述基片上的至少一个连接垫，其中所述至少两个电极连接到所述的至少一个连接垫上；和d)连接到一个或更多连接垫上的一个阻抗分析仪。装置具有适应细胞贴附或生长的表面，装置上细胞的贴附或生长将会导致上述至少两个电极间可测量的阻抗变化。
[00152]还有另外一方面，本发明是关于一种监测细胞-基片阻抗的装置，该装置包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在基片同一面的至少两个电极结构，其中所述至少两个电极结构有基本相同的表面积，其中所述至少两个电极结构的每一个均包含有两个或更多个电极部件，c)所述基片上的至少一个连接垫，其中所述至少两个电极结构连接到所述的至少一个连接垫上。装置具有适应细胞贴附或生长的表面，装置上细胞的贴附或生长会导致上述至少两个电极间可测量的阻抗变化。
[00153]优选的是，所述装置中任何一电极或电极结构的表面上的细胞贴附或生长都会导致上述电极或电极结构间可测量的阻抗变化。
[00154]还有另外一方面，本发明是关于一种监测细胞-基片阻抗的装置，它包括：a)一个绝缘的基片；b)装配在基片同一面的至少两个电极，所述至少两个电极有明显不同的表面积；c)用于连接所述至少两个电极与基片上的连接垫的工具，装置具有适应细胞贴附或生长的表面，装置上细胞的贴附或生长会导致所述至少两个电极之间可测量的阻抗变化。优选的是，比所述至少两个电极的最大电极表面积小的一个电极上具有用细胞粘附促进部分修饰过的表面。
[00155]上述装置中用于检测靶分子或监测细胞-基片阻抗时检测到的阻抗变化，可以在任何合适的频率范围内检测。例如，阻抗可以在大约1Hz到大约100MHz的频率范围内测量。阻抗可以在大约100Hz到大约2MHz的频率范围内测量。阻抗一般是频率的函数，即，当频率改变时，阻抗值也会改变。
[00156]电极间的阻抗具有两个成分-电阻和电抗成分。电抗可被分成两类，电容性电抗和电感性电抗。当阻抗具有电阻和电容性电抗两个部分时，阻抗有时被说成是具有一个电阻成分和一个电容成分。电阻成分，或电抗成分，或两个成分的变化都能构成阻抗的变化。
[00157]本发明装置可使用任何适合的绝缘基片。在此提及的“绝缘”是指在装置使用的条件下绝缘，详细的是指，材料电阻率大于大约105欧姆米，优选地大于106欧姆米，或更优选地大于107欧姆米。基片的例子可以包含许多材料，包括，但不限制于，二氧化硅在硅上，硅在绝缘(SOI)晶片上，玻璃(如石英玻璃，铅玻璃或硼酸盐玻璃)，蓝宝石，陶瓷，聚合物，塑料，如聚酰亚胺(如Kapton，DuPon提供的聚酰亚胺薄膜)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚氯乙烯，聚酯，聚丙烯和尿素树脂。优选的是，基片和基片的表面将不干扰发生在基片表面的分子结合反应。对于细胞-基片阻抗监测，在本发明装置的使用中可以暴露于细胞的绝缘基片的任何表面，在优选的情况下是生物相容的。生物不相容的基片材料可以通过包被其他材料，例如聚合物或生物分子包被层，变成生物相容的。基片材料可以是多孔或非多孔的。基片也可以由印刷电路板(PCB)制成。在这时，PCB板是指一种机械的装配物，它包括玻璃纤维片层，并任选用蚀刻的金属薄膜模具(如铜模具)层压。对于电子工业，印刷电路板被用于固定适合装配的电子元件。在本发明中，PCB板可以被用于印制所需的电极构型来检测和测量溶液中的分子，和用于测量细胞-基片的阻抗。在本发明装置或装置使用中，PCB基片暴露于样品溶液中的表面，如果需要的话，可以包被上例如聚合物或生物分子包被层。就监测细胞-基片的阻抗来说，在本发明装置或仪器使用中，PCB基片暴露于样品溶液中的表面，可以包被上例如聚合物或生物分子包被层，以使表面具有生物相容性。
[00158]基片可以有一个包被层，溶液中的或溶液中被疑有的靶分子可以到结合该包被层。这个包被层可以包含特殊的捕捉分子，靶分子可以特异性与其结合。捕捉分子可以是任何分子，包括核酸分子，蛋白质分子，抗体(针对蛋白质，抗原，核酸分子如DNA或RNA或DNA/RNA杂交体，化学分子等)，或以上分子的任意组合。
[00159]基片可以包含一种包被层，以促进细胞的贴附。此包被层可为聚合物，如塑料膜，或者一种或多种生物分子或其一种或多种衍生物，例如但并不限于，聚合物，如聚鸟氨酸或聚赖氨酸，肽或蛋白质，或细胞外基质成分(或其衍生物)包括但并不限于明胶，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原，一种或多种糖胺多糖，一种或多种肽聚糖，等。此包被层，优选但任选覆盖基片的整个表面，这个表面，包括电极表面，在装置使用时将暴露于细胞或可以被细胞接触到。包被层可以是半固体或凝胶。包被层可以是一种简单或复杂的生物分子混合物，并且可以模仿或复制天然存在的胞外基质。
[00160]包围许多动物细胞的胞外基质构成了固定组织的结构框架，且在细胞的分化，增殖，迁移，形态，定位方向和信号传导中扮演着重要的角色。虽然许多细胞种类可以被培养在细胞培养塑料上，但这种环境不是生理性的。当胞外基质分子包被层到基片上时，就可以提供一种有效的生理基片，它可以支持和促进关键的细胞功能。一种给定的胞外基质(天然的，源于细胞或组织的，或人造的)可以是一种复杂的混合物，包含糖蛋白，胶原质和蛋白聚糖。不受限制的胞外基质成分的例子包括胶原(如，I，V和II型原纤维)，糖蛋白，例如纤连蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白，血小板反应蛋白，生腱蛋白。胞外基质可以有任选包含附加的成分例如，但不限制于，生长因子。
[00161]例如，MatrigelTM基底膜基片(BD BioSciences)是由Engelbreth-Holm-Swarm(REHS)小鼠肉瘤提取而来的溶解的基底膜制剂，该瘤是一种富含胞外基质蛋白的肿瘤。它最主要的成分是层粘连蛋白，其次是胶原IV，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白。它也包含β-TGF，成纤维细胞生长因子，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，和其它在EHS肿瘤中天然存在的生长因子。
[00162]在使用中，本发明装置可以包含一个或更多的容器，以作为流体容器。这种容器可以是可逆地或不可逆地连接于基片或基片的一部分，或在其中形成(例如，形成微量滴定板的孔)。在另一例中，本发明装置包括的微电极条带是可逆地或不可逆地连接于塑料外壳上，该外壳具有与位于微电子条带上的电极结构单元相对应的开口。合适的流体容器材料包括塑料，玻璃，或塑料包被的材料(例如陶瓷，玻璃或金属等)。
[00163]本发明装置的基片可以有一个或更多的空洞，或孔。在本发明的一些优选实施方案中，阻抗的变化是由细胞贴附到，例如，基片的上表面而来的，而且基片上表面包含一个或多个电极，基片上的空洞直径可比用装置检测的细胞的直径更小，这样细胞就不能通过基片上的空洞。例如，孔可以有小于5微米，或1微米的直径。培养基或其它溶液或凝胶，包括含生长因子，化学趋化物，药物，或被测化合物的培养基，溶液或凝胶可任选在基片下面提供，在那里它们可以穿透多孔的基片。
[00164]本发明的一个目标是可靠，敏感，和定量检测和监测在样品溶液中有的或疑有的靶分子或细胞。为了这个目的，电极被排列在称为“传感器区域”的，包含电极和电极间隙的基片表面。为了监测细胞的行为，电极优选被排列，这样在“传感器区域”，电极或电极部件的分布，使得当细胞与传感区域内基片接触和/或贴附时，细胞与基片上至少一个的电极或电极部件(或它们的一个或多个部分)接触和/或贴附的概率是大的。在本发明的大多数方面，基片(或它的一个部分)将被一个流体容器(例如：一个孔)所环绕，容器内可以进行检测。在这些方面中，优选的是，基片的传感器区域包含装置的表面区域，而该表面区域是围绕在流体容器(例如孔)上的。这意味着，当装置装配到流体容器时，电极传感器区域面朝上，并且电极所在平面形成流体容器内底表面，传感器区域占据流体容器的整个内底面。细胞接触电极的高概率意味着高于50％的概率，优选的是，高于70％的概率，或更优选的是，高于90％的概率。
[00165]在本发明的一个优选实施方案中，本发明装置包含多个电极结构，并且可以可逆地或不可逆地连接到一个无底的多孔板上，这样，装置的基片组成了孔的底部。一种特别的优选实施方案是将一个无底多孔板(垂直固定了具有相对的开放末端的管状流体容器)以一种不漏液的方式连接到具有孔的基片表面上。
[00166]装置上的流体容器，如果存在，可以有任何合适的直径或尺寸，它足以保留本装置电极传感器上的生物流体样品。然而，以垂直固定了具有相对的开放末端的管状流体容器的无底多孔板为例，应该理解，容器开口处的直径应该优选稍大于容器所围绕的每个孔的直径。
[00167]在一种特别优选的实施方案中，每个位于基片上的每个孔周围流体容器，在对着基片的流体容器开口处的直径应大于容器与基片连接的末端的直径。例如，容器开口的直径可足够大，以允许一个自动加样器进入每个容器。(例如，参见图8中所示元件)。
[00168]以常规微量滴定板(一种96孔板)为参考举例来说，流体容器在与基片连接末端的直径适合在4到7毫米，优选地，在4到6.5毫米。在后一种构型中(以6.5毫米容器直径作为参考)，一列容器中的流体容器之间的距离是大约2.5mm，而相邻两行容器的流体容器间的距离为大约9mm。容器在与基片连接末端的直径也可能与传感器区域的大小(包括电极部件和电极部件间的间隙)相关。如同以下所述，在一种优选的实施方案中，传感器区域占有了几乎整个装置的表面区域，在这里所指的表面区域是被包围在或将被包围在一个流体容器内的区域。因此，如果容器在基片连接末端的直径太大的话，将给自电极延伸到基片末端或边缘的电极迹线留下很小的空间。在一种96孔板的特定实例中，容器在基片连接末端的直径是5毫米，而传感器区域(例如，使用图1A中所示的电极)的直径是5.5毫米。图1A中所指的传感器区域是指由两个弧形导电连接迹线125确定的面积。
[00169]本发明装置中一个电极结构中的电极或电极部件可以具有任何适合的形状，例如，矩形，圆形，圆在矩形线上(“圆在线上”)，方形在矩形线上，或正弦形线。它们也可以是曲线形式，例如，但不限制于，螺旋或弧形。图1和7图示了用于本发明装置中的电极，电极结构或电极结构单元的一些例子。
[00170]在发明的优选实施方案中，电极结构可以是如图1B，1C，7A和图7F所示的交错电极结构(IDESs)或同心电极结构(CCESs)。例如，一个电极结构可包含两个或更多的电极，它们构成的一个或更多的IDESs或CCESs。交错电极结构(IDESs)可进一步修改或改变，以便平行线电极部件具有更大周长的亚几何形状，就是说，上述附加于线形电极部件(其本身可为平行线，曲线，环线，三角形，拐角形等)的部分可为分支，露头，突出等，这样线形电极通路有一个比如果其边界符合电极部件通路方向时更大的周长。大周长结构的例子包括图1A和7C显示的“菱形在线上”电极结构和“圆在线上”电极结构，图7B和7D所示齿形电极结构。带大周长亚几何形状的电极并不仅限于这里所述的情况，亚几何形状(曲线，角，圆，长方形)及其周期性也可以是规则的或不规则的。
[00171]优选地，电极或电极部件分布在它们所被装配的装置的整个表面，这里的表面区域，会或将会暴露接触到，包含细胞和/或靶分子的样品溶液。换句话说，会或将会暴露接触到样品溶液的表面区域将被电极(或电极部件)和电极(或电极部件)间隙所覆盖。本发明优选的装置中，传感器区域可占据至少5％，10％，30％，50％，70％，80％，90％，95％或甚至100％的装置表面区域。这里的表面区域是包含在或将包含在于流体容器中的。换句话说，本发明优选的装置，至少5％，10％，30％，50％，70％，80％，90％，95％或甚至100％的表面区域是被或将被电极(或电极部件)和电极(或电极部件)间隔上所覆盖，这里的表面区域是含在或将包含在流体容器中的，也是暴露或将暴露于样品液体。优选的是，传感器区域上的电子或电极部件的分布是均匀的或接近均匀的。
[00172]在装置包含至少两个电极结构组成的实施方案中，这两个或多个电极部件优选排列成电极结构。当电极部件不是矩形时，“电极宽度或电极部件宽度”指在基片平面延伸(通常是电极部件主轴的方向)的电极部件从与一个电极间隙的接界处到与之相对的另一个电极间接界处的平均尺寸。当电极间隙不是矩形时，“电极间隙”指在基片平面延伸(通常是间隙主轴的方向)的间隙从与一个电极部件接界处到对侧的另一个电极部件接界处的平均尺寸。
[00173]为了监测细胞的行为，优选地，电极部件的间隙应不大大超过用本装置监测其行为的细胞的大小(如：铺展并贴附于基片的细胞的宽度)。这减少了细胞和基片接触但不与电极或电极部件的至少一部分接触的可能性。而且，优选的电极部件间的间隙的宽度(或间隙大小)应不大大小于被装置监测其行为的细胞的大小(如：铺展并贴附于基片的细胞的宽度)以减低测量接触两个相邻电极的细胞的可能性，那样将会产生相对于一个细胞接触于一个电极时，特别大的阻抗信号。如果电极的宽度远大于(如10倍)用本装置监测其行为的细胞的大小，那这点尤其重要。另一方面，如果电极宽度与细胞的大小(如细胞铺展并贴附于基片时的平均宽度)可比，电极部件间的间隙宽度可略小于细胞大小。虽然其他间隙尺寸可被使用，但在优选的情况下，电极结构的电极部件间隙大小的范围优选为用本装置检测的细胞宽度的约0.2至3倍。本发明装置的电极或电极部件间隙，在优选的情况下，在监测真核细胞，如哺乳动物细胞，(如癌细胞，内皮细胞，或上皮细胞)时，应为约3到80微米，更优选的是约5到50微米，最优选的是约8到30微米。
