CN104531838B - 浙白术pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浙白术PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为ZBZ1和ZBZ2，ZBZ1：5’‑CAAGTTGGATACACTCCTGG‑3，ZBZ2：5’‑CTACTACCATCGCAAACTCT‑3’；本发明提供了一种快速、准确鉴定浙白术的方法，可以广泛应用于浙白术中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药浙白术PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)背景技术
白术是为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎，在临床上应用广泛，俗有“十方九术”、“北参南术”之称，具有治脾益气，燥湿利水，止汗安胎的功效。浙江是白术的主产区，有上百年的栽培历史。浙江磐安、新昌、嵊县、东阳等地所产品种称为“浙白术”(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)，为著名的道地药材“浙八味”之一，其特点为术形较为丰满，“术腿”粗短，“云头”膨大。
近年来,由于白术市场的不断扩大，种植户应用的种质混杂和种植方法不规范，商家以次充好等原因，使辨析白术品种及其真伪较为困难，导致了白术成药质量的降低。目前白术品种的鉴定方法主要包括外观形态观察，利用化学试剂、光谱、核磁共振等技术对其进行区分，但由于不同产地白术的亲缘关系较近，外观相似，且含有的化学成分较雷同，利用传统的中药鉴定方法较难进行鉴定。利用分子生物学的技术，从基因水平进行的中药分子鉴定方法，由于不受外界因素和生物体发育阶段及组织器官差异的影响，具有准确性高、重现性好等特点。本发明提供的PCR检测法就是一种浙白术的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定浙白术。目前利用PCR检测法对浙白术进行鉴定尚未见报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药浙白术的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种浙白术PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为ZBZ1和ZBZ2：
ZBZ1：5’-CAAGTTGGATACACTCCTGG-3’，
ZBZ2：5’-CTACTACCATCGCAAACTCT-3’。
进一步，所述的浙白术PCR鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种利用所述浙白术PCR鉴定试剂盒对浙白术进行鉴定的方法，所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用浙白术PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZBZ1和ZBZ2，进行PCR扩增：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性45s，60～65℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液(即PCR buffer)1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在540bp处出现扩增条带的为浙白术，在540bp处不出现扩增条带的不是浙白术。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在540bp处有无扩增条带作为鉴定浙白术的依据，可以检测单个或者混合白术DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用浙白术PCR鉴定试剂盒中引物ZBZ1和ZBZ2以及PCR反应溶液配方可以制造浙白术鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定浙白术的方法，可以广泛应用于浙白术中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为十四种供试品经浙白术PCR鉴定试剂盒鉴定后的电泳图，泳道1～14分别为浙白术、河北小白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、黄精、蒲公英、向日葵、浙贝母、杭麦冬、益母草，泳道M为marker。
图2为不同浓度的浙白术经浙白术PCR鉴定试剂盒鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL浙白术，泳道2为0.5ng/μL浙白术，泳道3为5ng/μL浙白术。
图3为混合样品经浙白术PCR鉴定试剂盒鉴定后的电泳图，泳道1为浙白术、河北小白术、湖南平术和安徽徽术的DNA混合溶液，泳道2为河北小白术、湖南平术和安徽徽术的DNA混合溶液，泳道M为marker。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用供试品(浙白术、河北小白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、黄精、蒲公英、向日葵、浙贝母、杭麦冬、益母草)均为《中国药典》中收编的中药材品种，这些中药品种均收集于各自的主要种植地区。
实施例1
1、浙白术PCR鉴定试剂盒关键试剂PCR引物的获得
应用植物基因组DNA快速提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)从浙白术、河北小白术、湖南平术和安徽徽术中分别提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对四种白术进行RAPD分析，筛选获得一条浙白术特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在浙白术品种中，在其他白术品种中没有，此条带中的DNA分子即是浙白术特异性DNA分子标记。将浙白术特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.3所示，命名为ZBZ647。
根据ZBZ647序列，设计一对特异性引物ZBZ1和ZBZ2，引物序列为：
ZBZ1：5’-CAAGTTGGATACACTCCTGG-3’，
ZBZ2：5’-CTACTACCATCGCAAACTCT-3’。
上下游引物选取的位点分别对应于ZBZ647序列位点上108-127的和628-647。
SEQ ID NO.3为：
