CN100577811C - 基于阻抗分析细胞和颗粒的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种监测生物颗粒如细胞迁移或侵袭的装置。本装置包括一个适合于接受和保持细胞样品的上室，一个有至少两个电极的下室，和一个生物相容的有孔膜，所述膜具有适合于细胞经过膜迁移的孔隙度。膜在装置上将上室和下室分隔开。细胞经多孔膜的迁移使得迁移细胞接触到下室的一个或多个电极。所述接触引起电极间一个可测量的阻抗改变。

Description

基于阻抗分析细胞和颗粒的装置和方法

[0001]本专利申请将以下专利申请引入作为参考：美国临时申请60/397,749，递交日期2002年7月20日；美国临时申请60/435,400，递交日期2002年12月20日；美国临时申请60/469,572，递交日期2003年5月9日。本专利申请还将以下PCT专利申请引入作为参考：PCT申请PCT/US2003/022557，名称为“IMPEDANCE BASEDDEVICES AND METHODS FOR USE IN ASSAYS”，专利代理人编号ACEA-0202，同本专利申请同时递交。

发明背景

技术领域

[0002]本发明通常涉及对细胞和颗粒的分析的领域。具体说，本发明提供了基于阻抗分析细胞和颗粒的装置、微量滴定板和方法。本发明的装置、微量滴定板和方法可用于监测细胞或颗粒的贴附、迁移和侵袭。本发明的装置、微量滴定板和方法亦可用于鉴别分析细胞或颗粒贴附、迁移和生长的调节物。

背景技术

[0003]生长和转移和细胞的病理性迁移是恶性细胞的基本特性。对病理性细胞迁移分子机制的进一步深入理解无疑有利于癌的治疗和预防。

[0004]体内模型和体外模型都用以研究此机制。体内模型可监测在实验动物体内癌转移的整个过程，但不适于大规模评价恶性细胞的特性。体外模型可更加定量地分析癌细胞的生长和迁移活性，包括细胞在单层或多层培养细胞或外植体组织上的移居，细胞经过天然和人工的胞外基质或细胞相似结构的生长，以及对趋化剂反应的细胞运动性。

[0005]当前，通常有3种方法可用于体外检测细胞生长和/或细胞迁移，包括：

[0006](1)化学引诱物诱发的迁移(即趋化性，是生物学细胞或有机体对化学试剂浓度梯度的定向反应)/侵袭和跨孔迁移分析法(trans-well migration assay)(Falk，W.，“A 48 Well MicroChemotaxis Assembly for Rapid and Accurate Measurement ofLeukocyte Migration.”Journal of Immunological Methods，第33卷，第239-247页，1980；Richards K.L.和J.McCullough，“A ModifiedMicrochamber Method for Chemotaxis and Chemokinesis.”Immunological Communications，第13卷，第49-62页，1984)：插入物中的细胞通过侵袭和迁移的方式穿过一层人造的多孔膜(无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜或聚对苯二甲酸乙二酯膜)进入含有给定化学引诱物的下部室。迁移过来的细胞通常贴附于膜的另一面，然后可以用化学染料(Neuroprobe，Inc.，见Neuroprobe，Inc.www.Neuroprobe.com/protocol/pt_96a.html)或荧光染料对这些细胞进行标记，再用显微镜或荧光分光光度计计算细胞数目(TECAN，Coster，BD Biosciences，(Ilsley，S.R.1996.

Basement Membrane Cell Invasion Chamber.Becton Dickinson Technical Bulletin #422；www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/techbulletins.html；BD BioCoat^TM FluoroBlok^TM Tumor Cell Invasion System，www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/drug_discovery/insert_systems/fluoroblok_invasion/；TECAN.www.tecan.com/migration_introl.pdf)。例如美国专利5,284,753公开了一种多位点趋化性实验的装置和方法。在一个方法中，趋化因子和对照被放置在底板顶面预先选定好的区域上，同时具有合适大小的孔且在其上放置有细胞悬液的薄膜滤器放置在底板上面，这样趋化因子和对照的小滴直接与置于细胞悬液位置之下的滤器薄膜相接触。这样在一定时间内，在趋化因子和对照影响下迁移经过薄膜滤器的细胞被进行计数和确定。

[0007](2)细胞原位扩散和迁移分析：将细胞点样在包被有化学引诱物的玻璃载玻片上。当细胞从最初点样位置开始迁移和扩散时，存在细胞的斑点的直径将会增加。在细胞培养完成后对此斑点的直径进行测量。迁移基于培养过程中细胞斑点的大小来确定(Berens，M.E.等人，“The role of extracellular matrix in human astrocytomamigration and proliferation studied in a microliter scale assay”，Clinical and Experimental Metastasis.第12卷，第405-415页，1994；Creative Scientific Methods.www.cre8ive-sci.com/process.html).

[0008](3)体外创伤愈合分析：在细胞单层上刮出细胞后在显微镜下测量划痕的愈合过程(Miyata K.等人.“New wound-healing modelusing cultured corneal endothelial cells.1.Quantitative study ofhealing process”，Jpn J Ophthalmol.第34卷，第257-266页，1990).

[0009]细胞原位扩散和体外创伤愈合分析方法都易于操作且成本较低。但是由于这两种方法都无法区别细胞迁移和细胞增殖，因此从这两种分析系统所得结果不十分可靠。跨孔侵袭和迁移分析法是最常用的和充分接受的用于分析细胞侵袭和迁移的体外方法。这种分析方法所采用的装置带有一个插入物，所述插入物形成上、下两个室。这两个室由一个包被有人工细胞外基质(ECM)的多孔膜(或称薄膜滤器)分隔开。在插入物或上室内的侵袭性细胞可以以侵袭和迁移的方式穿过所述包被有人工ECM的微孔膜进入下室。通过对穿过包被有ECM的膜进入下室的细胞进行计数可以确定该细胞侵袭和迁移的活性。显然此体外分析系统既可以模拟体内细胞侵袭和迁移过程，又适于对相应的基因和胞内信号转导路径进行大规模分析。然而目前适于这种体外系统的数据采集方法或技术是基于染料的或基于放射性同位素的方法，而且在大多数情况下，数据的采集需要进行手工计数。对侵袭和迁移通过膜到达下室的细胞进行计数是困难和费时的，所以该分析方法的准确性和通量受到极大的限制。而且在使用这种数据采集方法时，经常会碰到灵敏性、重复性和简易性等问题。目前，已知对与细胞侵袭和迁移相关的分子和胞内信号转导路径的分析快速增加，因此迫切需要一种更有效的体外分析系统。为了提高分析的准确性和通量，Amersham Pharmacia和Becton Dickson(BD)Bioscienses公司提出了两种新的分析系统。Amersham系统使用闪烁微量滴定板(cytostar-T)(Graves，R.等人，“A novel assay for cell invasion usingCytostra-T scintillating microplates”，Scientific poster，http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/DrugScr+Scientific+Posters)以使用[¹⁴C]和[³⁵S]标记的细胞来测量细胞侵袭和迁移。在每个检测孔内都加上一层下层ECM凝胶层形成屏障，用于阻碍标记细胞到达含有闪烁体的基板。标记细胞然后被加在上层ECM凝胶层上，然后对整个微量滴定板进行过夜培养。只有能侵袭下层ECM凝胶层并接近闪烁体的细胞才能在分析中产生信号。此系统可用于自动并实时监测穿透ECM凝胶的细胞。然而放射性同位素标记的使用限制了此系统的应用。BD-Biosciences开发的这套系统采用一种避光Fluoroblok PET膜，该膜是特殊设计的可阻止490-700纳米的光线的透射(BD BioCoat^TM FluoroBlok^TM Tumor Cell Invasion System：http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/drug_discovery/insert_systems/fluoroblok_invasion/)。实验细胞需先用荧光染料染色，再置于避光Fluoroblok PET膜插入物上。到达插入物背面的侵袭细胞，可实时地被荧光检测器监测而不破坏分析。使用此分析系统，侵袭分析的生产力和通量可显著地提高。然而，由于并非所有细胞类型都可被荧光染料均匀地标记，并且在某些情况下对细胞进行标记会改变细胞的侵袭和迁移，因此此系统的运用受到极大的限制。

[0010]生物电子学是正在发展的涉及生物材料和电子仪器整合的跨学科的研究领域。在细胞操作和细胞分析中使用电子学方法已引起越来越多的关注。

[0011]细胞-基片阻抗(cell-substrate impedance)测量是一种用于细胞监测和传感的电子学方法。贴壁细胞培养在位于固体基片上的微电极结构表面。贴附在电极表面有无细胞可敏感地影响细胞培养基和电极结构间的电子和离子传导(可参见如Giaever I.和Keese C.R.，“Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an appliedelectric field”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1984，第81卷，第3761-3764页)。由此，查询电极阻抗值可提供存在于电极上细胞的生物学状态的重要信息。美国专利5,187,096公开了一个具有多电极阵列的细胞基片电阻抗传感器。用于测量细胞基片阻抗的阻抗传感器上的每一个电极对包括一个小的电极(测量电极)和一个大的电极(参考电极)，它们位于两个不同的层。两个电极尺寸大小的区别确保了测量的阻抗值相对于无细胞存在于电极上时阻抗值的变化是直接与细胞数目和大小相联系的，通常20-50个细胞，甚至单个细胞贴附或生长在测量电极上。这种细胞传感器的一些应用包括监测生物反应器中的状况，监测细胞培养物中的状况，检测化合物的细胞毒性，研究细胞生物学以探测细胞运动性、代谢活性、细胞贴附和扩散等等。然而此包含双层结构的阻抗传感器，由于测量电极在一层中而参考电极处于另一层而显得相当复杂。而且对小电极选择的电极面积限制了每次最多监测50个细胞。

[0012]美国专利号4,686,190公开了一种用于体外研究细胞经单层上皮细胞层迁移情况的装置，该装置可同时测量上皮细胞层的跨上皮电阻。

[0013]WO 02/42766A2公开了一种用于研究化学药品及其它因素对细胞活动的影响的装置和方法。在此装置中，细胞在一种琼脂糖环境内迁移，其位置可被一个系统监测，该系统可在细胞到达靶电极时，测量装配石印在基片上的靶电极上的阻抗和其它系统电参数的变化。

[0014]其它一些目前用于体外细胞迁移分析的数据采集方法或技术一般是基于染料的，而且大多数情况下都需要人工计数。因此在使用基于染料的方法时，经常会碰到灵敏性、重复性和简易性的问题。

[0015]为了克服现存技术的缺点，本发明的目标是扩展电领域和其他电子学方法在测量和分析细胞、非细胞颗粒以及该细胞或非细胞颗粒的生物学、生理学和病理学状况中的用途和应用。为此目的，此发明提供了一种创新的利用微电子技术的细胞迁移分析装置。

发明概述

[0016]一方面，本发明提供了一种用于监测生物学颗粒迁移(如细胞的迁移)的装置。此装置包括一个上室以接受和保持细胞样品，一个下室，该下室包括至少两个电极，和一个生物相容的多孔膜，该膜带有足够让细胞可迁移通过的孔隙度。该薄膜被放置在装置中以分隔出上下两个室。迁移过多孔膜的细胞迁移使得迁移的细胞可与位于下室内的一个或多个电极相接触。此接触引起电极间或电极之中一个可测量的阻抗变化。

[0017]在一个优选的实施方案中，该装置包括一种或多种固定在至少两个电极表面的捕捉试剂。这些捕捉试剂具有结合靶细胞和/或颗粒的能力。

[0018]电极可被装配放置在位于下室的膜的表面上。在一个实施方案中，下室具有足够大的底面积用于贴附选自1-10，10-100，100-300，300-700，100-1,000，700-1,000，1,000-3,000，3,000-6,000，6,000-10,000和1,000-10,000个细胞的细胞群。在另一个实施方案中，位于下室内的膜的表面至少有5％被电极覆盖。在另一个实施方案中，下室的表面积小于1mm²。

[0019]在一个优选的实施方案中，该装置还包括一个与电极存在电连通的阻抗分析仪。

[0020]生物相容的多孔膜可含有绝缘材料。此绝缘材料可为玻璃，蓝宝石，硅，硅上的二氧化硅，或一种或多种聚合物。在一个优选实施方案中，此生物相容的多孔膜的厚度为2-500微米。

[0021]另外，该生物相容的多孔膜还可含有包被层以促进一个或多个细胞的贴附。

[0022]在另一个实施方案中，该装置还包括从至少一个电极对上引出的并与电极对具有电连通的导电迹线(trace)，以及用来建立导电迹线与阻抗分析仪之间的电连接设备。

[0023]在另一方面，本发明还包括一种监测细胞迁移的方法。该方法包括将细胞导入到上述装置的上室中并确定电极间或电极之中是否有阻抗变化。如果在实验过程中有阻抗变化，则说明有细胞迁移入或通过生物相容的多孔膜。

[0024]此方法还包括在装置的下室中加入已知的或怀疑是的细胞迁移调节物。

[0025]在另一个实施方案中，该方法还包括在装置的上室中加入已知的或怀疑是的细胞迁移调节物。

[0026]细胞可为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，此哺乳动物细胞是被怀疑为恶性的细胞。在另一个实施方案中，该哺乳动物细胞为神经元细胞。

[0027]细胞也可包括一种或多种微生物。

附图简述

[0028]图1为细胞迁移测量装置的示意图，包括上室110、跨膜孔120，下室130，该下室具有基于阻抗的计数电极150。阻抗分析仪可与电极150相连接以监测细胞迁移/侵袭。操作中，有迁移/侵袭能力的细胞由上室110经跨孔膜内的孔迁移至下室。由上室迁移到下室的一些或全部细胞可附于下室130的底面，在此处有电极150，因而细胞可接触并贴附于电极150而使在电极150的阻抗发生改变。此阻抗的改变可用于监测由上室迁移而来的细胞数目。

[0029]图2是通过直接监测在细胞通过膜230上的孔时，上室210和下室220间阻抗的变化来确定细胞迁移的示意图。阻抗的改变由阻抗分析仪240监测。

[0030]图3示意了8种不同类型电极在贴附有NIH3T3细胞和没有NIH3T3细胞贴附时的电阻和电容性电抗。图3-7，10，11中Y轴所示阻抗为电阻，图16到29中Y轴所示电容为电容性电抗。电阻和电容性电抗的单位都为欧姆。

[0031]图4示意了用3B电极定量测量细胞。

[0032]图5示意了用3C和3B电极实时监测NIH3T3细胞和PAE细胞的增殖。

[0033]图6示意了用3C电极测量的4种不同细胞类型的阻抗比较。

[0034]图7示意了阻抗测量的重复性。

[0035]图8是一个电子细胞芯片设计图。此图显示了5个代表性的电子细胞芯片设计。不同形状和大小的金电极位于玻璃基片的中央。玻璃基片的尺寸为1cm×1cm。金电极经位于玻璃基片侧面的连接电极垫(connection electrode pads)与电子检测界面(electricdetection interface)相连。

[0036]图9示意了电极检测细胞的机理。

[0037]图10示意了在测试装置上实时监测PAE细胞增殖的情况。细胞以不同密度(8,000和1,000细胞)接种于包被的电极上。如所显示的测量不同时间间隔的电阻(在图中显示为阻抗)和电抗(未显示)以监测细胞增殖。“t0”显示为接种细胞后的立即测量。在两种细胞接种密度下，阻抗(即电阻)值都随着培养时间增加而上升，说明细胞处于增殖状态。接种密度高的细胞增殖速度明显高于接种密度低的细胞。Sd：接种密度。

[0038]图11示意了在测试装置上和应用MTT分析法对细胞进行定量测量。连续稀释的NIH3T3细胞(10,000，5,000，2,500，1,250和625个细胞)被加到包被了纤连蛋白的测试装置或96孔平板上。对于使用装置的分析，阻抗(在此图中为电阻)是在接种后16小时测量的。对于MTT分析，细胞在接种后16小时用MTT染料染色，再在ELISA平板阅读器上于540nm进行阅读。如图所示，装置可定量地测量细胞数目的变化。两种方法所得到的结果几乎相同。进一步，目前芯片的设计具有检测少于600个细胞的能力，在这一点上，是与MTT检测法相当的。

[0039]图12显示是用于迁移分析的16单元的电子细胞芯片。

[0040]图13展示了一个用于迁移分析的示例性装置。(A)显示了一个测试单元：包括一个含有电子细胞芯片室(下室)，一个带有微孔膜的插入物。细胞被接种于插入物中并被培养。有侵袭能力的细胞以便袭和迁移的方式通过膜并贴附在芯片的电极上，从而被阻抗分析仪检测。(B)显示装置的横截面，每行有8个单元。(C)显示一个16单元的装置且与阻抗分析仪相连接。

[0041]图14为细胞迁移/侵袭测量装置的示意图，包括上室10，带有基于阻抗的计数电极或电极阵列25的跨孔膜20，和下室30。电极阵列25位于跨孔膜20的底面，面对下室30。阻抗分析仪或阻抗测量电路60由特定电连接电缆/电线或其他方法可操作地连于电极25，用来监测电极上的细胞数目。电极阻抗的改变是由从上室迁移来的细胞贴附导致的，反映了从上室迁移而来的细胞数目。

[0042]图15为在图14中所示的用于监测细胞迁移/侵袭的电极的形状的示意图。15(A)交错的平行线状电极阵列，此电极的宽度可以大于、等于或小于电极间隙(gap)；15(B)齿型的错位电极结构；15(C)盘状电极添加在线形电极上的电极结构；15(D)齿型的直电极结构；15(E)正弦曲线状电极结构；15(F)同心电极结构。电极的特征尺寸小的可以小于10微米，大的也可以大于数百微米。整个激活的电极面积可以有不同的形状，如规则的形状，如矩形，(图15(A)，15(B)，15(E))或类似圆形(15(C)，32(D))或者其它的规则或不规则形状。优选的，整个电极区域的面积(包括电极和电极间隙的面积)可覆盖上室的几乎全部底面。电极结构经连接垫连接到阻抗测量电路(如阻抗分析仪)(如图15(A)和图15(B)所示)，连接垫可以直接与电极部件相连(如图15(A)，图15(C)，图15(E)所示)或经过其它电连接方式与电极部件相连(如图15(B)和图15(D)所示)。在图15(A)，(C)和(E)中，连接垫也是电极结构中连接电极部件的电导连接通路。

[0043]图16是一个包含多个上室(1610)和下室(1630)的装置示意图。在这种情形中，多个上室(1610)与带有大小适合于细胞迁移或侵袭的孔的膜(1620)相连接。每个上室(如1610a)有一个对应的下室(如1630a)。对于每个上室，在膜的底面都有面向下室的电极结构。操作中，膜上的电极结构可经不同方法连接至阻抗测量设备上。例如，电极结构经膜上导电迹线或通路与位于膜边缘的连接垫相连接。连接垫可由不同方法与阻抗测量设备相连接。一种方法是：与阻抗测量设备或电路可操作地相连的电线可被焊接或通过导电连接结合在连接垫上。对于上室也存在各种实施方案，在一个实施方案中，多个上室是是单独分离的，仅在连接于同一膜(1620)上时被连接到一起。在另一个实施方案中，多个上室是相互连接的并被装配在一起(如多个上室可以是塑料的并通过注射成型法制成)。然后这些上室的一件被结合在膜上。

[0044]图17是含有多位点细胞迁移和侵袭测量的装置的示意图。其底板(1730)包含多个下室。顶板(1710)包含多个插入孔(1715)。每一插入孔的底面为膜(1720)，其底面具有电极结构，面向下室。操作中，顶板(1710)置于底板(1730)上。位于各个插入孔底面的电极结构可以以多种方法连接于阻抗测量设备上。例如位于膜的底面的电极结构可经位于插入孔外面的导电通路(1780)连接于插入孔外缘的连接点(1790)。当插入孔插入底板时，这个连接点(1790)可进一步与底板上的连接垫(1795)相连接。这个位于底板上的连接垫(1795)可操作地连接到阻抗测量电路上。在另一个例子中，膜的底面的电极结构可被连接到膜上的连接垫处(未显示)。当插入孔插入底板时，此连接垫可与位于下室上的的针状或其它形状的连接点(1750)接触相连。

[0045]图18为图17中所示的细胞迁移/侵袭装置的横截面示意图，图示位于各个插入孔的膜上的电极结构在细胞经膜上的孔迁移前(上图，阻抗为Z₀)和在细胞经膜上的孔侵袭/迁移后(下图，阻抗为Z_cell)的阻抗测量。

[0046]图19为含有多个上室(1910)，跨孔膜1920和下室(1930)的装置示意图。其中多个上室(1910)与带有大小适合于细胞迁移或侵袭的孔的膜(1920)相连接。每个上室(如：1910a)都有一个对应的下室(如：1930a)。对于每个下室，在下室的底面都有电极结构，面向上室。操作中，在下室的电极结构可经不同方法连接于阻抗测量电路或设备上以测量贴附和/或粘着于电极上的细胞。监测所得的阻抗可反映由上室迁移至下室的细胞数目。

[0047]图20是一个具有多位点细胞迁移和侵袭测量的装置的示意图。底板(2030)包含多个下室。电极结构置于或整合入下室的底面上，面对上室。顶板(2010)包含多个插入孔(2015)。每个插入孔的底面都为膜。操作中，顶板(2010)置于底板(2030)上。在每一下室底面上的电极结构可由各种方法与阻抗测量设备相连接。

[0048]图21是图20细胞迁移/侵袭装置的横截面示意图，图示位于下室上的电极结构在细胞经膜上的孔迁移前(上图，阻抗为Z₀)和细胞经膜上的孔侵袭/迁移后的阻抗测量(下图，阻抗为Z_cell)。

[0049]图22为非侵袭性NIH3T3细胞和侵袭性HT1080细胞在细胞迁移装置中的侵袭和迁移活性的对比，此装置的电极结构整合于下室的底面，如图1所示。

[0050]图23(A)为非侵袭性NIH3T3细胞和侵袭性HT1080细胞在细胞迁移装置(图23(B))中的侵袭和迁移活性的对比，此装置的电极结构位于插入物的微孔膜上(相似于图16所示结构)。

[0051]图24显示用细胞迁移装置实时监测强力霉素对癌细胞侵袭和迁移的抑制效果的结果，其中电极结构位于插入物的多孔膜上(类似于图16所示结构)。(A)一种由强力霉素引起的时间和剂量依赖性的对HT1080细胞侵袭和迁移的抑制。(B)使用具有软件控制的阻抗测量数据采集的全自动设备实时监测强力霉素对HT1080细胞侵袭和迁移的动态抑制作用。如图24(B)所示，此迁移过程连续地每隔15分钟监测一次。

[0052]图25(A)显示在两种条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”(circle-on-line)电极结构所测得电阻的典型频谱：(a)空心标记，含HT1080细胞的组织培养基被添加于在孔的底面含电极结构的孔中不久后(10分钟以内，细胞尚未贴附于电极和基片表面上)；(b)实心标记，为含HT1080细胞的培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中之后2小时40分钟(细胞已贴附到电极和基片表面上)。在此2小时40分钟内，孔被置于温度为37℃和5％CO₂水平的组织培养箱中。电极结构如图3B所示设计，线宽为30微米，线间隙为80微米，在线上的连续圆的直径为90微米。在此例中覆盖电极和电极间隙的总面积约等于一个直径3mm的圆。此玻璃基片上的电极结构构成一个圆锥体状孔的底面，孔的顶面直径为6.5mm，底面直径大约为5mm。在实验中，含约7,000个HT1080细胞的，总体积100微升的组织培养基被加入在孔的底面包含电极结构的孔中。

[0053]图25(B)所示为与图25(A)相同条件下，在相同电极结构所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对大小被绘制为对数值(以与图16中的曲线相同的方式)。除了高频率的1MHz和580kHz，在含有HT1080细胞的组织培养基被加入含有电极结构的孔中不久后(10分钟内)测得的电极结构的电抗都为负值(电容性电抗)。在细胞悬液加入含有电极结构的孔中后2小时40分钟时测得的电抗在测量的整个频率范围100Hz到1MHz内都为负值。

[0054]图25(C)示意了基于图25(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。

[0055]图25(D)示意了基于图25(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意在计算电抗比率时，电抗极性(即，电容和电感性电抗)已被考虑在内。

[0056]图26(A)显示在两种条件下装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱：(a)空心标记，为含HT1080细胞的组织培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中不久(10分钟以内，细胞尚未贴附到电极和基片表面上)；(b)实心标记，为含HT1080细胞的培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中之后2小时40分钟(细胞已贴附到电极和基片表面上)。在2小时40分钟内，孔被置于温度为37℃和5％CO₂水平的组织培养箱内。电极结构如图3B所示设计，线宽为30微米，线间隙为80微米，在线上的连续圆直径为90微米。在此例中，覆盖电极和电极间隙的总面积约等于一个直径3mm的圆。此玻璃基片上的电极结构构成一个圆锥状孔的底面，孔的顶面直径为6.5mm，底面直径约为5mm。实验时，含约3,200个HT1080细胞的总体积100微升的组织培养基被加入在孔的底面包含电极结构的孔中。

[0057]图26(B)所示为与图26(A)相同条件下，在相同电极结构所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对大小被绘制为对数值(以与图16中的曲线相同的方式)。除了高频率的1MHz和580kHz，在含有HT1080细胞的组织培养基被加入含有电极结构的孔中不久后(10分钟内)测得的电极电抗都为负值(电容性电抗)。在细胞悬液加入含有电极结构的孔中后2小时40分钟时测得的电抗在整个测量频率范围100Hz到1MHz内都为负值。

[0058]图26(C)示意了基于图26(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。

[0059]图26(D)示意了基于图26(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意：在计算电抗比率时，电抗的极性(即，电容和电感性电抗)已被考虑在内。

[0060]图27(A)显示在两种条件下装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测得电阻的典型频谱：(a)空心标记，为含HT1080细胞的组织培养液被添加到在孔的底面含电极结构的孔中不久(10分钟以内，细胞尚未贴附到电极和基片表面上)；(b)实心标记，为含HT1080细胞的培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中之后2小时40分钟(细胞已贴附到电极和基片表面上)。在2小时40分钟内，培养孔被置于温度为37℃和5％CO₂水平的组织培养箱内。电极结构如图3B所示设计，线宽为30微米，线间隙为80微米，在线上的连续圆直径为90微米。在此例中，覆盖电极和电极间隙的总面积约等于一个直径3mm的圆。此玻璃基片上的电极结构构成一个圆锥状孔的底面，孔的顶面直径为6.5mm，底面直径约为5mm。实验时，含约500个HT1080细胞的总体积100微升的组织培养基被加入在孔的底面含电极结构的孔中。

[0061]图27(B)所示为与图27(A)相同条件下，在相同电极结构所测得的电抗频谱。注意电抗的绝对大小被绘制为对数值(以与图16中的曲线相同的方式)。除了高频率的1MHz和580kHz，在两种条件下测量的电极结构的电抗都为负值(电容性电抗)。

[0062]图27(C)示意了基于图27(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电阻值与无细胞贴附时的电阻值的比率频谱。

[0063]图27(D)示意了基于图27(A)所示结果，有细胞贴附于电极表面时电抗值与无细胞贴附时的电抗值的比率频谱。注意：在计算电抗比率时，电抗的极性(即，电容和电感性电抗)已被考虑在内。

[0064]图28(A)是不同数目的细胞加入带有相同类型的“圆在线上”电极结构(电极形状3B)的孔内的电阻比率频谱。图28(A)为图25(C)，26(C)和27(C)中所示频谱的综合图示。一种计算“细胞数目指数”(cell number index)的方法是基于这些电阻比率的频谱，该方法首先确定电阻比率的最大值，然后将最大值减一而得到“细胞数目指数”。通过此法得到的细胞数目指数在加入不同细胞数目7,000，3,200，和500时分别为5.17，1.82和0.17.显然，细胞数目越大，细胞数目指数越高。

[0065]图28(B)是不同数目的细胞加入带有相同类型的“圆在线上”电极结构(电极形状3B)的孔内的电抗比率频谱。图28(A)为图25(D)，26(D)和27(D)中所示频谱的综合图示。

实施本发明的模式

[0066]为了公开内容的清楚而不是以此限制本发明的内容，本发明以下的详细阐述将分为多个部分。

[0067]具有采用本专利申请所公开的装置和系统的阻抗传感的基于细胞的分析可提供无侵害性的测量，从而细胞可实时地，持续地被监测，且在基于阻抗的传感后细胞还可继续用于其他的基于细胞或基于分子的分析。所公开的装置和系统可以提供细胞数目和细胞生物学状况(包括贴附状况、状况、生存力等)的动态信息。此外，测量过程不需要进行任何试剂标记，由此节省了标记试剂的费用以及相关的处理和添加那些标记所需的人力。进一步，整个测量过程可由计算机控制并是全自动的。研究人员只需对所需的分析过程接种细胞并添加合适的化合物和培养基。最后此测量系统是准确的，且具有高度再现性和重复性。而且该测量系统也是非常灵敏的，表示为单位面积上的细胞数目(例如大约为5细胞/mm²)。

[0068]公开的实施方案中大部分加到孔中的细胞对本申请装置上电极间阻抗变化的影响，都被进行监测。这是通过一个大的电极宽度和电极间隙比率实现的，且在本发明装置的一个实施方案中，是通过传感电极实现的，该电极覆盖平板上孔的整个面积。由此更多的细胞对电极间阻抗的改变的影响都得到监测的实施方案具有如下优点，可以减少同一平板的不同孔间或不同平板中孔间的实验变差。这也能够提高在分析中测量少量细胞时的精确性和灵敏性。

[0069]电极宽度，间隙宽度和电极部件分布的选择保证电场分布相对均匀。比如说，电极的设计保证对于任意两个邻近的处于不同电极结构上的电极部件，从这两个部件的每一个到与它们相应的连接垫之间的电阻的总和对于任意给定的两个相邻电解部件而言几乎是恒定值。由此，任意两个邻近部件对阻抗的影响是近乎相同的。这样无论细胞位于何处，它们对阻抗改变的影响是相同的。

[0070]电极间连接的方便方法可保证在同一载玻片上易于增加多个传感器。

[0071]在用于阻抗传感的电极的某些实施方案中，存在不均匀的电场分布。这种情况已经在很多介电电泳的文献中被证实和显示，其中在特定的电和细胞悬液条件下，细胞将会经受所谓的介电电泳力，并朝着电极部件边缘方向移动或是离开电极部件边缘方向移动。如，下列文献清楚地证实了对各种电极出现的这种效应：“Selectivedielectrophoretic confinement of bioparticles in potential energy wells”，by Wang X-B等人，J.Phys.D：Appl.Phys.第26卷：第1278-1285页，1993；“Positive and negative dielectrophoretic collection ofcolloidal particles using interdigitated castellated microelectrodes”，byPethig R.等人，J.Phys.D：Appl.Phys.第25卷：第881-888页，1992。另外，下列理论性的论文提供了交错电极的不均匀电场分布的额外信息：“A theoretical method of electrical field analysis fordielectrophoretic electrode arrays using Greens’s theorem”，by WangX-J等人，J.Phys.D：Appl.Phys.第29卷：第1649-1660页，1996。

[0072]表1为MTT检测结果和细胞阻抗传感检测结果的比较。在此实验使用的是具有16个电极单元的玻璃载玻片(每个电极单元具有3B所示的性状，见下表2)。底部直径为5mm的16孔塑料条被液态粘合剂装配在玻璃载玻片上。不同数目的HT1080细胞被接种于16×装置的不同孔中。通过对每个电极单元测量的串联电阻中最大的相对变化值进行计算可推导出相应的细胞数目指数。表1显示细胞接种后2.5小时的细胞数目指数。孔表面(包括电极表面)通过在孔内浸泡浓度为50μg/ml(微克每毫升)的纤连蛋白溶液一小时的方法进行纤连蛋白的预包被(pre-coated)。在阻抗测量开始后2.5小时结束实验。在同一装置中的细胞同时用MTT分析以做比较。做MTT分析时，10μl MTT试剂溶液被加入到每个孔中。反应物在37℃下培养4小时后在每个孔中加入100μl的停止液(stop solution)。加入停止液后，反应物继续在37℃下培养12小时以溶解在MTT反应时形成的不溶性紫色甲

(formazan)晶体。装置中的颜色密度在波长设为550nm的96×平板阅读器Molecular Device上测量。作为参考吸光度(在650nm的波长)用于测量非特异性读数。

表1

孔号	细胞数目	细胞数目指数	MTT读数
				B1	1.54E+04	4.74E+00	1.43E+00
C1	1.19E+04	4.71E+00	1.43E+00
				D1	9.13E+03	3.73E+00	1.18E+00
E1	7.03E+03	5.80E+00	1.01E+00
				F1	5.41E+03	4.41E+00	9.40E-01
G1	4.17E+03	2.79E+00	7.62E-01
				H1	3.21E+03	1.59E+00	6.86E-01
H2	2.47E+03	7.99E-01	5.99E-01
				G2	1.90E+03	6.94E-01	5.39E-01
F2	1.47E+03	7.67E-01	4.29E-01
				E2	1.13E+03	5.89E-01	3.83E-01
D2	8.69E+02	3.61E-01	3.30E-01
				C2	6.69E+02	2.62E-01	3.14E-01
B2	5.15E+02	1.39E-01	2.48E-01
				A2	3.97E+02	1.51E-01	2.54E-01
A1	0.00E+00	9.38E-02	2.38E-01

A.定义

[0073]为了公开内容的清楚而不是以此限制本发明的内容，本发明以下的详细阐述将分为多个部分。

[0074]除非有另外的定义，在此使用的所有技术和科学术语都与本发明所属技术领域内技术人员理解的术语具有相同的意义。在此所提及的所有专利，申请，公开的出版物和其他在此处引用的出版物都整体引入作为参考。如若在本部分内提出的定义与在此处引入作为参考的专利，申请，公开的出版物或其他出版物中提出的定义相反或矛盾，则采用本部分提出的定义，而不采用在此处引入作为参考的定义。

[0075]在此使用的“一个(a)”或“一个(an)”指“至少一个”或“一个或多个”。

[0076]在此使用的“至少两个电极装配在基片的同一面上”，指如果绝缘基片为多层，则至少两个电极被装配在基片的同一层上。

[0077]在此使用的“膜”，是指材料薄片。

[0078]在此使用的“生物相容的膜”指对细胞没有有害作用的膜，包括对存活力，贴附，扩散，运动性，生长，细胞分裂等没有有害作用。

[0079]当含有活的，未受损害的，上皮细胞或内皮细胞的悬液被加入器皿中时，器皿的表面“适于细胞贴附”是指12小时内显著比例的细胞贴附于器皿表面。优选的是，在12小时内至少50％的细胞贴附于器皿表面。更优选的是，一个适于细胞贴附的表面具有的表面性质使得平板接种(即，将细胞加入器皿)12小时内至少70％的细胞贴附于表面。或更加优选的是，适合于细胞贴附的表面的表面性质使得平板接种12小时内至少90％的细胞贴附于表面。最优选的是，适合于细胞贴附的表面的表面性质使得平板接种8，6，4，2小时内至少90％的细胞贴附于表面。为了具有用于细胞贴附所需的表面性质，表面须经化学处理(如：用酸和/或碱处理)和/或物理处理(如：用血浆处理)，和/或生物化学处理(如：用一种或多种有利于细胞贴附的分子或生物分子包被)。在此发明中，一个生物相容的表面(例如膜)优选适合于让在用于生物相容的表面(膜)的分析中所使用的细胞类型贴附，更优选地是在分析中使得至少90％与生物相容的表面接触的细胞能够贴附。

[0080]“生物分子包被”是指在表面的包被，包含天然生物分子或生物化学分子，或衍生自或基于天然生物分子或生物化学分子的生物化学分子。例如，生物分子包被可包括胞外基质成分(如纤连蛋白，胶原)，或其衍生物，也可包括生物化学分子，如聚赖氨酸或聚鸟氨酸，它们是基于天然存在的生物化学分子赖氨酸和鸟氨酸的聚合物。基于天然存在的生物化学分子如氨基酸的聚合物分子，可利用天然存在的生物化学分子的异构体和对映异构体。

[0081]“胞外基质成分”是指存在于动物胞外基质中的分子。它可以是来源于任意物种和任意组织类型的胞外基质成分。胞外基质成分的非限制性例子包括层粘连蛋白，胶原纤连蛋白，其他糖蛋白，肽，糖胺聚糖，蛋白聚糖等。胞外基质成分还包括生长因子。

[0082]“电极”是指一种具有高导电性的结构，它的导电率远远高于周围物质。

[0083]在此使用的“电极结构”是指单个电极，特别是一个具有复杂结构的电极(如一个螺旋型的电极结构)，或者是至少两个电连通的电极部件的结合体。所有在一个“电极结构”中的电极部件都是电连通的。

[0084]在此使用的“电极部件”是指电极结构中的单个构造，例如，交错电极结构中的指状突起结构。

[0085]在此所指的“电极结构单元”是指两个或多个电极结构所形成具有一定尺寸和间隔的结构，当连接于信号源时，可作为一个单元在电极结构周围间隔区产生电场。本发明中优选的电极结构单元可测量当细胞贴附在电极表面时的阻抗变化。电极结构单元的非限制性例子包括交错电极结构单元和同心电极结构单元。

[0086]“电极迹线”(electrode traces)是指由电极或电极部件或电极结构通向装置或设备一端或周边的一个导电通路，以将电极，电极部件或电极结构与信号源连接起来。装置的末端或周边可对应于装置或设备上的连接垫。

[0087]在此使用的“至少两个电极(电极阵列)有基本基本相同的表面积”指任意两电极(电极阵列)的表面积没有大的差别，从而细胞在大电极(电极阵列)贴附或生长引起的阻抗改变对阻抗中总的可探测改变的作用的程度与细胞在小电极(电极阵列)贴附或生长引起的阻抗改变是相同或相似的。换句话说，无论是大电极(电极阵列)或小电极(电极阵列)，当细胞在其上贴附或生长时，均对总的阻抗改变起作用。一般说来，最大的电极(电极阵列)和最小的电极(电极阵列)间表面积的比率小于10。优选的是，最大的电极(电极阵列)和最小的电极(电极阵列)间的表面积比率小于5，4，3，2，1.5，1.2或1.1。更优选的是，至少两个电极(电极阵列)有近于相等或相等的表面积。

[0088]“交错”是指来源于一个方向的突起结构与来自另一个方向的突起结构以手指或紧握的手的方式交错(限定是交错的电极部件优选不会相互接触)。

[0089]在此使用的“装置有适于细胞贴附或生长的表面”是指装置上的电极和非电极区域具有合适的物理特性，化学特性，或生物学特性以使实验所需的细胞贴附于其表面，并在装置表面生长时保持贴附。然而，此装置或装置表面却不是必须带有供应细胞存活力或生长的必须物质。这些必须物质如养分或生长因子可以由培养基来提供。优选的是，当含有活的，未受损害的，上皮细胞或内皮细胞的悬液加入“适于细胞贴附的表面”，12小时内至少50％的细胞贴附于该表面。更优选的是，一个适于细胞贴附的表面具有的表面性质使得在平板接种(即，将细胞添加到包含上述装置的室或孔中)12小时内至少70％的细胞贴附于表面。甚至更优选的是，适合于细胞贴附的表面的表面性质使得平板接种12小时内至少90％的细胞贴附于表面。最优选的是，适合于细胞贴附的表面的表面性质使得平板接种8，6，4，2小时内至少90％的细胞贴附于表面。

[0090]在此使用的“在电极之间可测量的阻抗变化”是指当细胞贴附或生长于装置表面时将导致电极之间产生显著的阻抗改变，该阻抗改变可被阻抗分析仪或阻抗测量电路测得。阻抗改变指当有细胞在装置表面贴附或生长时的阻抗和无细胞在装置表面贴附或生长时的阻抗值之间的差别。一般说来，阻抗改变超过0.1％即可被测得。优选的是，可测得的阻抗值改变超过1％，2％，5％，8％。更优选的是，可测得的阻抗值改变超过10％。电极间的阻抗通常是所加用于测量的电场频率的函数。“在电极之间可测量的阻抗变化”并不要求在所有的频率有可测得的阻抗改变，而只需阻抗的改变在任一单个或多个频率可被测得。此外，阻抗包括两部分，电阻和电抗(电抗可被分为两类，即电容性电抗和电感性电抗)。“在电极之间可测量的阻抗变化”只需电阻和电抗之一的变化在任一单个或多个频率可被测得。

[0091]在此使用的“至少两个电极有基本不同的表面积”是指任一电极的表面积相互都不类似，因此当细胞贴附或生长于大电极时引起的阻抗改变对总的可测量阻抗的作用的程度与或当细胞贴附或生长于小电极时引起的阻抗改变不相同或相似。优选地，细胞贴附或生长于于大电极引起的阻抗改变明显小于细胞贴附或生长于于小电极引起的阻抗改变。一般说来，最大电极和最小电极表面积的比率应超过10。优选地，最大电极和最小电极表面积的比率超过20，30，40，50，或100。

[0092]在此使用的“接触电极部件的可能性大”是指如果细胞被随意的放到本发明的设备或装置传感器区域，细胞(或颗粒)接触电极部件的可能性由在本发明设备或装置之上或之中应用的细胞的平均直径，电极部件的大小，电极部件的间隙大小计算而来，应大于约50％，更优选的情况下应大于约60％，更优选的情况下应大于约70％，甚至优选地大于约80％，大于约90％，或大于约95％。

[0093]“插入托盘(insert tray)”是一种包含一个或多个凹陷或孔(在下文中称为插入物)的结构，它可配合进入一个液体容器；或者，如果插入托盘包括多个插入物，它们可配合进入多个液体容器或多孔平板，这样插入托盘的一个或多个插入物构成在液体容器中的室或多孔平板中的孔。在本发明的某些方面，一个插入托盘带有至少一个本发明的装置，构成至少一个插入物的底部，这样当插入物被放入一个液体容器中时，由其形成的室在其底面有带有至少一个电极的非导电的基片。

[0094]在此使用的“剂量反应曲线”是指细胞对检验化合物的剂量浓度反应的依赖关系。细胞的反应由许多不同的参数测得。例如，某检验化合物被疑为具有细胞毒性和可导致细胞死亡。那么细胞的反应可用此检验化合物处理细胞后不能生活的(或活的)细胞的百分比来表示。

[0095]在此使用的“样品”是指含有使用本申请的装置、微量滴定板或方法来分离，操作，测量，定量，探测或分析的部分的任何物质。样品可为生物学样品，如生物流体或生物组织。生物流体的例子包括尿，血，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰，脑脊液，泪液，粘液，羊膜液等。生物组织是通常具有特定类型的细胞与其细胞间物质一起的集合，可形成人，动物，植物，细菌，真菌或病毒结构的一种结构材料，包括结缔组织，上皮组织，肌肉组织，和神经组织。生物组织的例子也包括器官，肿瘤，淋巴结，动脉，和单个细胞。生物样品也可进一步包括细胞悬液，包含生物分子(如蛋白，酶，核酸，糖类，结合到生物分子的化学分子)的溶液。

[0096]在此使用的“液体(流体)样品”为天然以液体或流体形态存在的样品，如生物流体。“液体样品”也可指天然以非液体状态，例如固体或气体存在的样品，但被制成含该固体或气体样品材料的液体、流体、溶液或悬液。如，液体样品可为含生物组织的液体，流体，溶液，或悬液。

B.检测细胞迁移的装置和方法

[0097]一方面，此发明是一种监测细胞迁移或侵袭的装置，它包括：a)一个上室，用于放置迁移或侵袭的细胞，或疑为迁移或侵袭的细胞；b)一个下室，包括两个电极；c)一个生物相容的膜，其上含多孔，孔的大小合适可使该迁移或侵袭的细胞经过，此膜连接于上室和下室之间，并将上室和下室隔离开，其中该迁移或侵袭的细胞经过该膜的孔，后接触和/或贴附于该下室的电极上，使电极间的阻抗产生改变，所述改变可用于监测细胞的迁移或侵袭。

在本发明包括由迁移或侵袭的细胞可经过的含孔膜分隔开的上室和下室的这些方面，其中下室包括至少两个电极，下室中的该至少两个电极优选位于下室底部的顶面。在这些方面的一些实施方案中，膜的下表面有一个或多个部分以阻止细胞贴附。这种部分的非限制性例子为聚乙二醇的某些制剂。在其他实施方案中，膜可经化学处理(如：酸处理)，或物理处理(如：象等离子辐射之类的某些辐射)，或生物处理(如：某种生物分子包被)，以使膜的下表面阻止细胞贴附而具有最小化的细胞贴附作用。在这些方面，经膜移动的细胞贴附于下室的底部引起下室底面电极上的阻抗的改变。

图19和图20显示了两种包含多个用于细胞迁移和侵袭的位点所装置的示例性实施方案。图19中装置包括多个上室(1910)，一个跨孔膜(1920)，和多个下室(1930)。多个上室(1910)连于具有大小适合细胞迁移或侵袭的孔的膜(1920)。每个上室(如1910a)具有一个相对应的下室(如1930a)。每个下室的底面有电极结构，面对上室。含有电极结构的下室的构造与2002年12月20日提交的美国临时申请60/435,400中B部分所描述的，用于监测和/或测量细胞-基片阻抗的装置相同或相似。因而，2002年12月20日提交的美国临时申请60/435,400中B部分关于装置、多孔平板的描述，关于多孔平板与含电极的基片装配方法的描述，电极结构与外部阻抗测量电路连接的方法描述，也适用于此处用来对细胞迁移/侵袭进行监测的下室。操作中，位于下室的电极结构经不同方法连接于阻抗测量电路或仪器以测量由上室迁移而来且已贴附和/或粘着电极结构的细胞。监测的阻抗可用于计算细胞数目指数(或称为细胞迁移指数)，该指数是由上室迁移到下室的细胞数目的指示(或反映)。

[0098]图20中所示装置包括顶板和底板。顶板(2010)包括多个插入孔(2015)。每个插入孔的底面为膜。底板(2030)包括多个下室。电极结构被装配在或整合在每一个下室的底面上，面向插入孔。带电极结构的下底的构造上述B部分所描述的用于监测和/或测量细胞-基片阻抗的装置相同或相似。上述B部分的关于装置、多孔平极的描述，关于多孔平板与含电极的基片装配方法的描述，关于电极结构与外部阻抗测量电路连接的方法的描述，也适用于此处用来监测细胞迁移/侵袭的下室和底板。操作中，将放于适当缓冲液或培养基中已加载了用于迁移/侵袭分析的细胞的顶板(2010)放于底板(2030)中，该底板已加载了包含合适试剂的缓冲液或培养基。置于各个下室底面的电极结构经各种方法被连接于阻抗测量电路或装置上。

[0099]另一方面，本发明涉及用来监测细胞迁移或侵袭的装置，它包括：a)一个用于放置迁移或侵袭细胞，或疑为迁移或侵袭的细胞的上室，该上室含有一个电极；b)一个下室，该下室含有一个电极；c)一个生物相容的膜，该膜含有至少一个大小适合于迁移或侵袭细胞经过的孔，此膜连接于上室和下室，并将上室和下室隔离开，其中迁移或侵袭细胞经该膜的孔运动，引起上室和下室的电极间阻抗产生改变，该改变可用于监测细胞的迁移或侵袭。

[00100]在本发明的另一方面，本发明的装置包括a)上室用于接受细胞；b)下室；c)一个生物相容的聚合物膜，该膜含有大小适合于细胞全部或部分地通过的多个孔，其中此膜将上室和下室相互隔离开；和d)至少两个电极装配在位于下室的膜上，如此电极的活性表面面向于下室。

[00101]本装置中使用的生物相容的膜可含有任何合适的材料。这些材料不受限的例子包括玻璃(如：石英玻璃，铅玻璃，硼硅玻璃)，硅，硅上的二氧化硅，绝缘体上硅(silicon-on-insulator)(SOI)晶片，蓝宝石，塑料，和聚合物。一些优选的聚合物有聚酰亚胺(如Kapton，DuPont出品的聚酰亚胺膜)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚氯乙烯，聚酯，聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，聚丙烯和尿素树脂。聚合物如聚碳酸酯，聚酯，聚对苯二甲酸乙二酯(PET)尤其优选。生物相容的膜可为各种厚度，可为薄至约2微米到厚至约500微米。优选的是，本发明装置的生物相容的膜的厚度为约5到约50微米，更优选的是约8到约25微米。

[00102]在本发明的设备或装置使用时，任何暴露于细胞的非导电基片表面都优选是生物相容的。优选的是，这些非导电基片的至少一个表面是适合于细胞贴附或生长的。非生物相容的或不适于细胞贴附或生长的基片材料可通过包被别的物质，如：聚合物或生物分子包被，以适合使细胞可在其上生长贴附和生长。因此，本发明设备的生物膜表面可包括某些物质，如塑料，它适于细胞的贴附和生长，或者，二者选一地或附加地，包括一层包被，以使细胞在生物膜表面上贴附。

[00103]生物相容膜任选地包含某种包被，该包被促进一个或多个细胞的贴附。此包被可为聚合物，如塑料膜，或者一种或多种生物分子或一种或多种生物分子的一种或多种衍生物，例如但并不限于，聚合物如聚鸟氨酸或聚赖氨酸，肤或蛋白，或胞外基质(或其衍生物或类似物)包括但并不限于明胶，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原，糖胺聚糖，肽聚糖等等。这些包被，优选地，但任选地能覆盖装置使用时能与细胞接触的或暴露于细胞的基片整个表面，包括电极表面。

[00104]包被(coating)可以是半固体或凝胶，也可任选地包含其它附加成分，如但不局限于生长因子。包被也可是生物分子的简单或复杂混合物，也可模仿或重复天然胞外基质(ECM)。例如，Matrigel^TM基底膜基质(BD Bioscience)，它是由Engelbreth-Holm-Swarm(REHS)小鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制剂，这种肿瘤含有丰富的胞外基质蛋白。它的主要成分为层粘连蛋白，其次是胶原IV，硫酸乙酰肝素，蛋白聚糖，巢蛋白和触觉蛋白。它也含有TGF-β，成纤维细胞生长因子，组织纤溶酶原激活物，和其他EHS肿瘤中天然存在的生长因子。

[00105]模仿或重复ECM的包被可以促进细胞贴附。也可在本发明的一些方面，形成屏障阻止细胞迁移/侵袭。细胞经ECM样屏障(如，但不限于Matrigel^TM)的渗透能力可用本发明的设备或装置通过“侵袭测试”实验而检测到。

[00106]本装置的生物相容膜可有一个或多个孔(优选的是多个孔)，该孔具有适合于迁移或侵袭行为被研究的细胞经过的任何合适大小。生物相容的膜可包含具有相同大小的多个孔。可选择地，生物相容的膜可包含具有不同大小的多个孔。优选的是孔的大小应限制同时通过一个孔的细胞少于3个，更优选的是甚至1个细胞。例如说，膜可含有多个大小相同的孔，该孔对于哺乳动物癌细胞，上皮细胞或内皮细胞而言直径为约1-约30微米，更优选的是约2-约10微米。

[00107]在本发明的另一些优选的实施方案中，生物相容的膜的一个或多个孔的直径不容许被用于测量细胞/基片界面电抗，电阻，电容的细胞通过该孔。例如，一个或多个孔可小于约5微米，或优选的是小于约1微米。在这些实施方案的一些方面，一个或多个电极被装配在膜上用于测量在膜上生长的细胞层被侵袭细胞破坏而引起的阻抗的改变。在这些实施方案的另一些方面，细胞在膜上的生长，贴附，脱附，形态，运动性也可被监测。

[00108]每个电极对都与阻抗分析仪电相接。阻抗可被在任何适宜的频率范围内分析或测得，例如频率范围在约1Hz-约100MHz之间，或约10Hz-约5MHz之间。

[00109]最优选地，每个电极对中的至少一个电极适合结合已完全穿过或部分穿过多孔膜的细胞。本装置用于监测细胞迁移的电极应有任意适合的表面积。例如，测量其之间的阻抗以监测细胞迁移或粘着的电极可有基本相同或明显不同的表面积。在另一例中，各个电极表面的表面积足够贴附至少10个细胞。

[00110]在本发明的优选的一方面，两个或更多的电极被装配在生物相容的膜的一面。优选地，两个或多个电极中至少有两个电极有基本相同的面积。有基本相同表面积的至少两个电极优选是同一电极结构单元的一部分。

[00111]本装置的电极结构中的电极或电极部件可有任何合适的形状，如矩形的，圆形的，圆放于矩形线上(“圆在线上”)，正方形放于矩形线上或正弦曲线状线上。它们也可以是别的曲线，如但不局限于螺旋线或弧线。本发明装置的电极，电极结构，或电极结构单元的一些举例示于图9和图15中。

[00112]在发明的一些优选实施方案中，电极结构可为如图15A和15F所示的交错电极结构(IDES)或同心电极结构(CCES)。例如，一个电极结构可包含两个或更多的电极而构成的一个或多个的IDES或一个或多个的CCES。交错电极结构(IDES)可进一步进行修饰或改变，从而平行线电极部件具有大的周长亚形状(subgeometry)，即，从上部观看，加于线形电极部件(其本身可为平行线，曲线，环线，角形，拐角形等)的部分可为分支，露头，凸起等，这样线形电极路径有一个比如果其边界仅符合电极部件路径方向性时更大的周长。具有大周长的结构的例子是菱形在线上电极结构，用图15C所示的“圆在线上”电极结构，图15B，15D所示齿型电极结构。带大周长亚性状的电极结构并不仅限于这里所述的情况，且在亚形状的周期性和外形(曲线形、角形，圆形、矩形)中也可以是规则的25或不规则的。

[00113]优选地，电极和电极部件分布于它们所被装配在的装置的整个表面区域上，其中这个区域会或将会与细胞相接触。换句话说，与或将与细胞相接触的区域由电极(或电极部件)和电极(或电极部件)间隙所覆盖。在本发明优选的装置中，传感器面积应占据装置上在分析中会或将会暴露于细胞的全部表面积的至少5％，10％，30％，50％，70％，80％，90％，95％甚至100％。换句话说，在本发明优选的装置中，分析中会或将会暴露于细胞的表面区域的至少5％，10％，30％，50％，70％，80％，90％，95％甚至100％都应覆盖电极(或电极部件)和电极(或电极部件)间隙。优选地，电极或电极部件在传感器区域的分布是均匀的或接近均匀的。

[00114]在装置包含至少两个电极结构的实施方案中，这两个或多个电极部件优选应排布成电极结构。当电极部件不是矩形时，“电极宽或电极部件宽”指在基片平面上的电极部件从与一个电极间隙的相接处到与之相对的另一个电极间隙相接处(在与电极部件长轴垂直方向上)的平均尺寸。当电极间隙不是矩形时，“电极间隙”指间隙在基片平面上，从与一个电极部件相接处到对侧的另一个电极部件相接处(在与间隙长轴垂直方向上)的平均尺寸。对于本发明而言，基片是指其上装配有电极的材料。如当电极装配在生物相容的膜上时，则膜为基片。