[00174]优选地，电极部件的宽度不能太窄，因为电极部件的宽度减小时，其电阻会增加。沿电极部件的电阻增加会导致在电极部件上的不同点上存在很大的电位差，从而使当细胞落在或贴附于电极部件不同区域时阻抗信号不同。优选地，细胞落在或贴附于基片表面的任意区域应有类似的阻抗信号。因此对于一个作为交错电极结构或同心电极结构一部分的电极部件，当装置用于测量真核细胞，如哺乳动物细胞(如癌细胞，内皮细胞，或上皮细胞)时，电极宽度在优选的情况下应超过约3微米，更优选是超过约10微米。电极宽度也是受限的，如果电极部件很宽，当细胞位于这个很宽的电极的中心时，相比于细胞位于场强明显高的电极的边缘位置，会引起一个小阻抗信号。优选地，电极部件的宽度应在大约0.5到10倍于用本装置检测的细胞的大小(如细胞铺展并贴附于基片时的平均宽度)。优选地，对于一个作为IDESs或CCESs一部分的电极部件，当装置用于测量真核细胞，如哺乳动物细胞(如癌细胞，内皮细胞，或上皮细胞)时，电极或电极部件应小于约500微米宽，更优选的是小于约250微米宽。在本发明的一些优选实施方案中，电极部件宽度应为约20到250微米。
[00175]本专利申请中，优选地，电极部件间的电极间隙的设计应考虑到电极宽度。尽管电极部件宽度与间隙比率有很多是合适可用的，但优选的比例是约1∶3到20∶1之间。更优选的是，电极部件宽度是间隙宽度的1.5到15倍，最优选的是2到6倍。例如，如果每个电极的最宽点的电极宽度是90微米，邻近电极间的间隙的最宽点的间隙宽度是约20微米。在本申请中，电极的宽度范围是小于5微米到大于10毫米，优选的是10微米到1毫米，更优选的电极宽度是20微米到500微米。
[00176]电极结构中的电极部件可以通过导电连接迹线而相互连接。例如，图1A中电极结构110所包含的电极部件110a，110b和110c通过弧形导电连接迹线或电极总线(125)而相互连接。导电连接迹线(电极总线)可以具有不同于电极部件的形状(因而具有不同的电场强度和分布)，所以电极总线上的分子反应(或细胞贴附)会从电极部件上的分子反应(或细胞贴附)产生不同的阻抗信号。虽然不是限制或必需的，在一些应用中，优选地，分子反应不要发生在这些电连接迹线上(电极总线)。同样的，优选地，细胞也不要贴附在这些电极总线上。因此，这种连接迹线上可有一个绝缘的包被层，这样一来，连接迹线区域上的分子反应或细胞贴附将不导致电极间的阻抗改变。在一些实施方案中，连接电极部件的导电连接迹线或电极总线(例如，图1A和1B中的125和225)，可以放在含有电极结构的流体容器(或孔)的底面的外面。在这种情况中，当样品溶液被加入到流体容器(或孔)中时，分子反应(或细胞贴附)将不发生在这些电连接迹线上。以图1A中的电极结构110为例，弧形的导电连接迹线的内部直径为1.2mm。这种示范的装置被装配到塑料，圆柱形，两个末端开口的流体容器上。这个圆柱形流体容器的内径可以为1mm。使用双面胶(例如，一种压敏胶)，电极装置可以被粘合到流体容器上。电极区域与圆形底面的流体容器的圆形末端同心对齐，且粘合上去。从而，1.2mm的直径将位于容器底面的外面。
[00177]不受限的电极或电极部件材料的例子可为氧化铟锡(ITO)，铬，铜，金，镍，铂，银，钢，铝。电极可包含多种材料。选择适当的材料制作电极取决于如下因素：此材料是否足够导电，将此材料装配在基片上是否困难，此材料是否能够被可靠地用于进行本发明的分子检测。
[00178]本发明的电极或微电极可是任何导电材料。例如，金(Au)，铂(Pt)等都可应用。当基片为玻璃和/或塑料时，可使用金属，如：铬和钛的粘合层。为了降低电极的电阻，具有导电薄膜的电极应为一定厚度。作为一个不限制的例子，电极可制成300埃厚的铬层覆以2000埃的金层。这样的电极层是不透光的。所以，如果光学测量需要光穿透带有电极的基片表面，那就不能用光学方法直接监测发生在这类电极表面的分子相互作用。同样，也不能直接监测贴附或粘附于这类电极的细胞。由于这些原因，在一些包括分子反应的阻抗监测用的电极结构的多孔板的实施方案中，一些孔是没有电极的，这样，在这些孔的分子反应或贴附或生长的细胞可以容易用光学测量方法监测。对于需要光学测量方法监测的分子反应，反应中的分子可能必须使用荧光分子或其它光学可检测的分子等光学标记进行标记。上面用作电极的金和铬薄膜的厚度，只是一个例子。薄导电膜层的厚度，可以是其他的数值，只要得到的电极和/或电极结构可用来测量分子反应。同样地，薄导电膜可以包括其它导电材料，如钛上的铂。
[00179]作为选择的，透光的电极可被用于本发明装置中，从而电极不仅能监测分子反应(和细胞基片阻抗)，也能利用任何种类的光学显微镜或其它光学检测方法，对样品溶液进行光学分析和检测。透光电极被制作于其上的基片材料优选也是光学透明的，例如，基片材料可以是聚碳酸酯，或聚苯乙烯，或聚乙烯，或玻璃。更进一步地说，这种电极和基片具有其它重要的性能，由于其性能，使电极和基片可以与其他用于分子或细胞的光学检测方法协调。从而，本发明引入了一种新颖的和令人惊讶的基片特征，该基片具有透光的电极，它允许光学观察和检测溶液，溶液的组成分子可以在同样的检测板，容器或孔中被电监测或测量。利用这样透光电极，本发明允许对细胞进行光学观察，所述细胞行为可以在同样的检测板，容器或孔中被电监测。例如，细胞可以被培养在包含基片上带有透光电极的的本发明装置腔室、或孔、或板中。细胞的生长或行为可以基于细胞-基片阻抗而被监测或检测。在电监测细胞过程中，或监测后，仍然完整的细胞(活的或死的)可被用于进一步的分子，细胞，或生物化学检测。例如，对一个特定的基于细胞的检测，基因表达的检测可以确定表达的基因的身份(和其表达水平)，酶检测可以检测多少细胞是可存活的或不存活的，而凋亡检测可以确定有多少细胞处在凋亡的不同阶段。
[00180]透光电极的例子包括氧化铟-锡(ITO)。就合适厚度的ITO层来说，穿过一个ITO薄膜电极的光通量可高达98％。在别的情形下，很薄的导电薄膜(例如，一个非常薄的金薄膜)可以用作透光电极。
[00181]通常地，本仪器应该有一个足够多个细胞贴附或生长的表面区域。在一个例子中，本仪器应该具有一个表面区域，足够让至少10个，更优选地至少50个细胞贴附或生长。在另一个例子中，连接到一个阻抗分析仪上的本仪器中的每对电极或每对电极阵列(如图1中的电极阵列110和120)应该具有一个表面区域足够让至少10个或优选地至少50个细胞贴附或生长。
[00182]本仪器中的电极部件，电极，电极结构及电极结构单元可有任何合适的构型，表面积及表面的修饰。其中一例，至少一个电极结构可有至少两个电极部件。在另一例中，电极或电极结构表面区域可被细胞贴附增强部分修饰。任一种增强细胞贴附的部分，例如自组装单分子(SAM)层(如硫醇烷在金层上，烷基硅氧烷在SiO2或SiOx上)，蛋白质(如纤连蛋白，明胶，胶原，层粘连蛋白，促进细胞特异性或非特异性贴附于电极或电极阵列表面区域的蛋白)，肽(如聚L赖氨酸)，聚合物层和带电基团都可以被用在本仪器上。在另一例中，非电极或非电极阵列表面区域可用抑制细胞贴附的部分修饰，(例如，某些聚乙二醇配方)。
[00183]优选地，电极，电极结构，对电极部件进行构造，使得电极迹线从基片表面的电极导向于基片边缘或末端，在此它们可被连于来自于阻抗测量电路或信号源的导线。电极迹线终止处的基片边缘或末端相应于基片上的连接垫。在本发明优选的方面，一个电极结构的电极部件上的迹线与另一个电极结构的电极部件的迹线是彼此绝缘的。在一种排列类型中，电极迹线位于基片的不同区域以便于它们所经路径交叉时它们不相接触。另一种排列中，电极迹线需互相交叉，一个绝缘材料层可被夹于两个电极迹线之间。装配这样的仪器或装置就涉及多层微装配工艺。
[00184]图17显示了一个例子，在一个基片上制作了多层电极结构。在电极表面监测分子反应和(监测细胞贴附/生长)的电极是圆形电极部件阵列，被交替地连接到两个连接垫上，连接垫可以操作性连接到一个阻抗检测电路。两组电极部件的每一组内的圆形电极部件之间的导电连接彼此交叉，它们被放置在不同的层，层间有绝缘层用来达到两组圆形电极的电分离。同样，连接电极部件至连接垫的电极迹线也会交叉，它们处于中间有一绝缘层的不同层。多层电极结构的其它例子可以在文献中找到，例如”Positioning and manipulation ofcells and microparticles using micromainaturized electricfiled traps and traveling waves”，by Fuhr et al，in Sensorsand Materials，Vol.7，No.2，pages 131-146，1995，和美国专利号6,448,794，题为“Apparatus and method for highthroughput electrorotation analysis。
[00185]本装置还包括连接到一个或多个连接垫的一个或多个阻抗分析仪。电极可直接或间接连到连接垫，经此接于来自信号源的导线。连接垫优选位于本发明装置的边缘或外周，其位置并不是本发明的要求。任选地，电极与连接垫之间的连接是经由位于基片一端的连接通路。在本发明仪器或装置的大部分应用中，装置将是一个能装载样品液体的流体容器或板的一部分，或者连接在该容器或板上，或者是在该容器或多孔板的内部。在这些实施方案中，连接垫可以位于流体容器上，或在带有一个或多个流体容器的板上。优选地，连接垫处在或靠近基片的一个或两个末端(参见，例如，图15，16)。
[00186]取决于用途，本发明的仪器或装置可具有任意适合的尺寸。在一个例子中，本发明装置可以具有一种尺寸来符合多孔微量滴定板，如，6-，12-，24-，48-，96-，192-，384-，768-和1,536-孔板的单孔的尺寸。在另外的一个例子中，本发明的仪器或装置具有与多孔微量滴定板相容的尺寸，并且具有依照多孔微量滴定板(如，6-，12-，24-，48-，96-，192-，384-，768-和1,536-孔板)的孔进行空间排列的多对电极。在另外的一个实施方案中，本发明装置具有与无底多孔微量滴定板相容的尺寸，并且具有依照多孔微量滴定板(如，6-，12-，24-，48-，96-，192-，384-，768-和1,536-孔板)的孔进行空间排列的多对电极。装置可以可逆地或不可逆地连接在一个无底的多孔微量滴定板上，以此装置一部分来组成孔底。在一些实施方案中，多孔微量滴定板的孔中的电极结构的电极区域大于孔的直径。从而，在本装置结合或连接到无底多孔板后，电极区域将覆盖孔底的整个表面。在其它的实施方案中，不是所有的孔都具有基于阻抗监测分子反应所需的电极结构。这一点当电极用非透光性材料制成时特别有用。例如，在图16(B)中，一个96孔板有92个孔包括检测电极结构，同时四个角的孔是没有电极结构的，这样这些孔中的分子反应可作为对照，可以使用光学显微镜或其它光学检测方法进行监测。同样的，利用在图16(B)中所示板，92个孔可以作基于阻抗的细胞监测，而四个角的孔是无电极结构的，这些孔中生长或培养的细胞可作为对照，并且可使用倒置光学显微镜进行监测。
[00187]本发明仪器可以具有任何合适数目的电极。例如，本发明仪器可以具有装配在基片上的至少四个电极，并且其中每个电极都有至少三个相邻的电极，电极阻抗是在一个电极和它的至少三个相邻电极之间检测的。优选地，每个电极具有可以足够至少10个细胞贴附或生长的表面区域。
[00188]在一种实施方案中，本发明仪器的电极或电极阵列可以包含一种针对内部应用的集成电路(ASIC)。优选地，ASIC包含一个开关电路，一个阻抗测量电路和一个电源。
[00189]在另一个实施方案中，本发明仪器包含一个阻抗测量电路。这个阻抗测量电路相当于一个阻抗分析仪，它可以检测本发明装置电极间的阻抗。优选地，本发明仪器可以还包括一个开关电路。
[00190]在另一实施方案中，本发明仪器的至少一对电极或一对电极阵列，就连接到阻抗分析仪或阻抗测量电路来讲，是可独立寻址。当有或没有分子反应发生在电极表面或电极结构表面时，这样一对电极或这样一对电极结构间的阻抗可以得到测量。“独立寻址”意味着电极阻抗可以直接地连接到这样一对电极或这样一对电极结构。
[00191]在另一个实施方案中，本发明仪器中包括电极，或电极结构，或阵列的传感器区域占用至少1％的仪器整个表面。在另一实施方案中，本发明仪器的传感器区域占用2％，5％，10％，30％，50％，70％，80％，90％，95％或甚至100％的仪器整个表面，该表面在使用仪器的检测过程中暴露于样品溶液。
[00192]在另一方面，本发明涉及一种监测分子反应的多孔微量滴定板，这种微量滴定板包括多个孔，至少有一个孔包含如上所描述监测分子反应的装置。
[00193]在另一方面，本发明涉及如上所描述的一种仪器，这种仪器基于阻抗监测细胞的行为。它可包含至少10个细胞，优选地，至少有50个细胞，贴附或生长于仪器表面。
[00194]在另一方面，本发明涉及一种基于阻抗监测细胞行为的多孔微量滴定板，这种多孔微量滴定板包含多个孔，至少有一个孔包含一个如上所描述的监测细胞-基片阻抗的装置。
[00195]本发明微量滴定板的一个孔，多个孔，或所有的孔，可具有一个或多个如上所描述的监测分子反应或细胞行为的装置。在一个例子中，至少有一个孔具有一个如上所描述的监测分子反应(或细胞行为)的仪器。
[00196]本发明微量滴定板所包含的电极或电极结构可以用任何合适的方式来排列。在一个例子中，就连接到一个阻抗分析仪或一个电极检测电路来说，至少一个装置上的至少一对电极或一对电极结构可独立地寻址。在另一例中，仪器的电极或电极阵列以“行-列”构型排列。这种多孔微量滴定板可以连接到一开关电路或进一步包含一个开关电路，例如，每个孔有一个电子开关电路。开关电路也可以“行-列”构型排列。另一例，在至少两个孔中，至少一个电极或电极结构共用一个位于本发明微量滴定板上的共用电连接垫。在另一个例子中，装置中的连接垫可连接到柔性电路。在这里，柔性电路是一种电路板，用于电连接一个阻抗检测电路或阻抗分析仪到监测分子反应和监测细胞行为的微量滴定板或仪器上的连接垫。柔性电路是由柔性材料制作(如一个柔性电路由一个夹于两个聚酰亚胺层之间的一个铜簿层构成)。微量滴定板孔中的传感器区域可覆盖任何合适百分比的微量滴定板孔的底面区域。例如，包含电极部件，电极或电极阵列的传感器区域可以占据至少1％的微量滴定板孔整个底面。优选的是，传感器区域可以占据至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％的微量滴定板孔整个底面。
[00197]本发明的多孔微量滴定板可以具有任何适合数量的孔，例如，6，12，24，48，96，192，384，768和1,536孔。为了将传感器电极置于微量滴定板构型内，可以使用多种组装方法。
[00198]其中的一种方法，是将一个无底板结合到电极或电极结构上，电极或电极结构被装配在例如玻璃或塑料材料的绝缘基片上。以96孔板为例，基片可以是单个塑料片或玻璃片，其上装配有全部的电极结构。在另一个例子中，基片可以由若干分开的基片组装而成(例如，2个基片每个分别对应48个孔，3个基片每个分别对应32个孔，4个基片每个分别对应24个孔，6个基片每个分别对应16个孔，8个基片每个分别对应12个孔，12个基片每个分别对应8个孔等)。包含电极结构的，被组装成96孔构型的基片可以是相同类型的基片或不同类型的板。不同类型的基片是指基片可以具有不同尺寸和/或具有不同数量的电极结构。
[00199]下面是一种示范性的实施方案，这里96孔板的组装是将无底的板结合到6块基片上，基片上有装配的或结合上的微电极。6个基片中的任一基片可以包含多至16个不同的电极结构，它们中的每一个对应于16孔中的一个。图15(A)显示了一个基片，上面装配有或结合有16个电极结构单元。图15(B)，显示了一个基片，上面装配有或结合有15个电极结构单元。基片(例如塑料或玻璃基片)上的电极结构可以使用多种方法装配，例如，光刻法和激光融蚀法。在一种示范性的实施方案中，基片的尺寸大约为77.2毫米×17.75毫米，电极结构由薄金膜(约0.2微米厚)覆盖在薄铬膜(约0.03微米厚)上形成。电极的形状可以是“圆在线上”构型，电极线宽度，电极线间隙和圆形直径分别为30/80/90(微米)，或其它几何形状。
[00200]将这种包含电极的基片组装到一个塑料，无底的板上，可以使用液体类的粘合剂，PSA(压力敏感粘合剂)，或塑料超声装配法，或任意其他适合的结合方法。
[00201]对于使用液体粘合剂，组装包含电极的基片到无底的多孔板(或简单的带孔板)，例如，粘合剂可被一个自动的液体分配机精确地分配到环绕每孔的底面。在这种分配液体粘合剂的操作中，孔板可颠倒放置。每个包含多至16个电极结构单元的基片可以通过，例如，一个“抓和放”的机器，被精确地安装到无底的孔板上。在液体粘合剂粘合后，基片被结合到无底的孔板上。使用液体粘合剂结合这些平板可使用以下步骤：(a)精确地将含有电极的基片放到孔板上，使基片和孔板之间具有很小的距离(例如100微米)；(b)将具有适当粘度的液体粘合剂施加到含电极的基片的边缘，利用毛细作用的力，液体粘合剂可以自动移动到含电极的基片与孔板之间的间隙。液体粘合剂充满到含电极的基片和孔板的间隙，且可以被固化。
[00202]就压力敏感粘合剂(PSA)方法来说，在两面带有支持性衬的双面胶上，可首先切割一些符合多孔无底微量滴定板孔底尺寸的一些孔。然后，剥下PSA一面的衬，PSA被精确地定位覆盖和压合在多孔板的底面上。另一面衬也可以被去掉。各个包含电极的基片可以利用将电极或电极结构对准到多孔板上的各个孔而定位到多孔板上。
[00203]图16(A)和16(B)显示了96孔板的底面，6个包含电极的装置组装在底部。在图16(A)中，每个装置有16X电极结构单元，并带有位于仪器边缘的连接垫(将连接垫连接在仪器的相对末端上是优选的)。如图16(B)所示，中间的四个装置，每一个都有16X电极结构单元，且带有位于装置边缘的连接垫。两面的装置有14X电极结构单元，也有位于装置边缘的连接垫。为了清楚地说明，电极结构细节，和连接垫与电极结构之间的电连接的细节在这些图中没有显示。
[00204]电子连接这种多孔板到外部阻抗分析仪是一种巨大的挑战，这是因为这些板的底面上的空间是有限的。操作时电极结构是面朝上。在一种将电极结构连接到外部的阻抗分析仪上的实施方案中，电子连接垫位于包含电极的基片的末端(例如：参看图12A和12B)。由于沿着多孔平板底面边缘的允许空间非常有限，电子工业中使用的连接器不能直接的在这种装置中使用。进一步说，由于多孔板的框架，从顶部到位于含电极的基片末端的连接垫的电连接可能没有可利用的空间。因为这个原因，必需一种特殊的设计将面朝上的连接垫连成底朝上。在一种方法中，一个小的具有直导线的PCB板(图13A所示)是面朝下，这些导线的一个末端是电连接到连接垫(图13B和13C)。于是导线的另一个末端可以从底面接触到。例如，一个长的，导电针可以被使用(例如，一个POGO销钉，细节可以在http://www.emulation.com/pogo/之类的网页中找到)(见于图13C)。图16显示了一个POGO-销钉支架的示意图，其中POGO-销钉可以接触连接到图13(A)和13(C)所示的小PCB板的导线上。在另外的方法中，可以使用一种柔性电路方法。在这个情况下，柔性电路的一端具有间隔相应距离的金属矩形线，并且可以被导电地结合到平板的边缘(图14A)。柔性电路可以包绕在传感器平板的底面边缘上(图14B和14C)。柔性跨接线的另一端也是金属线，可以用针结构导体接触连接(图14C)。图14C所示的柔性电路是一条定数目的金属线(图14C中的10根线)，组装到一块塑料片上。在类似的一个方法中(图14D，14E)，组成短夹(金属夹)的金属线(即电连接销钉)可以被用于相同的目的，即连接位于基片上表面的连接垫到基片底面。一种作为范例的短夹的细节可以在网页 http: //www.nasinterplex.com/short_clips/short_set.html中找到。在另一种方法中，线连接法可以用来连接含电极的基片上的连接垫到一个小的PCB板。PCB板上有可导电的通路孔，这样，可从底面去电连接PCB板。
[00205]在另外一种范例中，连接垫连到沿着无底多孔板的孔边缘或孔之间到顶面的导线。因此，可以从顶面实现电连接。
[00206]本发明装置的一种优选的构型是，连接垫位于仪器基片的相对末端。所有延伸自每个电极阵列的迹线在它们的任意末端构成了导电电路至连接垫，并且各个迹线间没有任何交叉。图4，12A和12B示范了从每个电极阵列到一个连接垫的迹线走向方式。
[00207]在另一个实施方案中，一种装配或制造的方法被用来在基片上某些特定的部位打孔。这些孔位于可以实现电连接到电极结构的位置上。这些孔可以在基片上镀薄膜时镀金。在基片上装配和制作电极结构后，基片上的孔可以被进一步的填充导电膏。在包含电极的基片被粘贴和结合到一块多孔板上后，可以在多孔板底面，在导电膏填充的孔相应的位置上实现阻抗检测电路或仪器的电连接。
[00208]在另一种方法中，无底多孔板可以结合到有一金属薄膜层的基片，或者有底微量滴定板或其它板的孔底面可以镀上金属层。而后，激光融蚀法被用于直接装配电极结构。可使用如上所描述的多种连接方法实现电连接这些多孔板上的电极结构。
[00209]在一个例子里，一个16X-单元的装置可以使用光刻法装配在玻璃基片上。最终的玻璃基片的尺寸是75mm×22mm，同时金镀层厚度约0.2微米，铬镀层厚度约0.03微米。不同形状的电极可按2排8列结构排列在16X-单元的装置上。电极连接垫可位于基片的长边。
[00210]为了构造测量装置，制造了一个适于16x装置的尺寸的，无底16x塑料孔条带。每个孔都是圆锥形的，孔的顶部直径大约为6.5mm而底部直径为5mm。在底部的5mm直径为电连接垫确保了足够的空间，电连接垫可连接到外部的阻抗分析仪。塑料孔条带的底面包含连续的通道，这些通道连接到2排8列的塑料孔中间的一个开口上。相对于16X玻璃片装置来说，塑料孔条带的底面是足够平的。
[00211]为了将16X塑料孔条带结合到16X-单元基片上，16X孔条带可以被紧紧的固定在16X-单元基片。一种生物相容性的，硅为基础的粘合剂被注入塑料条带中的开口中。多种粘合剂可以在塑料条带底面上的通道中运动。在粘合剂固化后，塑料条带被紧紧的固定在16X-装置上。另外一种将16X塑料孔条带固定到16X-单元基片上的方法是使用双面胶(例如，压力敏感粘合剂)。在这种方法中，粘合剂被处理或机械处理，它将有16个孔，这些孔的位置是与16X塑料孔条带上的16个塑料孔，或16X基片上16个电极单元的位置相对应的。粘合剂16个孔的直径是与塑料条带上的孔的直径相同或类似。在装配过程中，粘合剂一面的支持衬被剥落，再与塑料孔板对准，以达到每一个粘合剂孔与一个塑料条带的每一个孔对准，并固定上去。在这个过程后，粘合剂的另一面也剥落，接着，16X基片可对准并结合到已经结合到塑料孔条带上的粘合剂上。
[00212]本发明的另一方面是关于用来制造多孔板的一种方法，多孔板可用于基于电阻抗测量的分子分析，或用于基于基片上装配的电极的细胞电穿孔，或用来基于电阻抗对细胞的贴附，细胞的生长或细胞的生物状态进行监测。本发明的方法包括(1)提供一种绝缘基片，(2)在所述的基片上镀导电薄膜，(3)使用激光融蚀导电薄膜的方法模塑导电薄膜以制作电极或电极结构，(4)将薄膜模塑的基片组装到无底多孔板上，以形成包含电极的多孔板。在本发明方法优选的一种实施方案中，基片的制作材料可以从玻璃，聚合物，塑料，陶瓷，玻璃纤维，或它们的组合中选择。为了准备镀导电薄膜，基片可以用适当的程序进行清洁。许多清洁玻璃，硅晶片，塑料-器皿的实验室程序都可被用来清洁基片。在一些情形下，基片表面的机械清洗是获得干净基片的必要步骤。
[00213]在本发明方法的一种优选实施方案中，镀于上述基片上的导电薄膜可以是金属薄膜，包括金，铬，镍，铜，铂，铝，钨和其它金属。可以有两种或超过两种的金属种类被用于电导薄膜。例如，铬薄膜可被用作为玻璃或塑料基片的一个粘附层，而金或铂薄膜被进一步的镀在粘附层上。也可以使用其他电导薄膜。例如，可使用氧化铟-锡。在其他的例子里，可使用导电聚合物薄膜。可以使用多种方法镀导电薄膜，例如热蒸发，电子束蒸发，阴极溅镀，这些方法的采用依赖于基片的材料和产生的导电薄膜种类。导电薄膜可以具有不同的厚度，它依赖于导电薄膜的电导率和所需的电导和电阻，导电薄膜的厚度可以薄至小于100nm，或厚至大于1微米。
[00214]在本发明方法的一种优选实施方案中，激光融蚀掩膜被用于模塑产生所需的电极中。激光融蚀掩膜上的几何图形与其底上装配的电极或电极结构的几何图形相同。激光融蚀掩膜的模具的几何形状可以与制作的电极或电极结构尺寸相同。激光融蚀掩膜的模具的几何形状的尺寸也可以大于制作的电极或电极结构的尺寸。例如，可以使用一个2X，或3X的掩膜，就是说，掩膜上的模具的尺寸是制造的电极或电极结构的尺寸的2或3倍。在使用激光融蚀对掩膜制作电极进行薄膜模塑时，掩膜被置于薄膜包被的基片(在其上发生薄膜模塑)和具有适当光通路的激光源之间。
[00215]激光源将提供一种具有特定几何图形(例如，200微米宽，2毫米长)的光束，其强度是相对均匀的。这种激光束扫描整个掩膜，并通过适当的光通路(例如，包括透镜)到达基片。激光束将会融蚀与掩膜上激光束透过的区域相对应区域的薄导电膜。在薄导电膜上与掩膜上激光束不能透过的区域相对应的区域，激光束将被阻断。虽然其它激光可以被用于激光融蚀薄导电膜，UV激元激光是特别适用于在玻璃或聚合物基片上的金属薄膜的模塑。例如，可以使用193nm和248nm之间的激态原子激光。
[00216]融蚀薄导电膜要适当的能量强度。例如，一个强度在0.5-1.5J/cm2的能量，可以被用于融蚀玻璃基片上0.2微米厚的金薄膜(带有一个0.0075微米-0.03微米厚的铬基底层)。那些可以熟练运用激光在基片上融蚀薄膜的人，可以容易地确定融蚀不同厚度薄膜所需的激光的波长，能量强度(能量密度)，激光脉冲时间和激光脉冲数量。这里引用下列文章或出版物，它们提供了激光融蚀基片上薄的基本信息：“Excimer laser ablation of thin gold films on a quartzcrystal microbalance at various argon background pressures”，by Zhang，X.，S.S.Chu，J.R.Ho，C.P.Grigoropoulos，in Appl.Phys.A：Material Science & Processing，volume 64，pp545-552，1997；“Metal film removal and patterning using a XeCllaser”，by Andrew J.E.，Dyer P.E.，Greenough R.D.and Key P.H.，in Appl.Phys.Letter，Vol.43(11)，pp1076-1078，1983；“Excimerlaser processing of thin metallic films on dielectricsubstrates”，by Sowada U.，Kahlert H.-J.，and Basting D.，in SPIE(High Power Lasers：Sources，Laser-MaterialInteractions，High Excitations，and Fast Dynamics)，vol.801，pp163-167，1984.
[00217]我们使用的激光融蚀金/铬薄膜的参数如下：(1)3X掩膜；(2)激光能量强度为0.5和1J/cm2，激光波长为248nm；(3)掩膜和基片的同步移动，基片的移动速度多至10mm/sec。为了确保电极间隙上金薄膜的全面去除，我们使用了多于一次的激光融蚀。
[00218]为了制造本发明装置的电极或电极结构，激光融蚀可被用于模塑基片上的导电薄膜，这是由于本发明装置的电极(或电极结构)具有大面积(例如，大于0.3mm2，1mm2，甚至5mm2，或甚至20mm2)，并且由于电极结构的相对精细(例如，电极部件为100微米宽，它们之间的间隙为20微米)，激光融蚀掉的导电材料可能回到基片的表面，导致了模塑后的基片出现一种再沉积的问题，这将影响薄层模塑的基片质量。
[00219]这里的质量问题包括，在处理过后，基片表面有多干净；用于模塑的激光融蚀过程是如何可重复；是否会发生导电电极表面上的融蚀材料再沉积；是否会发生电极间隙上的融蚀材料再沉积。为了使处理好的装置上的电极能够恰当地进行电阻抗测量或保证从一个装置到另一个装置能重复性地进行电阻抗测量，这种再沉积必须清除或去除。
[00220]本发明的一个重要的方面包括，如何来解决“再沉积问题”。在一种发明的方法中，一种很容易被像水或丙酮的溶剂去除的材料构成的薄的“舍弃”膜，可在激光融蚀前被沉积或包被在基片上。优选地，这个“舍弃”膜是薄的和均匀的，并且是很容易被激光融蚀过程去除的。“舍弃”膜的厚度可以是任意的。然而，优选地，“舍弃”膜的厚度小于5微米，或小于1微米，或小于0.1微米。“舍弃”膜可以是光致抗蚀剂材料或来自浓稠肥皂液的沉积物。因此激光融蚀过程可在带有“舍弃”膜的基片上来进行。在激光融蚀后，将以一种简单的使用一些溶剂的步骤来除去基片上的“舍弃”层。使用“舍弃”膜将能解决出现在模塑的电极表面上的再-沉积的问题。在另一种被发明的方法中，在激光融蚀电导薄膜后，激光处理后的基片可被彻底清洗以去除再沉积物。
[00221]例如，激光处理后的基片可被放置在清洗溶液中，例如，酸(1M HCl)和/或碱(例如1M NaOH)溶液，处理一段时间(例如，1小时，3小时，5小时，8小时，12小时，或者甚至是24小时)。当激光处理后的基片放置到其中时，溶液可以被搅动。这种搅动可以用超声波或简单的机械搅棒实现。经过这些处理，一些再沉积物可以被去除。在另一清洁激光处理基片的例子，可以使用机械擦洗基片来进行清洁。这种擦洗可以使用浸水，或酸，或其它溶液的棉球(或Q-tip，或药签)。另一清洁激光处理基片的例子，可以将以上描述的清洗溶液和机械洗擦的两个例子的清洁方法合并使用。
[00222]在一种实施方案中，可使用双面压力敏感粘合剂将薄膜模塑的基片，组装到无底多孔板以构成包含电极的多孔板。在另外的一种实施方案中，可使用液体粘合剂将薄膜模塑的基片组装到无底多孔板以构成包含电极的多孔板。上面已描述了使用液体粘合剂或双面压力敏感粘合剂实现将带有薄膜模塑基片固定到无底多孔板的示范步骤。
[00223]在非优选的实施方案中，其他制作装配本发明基片上电极的方法也可以被使用。例如，电极部件，电极或电极结构可以利用任何适合的方法装配到绝缘基片的同一面上，例如光刻蚀法。一个电极阵列里的电极或电极部件可以利用适当的微装配法或显微机械法作装配到基片上(可见于，例如，“Lithography”，”，in Fundamentals ofMicrofabrication，1997，Chapter 1，pp1-50，edited by MarcMadou，CRC Press)。一种典型的方法是使用光刻蚀法的方法来制造这种电极。作为一种非限制性的例子，利用光刻蚀法的方法在固体的基片上生产电极阵列的方法描述如下。基片可以是任意适合的材料的，如，玻璃。这个过程开始于一片清洁的玻璃，玻璃首先被镀上一层薄的，铬或钛的粘附层(例如10nm)，然后再镀上一层100-200nm厚的金。镀膜可以通过一种真空蒸发法获得。而后，微米厚的光致抗蚀剂材料被旋转包被在金薄膜上，然后，通过一个包含所需电极阵列图象的掩膜暴露于UV下。被暴露的光致抗蚀材料通过光致抗蚀剂显影剂而显影，而金与铬的镀层分别在随后的过程中被KI/I2和K3Fe(CN)6/NaOH蚀刻。掩膜通常是使用电子束书写技术在极高分辨率的板上产生的。
[00224]其它技术也可以用于装配基片上的电极。例如，一种电极模式可通过使用激光融蚀法制作。利用激光融蚀法，基片的一面首先被镀上一薄层的金属膜(例如，一个大约0.2μm的黄金膜覆盖在一个25nm厚的铬基底层上)，这个过程可使用例如蒸发镀和/或溅射镀膜的方法。而后，这个金属薄膜通过一个包含所需的电极阵列图象的掩膜板暴露于适当强度的激光下(例如，一种在248nm下的激元激光)。在掩膜上“透过”激光的区域上，激光击中的金属膜并与之反应，从而金属膜就从基片上融蚀掉。因为基片(例如玻璃或塑料)对激光的反应不同于金属膜对激光的反应，可以选择适当的激光条件(波长，强度，脉冲宽度)，以使激光能融蚀掉金属膜，同时不影响或极小地影响基片。在掩膜“阻断”激光的区域，金属膜被保留在基片上。掩膜通常是使用电子束书写技术在极高分辨率板上产生的。那些可以熟练的运用激光融蚀法并利用此法模塑薄膜的人，可以容易的选择适当的步骤及激光的波长，强度，在聚合物膜上生产电极的掩膜。
[00225]还有其它的微装配法或微机械法，可用在不同的基片上装配电极或电极部件。例如，网板印刷的方法和用于制造印刷电路(PCB)的方法都可用来在不同基片上制造电极或电极结构。那些能熟练的运用微装配和微机械法的人，可以容易地依照所需基片材料和电极材料，和所需电极或电极部件的几何分辨率，选择适当的制作方法。
[00226]在本发明装置的另一个实施方案中，装置采用微电极条带或电极条带形式。这种电极条带或微电极条带的例子可见于图11和18。在电极条带的一个实施方案中，一种矩形的绝缘基片用作条带，其上有装配或结合上去的微电极结构单元。绝缘基片条带的不受限的例子包括聚合物膜，玻璃，塑料片，陶瓷，绝缘体-在-半导体上，玻璃纤维(类似于那种用于制造印刷电路板的玻璃纤维)。电极结构单元具有不同的几何形状，可以利用任何适合的微装配，微机械，或其它方法被装配或制造在基片条带上。电极几何形状的非受限的例子包括交错的电极，圆在线上的电极，菱形在线上的电极，齿形电极或正弦曲线的电极。这些电极几何形状的特征尺寸是可以变化从小于5微米，或小于10微米，到大于200微米，大于500微米，大于1毫米。电极几何形状的特征尺寸是指电极部件的最小宽度，或邻近电极部件间的最小间隙，或电极几何形状上反复出现的一个特征的尺寸。可选择的是，这些尺寸可以用电极宽度和电极间隙的形式来描述。从而，电极宽度和电极间隙可以小到小于5微米，或小于10微米，大到大于200微米，大于500微米，大于1毫米。
[00227]本发明的电极条带(或微电极条带)可以有任何几何形状。电极条带的一种示范性的几何形状是矩形，条带的宽度为小于50微米到大于10毫米，条带的长度为小于60微米到大于15毫米。例如，一种电极条带可以有200微米宽，20毫米长的几何形状。一个单一的微电极条带可以具有两个电极作为一个测量单元，或多个这样的“两个电极”作为多个测量单元，或单个电极结构单元作为测量单元，或多个电极结构单元作为多个电极结构单元。在一种实施方案中，当多个电极结构单元被装配在单个微电极条带上时，这些电极结构单元是沿着条带的长方向定位的。电极结构单元可以是正方形，或矩形，或圆形的。每个电极结构单元可能具有的尺寸从小于50um×50um，到大于2mm×2mm。在图18中所示的实施方案中，电极条带包含8个测量单元，它们中的每一个都是一个单独的可用于进行分子检测反应测量的电极结构单元。在这个例子中，有从每个电极结构单元中伸出的电连接线。在每个电极结构单元中电极结构间的阻抗就是在这样的两个电连接线间测量得到的。然后，这两个电连接线被连接到位于电极条带边缘的电极连接垫上。而后，外部的阻抗分析仪或阻抗测量电路被连接到这些连接垫，用于测量电阻抗。电极结构单元的表面可以被包被有或覆盖捕捉分子，或锚定分子。不同捕捉分子或锚定分子可被用于不同的电极结构单元表面。为了使用这种电极条带，具有多个开口的塑料壳可被结合到电极条带上来构成“电极条带单元”或“电极条带测试单元”，可使用不同结合方法，包括液体粘合剂，粘合带(例如双面压力敏感性粘合剂)。塑料壳上的每个开口都位于每个检测单元(也就是电极结构单元)相应的位置上，以用做为液体样品的检测孔。在将电极条带结合到塑料壳上后，样品溶液可以被加到每个孔来进行分子检测。在使用电极条带的另一个实施方案中，塑料壳上的每个开口可以包括两个或更多的测量单元。
[00228]还有其它的使用电极条带的方法。在一种方法中，液体样品可通过多孔材料，可以被放置在电极条带上，而后塑料壳被结合到电极条带上，并且包围多孔材料。塑料壳可以具有一个或更多的开口。每个开口将围绕至少一个测量单元。因为多孔材料允许液体样品通过，加入液体样品到多孔材料中，将导致样品被加到电极条带的所有区域。
[00229]本发明的另一个方面，是关于一种获得电极条带单元(或电极条带测试单元)的方法，这种电极条带单元用于基于电阻抗测量的分子检测，或基于装配于条带上的电极或电极结构的细胞电穿孔，或基于电阻抗监测细胞贴附，细胞生长或细胞生物状态。本发明的方法包括，(1)提供一个绝缘的基片；(2)在所述的基片上镀导电膜，(3)通过导电膜的激光融蚀法模塑导电膜来制造电极或电极结构，以获得模塑的基片。(4)任选将薄膜模塑的基片切割成为确定几何图形的电极条带，任选所述薄膜模塑的基片用作电极条带；(5)装配所述电极条带到包含至少一个开口的塑料壳上形成一个电极条带单元，在其中，所述至少一个开口是与电极条带上的电极或电极结构是对齐的。在本发明方法的一种优选实施方案中，基片的制作材料可选自聚合物，塑料，玻璃，陶瓷，玻璃纤维，或上述材料的组合。为了镀导电薄膜，基片可以用适当的程序清洁。许多实验室清洁玻璃，硅晶片，塑料-器皿的程序都可被用于基片的清洁。在一些情形下，获得干净-基片的必要步骤包括对基片表面的机械擦洗。
[00230]在本发明的一种优选实施方案中，在所述基片上镀导电膜，以便制作电极条带，所述导电膜与那些适合于制作上面描述的多孔板的膜是相同的或类似的。同样的，激光融蚀法是优选的用来薄膜模塑，以装配所需微电极的方法。
[00231]薄膜模塑的基片可以按适当的或所需的几何形状和尺寸切割为条带或电极条带。例如，薄膜模塑的基片可以是20mm×30mm的矩形。在薄膜模塑后，电极或电极结构适当的排列在基片上，基片可以被切割为15个电极条带，每一个条带的尺寸都为2mm×20mm，并且具有恰当的可被使用的电极或电极结构。
[00232]在一个实施方案中，可以使用双面压力敏感性粘合剂组装一个电极条带到塑料壳中，构成一个电极条带单元或电极测试条带单元。在另一个实施方案中，可以使用液体粘合剂，组装一个电极条带到塑料壳中，构成一个电极条带单元或电极测试条带单元。在本申请的上面内容中已描述了通过使用液体粘胶或双面压力敏感粘合剂，实现将带有薄膜模塑的基片，固定到无底多孔板的示范方法。
[00233]在本发明系统的一种优选实施方案中，装置，仪器或系统中所包含的电极，通过至少包含两个连接垫连接到一个阻抗分析仪或阻抗测量电路。电极可以直接的或间接的连接到一个连接垫上，在那里它们连接到来自于阻抗测量电路或阻抗分析仪的导线。优选地，连盘位于本发明装置或仪器的边缘或外周上，但这不是本发明所必需的。电极与连接垫之间的连接可以任选地经由一个位于装置边缘的连接通路。在本发明装置的许多应用中，装置将作为一个仪器的部分，并且附着在可以容纳溶液样品的板或流体容器上，或放置其内。在这些实施方案中，连接垫可以被置于流体容器上，或置于包含一个或多个流体容器的培养板上，并且优选地置于或靠近装置边缘或外周。
[00234]在本发明的优选实施方案中，包含本发明装置的系统也包含界面电子仪器，包含阻抗测量电路和开关(例如，电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路到本发明仪器的不同的电极结构单元。优选地是，本发明的系统也包括一台计算机，它具有能够实时检测或监测本发明仪器的电极或电极结构之间的阻抗的软件程序。测量阻抗数据可以被自动的分析和处理以获取适当的参数(例如，分子反应指数，或细胞数目指数)，并且显示在监视器上。
[00235]优选地，软件程序具有一种或更多的下列的功能：(1)电子转换，以连接阻抗测量电路(或分析仪)到本仪器的多个电极单元(或电极结构单元)中的一个；(2)控制阻抗测量电路(或分析仪)来测量电极或电极结构间在一个或多个频率的阻抗；(3)处理获得的阻抗数据，得到适当的生物学相关参数(例如，分子反应指数，或细胞数目指数)；(4)将结果显示在监视器或存储起来；(5)以规则或不规则时间间隔，自动执行所述1到4的功能。
使用本发明装置的方法
[00236]本装置和多孔微量滴定板可检测生理离子浓度或非生理离子浓度状态下的阻抗。再者，装置和多孔微量滴定板也可对悬浮于包含电极或电极结构的孔中的细胞或贴附于所述孔表面的细胞实行电穿孔。可使用具有适当的电压振幅，波形，持续时间，脉冲数量的电穿孔程序，以便对电极或电极结构单元施加适当的电压脉冲，以产生足够强的电场来电穿透细胞膜。本装置或微量滴定板可用于悬浮细胞和贴附细胞的电穿孔，但本装置或微量滴定板是更适用于对贴附细胞的电穿孔。
[00237]使用本装置或多孔微量滴定板对贴附细胞电穿孔的方法包括，(1)提供如上描述的多孔微量滴定板，至少有一孔的底面含有电极或电极结构单元；(2)使细胞贴附或生长在含有电极结构的孔中，(3)在电极上施加电压脉冲，导致粘附在孔底面上的细胞的膜被电穿孔。使用本装置或多孔微量滴定板对悬浮细胞进行电穿孔的方法包括：(1)提如上描述的多孔微量滴定板，至少有一孔的底面含有电极或电极结构单元；(2)在含有电极结构的孔中加入细胞；(3)在电极上施加电压脉冲，导致孔内的细胞的膜被电穿孔。根据不同的实验，可确定，具有适当电压振幅，波形，持续时间，脉冲数量的电穿孔条件以达到最佳电穿孔效率。在已发表的文章和出版物中，已提供了电穿孔的一般指南和可能的具体条件。这些出版物中的一些被引用在这里，包括“Cell electropermeabilization：a new tool for biochemical andpharmalogical studies”，by Orlowski，S.and M.Lluis，inBiochim，Biophys.Acta，Vol：1154，pp51-63，1993；“Electroporation of cell membranes”，by Tsong，T.Y.，Biophys.J.Volume 60：pp297-306，1990；“Electroporation of adherentcells in situ.”，by Raptis，L.and K.L.Firth in DNA CellBiology，Vol.9，pp615-621，1990；“Electroporation of adherentcells in situ for the introduction of nonpermeant molecules”，by Raptis LH，Firth KL，Brownell HL，Todd A，Simon WC，BennettBM，MacKenzie LW，Zannis-Hadjopoulos M.，in Methods MolocularBiology，Vol.48，pp93-113，1995；“Recovery of Adherent cellsafter in situ electroporation monitored electrically”，byWegner J.，Keese C.R.，Giaver I.，in Bio Techniques，Vol.33，pp348-357，2002。
[00238]在另一个方面，本发明提供一种用于监测靶分子的方法，这种方法包括：a)用上述的装置或多孔微量滴定板来监测分子反应，b)加入包含靶分子的样品溶液或疑有靶分子的样品溶液到上述的装置中；c)在装置中孵育样品，使靶分子捕捉到捕捉分子；并且d)监测电极之间的阻抗变化来监测溶液中靶分子的存在或数量。
[00239]在另一个方面，本发明提供了可用于检测样品溶液中靶分子的检测方法，该方法包括：a)提供一种装置，该装置包括1)一块绝缘基片，2)装配在基片同一个面上的至少两个电极，3)上述基片上的至少两个连接垫，其中，上述的至少两个电极分别连接于上述的至少两个连接垫；b)加入包含靶分子的样品溶液到上述的装置中；c)在装置中孵育样品溶液，使靶分子结合到电极表面；d)在装置中加入包含报道分子的溶液；e)在装置中孵育步骤d)的溶液，使靶分子与报道分子相结合；f)监测电极间的阻抗变化来监测溶液中靶分子的存在或数量。
[00240]本方法可用于监测，任何与在电极表面发生的分子反应相关的适当参数。例如，本方法可以进一步测定样品溶液中靶分子的量或数目。
[00241]另一方面，本发明提供了一种监测细胞贴附或生长的方法，该方法包括：a)提供一种上述的用于监测细胞-基片阻抗的仪器或多孔微量滴定板；b)细胞在上述的仪器或多孔微量滴定板的孔表面进行贴附或生长；c)监测电极或电极阵列之间的阻抗来监测上述细胞在上述的仪器或多孔微量滴定板表面上的贴附或生长。
[00242]本方法可用于监测，任何与细胞贴附或生长相关的适当参数。例如，本方法可以通过监测阻抗来确定在仪器或多孔微量滴定板表面上贴附或生长的细胞的量或数目。
[00243]本方法可用于确定被检化合物是否能够调节，即增加或减少细胞贴附或生长，或用于筛选所述调节物。例如，本发明方法可以监测在被检化合物存在或不存在时细胞的贴附或生长情况，并通过这种方法来确定上述的被检化合物是否调节细胞贴附或生长。通常如果一种被检化合物的存在导致细胞贴附或生长增加，这种化合物就被确定为细胞贴附或生长的刺激物。相反的，如果一种被检化合物的存在，导致细胞贴附或生长减少，这种化合物就被确定为细胞贴附或生长的抑制物。
[00244]本方法可用于监测活细胞的贴附或生长。例如，当只有活细胞可以贴附或生长在本发明所述的仪器或多孔微量滴定板的孔表面上时。可以进行本发明所述方法，该方法可用于监测活细胞贴附或生长或死亡细胞的脱离。进一步，本方法还可确定活细胞或死亡细胞的量或数目。这种方法也可用于监测在某一被检化合物存在和不存在的状况下的细胞贴附或生长，从而测定该被检化合物是否可以调节细胞的存活力。在另一个例子中，该方法可用于检测生长因子对细胞贴附或生长的刺激作用，并可用于从被检化合物中筛选出生长因子拮抗剂。
[00245]通过阻抗测量可以监测和分析影响细胞贴附和生长的各种条件。一般来说，对于贴壁细胞，存活的细胞贴附或粘附到基片上。当细胞死亡后，它们开始失去在基片上的贴附作用，通过细胞-基片的阻抗变化可以监测这种脱离现象。例如，本发明可被用于细胞毒性的检测，和监测并且确定细胞的生理学和健康状况。具有细胞毒性或者是被疑有细胞毒性的化合物被加入到含有细胞的培养室/孔中。化合物可能会导致细胞死亡，这是通过不同的机制，例如细胞凋亡和坏死。当细胞从最初的存活状态死亡，改变了细胞贴附状况。典型的现象是它们会失去对表面的贴附。这种贴附的丧失可以很容易通过本发明的阻抗的变化来监测。因而，本发明可实时监测细胞毒性过程。
[00246]在另外的例子中，这种检测可用于监测细胞增殖。当细胞进入分裂期后，越来越多的细胞在电极表面生长，这将导致一个大的阻抗变化，此处所述的阻抗变化是相对于当没有细胞存在或没有细胞贴附到电极表面时的电极阻抗基线。
[00247]该方法可用于监测任何适当的细胞的贴附或生长，示例性的细胞包括动物细胞，植物细胞，真菌细胞，细菌细胞，重组细胞和培养细胞。
[00248]在另一方面中，本发明提供了一种监测细胞贴附或生长的方法，该方法包括：a)提供一种上述的多孔微量滴定板；b)使细胞在上述的多孔微量滴定板的孔中贴附或生长，其中每个孔都含有基本相同数目的相同类型的细胞以及一系列不同浓度的被测化合物；c)通过监测以时间为函数的电极或电极阵列间的阻抗来监测上述被测化合物对细胞贴附或生长的影响。
[00249]在一个实施方案中，这种方法可以进一步包括确定每孔中活细胞的数目。在另一实施方案中，这种方法可以进一步包括确定被测化合物是否是细胞生长的拮抗剂。在另一实施方案中，这种方法可以进一步包括确定被测化合物的剂量反应曲线。
[00250]本发明所述的仪器，微量滴定板和方法可以被用于监测细胞，组织，或器官的生物的，生理的和病理的过程，如，细胞生长，细胞死亡，细胞毒性和细胞分裂等。
[00251]检测细胞毒性，细胞死亡，细胞存活的关键包括确定死亡细胞数目和存活细胞数目。用于检测细胞毒性，细胞死亡，细胞存活的方法包括：1)检测细胞内ATP浓度以确定细胞存活(基于荧光的探测系统)；2)MTT检测，检测细胞内酶的活性来确定细胞存活(比色法)；3)凋亡细胞的特异性染色，例如TUNEL检测，通过荧光染色的细胞确定死亡细胞。所有的常用或经典的细胞毒性，细胞死亡，细胞存活检测方法都有其局限性，其中实验复杂，需要使用昂贵的化学试剂，并且都是提供终点结果而不能提供动力学信息。
[00252]对于细胞存活检测，生长因子是细胞存活所必需的。从而，使用生长因子拮抗剂处理，通过干扰生长因子信号传导途径可导致细胞死亡。下面例举了细胞接种和生长的步骤：1)用12ml的EGM培养基(生长培养基)将1×106个3T3细胞接种在75cm2组织培养瓶中；2)在细胞贴附过夜后更换生长培养基；3)再培养3天后再次更换生长培养基，并允许细胞再生长两天。
[00253]下面举例说明了细胞存活检测的步骤：1)胰酶消化75cm2培养瓶中细胞，并以100ul体积中1×104个细胞/孔在96孔板中接种细胞，在生长培养基中培养细胞过夜；2)移出生长培养基，换入不含生长因子的培养基，饥饿细胞24小时；3)加入系列稀释的生长因子拮抗剂到每个孔中，孵育培养物1小时；以及4)在每个孔中加入相应的一种或多种生长因子，持续培养细胞3天。
[00254]下面举例说明了MTT检测步骤：1)72小时(3天)后，在每个孔中加入15ulMTT染色液；2)在37℃，95％空气/5％CO2的培养箱中孵育4.5小时；3)加入100ul终止液，并且在37℃，95％空气/5％CO2的培养箱中孵育培养板过夜；4)在ELISA读板仪上用570/630nm的波长读板。来自读板仪的数据可以使用Excel为基础的统计数据分析模板进行分析并且制作剂量反应曲线或IC50(50％抑制浓度)。
[00255]本发明所述的仪器，微量滴定板和方法，结合上述步骤，可通过检测电极阻抗的变化来检测细胞的总数。阻抗变化和电极上细胞数目的相关性可以被确定。这种相关性可以是线性的或非-线性的。对于细胞毒性，细胞死亡，细胞存活的检测，本仪器、微量滴定板和方法相对于传统方法的优势在于：(1)在细胞接种到孔和/或在化合物加入到孔后，本发明可全自动地监测细胞的状况；(2)本发明用于监测细胞状况的检测方法不需要检测细胞状况试剂；(3)本发明用于监测细胞状况的检测方法可以提供动力学的信息。
[00256]下面的例子说明了一种用本发明所述的仪器，微量滴定板和相应方法检测细胞存活的方法。(1)提供一种本发明所述的微量滴定板来监测细胞-基片的阻抗，电极表面包被了一层特殊的贴附增强分子；(2)在T75烧瓶中用胰酶消化细胞；3)依照相当于每个96孔板的孔中含有100ul体积的1×104个细胞的表面密度接种细胞到微量滴定板的孔中，然后在生长培养基中培养细胞过夜；4)取出生长培养基，换入不含生长因子的培养基，然后饥饿细胞24小时；5)在微量滴定板的每孔中加入系列稀释的生长因子拮抗剂，孵育培养物1小时；6)在微量滴定板的每孔中加入相应的生长因子；7)再持续培养细胞3天，并且在3天内随时间监测在每个孔中电极或电极阵列之间的阻抗变化；8)分析阻抗的变化，从阻抗的变化中得出细胞数目或细胞数目指数。
[00257]本发明所述的仪器或多孔微量滴定板可在本发明所述方法中单独使用，也可以被用作为大型装置或系统的一部分。
[00258]本发明所述方法可以手动操作。该方法也适于高通量操作模式。在一个实例中，本方法可被自动操作。在另外的一个实例中，本方法可用于监测分子反应。
[00259]图19图解了基于阻抗检测的，监测分子结合反应的工作原理。
[00260]图19(A，C，E和G)是本发明的一个装置的横截面图，显示了两个电极。“Y”符号表示的捕捉分子，是被锚定，放置，导入，或结合到电极表面的。捕捉分子可以是任何分子，它可以与样品溶液中的被测量或被监测的靶分子相互作用。捕捉分子可以是抗体，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与靶分子相互作用或结合的分子。例如，抗DNA/RNA杂合分子的抗体可作为捕捉分子。这样的抗体可被直接吸附到电极表面。或者，这样的抗体也先用生物素分子标记，以便生物素修饰的抗体可经亲和素-生物素结合固定于亲和素修饰的电极表面。例如，用链霉亲和素分子做捕捉分子。这时，被测的靶分子用生物素分子标记，以便生物素标记的靶分子通过生物素-亲和素相互作用在电极表面与捕捉分子即链霉亲和素分子结合。
[00261]图19(A)示意了检测包被、覆盖、或修饰有捕捉分子的电极的背景阻抗Z0。捕捉分子可用任何合适的物理或化学方法被锚定，放置，吸附，或结合于电极的表面。适用的物理方法包括但不局限于被动吸附，用分子溶液旋转包被后再干燥，将分子溶液点样于电极结构单元表面。适用的化学修饰方法包括但不局限于：分子自组装，在表面进行化学反应。用物理或化学方法可用锚定化学分子来修饰电极表面。
[00262]图19(B)是本发明的一个装置的横截面图，显示了带有捕捉分子的两个电极。在电极表面的捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。靶分子可以是任何与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑含有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡聚苷酸，或任何可以与捕捉分子相结合或相互作用的分子。图B所示是阻抗Zm的测量，测量用结合靶分子的捕捉分子修饰的电极。图(A)和(B)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为Zm，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(A)和靶分子与捕捉分子结合后的情形(B)。
[00263]图19(D)是本发明的一个装置的横截面图，显示了带有捕捉分子的两个电极。在电极表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号表示。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Zo)，换句话说，可以放大检测信号。靶分子可以是任何与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑具有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相互作用或结合的分子。(D)显示的是检测电极的阻抗ZmL，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(C)和(D)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为ZmL，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(C)和靶分子与捕捉分子结合的情形(D)。图19(D)中的标记分子或标记颗粒被用于放大或进一步的增大阻抗的改变(ZmL-Zo)。标记分子的一个非受限的例子，是某些大有机分子，它在电极上出现后会影响电极表面的离子或电子通过，将导致测量的电极间阻抗的大的变化。标记颗粒的一个例子可以是纳米级的绝缘颗粒，半导体颗粒，或甚至导电颗粒。这种纳米级的颗粒的存在将会影响电极表面的离子或电子通路，将导致电极间阻抗的大的改变。在此，标记分子或颗粒可以直接经共价键(或任何其它类型的键合)或间接经识别分子对，如生物素-亲和素，糖-卵磷脂，抗原-抗体，和受体-配体与靶分子结合。
[00264]图19(F)是本发明的一个装置的横截面图，显示了含有捕捉分子的两个电极，在电极的表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号做表示。捕捉分子与靶分子形成了一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Z0)，换句话说，可以放大检测信号。在这里，由标记分子或颗粒所造成的信号放大是通过标记分子或颗粒与溶液中一些反应分子(R)发生特定反应实现的。反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，导致电极间的阻抗ZMP。靶分子是任何可以与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑具有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，多肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相互作用结合的分子。图19(F)显示的是检测电极的阻抗Zmp，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(E)和(F)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为Zmp，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(E)和靶分子与捕捉分子结合的情形(F)。图19(F)中的标记分子或标记颗粒被用于扩大或进一步的增大阻抗的改变(Zmp-Zo)。图19(F)中标记分子或颗粒的信号放大是通过标记分子或颗粒与溶液中某些反应(R)分子发生特定反应实现的，反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，将会影响电极表面的电子和/或离子通过，这导致了一个大的阻抗变化。在此，标记分子或颗粒可以直接经共价键(或任何其它类型的键合)或间接经识别分子对，如生物素-亲和素，糖-卵磷脂，抗原-抗体，和受体-配体与靶分子结合。图19(F)中显示的条件，可以被认为是图19(D)的一个特例。
[00265]图19(H)是本发明的一个装置的横截面图，显示了含有捕捉分子的两个电极，在电极的表面捕捉分子以“Y”符号表示，靶分子以“◆”符号表示，并与捕捉分子相结合。不同于图19(B)，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒，以“●”符号做标记。捕捉分子与靶分子形成一个分子相互作用对或分子结合对，从而靶分子可以与捕捉分子相结合。标记分子或标记颗粒是分子或颗粒，它们可以增大阻抗的改变(ZML-Z0)，换句话说，可以放大检测信号。在这里，标记分子是酶，标记分子的信号放大是通过酶介导或催化的溶液中底物分子(S)的反应所获得的。酶介导的反应产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，测量导致的电极的阻抗(ZMBP)。靶分子是任何可以与捕捉分子相互作用的分子。样品溶液中的靶分子或样品溶液中被怀疑带有的靶分子是被测量或监测的感兴趣分子。如同捕捉分子，靶分子可以是抗体，抗原，肽，配体，受体，蛋白，核酸，核苷酸，寡核苷酸，或任何可以与捕捉分子相结合或相互作用的分子。图(H)显示的是检测电极的阻抗ZMEP，所述电极被与靶分子结合的捕捉分子修饰，这里的靶分子被标记上标记分子或标记颗粒。图(G)和(H)是一对，它们显示了电极间的阻抗从Zo改变为ZMEP，对应于电极上被修饰有捕捉分子的情形(G)和靶分子与捕捉分子结合的情形(H)。图19(H)中的标记分子或标记颗粒被用于扩大或进一步的增大阻抗的改变(ZMEP-Zo)。在这里，标记分子是酶，信号放大是通过酶介导或催化的，溶液中底物分子(S)的反应所获得的。酶介导的反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，测量导致的电极的阻抗(ZMEP)。反应的产物(P)被沉积或沉淀在电极表面，将会影响电极表面的电子和/或离子通过，这将导致一个大的阻抗改变。在此，标记分子或颗粒可以直接经共价键(或任何其它类型的键合)或间接经识别分子对，如生物素-亲和素，糖-卵磷脂，抗原-抗体，和受体-配体与靶分子结合。图19(H)的条件可看作图19(F)的特例。在此基于酶的信号放大过程已在图8中被描述。