5'-CCATTAGTGGGTAAAAGGTAAAACAGTAATTTTTTTGTCAAATTTTGTATCTTGGATACATACAATAACAAAAAAATAAGTAGAGTACACACAATAGCAAAAAGTGACAAGTTGGATACACTCCTGGATACTTTTCCCTAAAATTAAATATAAGGGAAGAATGGAGAGGACTTGAAGTAATACTGTACAAGCTATTAATGCATGAATGTATAATGTATAAGTCATCAATGCCTGAAATTTGTACCAAGTAATCCATCCATGCACAAATAAAATTTAAGAAAATCCACCACTTTACACCTTGCAATAATATAAAGGTACCACTTTTTATCTAATGTACACAAAATGACCACCTGCTTTGTGATGGATCATTCAAGACAAAATGTAGTGGACTTAAAAAGCAACAATAAATCAATGTCAGAATAGATAGGGTTCGTGATGGCTTATCACATACAACTTTATTGTCCCGAACTCCAAAAAAAACCAAAAAAAAAGTTGTGAAAACAACGAAGTTTGCAAAATGTTAGGCCAAAATCTATTCAATATATTATACAACACAAGGTAGTAAACATAGATATACATTTTTAAACATATTTGATCAAAAAACAAAAAAAAAGTTGCATTTTCTACAGAGTTTGCGATGGTAGTAG-3'。
2、浙白术的PCR检测法
(1)采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板(以ZBZ1和ZBZ2作为引物)；以电泳法(同步骤(3))检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)按照ZBZ1和ZBZ2的序列用体外合成仪合成引物ZBZ1和ZBZ2。以ZBZ1和ZBZ2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：
94℃预变性3min，94℃变性45s，60～65℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在540bp处出现扩增条带的样品为浙白术，在540bp处不出现条带的样品不是浙白术。
实施例2：
1、浙白术PCR鉴定试剂盒检测法的准确性研究
从浙白术、河北小白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、黄精、蒲公英、向日葵、浙贝母、杭麦冬、益母草这14种植物中提取基因组DNA。以上述14种品种的基因组DNA为模板，利用特异性引物“ZBZ1/ZBZ2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证浙白术PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～14分别为浙白术、河北小白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、黄精、蒲公英、向日葵、浙贝母、杭麦冬、益母草，泳道M为marker。
图1表明，浙白术在540bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的浙白术PCR鉴定试剂盒经实验证明可以用于浙白术的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、浙白术PCR检测法的灵敏度研究
将原始浙白术模板DNA浓度(50ng/μL)经三个梯度进行稀释，配置三份不同浓度的浙白术基因组DNA溶液：一份浓度为原始浙白术模板DNA浓度的10％，即5ng/μL；一份浓度为原始浙白术模板DNA浓度的1％，即0.5ng/μL；一份浓度为原始浙白术模板DNA浓度的1‰，即0.05ng/μL。
分别以这三种不同浓度的浙白术基因组DNA作为模板(1.2μL)，以“ZBZ1/ZBZ2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证浙白术PCR检测法的灵敏度，结果见图3所示，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL浙白术，泳道2为0.5ng/μL浙白术，泳道3为5ng/μL浙白术。
结果显示当浙白术模板基因组DNA浓度为原始模板标准浓度的1‰，即含量仅为0.05ng时，在540bp处依然出现浙白术的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的浙白术PCR鉴定试剂盒灵敏度很高，含量极微弱的浙白术也能够鉴定出来。
3、浙白术PCR鉴定试剂盒对混合样品的鉴定效果
配置两份不同的基因组DNA混合溶液：组1为浙白术、河北小白术、湖南平术和安徽徽术的DNA混合溶液，四者等量加入，浓度各为原先浓度(50ng/μL)的四分之一；组2为河北小白术、湖南平术和安徽徽术的基因组DNA混合溶液，三者等量加入，浓度各为原先浓度(50ng/μL)的三分之一。
将这两份不同的DNA混合液分别作为模板，以“ZBZ1/ZBZ2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以研究浙白术PCR鉴定试剂盒对混合样品的鉴定效果。实验结果见图3，泳道M为Marker，泳道1为组1，泳道2为组2。
图3表明，组1加入浙白术的混合样品经PCR检测后，结果显示在540bp处出现明亮的扩增条带。组2没有加入浙白术的混合样品经PCR检测后，结果显示在540bp处没有出现条带，浙白术在四种白术的混合材料中被很好的鉴定了出来。经过多次重复验证，结果保持稳定，这显示出本发明的浙白术PCR鉴定试剂盒具有极高的准确性，能在混合药材样品中鉴定出浙白术。实验证明这种方法不仅可以检测单个浙白术样品，还可以在混合物中检测出浙白术，应用范围较广。
Claims (3)
1.一种浙白术PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为ZBZ1和ZBZ2：
ZBZ1：5’-CAAGTTGGATACACTCCTGG-3’
ZBZ2：5’-CTACTACCATCGCAAACTCT-3’。
2.如权利要求1所述浙白术PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的浙白术PCR鉴定试剂盒的组成为：
3.一种利用权利要求1所述浙白术PCR鉴定试剂盒对浙白术进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用浙白术PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZBZ1和ZBZ2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性45s，60～65℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在540bp处出现扩增条带的为浙白术。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |