CN102393406A - 一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物学领域，具体是指一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法。本发明是通过采用中药材的提取、再进行常规细胞的培养、种板到一定程度，然后进行细胞动态学检测，在检测过程中再对细胞进行给药过程，并同时进行细胞动态学检测，将所检测结果与标准道地药材的数值进行数值比较，即可得所测药材的结果。本发明的优点是利用现代分子生物学和细胞生物学为基础，结合现代信息技术，可以更快速、准确、方便地检测出同一物种因地域不同所产生的不同性质，以及方便鉴别出地哪些为地道药材、天然药物等，具有重复性好、操作方便等特点。本发明在传统中药材检测行业内具有广泛用途。

Description

一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法

技术领域

本发明涉及一种生物学领域，具体是指一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法。

技术背景

目前，鉴别中药材的方法往往采用物理方法，化学方法，生物化学分析方法，基因分析方法和动物实验方法。物理方法包括外观，气味，酸碱度，和使用紫外光谱、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱、核磁共振、透射电镜、X射线、薄层分析(TLC)、气相色谱(GC)、质谱(MC)、电子显微镜、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP)等分析法；化学方法包括单体的元素分析、结构或基团分析，氨基酸分析，糖组成分析等；生物化学分析方法包括酶分析，抗体分析和活性分析等；以上方法用于化学单体是成功的，但用于中药分析潜在难以克服的问题。因为一味药材本身就是一个大复方，由已知和未知的含量不等的化学成分组成，其中某一种甚至几种成分或组分的多少或几个比例往往难以反映道地药材和中草药的质量高低和好坏，对于由道地药材和中草药组成复方的质量判断，往往束手无策。虽然，以上方法已列入中华人民共和国药典，尤其是高效液相色谱分析方法，各版药典不断增加，让它反映中医药理论和鉴别道地药材是困难的。

基因分析方法是只测定中草药的几个比例不到1％碱基的特征位点的碱基序列，因为绝大多数的中草药没有完成全基因序列的测定，特征位点的碱基序列只能说明物种或个体的相似性，不能代表中药的功效，因为基因的表达与生态环境有关，所以，基因分析方法用于中药材质量判断可以作为一个鉴别项目，但需要有与功能相关的指标配合。

动物实验方法是目前常用的药物研究方法，中国为中药材的药理毒理研究制订了一整套的规范，努力想通过动物实验直接反映中草药的功效。因为动物与人类的天生差异，又因为动物实验的周期长，成本高，稳定性差，一直没有用于中药材的质量检测，也无法用于道地药材的鉴别。

中医药是中国的国宝，而道地药材则是宝中之宝。道地药材是指来自特定产区、生产历史悠久、栽培和加工技术精细、质量优良、疗效显著的药材。道地药材是优质药材的代名词。道地药材是一约定俗成的概念，是一个古代药物标准化的概念。它的产生是以几百年甚至上千年的实践教训和经验为依据的、经过临床的考验的、有着丰富的中医药内涵的科学。中药材的最大特点和精华是它的道地性。

从生物学上说，道地药材的形成是基因型与生境之间相互作用的产物。道地药材这一概念的形成和发展的全过程都离不开特定产地，其本质是同一药材在不同产地中质量最佳者。因此，道地药材一般在药材前冠以地名，如阳春砂、宣木瓜、茅苍术、岷当归、关黄柏及四大川药、四大怀药、辽五味、浙八味等等。古人早就有了概括：“离其本土，则效异”。

今天，大量存在着离开道地产区种植道地药材，用有人称之为“唯有效成分论”的化学药管理方法鉴定中药材品质优劣。收效甚微。导致道地药材不道地，甚至濒临灭绝，导致中医处方不错而疗效不好的现象时常发生，导致国内外中药材市场信用危机。问题就出在没有一种鉴别道地药材的实用而有效的方法。

所以，科学界、中医界和中药产业界希望有一个接近人体的、简易的、周期短的、成本低的，稳定性好，与人体相关性强的鉴别道地药材的方法出现。一种基于高通量的细胞学信息鉴别道地中药材的方法是一种可重复、稳定、有对应相关和简易的新方法。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出了一种稳定性好、操作方便、成本低廉，而且重复性好的方法，用于鉴别中药材是否为地道药材，本发明是充分利用了现代生物学技术、现代检测技术与传统中药材的结合而得出的。

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)中药材提取

取中药材，烘干，打粉，加蒸馏水溶解，浸泡30min，以频率42KHz超声10min，沸水浴加热20min，10000转/分离心分离10min，取上清液备用；

(2)常规细胞培养

细胞培养基：选用1640培养基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基、或McCoy’s 5A培养基中的一种；上述各种细胞培养基都是目前在公开市场上可以购得，也可以公知的方法制备而得，且相应的名称的培养基为行业内所熟知，特定简称的细胞培养基与特定的组成相对应，在本发明中为公知技术；

胎牛血清、0.25％胰酶(为体积比例)、PBS，其中PBS的制备是：取Nacl 8g，Kcl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，加蒸馏水1000ml，调pH至7.4；经121℃，30min的高压灭菌后可使用。

细胞培养液配方：细胞培养基加10％胎牛血清，本发明中是指体积比例，即100毫升中加10毫升血清制备而得；

选用贴壁细胞为细胞株，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞长到密度为80％～90％，吸去培养液，加PBS润洗1～2次，再用0.25％胰酶消化细胞，直至细胞鼓起、加入细胞培养液终止消化，用细胞培养液将细胞稀释成浓度10⁴～10⁵个/ml，待用；

(3)种板

测基线：取16孔或96孔检测板，每孔加入细胞培养基，通过检测板底部连接的电子传感器，检测孔底部排列的微电极阵列的阻抗；当没有细胞时，检测孔底部排列的微电极阵列的阻抗分布均匀；对于阻抗测量的简单原理是：将96或16孔细胞板的每个小孔底部都分布着电极阵列，覆盖率在80％，形成一个电流回路。当这个回路的上面覆盖了细胞时，会产生阻抗(电阻)的变化，由此反映小孔内细胞的各种状况。目前对此技术已为相关文献所公开，专利号03822454.2的专利公开了一种装置，通过测量由细胞和/或分子导致的阻抗的改变来检测细胞和/或分子。装置的一个公开的实施方案包括一个带有沿着长轴的两个相对末端的基片。多个电极阵列被定位于基片上。每个电极阵列包括至少两个电极，并且在电极阵列中，每个电极通过绝缘材料区域与至少一个相邻的电极分开。电极在它的最宽点的宽度为绝缘材料区域宽度的约1.5倍到10倍。装置也包括导电迹线，它们基本沿长轴延伸到基片的两个相对末端中的一个，并且与其它导电迹线是互不交错的。每条迹线与至少一个电极阵列电连通，即可测得；另外03822348.1也公开了一种装置，包括一个适合于接受和保持细胞样品的上室，一个有至少两个电极的下室，和一个生物相容的有孔膜，所述膜具有适合于细胞经过膜迁移的孔隙度。膜在装置上将上室和下室分隔开。细胞经多孔膜的迁移使得迁移细胞接触到下室的一个或多个电极。所述接触引起电极间一个可测量的阻抗改变。本发明对于阻抗的测定，正是利用了已公开的现有技术进行测量的。

接种细胞：将上述步骤(2)中用细胞培养液稀释好的细胞加到检测板中，细胞密度为10³～10⁴个/孔；

(4)细胞动态学检测

接种细胞在检测板上的贴壁、生长，同时检测板底部连接的电子传感器测量其阻抗；阻抗的大小用细胞指数进行衡量，检测数据以时间为横坐标，以细胞指数为纵坐标制得动态曲线图；

(5)给药

待细胞长到接种后18～24小时，细胞已贴壁，将每孔的细胞培养基吸出，换成无血清培养基，培养2小时，进行给药；

将步骤(1)中备用的上清液，往检测板上孔中进行给药；同时有对照孔中加灭菌的蒸馏水，并继续进行细胞动态学检测；

(6)数据分析

将给药前的最后一个时间点测得的细胞指数为基准，对上述步骤(5)中加了上清液和对照孔中的细胞继续进行动态学检测，分别测得各自的阻抗值，通过所得阻抗值的对比即可得知待测中药材的性质。

本发明正是以现代分子生物学和细胞生物学为基础建立的快速、微量、体外筛选模型和测试方法，结合自动化技术发展起来的已商品化的市售技术平台或仪器的一种高通量地从各种细胞捕获中药材细胞学动态信息技术。将从各种细胞捕获中药材细胞学动态信息经组合构成的数值，经各种统计学分析方法转换成数学矩阵表示，也可以转换成数字或字母构成的条码表示，赋予一种或一类中草药及其代谢产物或其复方制品的特有信息，作为它们的各种生物功能的象征标记。