计算方法及应用举例
I.分子分析的阻抗频谱
[00266]前面已经提到，阻抗(Z)有两个成分，即电阻Rs和电抗Xs。在数学上，阻抗Z表示如下，
Z＝Rs+j Xs
在此， j = - 1 , 指对于(串联)电抗成分Xs，施加于其上的电压与通过的电流有90度相差。对于(串联)电阻，施加于其上的电压与通过的电流具有相同的相位。如电子学和电子工程学中所公知，阻抗也可如下由并联电阻Rp和并联电抗Xp来表示，
Z＝Rp*(jXp)/(Rp+jXp)，
在此， j = - 1 . 然而，这些表达式(串联电阻和串联电抗，或并联电阻和并联电抗)是等价的。电或电子工程学的技术人员可以容易地从一种表达式的参数值推导出另一种表达式。为了表达清楚性与一致性，在本发明中的描述和讨论使用串联电阻和串联电抗表达式。串联电阻和串联电抗简称为电阻和电抗。
[00267]图20(A)显示了装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构(线宽＝30微米，线间隙＝80微米，圆直径＝90微米)在不同条件下测得的电阻的典型频谱。包含电极结构的玻璃基片组成电极装置。塑料孔组装到电极结构上构成了一个测试装置。电极结构的表面被固定上碱性磷酸酶分子，这是通过首先在电极上包被生物素标记的牛血清白蛋白，而后将电极培养在链霉亲和素的碱性磷酸盐中，以使链霉亲和素修饰的碱性磷酸盐(AP)与电极表面的生物素结合。在链霉亲和素修饰的碱性磷酸盐(AP)包被到电极表面上后，孔用Tris(pH＝7.6)缓冲液充分的洗涤。包含BCIP(17ul BCIP母液加到1.5ml Tris中，BCIP母液用25mg/ml浓度的DMSO配制)和NBT(33ul加到1.5mlTris中，NBT母液用25mg/ml浓度的去离子水配制)的Tris溶液加入到孔中。阻抗测量在加入溶液后立即或在其后的不同时间进行。(a)符号◇，加入溶液后的即时，(b)符号X，□，▲对应在加入溶液后13(X)，28(□)和80(▲)分钟。对于在电极表面发生的酶介导的反应，反应产物沉淀于电极表面并导致电极上串联电阻的增加。对于加入溶液后即刻(少于1分钟)测量阻抗，酶介导的反应不在电极表面产生太多沉淀。典型的是，高频(如1MHz左右及以上)阻抗(电阻和电抗)主要取决于电极几何形状和导入电极结构上的溶液的培养基的电特性(电导率和介电常数)。低频时，存在一个所谓的“电极极化”效应，会导致一个频率依赖性的电阻和电容。(例如：Schwan，H.P.，“Linear and nonlinear electrode polarization andbiological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，Vol.20，pp269-288，1992；Jaron，D.，Schwan，HP and Geselowitz.，“Amathematical model for the polarization impedance of cardiacpacemaker electrodes”，in Med.Biol.Eng.，Vol.6，pp579-594)。溶液加入孔中13分钟后，酶介导反应产物沉淀引起电极间产生较大的阻抗变化。因为电极表面存在非导电或低导电的沉淀物，电极结构的电阻频谱发生了变化。典型的是，在小于兆赫兹的低频时电阻将增加，高频区域的变化较小。
[00268]图20(B)显示了在与图20(A)相同条件下的同一电极结构的测量电抗频谱：(a)符号◇，加入溶液后的即时，(b)记号X，□，▲分别对应在加入溶液后13(X)，28(□)和80(▲)分钟。在图20(B)中显示的电抗是电抗的绝对值，换句话说，是指电抗的幅值。在加入溶液后即刻检测的电抗，在10Hz到500kHz之间为电容性和在792kHz到5MHz之间为电感性。对于其它的测量，电抗从10Hz到3.155MHz之间为电容性和在5MHz时为电感性。对于在电极表面发生的酶介导的反应，反应产物沉淀于电极表面并导致电极上串联电抗的增加。对于加入溶液后即刻(少于1分钟)测量阻抗，酶介导的反应不在电极表面产生太多沉淀。典型的是，高频(如1MHz左右及以上)阻抗(电阻和电抗)主要取决于电极几何形状和导入电极结构上的溶液的培养基的电特性(电导率和介电常数)。低频时，存在一个所谓的“电极极化”效应，会导致一个频率依赖性的电阻和电容。(例如：Schwan，H.P.，“Linear and nonlinear electrode polarization andbiological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，Vol.20，pp269-288，1992；Jaron，D.，Schwan，HP and Geselowitz.，“Amathematical model for the polarization impedance of cardiacpacemaker electrodes”，in Med.Biol.Eng.，Vol.6，pp579-594)。溶液加入孔中13分钟后，酶介导反应产物沉淀引起电极间产生较大的阻抗变化。因为电极表面存在非导电或低导电的沉淀物，电极结构的电抗频谱也发生了变化。与测得的电阻改变不同的是，在高频区发生较大的电抗相对变化。相对而言，低频区(例如，少于100Hz)电抗的变化较小。
[00269]相对于加入溶液后立即测量的电阻，可将在分子反应的不同时间点(即加入溶液后的不同时间点)所测得的电阻与之相比得到相应的比率，将其绘制成作为频率的函数的曲线(即电阻或串联电阻的相对变化)，通常得到一个典型的峰形曲线(图20(C))。在高频率时，阻抗(在此为串联电阻)只有小的变化或无变化，比值接近于1。随着频率的降低，比率增加直至峰值。当频率继续降低，比率又降低。甚至在10Hz时，比率仍明显高于1。
[00270]也可以绘制成相对于电抗或电容值的改变的示意图，用电抗的改变来监测和反映发生在电极表面的分子反应，或监测在电极表面导致反应产物沉淀的酶介导的反应(见图20(D))。进一步，用并联电阻和电抗来表示阻抗也可用于描述电极表面发生的分子反应导致的阻抗变化。
II.细胞分析的阻抗频谱
[00271]图38(A)显示在两种不同条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱。(a)空心符号，含HT1080细胞的组织培养基被添加于含电极结构的孔中不久后(10分钟以内，细胞尚未贴附电极和基片表面)测量的结果；(b)实心符号，含HT1080细胞的培养基加入到孔底面包含有电极结构的孔2小时40分钟后(细胞已经贴附到电极和基片表面)。当含细胞培养基加入到孔内短时间内(10分钟内)，细胞没有足够时间贴附到电极上。这一点可由此得到证实：在含细胞的培养基的电极上测得的阻抗(电阻和电抗)和向孔中加入无细胞的培养基测得值是相同或几乎相同的。在无细胞的培养基被导入电极上的条件下，或者当含细胞的培养基导入电极上但是细胞尚无足够时间贴附于电极结构上的条件下，典型的是，高频(如1MHz左右及以上)阻抗(电阻和电抗)主要决定于电极几何形状和导入电极结构上的溶液的培养基的电特性(电导率和介电常数)。低频时，存在一个所谓的“电极极化”效应，导致频率依赖的电阻和电容。(see，for example，Schwan，H.P.，“Linear and nonlinearelectrode polarization and biological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，Vol.20，pp269-288，1992；Jaron，D.，Schwan，HP and Geselowitz.，“A mathematical model for the polarizationimpedance of cardiac pacemaker electrodes”，in Med.Biol.Eng.，Vol.6，pp579-594)。在含细胞的培养基导入孔中后2小时40分钟放入组织培养箱超过2小时40分钟的情况下，细胞有足够时间贴附和铺展(在显微镜下观察细胞在不被电极覆盖的区域而得到证实)。由于细胞膜的非导电性，电极结构的电阻频谱被改变，典型的是，在中频(1kHz到100kHz)时升高。在低频或高频区域有较小的变化。
[00272]图38(B)显示了在与图38(A)相同的两种条件下，同样电极结构测量出的电抗频谱。(a)空心符号，有HT1080细胞的组织培养基加入到包含有电极结构的孔短时间内(10分钟内，细胞还未贴附到电极和基片表面)；(b)实心符号，含有HT1080细胞的组织培养基加入到孔底包含有电极结构的孔后2小时40分钟(细胞已经贴附到电极和基片表面)。当含细胞培养基加入到孔内短时间内(10分钟内)，细胞没有足够时间贴附到电极上。这一点可由此得到证实：在含细胞的培养基的电极上测得的阻抗(电阻和电抗)和向孔中加入无细胞的培养基测得值是相同或几乎相同的。在无细胞的培养基被导入电极上的条件下，或者当含细胞的培养基导入电极上但是细胞尚无足够时间贴附于电极结构上的条件下，典型的是，高频(如1MHz左右及以上)阻抗(电阻和电抗)主要决定于电极几何形状和导入电极结构上的溶液的培养基的电特性(电导率和介电常数)。低频时，存在一个所谓的“电极极化”效应，导致频率依赖的电阻和电容。(see，for example，Schwan，H.P.，“Linear and nonlinear electrode polarization andbiological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，Vol.20，pp269-288，1992；Jaron，D.，Schwan，HP and Geselowitz.，“Amathematical model for the polarization impedance of cardiacpacemaker electrodes”，in Med.Biol.Eng.，Vol.6，pp579-594)。在含细胞的培养基导入孔中后2小时40分钟放入组织培养箱超过2小时40分钟的情况下，细胞有足够时间贴附和铺展(在显微镜下观察细胞在不被电极覆盖的区域而得到证实)。在所述条件下，由于细胞膜的非导电性，电极结构的电抗频谱也发生了变化。与电阻的改变不同的是，由于细胞贴附于电极上，主要的相对变化发生在高频区，而电抗的总体强度也显著增加。
[00273]如果我们取细胞贴附时测得的电阻和无细胞贴附时测得的电阻的比率(即电阻或串联电阻的相对改变)作为频率的函数并绘制成图，典型的，我们将得到一个峰形的曲线(图38(C))。在低频率时，阻抗(在这里是串联电阻)有一个小的变化或无变化，比率接近1。随着频率的升高，比率增加直至峰值。当频率继续增加，比率降低到大约1(高频处)。应该指出的是，也可绘制成电抗或电容值的相对变化，利用电抗的变化来监测和反映电极表面的细胞贴附(见图38(D))。更进一步，用并联电阻和电抗来表示阻抗也可用于描述由细胞贴附在电极表面导致的阻抗变化。
[00274]除了一些别的因素外，电阻比率(即细胞贴附时测得的电阻和无细胞贴附时测得的电阻的比率)的峰值和产生此峰值时的频率取决于细胞贴附于电极表面的多少，贴附的紧密程度，细胞的大小，它们的浆膜和胞内成分的介电特性等等。对于已检测的多种细胞类型，我们发现在相同的细胞类型和相似的生理条件下(如处于指数生长阶段)，电极表面贴附细胞数量的增多导致更大的比率峰值及在更高的频率处得到该比率峰值。
[00275]相对于图38(A)，38(B)，和38(C)的结果，图39(A)，39(B)，39(C)显示了较多的细胞加入含“圆在线上”电极结构的孔的孔底上时相似的“圆在线上”电极上所测得的电阻，电抗，电阻比率的频谱。图40(A)，40(B)，40(C)示意较少的细胞贴附于电极上的相应情况。
[00276]图41显示在具有相同类型的“圆在线上”电极的孔中加入不同数目的细胞所得到的电阻比率频谱。例如，接种500个细胞在约2kHz时导致串联电阻最大变化为17％，而接种3200和7000个细胞在约5kHz和30kHz时导致串联电阻最大变化分别为182％和517％。而且，串联电阻的变化也可用于确定细胞数目和电抗数值的变化大小之间的关系(见图41B，例如，在250kHz时的电抗值可用于表达细胞数目和电抗数值变化大小之间的关系)。进一步说，如果并联电阻和并联电抗用于测得阻抗的表达，也可证明细胞数目和并联电阻和/或并联电抗改变值之间的依赖关系。
III.分子反应指数的推导
[00277]基于测得的阻抗值和分子相互作用之间的相互依赖关系，可由测得的阻抗频谱推导出称为“分子反应指数”的值。可用不同方法来计算这个分子反应指数。下面，我们阐述几种基于电极表面发生分子相互作用时与分子相互作用前所对应的电阻或电抗的改变，来计算分子反应指数的方法。在分子反应前，但电极结构上有相同样品溶液时电极结构的阻抗(电阻和电抗)有时称作基线阻抗。因此，一种用于获得基线阻抗的方法是通过测量在含有电极结构的孔中加入溶液后电极或电极结构的阻抗而得到，这里的溶液除了没有靶分子，与监测分子结合反应的条件下测量阻抗所用的溶液是一样的，在此电极或电极结构表面也同样锚定或覆盖或修饰有捕捉分子。
[00278]在一个例中，分子反应指数可计算如下：
(1)在每一测量频率，用(当电极表面发生分子相互作用时)测得的电阻除以基线电阻，计算得到电阻比率，
(2)在整个频谱中发现或确定电阻比率的最大值，
(3)用电阻比率的最大值减去一。
[00279]这种情况下，零值或接近于零值的“分子反应指数”显示在电极表面无分子反应。一个更高的“分子反应指数”值表明，对于相似的分子反应类型，有更多的反应发生在电极表面。
[00280]在另一例中，分子反应指数可计算如下：
(1)在每一测量频率，用(当电极表面发生分子相互作用时)测得的电阻除以基线电阻，计算得到电阻比率，
(2)在整个频谱中发现或确定电阻比率的最大值，
(3)取此情况下最大电阻比率的对数值(如基于10或e＝2.718)。其中，零值或接近于零值的“分子反应指数”显示在电极表面无分子反应。一个更高的“分子反应指数”值表明，对于相似的分子反应类型，有更多的反应发生在电极表面。
[00281]在一例子中，分子反应指数可计算如下：
(1)在每一测量频率，用(当电极表面发生分子相互作用时)测得的电抗除以基线电抗，计算得到电抗比率，
(2)在整个频谱中发现或确定电抗比率的最大值，
(3)用电抗比率的最大值减去一。
[00282]在这种情况下，零值或接近于零值的“分子反应指数”显示在电极表面无分子反应。一个更高的“分子反应指数”值表明，对于相似的分子反应类型，有更多的相互作用发生在电极表面。
[00283]在另一例子中，分子反应指数可计算如下：
(1)在每一测量频率，用(当电极表面发生分子相互作用时)测得的电阻除以基线电阻，计算得到电阻比率，
(2)在每个测量频率由电阻比率减去一计算出电阻的相对变化值，
(3)对所有相对变化值进行积分。
[00284]在这种情况下，零值或接近于零值的“分子反应指数”显示在电极表面无分子反应。一个更高的“分子反应指数”值表明，对于相似的分子反应类型，有更多的反应发生在电极表面。
[00285]值得指出的是，在利用阻抗信息来监测电极上的分子反应时推导所述计算“分子反应指数”不是绝对必要的。事实上，也可直接用阻抗值(在单个固定频率，或最大相对改变频率，或多个频率上)作为在电极表面发生的分子相互作用的指标。
IV.关于细胞数目指数的推导
[00286]基于测得阻抗，细胞数目(更确切的说，活细胞数目，或贴附细胞数目)和细胞贴附状态之间的互相依赖关系，可由测得的阻抗频谱推得一种称做“细胞数目指数”(或细胞指数)的参数。不同的方法可用于计算这种“细胞数目指数”。在此，我们举例说明几种基于电阻或电抗改变来计算该细胞数目指数的方法。这里的改变是指细胞贴附于电极结构相对于无细胞贴附电极结构时的电阻或电抗的改变。电极结构无细胞贴附但含有相同的培养基时的电极结构阻抗(电阻和电抗)有时被称为基线阻抗。基线阻抗可由一种或多种以下途径获得：(1)当不含细胞的培养基置于带有电极结构的孔中测得的阻抗，此培养基与监测细胞贴附的条件下测量阻抗所用的培养基相同。(2)含有细胞的培养基加入到孔底含有电极结构的孔中不久(如10分钟)后测得的阻抗(加入含细胞的培养基后短期内细胞尚无足够时间贴附于电极表面，该短期时间长度有赖于细胞类型和/或电极表面处理或修饰方法)。(3)当孔内的全部细胞被某种处理方法(如：高温)和/或试剂(如：洗涤剂)杀死后测得的电极结构阻抗(如用这种方法，那么该处理和/或试剂应不影响电极上培养基的介电特性)。
[00287]在一例中，细胞数目指数可如下方法计算：
(1)在每一测量频率，用测得的电阻值(当细胞贴附于电极时)除以基线电阻，得到电阻比率。
(2)发现或确定频谱中电阻比率最大值。
(3)用电阻比率最大值减一。
[00288]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。更高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相似生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。
[00289]在另一例中，细胞数目指数可用如下方法计算：
(1)在每一测量频率，用测得的电阻值(当细胞贴附于电极时)除以基线电阻，得到电阻比率。
(2)发现或确定频谱中电阻比率最大值。
(3)计算电阻比率最大值的对数值(如基于10或e＝2,718)。
[00290]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。更高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相似生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。
[00291]在另一例中，细胞数目指数可如下计算：
(1)在每一测量频率，用测得的电抗值(当细胞贴附于电极时)除以基线电抗，得到电抗比率。
(2)发现或确定频谱中电抗比率最大值。
(3)用电抗比率最大值减一。
[00292]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。更高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相似生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。
[00293]在另一例中，细胞数目指数可由如下方法计算：
(1)在每一测量频率，用测得的电抗值(当细胞贴附于电极时)除以基线电抗，以得到电阻比率。
(2)在每一测量频率，将电阻比率值减一而计算电阻的相对改变值。
(3)将所有相对改变值积分。
[00294]在这种情况下，“细胞数目指数”基于多频率点获得，而不是如上述举例中的在单个的峰值频率得到。同样的，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。更高的“细胞数目指数”指，对于相似类型和在相同生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。
[00295]值得指出的是，推导上述的“细胞数目指数”以利用阻抗信息来监测电极上的细胞。并不是必须的。实际上，可以直接用阻抗值(如在单一的频率下，或在最高相对变化频率，或在多个频率)作为细胞状态的指示。
[00296]但本发明优选推导细胞数目指数，并用这样的指数来监测细胞状态。它“细胞数目指数”来监测细胞生长和/或贴壁和/或存活状态具有如下优点：
[00297]第一，可以用细胞数目指数比较不同几何形状的电极的性能。
[00298]第二，对于一种给定的几何形状的电极，可以通过测量不同数目的细胞被加入电极上时的阻抗值，建立“校准曲线”，以预测细胞数目和细胞数目指数之间的相互关系(在这种实验中，确保接种的细胞很好的贴附到电极表面是重要的)。用这样的校准曲线，当进行新的阻抗测量时，可以从新测得的细胞数目指数而估计细胞数目。
[00299]第三，细胞数目指数也可用于比较不同的电极表面状况。对于相同几何形状的电极和相同的细胞数目，有较大细胞数目指数的表面，说明细胞更好地贴附于电极表面和/或此电极表面更适于细胞贴附。
C.监测细胞迁移或生长的方法和装置
[00300]在另一个方面，本发明涉及可用于监测细胞迁移或生长的装置，此装置包括一个绝缘基片，在这个基片的表面，包括可贴附细胞的第一区域，第一区域被第二区域包围，第二区域至少两个电极，该第一细胞贴附区域和第二电极区域由细胞迁移屏障所隔开。移去屏障后，可使细胞从第一细胞贴附区域迁移或生长进入第二电极区域，细胞的迁移或生长可导致位于第二电极区域的电极间阻抗的变化。
[00301]第一细胞贴附区域有任何适于细胞贴附的表面。另外，可用促进细胞粘附的部分来修饰第一细胞贴附区域以提高细胞贴附率。任何合适的促进细胞粘附的实体分子，包括B节所述的物质，都可被用于本装置。
[00302]本装置的第一细胞贴附区域和第二电极区域可有任何合适的构型。例如，图24所示，第一细胞贴附区域和第二电极区域是同心的。
[00303]任何合适的迁移屏障可被用于本装置。例如，细胞迁移屏障可为由聚合物材料制成的孔。
[00304]可在任何合适的频率范围测量或分析阻抗，如，频率范围为约1Hz至100MHz，或10Hz至5MHz。
[00305]在另一个方面，本发明涉及监测细胞迁移或生长的方法，该方法包括：a)提供上述用于监测细胞迁移或生长装置；b)将待监测细胞置于第一细胞贴附区域；c)移去细胞迁移屏障，使细胞从第一细胞贴附区域迁移至或生长在第二电极区域；d)监测位于第二电极区域的电极间的阻抗变化，以监测细胞的迁移或生长。
[00306]本方法可用于监测任何与细胞迁移或生长有关的合适参数。例如，此方法可进一步包括确定迁移或生长进入第二电极区域的细胞的量或数目。
[00307]本方法可用于确定被检化合物是否可调节，如增加或减少细胞的迁移或生长，或用于筛选这样的调节剂。例如，本方法可通过监测细胞在含有或不含有被检化合物的条件下的迁移或生长，来确定被检化合物是否调节细胞迁移或生长。在另一例中，本方法也可用于通过迁移或生长刺激剂刺激细胞迁移，并用于筛选被测化合物以得到此刺激剂的拮抗剂。
[00308]研究神经突生长时，用显微镜测量培养的神经元(细胞系或原代神经细胞培养物)的神经突的长度和数目是唯一方法。这样的测量非常费时及主观。通过整合荧光标记和荧光共聚焦显微镜和计量技术，检测的精确性可以得到明显地提高。然而，这种系统非常昂贵并需要荧光标记，而且由于测量流程缓慢，此系统无法满足大规模研究的需要。
[00309]下述装置可用于对单个神经细胞进行定位并实时监测神经突的生长。装置或仪器的规模可依照要求来设计。例如，用于研究目的的仪器可为低密度阵列并且检测是半自动的。用于高通量筛选药物的仪器将是高密度阵列，适于目前的筛选系统，并且检测是自动的。其软件包可用于基本测量，计算，和统计分析。
[00310]因此，另一方面，此发明涉及可用于监测神经突的生长的装置，该装置包括一个绝缘基片，其表面上，有一中心神经元锚定区域，它被神经突生长检测区域包围，神经突生长检测区域带有至少两个电极，当至少一个电极的至少部分被生长的神经细胞所覆盖时，电极间可产生阻抗的改变。例如，至少一个电极的至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％，或100％被生长的神经细胞覆盖时会产生阻抗的变化。
[00311]神经元锚定区域可有任何适合细胞贴附的表面。另外，神经元锚定区域可用促进细胞贴附的部分修饰，以提高神经元的锚定效率。任何合适的促进细胞粘附的部分，包括B节所述的物质，都可被用于监测神经突生长的本装置。
[00312]本装置的神经细胞锚定区域和神经突生长检测区域可有任何合适的构型。例如图25所示，神经元锚定区域和神经突生长检测区域可为同心的。另一例，神经元锚定区域可为居中的圆形区域，而神经突生长检测区域包含多个圆形或分段电极。再一例，神经元锚定区域可为居中的矩形区域，神经突生长检测区域包含多个线形分段电极。
[00313]此装置可进一步包含一个阻抗分析仪，可监测两个或多个电极间的阻抗改变。
[00314]另一方面，本发明提供了一种监测神经突生长的方法，此方法包括：a)提供上述监测神经突生长的装置；b)将待监测神经元定位于神经元锚定区域；c)让神经元由神经元锚定区域向神经突生长检测区域生长；d)监测神经突生长检测区域中电极间的阻抗变化，以监测神经细胞的生长情况。
[00315]此发明的方法可用于监测任何与神经突生长有关的合适参数。例如，此方法可用于监测培养的神经元的神经突长度和数目。尽管此方法可用于监测单个神经元的神经突生长，但优选地，可用于高通量的模式，即同时监测多个神经元的生长。
[00316]]本方法可用于确定被检化合物成分是否可调节，即增加或减少神经突生长，或用于筛选这样的调节剂。例如，本方法可通过测量神经突在含有或不含有被检化合物的条件下的生长，来确定被检化合物是否调节神经突生长。另外，本方法也可用于通过神经突生长刺激剂刺激神经突生长，并用于筛选被测化合物以得到此调节剂的拮抗剂。
[00317]下面示例了本装置及其操作。装置包括一个固体基片，其上结合有多个测量单元。每个测量单元带有多个具有适当几何关系的电极。当施加合适的电信号在电极上时，电极可产生适当的介电电泳力用于将各个神经细胞定位到基片表面的所需位置。(Wang X-B andCheng J.“Electronic manipulation of cells on microchip-baseddevices”in Biochip Technology(eds：Cheng J and Kricka L)，Harwood Academic Publishers，PA，U.S.A.，pp135-139)在一个实施方案中，测量单元包括居中的圆形电极，由多个圆形的分电极包围。另一个实施方案中，测量单元包括居中的正方形电极，由多个线形分段电极包围。此装置还另外带有一个阻抗分析仪用于测量两组电极间的阻抗变化。
[00318]使用时，合适浓度的神经元被置于芯片表面。通过施加合适的电压信号将各个细胞定位于测量单元的中心。神经元细胞沉降并贴附到芯片表面后，微电极阵列中电极间的电阻抗被测定。测得的阻抗值被用于获得神经突生长的信息。当定位的神经元的轴突和树突生长达到特定电极部件时，电极部件的电阻抗会发生改变。
D.分析微通道中的颗粒的仪器和方法
[00319]在另一方面，此发明提供一种用于分析颗粒的仪器，它包括一个基片，其上带有一个微通道和位于微通道相对面的一对电极，每个电极的表面积等于或小于被分析颗粒最大横截面积的两倍，当颗粒通过位于微通道上的电极对时，电极对间的阻抗可产生改变，该阻抗变化可用于分析颗粒。
[00320]用于分析通过微通道中的颗粒的本发明的仪器的电极可具有合适的表面积，长度或高度。在一例中，每个电极的表面积可等于或小于被分析颗粒最大横截面积，或其一半，或其十分之一。在另一例中，每个沿微通道长度方向的微电极的长度应明显小于被分析颗粒的最大一维尺寸。还有一例，电极可以跨微通道的整个高度。
[00321]本发明的仪器可有任何合适的电极数目。在一例中，本仪器包括两对电极，它们沿微通道长度方向被互相隔开，间隔距离为等于或小于被分析颗粒的最大一维尺寸。优选地，两对电极间阻抗的变化被测量。
[00322]在另一例中，本仪器包括三对电极，它们沿微通道长度方向被互相隔开。其中位于两端的两对电极用于提供电压，位于中间的电极对用于产生电极阻抗变化。优选地，位于中间的电极对和位于一端的电极对之间电压的改变被监测。
[00323]在另一例中，本仪器包括四对微电极，它们沿微通道长度方向被互相隔开。其中位于两端的两对电极用于提供电压，位于中间的两对电极用于产生电极阻抗变化。优选地，位于中间的一对电极和位于一端的电极对之间电压的改变被监测。
[00324]此仪器还另外带有一个阻抗分析仪。
[00325]另一方面，本发明提供了一种分析颗粒的方法，此方法包括：a)提供上述用于分析微通道中的颗粒的仪器；b)让待分析颗粒通过微通道中的电极对，以在电极间产生阻抗改变；c)测量阻抗的改变以分析颗粒。
[00326]此方法可用于监测颗粒的任何适合的参数。例如，此方法可以进一步包括分析颗粒的数目和量。此方法可用于监测任何适合的颗粒，可用于监测细胞以及非细胞颗粒。细胞包括动物细胞，植物细胞，真菌细胞，细菌细胞，重组细胞，和培养细胞。此方法可用于监测细胞的任何适合的参数。见Song at al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 97(20)：10687-90(2000)。而且，细胞内的DNA含量也可被监测。
[00327]另一方面，本发明提供了一种分析颗粒的仪器，此仪器包括：a)适于放置含有被分析颗粒的溶液的容器；b)将容器隔离成两个电分离的腔室的膜，所述的膜上有孔，其孔径等于或略大于所述颗粒的大小；以及两个电极，电极适用于检测颗粒瞬时通过孔时所引起的溶液中的阻抗改变。
[00328]本发明仪器中的膜可为任何合适厚度。其中一种例子中，膜的厚度从大约1微米到大约100微米。在另一例子中，膜的厚度为大约5微米到大约30微米。在另一例子中，膜的厚度等于或小于被分析颗粒的直径。
[00329]本发明的仪器的孔径可为基于被分析颗粒大小的任何适合大小。例如，孔径大小可为大约2，5，10，15，20，30或50微米。
[00330]本发明的仪器的两个电极可位于任何合适位置和具有合适的构型。例如，这两个电极可位于膜的相对面。另一例中，两个电极具有环绕孔的同心形状。
[00331]在一个实施方案中，本仪器可带有系列排列的多层膜并使颗粒顺序通过所述膜的孔。在另一实施方案中，本仪器可进一步带有一个阻抗分析仪。
[00332]在另一方面，本发明提供一种分析颗粒的方法，该方法包括；a)提供上述仪器；b)将含有被分析颗粒的溶液置于容器中，使所述的颗粒通过孔；c)测量当颗粒瞬时通过孔时所引起的溶液中的阻抗改变以分析颗粒。
[00333]本方法可用于监测颗粒的任何有关参数。例如，本方法可用于分析颗粒的大小或介电特性。
[00334]为方便分析，颗粒可以用一个纳米级的介电或电部分进行标记。优选地，纳米级的介电或电部分可包含特异性结合于被分析颗粒的抗体。还是优选地，此纳米级的介电或电部分可为金颗粒。
[00335]本方法可用于监测细胞或非细胞颗粒。细胞可包括动物细胞，植物细胞，真菌细胞，细菌细胞，重组细胞，和培养细胞。本方法可用于监测细胞的任何有关参数，如细胞大小，介电性，存活力等。为了方便分析，细胞可以用一个纳米级的介电或电部分进行标记。优选地，纳米级的介电或电部分可包含特异性结合于被分析颗粒的抗体。还是优选地，此纳米级的介电或电部分可为金颗粒。
E.监测细胞-基片阻抗和溶液电导率的系统和方法
[00336]在另一方面，本发明关于监测细胞-基片阻抗和溶液电导率的系统和方法。任何在以上章节提及的和其他本领域公知的用于监测细胞-基片阻抗的仪器，系统，和方法，都可用于本发明的系统和方法。任何本领域公知监测溶液电导率的装置，系统和方法都可用于本发明的系统和方法。见美国专利号6,235,520B1。
[00337]在一实施方案中，本发明是关于监测细胞-基片阻抗和溶液电导率的系统，系统包括：a)一个基片，在基片表面带有多个不连续的微孔，每个所述的孔中包含以上章节中描述的用于监测细胞-基片阻抗的仪器；b)用于测量每个微孔中溶液培养基导电性的工具，该工具包括(i)适于插入基片上孔中的一对电极，和(ii)当该对电极淹没到培养基中，提供低电压交流信号到电极上的电工具，(iii)同步测量跨电极的电流的电工具；所述系统可用于监测每个孔中包含的细胞的贴附，生长或代谢活性。