其中，使用象征标记区别相同物种不同生长地、不同物种不同生长地的道地药材、中草药和天然药物。

使用象征标记作为一种或一类中草药及其代谢产物和它们的中成药质量标准的鉴别项目。

使用象征标记指导中国道地药材、中药材和饮片及天然药物的选种、选地、栽培或养殖或培养(克隆)、采集或终止培养、加工的质量标准的控制指标。

使用象征标记作为指标或模型分离中国道地药材、中草药和天然药物中的有效组分和有效成分分离模型。

有益效果：本发明利用现代分子生物学和细胞生物学为基础，结合现代信息技术，可以更快速、准确、方便地检测出同一物种因地域不同所产生的不同性质，以及方便鉴别出地哪些为地道药材、天然药物等，具有重复性好、操作方便等特点。

附图说明

图1：A549细胞株(非小型肺癌细胞)的细胞图谱

图2：RBL细胞株(大鼠嗜碱性白细胞)的细胞图谱

图3：HepG2细胞株(人肝胚细胞瘤细胞)细胞图谱

图4：六种细胞的细胞图谱的数值呈量效关系

图5来自青藏高原的不同产地的17种冬虫夏草对A549细胞图谱

图6中国市场上8种与“虫草”相关产品的A549细胞图谱

图7青藏高原冬虫夏草标准编码

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的实施作具体说明：

实施例1

中药材提取：

取中药材烘干，打粉(100目)，称取中国药典中药材人用量的千分之十五的量，加1ml蒸馏水，浸泡30min，超声(频率42KHz)10min，沸水浴加热20min，10000转/分离心10min，取上清液备用。

常规细胞培养：

选用主要设备器材：

超净工作台、细胞培养箱(37℃，5％CO₂)、倒置显微镜(50倍～400倍)、水浴箱、细胞培养瓶(50ml、100ml、250ml)、移液器(0.5～10ul、10～100ul、100～1000ul)、枪头(10ul、300ul、1000ul)、吸管(1ml、5ml、10ml、20ml)、细胞计数板。

主要试剂：

细胞培养基：1640培养基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基、McCoy’s 5A培养基，规格500ml，Hyclone公司产品。

胎牛血清：规格500ml，Gibco公司产品。

0.25％胰酶(消化贴壁细胞)：规格100ml，Hyclone公司产品。

PBS：Nacl：8g，Kcl：0.2g，KH₂PO₄：0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O：3.58g，加蒸馏水1000ml，调pH：7.4。高压灭菌(121℃，30min)后可使用。

细胞培养用培养液配方：细胞培养基加10％胎牛血清。

选合适\稳定的细胞株，一般为贴壁细胞，于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)培养，待细胞长到密度为80％～90％，吸去培养液，加PBS润洗1～2次，用0.25％胰酶消化细胞，细胞鼓起，加入细胞培养液终止消化，轻轻将细胞从瓶壁吹打下来，并进行细胞计数，用细胞培养液将细胞稀释成浓度10⁴～10⁵个/ml。

种板

测基线：取16孔或96孔检测板，每孔加入50ul细胞培养基，测基线。检测板底部整合了电子传感器，没有细胞时，检测孔底部排列的微电极阵列的阻抗分布近似均匀。

接种细胞：稀释好的细胞每孔100ul种板，细胞密度为10³～10⁴个/孔。

细胞动态学检测：

细胞在检测板上的贴壁、生长状况与传感器测量得到的阻抗相对应。阻抗的大小用细胞指数Cell Index进行衡量，检测得到以时间为横坐标，以细胞指数Cell Index为纵坐标的动态曲线图。根据阻抗得到的细胞指数，反映了细胞生物学状态包括细胞增殖、存活、凋亡、形态变化。细胞附着和生长18-24小时以达到稳定视为正常。

给药：

待细胞长到接种后18～24小时，细胞已贴壁，将每孔的细胞培养基吸出，换成无血清培养基，150ul每孔，培养2小时，进行给药。取中药材提取液，按10ul/孔进行给药，对照加10ul/孔灭菌的(121℃，30min)蒸馏水，给药完成，继续进行细胞动态学检测。

数据分析：

将给药前的最后一个时间点测得的细胞指数Normalize为1，得到以时间为横坐标，以Normalized Cell Index为纵坐标的曲线图。不同的中药材呈现不同的独有的细胞动态图谱。

用市售的永生化细胞和基因改造过的不同细胞株，捕获的冬虫夏草细胞动态信息，见图1～4，所获细胞学信息提示：1、.同一中药(冬虫夏草)从不同来源的细胞株捕获到的动态信息不同；2、同一细胞株对同一中药不同浓度的图谱呈量效关系，可用于中药材的有效部位或有效成分的含量或作用强弱判断。

图1～4分别是使用购自ATCC的细胞株：A549(非小型肺癌细胞)，RBL(大鼠嗜碱性白细胞细胞株)，HepG2(人肝胚细胞瘤细胞)，COS1(非洲绿猴肾细胞-1)，NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)，Hela(人宫颈癌细胞)，MCF7/adr(人乳腺癌耐药细胞)。

实施例2

按实施例1相同的方法，取同样来自青藏高原的不同产地的18种冬虫夏草，它们对A549细胞株的动态信息有相同和不同，见图5，所获细胞学信息提示：青藏高原的冬虫夏草对A549细胞株的动态信息大多数相同，而且细胞学动态信息的重复性好。我们取其均值和均值±离差，在23～65小时期间，用9位字母和数字，按预先设定的条件，转换成字母和数字表示：CHC765467和条码，见图7。如果我们把CHC765467和条码当成冬虫夏草的A549细胞株的动态信息标准编码。再取市售各“虫草”产品，结果见图6，其中只有一种产品落在标准区间编码内，经调查了解，落在标准区间编码内的产品是由青藏高原产的冬虫夏草磨粉所制，其他“虫草”产品与冬虫夏草的图谱相差甚远。

其它各种不同物种，通过本发明的实施，都可以看出在不同的产生，具有不同的图谱，从而可以鉴别出哪一种为地道药材。本发明所举实施例，仅为对本发明的举例说明，并不表示对本发明内容的限制，通过对本发明的了解，在不经过创造性劳动情况下，所获得的技术内容，都属于本发明所要保护的范围。

Claims (1)

1.一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)中药材提取

取中药材，烘干，打粉，加蒸馏水溶解，浸泡30min，以频率42KHz超声10min，沸水浴加热20min，10000转/分离心分离10min，取上清液备用；

(2)常规细胞培养

细胞培养基：选用1640培养基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基、或McCoy’s 5A培养基中的一种；

胎牛血清、0.25％胰酶、PBS，其中PBS的制备是：按质量比例取Nacl 8份，Kcl 0.2份，KH₂PO₄ 0.24份，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58份，加蒸馏水1000份，并调节pH至7.4，在121℃高温下灭菌30min后可使用；

细胞培养液配方：细胞培养基加10％胎牛血清；

选用贴壁细胞为细胞株，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞长到密度为80％～90％，吸去培养液，加PBS润洗1～2次，再用0.25％胰酶消化细胞，直至细胞鼓起、加入细胞培养液终止消化，用细胞培养液将细胞稀释成浓度10⁴～10⁵个/ml，待用；

(3)种板

测基线：取16孔或96孔检测板，每孔加入细胞培养基，通过检测板底部连接的电子传感器，检测孔底部排列的微电极阵列的阻抗；当没有细胞时，检测孔底部排列的微电极阵列的阻抗分布均匀；

接种细胞：将上述步骤(2)中用细胞培养液稀释好的细胞加到检测板中，细胞密度为10³～10⁴个/孔；

(4)细胞动态学检测

接种细胞在检测板上的贴壁、生长，同时检测板底部连接的电子传感器测量其阻抗；阻抗的大小用细胞指数进行衡量，检测数据以时间为横坐标，以细胞指数为纵坐标制得动态曲线图；

(5)给药

待细胞长到接种后18～24小时，细胞已贴壁，将每孔的细胞培养基吸出，换成无血清培养基，培养2小时，进行给药；

将步骤(1)中备用的上清液，往检测板上孔中进行给药；同时有对照孔中加灭菌的蒸馏水，并继续进行细胞动态学检测；

(6)数据分析

将给药前的最后一个时间点测得的细胞指数为基准，对上述步骤(5)中加了上清液和对照孔中的细胞继续进行动态学检测，分别测得各自的阻抗值，通过所得阻抗值的对比即可得知待测中药材的性质。

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