[00338]在另一实施方案中，本发明是关于监测细胞-基片阻抗和溶液电导率的系统，该系统包括：a)一个基片，在基片表面带有多个不连续的微孔，每个所述的孔中包含以上章节中描述的用于监测细胞-基片阻抗的仪器；b)一个亚系统，包括：(i)至少一对电极，适于插入基片上的第一个孔中；(ii)一个电路，适于当电极淹没到第一个孔的溶液培养基时，施加低电压交流信号到所述的第一对电极，该电路还可同步测量跨电极的电流，所述系统可用于监测每个孔中包含的细胞的贴附、生长或代谢活性。
[00339]在另一个实施方案中，本发明提供一种监测细胞贴附，生长，或代谢活性的方法，包括：a)提供以上所描述的系统以监测细胞-基片阻抗和溶液的电导率；b)将含有待监测细胞的溶液置于本系统的至少一个孔中；c)监测细胞-基片阻抗和所述孔中溶液的电导率以监测各个孔中细胞的贴附，生长和代谢活性。优选地，位于本系统多个孔或所有孔中的细胞可同时被监测。
F.实施例
[00340]下列实验用于阐明本发明但并不限制本发明。
                         实施例一
八种不同电极在有细胞贴附与无细胞贴附时的电阻和电容性电抗
[00341]图26为8个不同类型电极在NIH3T3细胞贴附和无NIH3T3细胞贴附时的电阻和电抗的图解。2AA，2AB，2AC，2AD，和3A的电极直径是1mm；2BE，3B，和3C的电极直径是3mm。每个电极类型的特征是不同的，示于表一。电极表面包被有化学和生物分子。在此实验中使用纤连蛋白包被。包被后，NIH3T3细胞被接种在电极的表面。电阻和电抗(电容性电抗)在接种后0小时(接种后立即)和接种后2小时被测量。(A，B)八种不同类型电极形状的电阻和电容性电抗，它们是频率的函数。在所有五种贴附NIH3T3细胞的电极类型中(接种后2小时)，相比于无细胞贴附的相应电极(细胞接种后0小时)可见电阻的增加和电容性电抗的减少。(B)柱形图显示给定频率的电阻和电容性电抗改变。在这里，电容性电抗值是绝对值。电阻和电容性电抗改变仅在贴附有NIH3T3细胞的电极上可见。
表一.检验的一些电极的概括
 电极结构名称  基片材料     电极结构类型         尺寸(微米)   活性区域直径
    2CF    玻璃       交错        48/28     6mm
    2BE    玻璃       交错        48/18     3mm
    2AA    玻璃       交错        80/50     1mm
    2AB    玻璃       交错        80/15     1mm
    2AC    玻璃       交错        50/30     1mm
    2AD    玻璃       交错        50/10     1mm
    3C    玻璃       “圆在线上”        60/160/180     3mm
    3B    玻璃       “圆在线上”        30/80/90     3mm
    3A    玻璃       “圆在线上”        30/80/90     1mm
   塑料       交错        50/50
电极2从，2AB，2AC，2AD，2BE和2CF是交错式电极，电极宽和电极间隙宽分别为80/50，80/15，80/30，50/10，48/18和48/28。
电极3A，3B和3C是“圆在线上”电极，它们的线宽，线间隙宽和电极圆直径分别为30/80/90，30/80/90和60/160/180。
                     实施例二
               用3B电极进行细胞定量检测
[00342]图27显示用3B形状底电极进行细胞定量检测。用于实验的仪器是按照如下方法构建：将无底的圆锥形或圆柱形塑料管粘在玻璃基片上，在玻璃基片上装配3B电极。塑料管粘到玻璃基片上的末端的直径为约5.5mm。玻璃基片形成了孔(或流体容器)底，塑料管形成了孔(或流体容器)壁。系列稀释的NIH3T3细胞(细胞数目10000，5000，2500，1250，和625)被加入仪器中纤连蛋白包被的3B电极表面。在接种后0小时(接种后立即)和接种后16小时测量电阻和电抗。曲线显示在给定频率时电阻和电容性电抗数据。注意频率为792KHz时电抗的极性为负(电容性电抗)，并且示出了电抗的强度。曲线T0为无细胞贴附时电极的基线电阻和基线电容性电抗。曲线T0-T16表示细胞贴附于电极后(0小时到16小时)电阻和电容性电抗的改变值。该3B电极可感知少于600个细胞。该3B电极对NIH3T3细胞的动态定量范围是10000到500。
                     实施例三
      用3C和3B电极实时监测NIH3T3细胞和PAE细胞增殖
[00343]图28显示用3C和3B电极实时监测NIH3T3细胞和猪主动脉内皮(PAE)细胞PAE细胞增殖。实验仪器在构造方法上与图26和图27所描述的方法相似。2500个NIH3T3细胞和2500个PAE细胞被接种在包被电极上。NIH3T3细胞接种在纤连蛋白包被的电极上，PAE细胞接种在明胶包被的电极上。每天测量电阻和电容性电抗以监测细胞增殖。注意频率为792KHz时电抗的极性为负(电容性电抗)，并且示出了电抗的强度。0天指细胞接种后立即测量。在此图中电容性电抗值为绝对值。在这两种细胞类型，电阻和电容性电抗值随培养时间(天数)增加而增加，表明细胞增殖。NIH3T3细胞生长在第四天达到平台期，而PAE细胞生长在第五天达到平台期。显示NIH3T3细胞比PAE细胞增殖速度快。
                       实施例四
用3B电极实时监测紫外线辐射(UV)诱导的NIH3T3细胞死亡
[00344]图29显示为用3B电极实时监测紫外线辐射(UV)诱导的NIH3T3细胞死亡。实验仪器在构造方法上与图26和图27所描述的方法相似。104个NIH3T3细胞被接种于纤连蛋白包被的3B电极，培养的细胞置于5％的二氧化碳培养箱中至长满。紫外线暴露时，将细胞单层上的培养基弃去，使细胞层直接暴露于UV下5分钟。紫外线暴露后，原来的培养基再被加至细胞单层上。立即测量电阻和电容性电抗，作为Uvt0。然后将UV暴露的电极置于5％的二氧化碳培养箱中孵育，以指出的不同的时间间隔测量阻抗和电容性电抗以监测由UV导致的死亡细胞。由图可见UV照射后，阻抗降低，表明UV诱导细胞死亡。细胞死亡最早可于UV暴露后4小时被测得，UV暴露后23小时，细胞死亡率达100％。经测量阻抗测得的细胞死亡与显微镜下观察的细胞形态学改变(数据没有显示)是相关的。
                     实施例五
             不同时间间隔时三苯氧胺的IC 50
[00345]图30为不同时间间隔时三苯氧胺的IC50。不同时间间隔时三苯氧胺的IC50s由实时监测三苯氧胺对NIH3T3细胞的细胞毒性作用而得。3C电极被用于实验。实验仪器在构造方法上与图26和图27所描述的方法相似。电极由纤连蛋白包被，每个电极接种104个NIH3T3细胞。当细胞长满达到100％时，按照指示将系列稀释的三苯氧胺加入细胞。以不同时间间隔测量被处理的细胞-电极界面的阻抗和电抗。细胞存活百分比的计算如下：
％细胞存活＝100*(Rt0-Rtx)/(Rt0_ctrl-Rtx ctrl)其中，Rt0和Rtx是处理后电极在T0时和给定时间间隔的电阻，Rt0和Rtx_ctrl是对照电极在T0时和给定时间间隔的电阻。在此计算所用的电阻是在一特定频率(31kHz)时所测得的值。如图所示，IC50s在21小时间隔(t21)，32小时间隔(t32)，43小时间隔(t43)是相似的，而在13小时(t13)和67小时间隔(t67)是明显不同的。这强烈说明对一给定的化合物，合适的处理时间对精确地测量IC50s是非常重要的。经实时检测细胞和电极间电阻的改变而监测细胞毒性作用，在获得精确获得的IC50方面有强大的优点。
                     实施例六
           用3C电极比较4种不同类型细胞的电阻
[00346]图31是用3C电极比较4种不同类型细胞的电阻。4种不同类型细胞的电阻用3C电极测量。实验仪器在构造方法上与图26和图27所描述的方法相似。这四种细胞类型是NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)，HEP-G2细胞(人肝细胞)，PAE细胞(猪主动脉内皮细胞)，和HUVEC细胞(人内皮细胞)。对NIH3T3细胞和HEP-G2细胞，电极用纤连蛋白包被，对PAE细胞和HUVEC细胞，电极用明胶包被。各个细胞类型都用两个电极测量。对NIH3T3细胞和HEP-G2细胞，每个电极接种10000个细胞，对PAE细胞和HUVEC细胞，每个电极接种20000个细胞。电阻和电容性电抗(仅显示电阻数据)在接种后0小时，和3或4小时被测量。对HEP-G2细胞，电阻在接种后119小时被测量。NIH3T3细胞，HUVEC细胞和PAE细胞的电阻在3或4小时时可见明显增加。而HEP-G2细胞的电阻在4小时时仅有微量的增加，表明肝细胞在电极上贴附较慢。HEP-G2细胞的电阻直至过夜培养后(数据未显示)在接种119小时才达到平台。
                     实施例七
                 电阻测量的可重复性
[00347]图32显示电阻测量的可重复性。在接种HUVEC细胞的7个电极(3B)上检测可重复性。实验装置在构造方法上与图26和图27所描述的方法相似。电极包被凝胶后在每个电极上接种15000个HUVEC细胞。在接种后立即(t0)和20小时30分钟时测量每个电极的电阻。电阻值在培养后20小时可见明显增加，表明细胞贴附于电极上。t0时的平均电阻值为47.4，标准差为3.9；在20小时30分时，平均电阻值为284.8，标准差为17.2；t0的方差系数是8.3％，对于t20h30m是6.1％。

Claims (52)

1.一种用于通过测量由细胞或分子贴附或结合于电极表面而引起的阻抗变化来检测电极表面的细胞或分子的装置，该装置包括：
a)具有沿纵轴的两个相对末端的绝缘基片；
b)位于基片上的多个电极阵列，其中每个电极阵列包括至少两个电极，并且其中每个电极通过绝缘材料区域与至少一个相邻电极隔开，所述电极最宽点的宽度大于绝缘材料区域宽度的约1.5倍并且小于绝缘材料区域宽度的约10倍；以及
c)基本沿纵轴延伸至基片的两个相对末端中的一个的导电迹线，并且其中每条迹线与至少一个电极阵列电连通。
2.权利要求1中所述的装置，其中基片包括玻璃，蓝宝石，在硅上的二氧化硅，或聚合物。
3.权利要求1中所述的装置，其中基片构型为板。
4.权利要求3中所述的装置，进一步包括多个容器，其中每个容器以垂直方向置于绝缘基片上，并且其中每个容器形成一个不漏液的容器，该容器与至少一个位于基片上的电极阵列相连。
5.权利要求1中所述的装置，其中多至一半的电极迹线延伸到基片的一个末端，多至一半的电极迹线延伸到基片的另一末端。
6.权利要求1中所述的装置，还包含相邻电极阵列对之间的电极迹线。
7.权利要求1中所述的装置，其中每个电极阵列的电极有相同的宽度。
8.权利要求7中所述的装置，其中每个电极最宽点的宽度为80微米。
9.权利要求8中所述的装置，其中相邻电极之间间隙的最宽点为20微米。
10.权利要求1中所述的装置，其中每个电极阵列包括多个均匀分布的电极。
11.权利要求10中所述的装置，其中每多个电极以交错形式排列。
12.权利要求10中所述的装置，其中每多个电极以同心、正弦曲线或齿形形式排列。
13.权利要求11中所述的装置，其中至少一条总线围绕每个电极阵列中多至一半的交错电极。
14.权利要求12中所述的装置，其中至少一条总线围绕每个电极阵列中多至一半的同心排列的电极。
15.权利要求13或14中所述的装置，其中距多个电极最近的总线由绝缘基片区与所述多个电极隔开。
16.权利要求15中所述的装置，其中总线包含一对电极，其中的每一个都围绕电极阵列的一半直径延伸。
17.权利要求16中所述的装置，还带有多个容器，每个容器以垂直方向置于绝缘基片上，并且其中每个容器形成一个围绕总线的不漏液的容器。
18.权利要求17中所述的装置，其中每个容器呈两端开口的管状，容器的一端不漏液地接触基片。
19.权利要求18中所述的装置，其中容器与基片接触一端的直径小于相对端的直径。
20.权利要求17中所述的装置，其中容器呈蜂巢状排列于基片上。
21.权利要求20中所述的装置，其中每个容器在接触基片的点的外壁与每个相邻容器的外壁间的距离最多至2.5毫米。
22.权利要求21中所述的装置，其中每个电极阵列的电极有相同的宽度。
23.权利要求22中所述的装置，其中每个电极最宽点的宽度为80微米。
24.权利要求23中所述的装置，其中相邻电极之间绝缘基片区最宽点为20微米。
25.权利要求22中所述的装置，其中相邻电极之间绝缘基片区最宽点不少于10微米。
26.权利要求1中所述的装置，还带有一个阻抗分析仪，电连接到基片至少一端上的所有或多个导电迹线的末端。
27.权利要求26中所述的装置，其中阻抗测量在约1Hz到约1MHz的频率进行。
28.权利要求1中所述的装置，其中基片中的导电迹线被一个绝缘层所覆盖。
29.权利要求1中所述的装置，其中导电迹线进一步至于基片的第二个平面。
30.权利要求20中所述的装置，其中容器共同构成了一个多孔的无底微量滴定板。
31.权利要求30中所述的装置，其中无底的微量滴定板的孔数目为6到1536。
32.权利要求20中所述的装置，其中少于所有的容器与活性电极阵列连接。
33.权利要求31中所述的装置，其中少于所有的容器与活性电极阵列连接。
34.权利要求1中所述的装置，其中每个导电迹线距最近的相邻导电迹线之间的距离最多至10毫米。
35.权利要求20中所述的装置，其中一个或多个容器的置于基片上的容器末端的直径为约3到7mm。
36.权利要求1中所述的装置，其中电极用激光融蚀法装配在基片上。
37.权利要求34中所述的装置，其中激光融蚀法在干燥条件下使用。
38.权利要求1中所述的装置，其中至少一个电极被单独寻址。
39.权利要求1中所述的装置，还包含：
一种或多种捕捉试剂，这些捕捉试剂固定在每个电极阵列中至少两个电极的表面，其中捕捉试剂能够结合靶细胞和/或分子。
40.检测样品溶液中靶细胞和/或分子的方法，该方法包括：
a)将权利要求1中所述的装置的一个或多个电极阵列暴露于疑为含有靶细胞和/或分子的生物样品；以及，
b)确定在一个或多个电极阵列中的电极间的阻抗是否发生了变化；
其中可检测的阻抗变化说明，生物样品中存在靶细胞和/或分子，而且在一个或多个电极表面捕捉到了所述的细胞和/或分子。
41.权利要求40中所述的方法，其中步骤(a)是自动的。
42.权利要求40中所述的方法，其中步骤(b)是自动的。
43.权利要求40中所述的方法，其中步骤(a)和(b)都是自动的。
44.权利要求40中所述的方法，其中该检测是针对靶细胞，还包括步骤(a’)：给生物样品提供足以让细胞生长的培养基。
45.权利要求1中所述的装置，还包括：
用于在导电迹线和阻抗分析仪之间建立电连通的连接工具。
46.权利要求1中所述的装置，其中连接工具包括一个适于稳固地啮合基片并与迹线形成电接触的机械夹。
47.权利要求46中所述的装置，其中机械夹适于与印刷电路板(PCB)形成电连接。
48.权利要求1中所述的装置，其中细胞或分子被捕捉于电极表面。
49.权利要求4中所述的装置，其中所述容器的外周的横截面图形包含在电极阵列的外周内。
50.权利要求17中所述的装置，其中所述容器的外周的横截面图形包含在总线形成的外周内。
51.权利要求7中所述的装置，其中每个电极最宽点的宽度为约50到约100微米。
52.权利要求7中所述的装置，其中每个电极最宽点的宽度为约10到约30微米。
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