[00115]为了监测细胞的行为，优选地，电极部件之间的间隙应基本不超过用本装置监测细胞行为的细胞的大小(如：指扩散并贴附于基片的细胞的宽度)。这减少了细胞和基片接触但不与至少一部分电极或电极部件接触的可能性。而且，优选的电极部件之间间隙的宽度(或间隙大小)应基本不小于被装置监测的细胞的大小(如：扩散和贴附于基片的平均细胞的宽度)以减低细胞接触相邻电极部件的可能性，那样将会产生相对于细胞仅接触于一个电极时，特别大的阻抗信号。如果电极的宽度远大于用本装置检测细胞行为的细胞的大小(如10倍)，那这点尤其重要。另一方面，如果电极宽度与细胞的大小(如：扩散和贴附于基片的平均细胞的宽度)相当，那么电极部件之间的间隙宽度可略小于细胞。虽然其他间隙尺寸可被使用，但在优选的情况下，电极结构的电极部件间隙大小的范围最好为用于应用本装置的分析中的平均细胞宽度的约0.2至3倍。在优选的情况下，本发明用于监测真核细胞，如哺乳动物细胞(如癌细胞，内皮细胞或上皮细胞)的装置的电极或电极部件之间间隙的宽度应为约3到80微米，更优选的是约5到50微米，最优选的是约8到30微米。

[00116]优选地，电极部件的宽度不能太窄，因为电极部件的宽度减小时，其电阻会增加。沿电极部件增加的电阻会导致在电极部件上的不同点上存在很大的电位差，从而使当细胞处于或贴附于电极部件不同区域时阻抗信号不同。优选地，细胞处于或贴附于基片表面的任意区域应有类似的阻抗信号。因此对于一个属于交错电极结构或同心电极结构的电极部件，当装置用于测量真核细胞，如哺乳动物细胞(如癌细胞，内皮细胞或上皮细胞)时，电极宽度在优选的情况下应超过约3微米，更好是超过约10微米。电极宽度基于如下考虑也是受限的，如果电极部件很宽，当细胞位于这个很宽的电极的中心部分时，相比于细胞位于场强明显高的电极的边缘位置，会引起一个小阻抗信号。优选地，电极部件的宽度应在大约0.5到大约10倍于用于使用该装置的分析中的细胞的大小(如当扩散和贴附于基片上时平均细胞的宽度)。优选地，对于一个属于IDES或CCES的电极部件，当装置用于测量真核细胞，如哺乳动物细胞(如癌细胞，内皮细胞或上皮细胞)时，电极或电极部件应小于约500微米宽，更优选的是小于约250微米。在本发明一些优选实施方案中，电极部件宽度应于约20到约250微米之间。

[00117]本专利申请中，优选地，电极部件的电极间隙的设计应考虑到电极宽度。电极部件宽度与间隙比率有很多是合适可用的，但优选的电极部件宽度与间隙比例是在约1∶3和20∶1之间。优选的是，电极部件宽度是间隙宽度的1.5到15倍，更优选的是电极部件宽度是间隙宽度的2到6倍；例如，如果每个电极的最宽点的电极宽度是90微米，邻近电极间的间隙的最宽点的宽度是约20微米。在本申请中，电极的宽度范围是小于5微米到大于10毫米。优选的是电极的宽度范围在10微米到1毫米间。更优选的电极宽度在20微米到500微米间。

[00118]用于电极或电极部件的不受限的材料的例子可为氧化铟锡(ITO)，铬，金，铜，镍，铂，银，钢和铝。电极可包含多种材料。选择适当的材料作为电极取决于如下因素：此材料是否足够导电，将此材料装配在基片上是否困难，此材料是否能够被用于可靠地进行本发明的分子探测分析。

[00119]本发明中的电极或微电极可是任何导电材料。例如，金(Au)，铂(Pt)等都可应用。当如塑料或聚合物膜等用作基片时，可使用金属粘着层如Cr和Ti。为了降低电极的电阻抗，具有导电薄膜层的电极应具有一定厚度。一个不受限的例子为：电极可制成300埃厚的Cr层覆以2,000埃的Au层。这样的电极层是不透光的。此外，透光电极也可用于本发明的装置。透光电极的例子包括氧化铟锡(ITO)。对于合适厚度的ITO镀层，光通过ITO层电极的穿透率可达98％。在别的状况下，足够薄的导电膜(即很薄的金膜)也可任选地作为透光电极。选择适合的电极材料有赖于如下因素：此材料是否有生物相容性和无细胞毒性，此材料导电性是否足够好，此材料是否易于装配在膜基片上。

[00120]在本发明的一方面，本发明装置或设备上的电极装配在用来监测细胞迁移或侵袭的生物相容的膜上。多种微装配方法都可用于在生物相容的膜上装配该电极。一个例子是利用光刻方法。用光刻方法的示范性步骤如下：生物相容的膜的一面首先用汽相沉积和/或溅射法镀上一层金属薄膜(如：约0.2μm的金膜镀于10nm的引晶Cr层上)，将光致抗蚀剂(如Shipley公司的光致抗蚀剂S1830)旋转涂敷于金膜上形成一定厚度(如1μm)，然后经一带有所需电极阵列图像的掩蔽物而暴露于紫外光下。暴露的光致抗蚀剂可用相应的显影剂(如Shipley公司的MF351显影剂)显影，然后金层和铬层依次分别用KI/I₂和K₃Fe(CN)₆/NaOH蚀刻。掩蔽物使用电子束刻写技术在超高分辨率平板上商业化生产。由于薄膜的“柔韧性”特性，使用光刻方法时需分外小心以保证在膜上可重复地并精确地制作微电极结构。尤其在装配过程中要小心地确使膜保持平整延伸，装配并与掩蔽物很好地接触。另外，由于膜具有至少一个大小适合于细胞迁移/侵袭的孔，且如果在装配电极前已经存在孔，那么装配过程中注意不要影响这些孔。另一个方法是，孔可在装配电极后用装配或微机械法(micromaching method)如激光打孔制作。那些光刻装配和其他微装配和微机械方法领域的技术人员易于选择和应用适当的材料和工艺来装配微电极和微孔。

另一微装配电极或使微电极形成图案的方法是激光融蚀法(laserablation)。对于计广融蚀法，膜的一面首先同汽相沉积和/或溅射法镀一层薄金属膜(如：约0.1μm的金膜镀于10nm的引晶Cr层上)。然后此薄金属膜经一带有所需电极阵列图像的掩蔽物暴露于适合强度的激光下(如248或351nm的激元激光)。在掩蔽物上“可透过”激光的区域，激光照射到金属膜上并与其相互反应使之从膜上融蚀。因为膜(如聚合物膜)与激光的相互作用和金属膜与激光的相互作用不同，因此可以选择适合的激光条件(波长，强度，脉冲宽度)以便使激光在不影响或极小影响膜的情况下融蚀金属膜。在掩蔽物上“阻断”激光的区域，金属膜仍保留于膜上。掩蔽物使用电子束刻写技术在超高分辨率平板上商业化生产。由于薄膜的“柔韧性”特性，使用激光融蚀法时需分外小心以保证在膜上可重复地并精确地制作微电极结构。在基于掩蔽物的激光融蚀过程中，尤其要小心地确使聚合物膜保持平整延伸。那些激光融蚀法及用激光融蚀法使薄膜产生相应图案领域的技术人员易于选择适当的方法和激光波长，强度，掩蔽物以在聚合物膜上产生电极。

[00121]如果在生物相容的膜上装配孔和电极或电极结构的装配方法允许，也许可以保证用于细胞迁移/侵袭的孔位于与电极表面相对应的的区域，而避免位于电极或电极部件的间隙。尽管这种做法在本发明中不是必需或限制性的，但仍然属于本发明一些方面的装置的优选实施方案。例如，在本发明的一方面，生物相容的膜贴附于顶室(或上室)的底面，该膜在面向底室(或下室)的表面上有电极。此结构的细节及应用将在下列部分“包含上和下室的装置”中叙述(见下文)。操作中，细胞在适当的培养基中被置于顶室，并通过测量作为细胞迁移到底室并贴附于膜上的电极结构的结果引起的阻抗变化来监测细胞通过生物相容的膜的迁移行为。将让细胞迁移/侵袭的孔位于相应于电极区域的膜区域的优点是，当细胞经孔迁移时，它们在离开膜中的孔时可接触并贴附于电极表面。通过将孔装配在电极部位而使与电极表面的贴附和通过孔的迁移联系起来可以确保所有的经膜中的孔迁移的细胞都对测量到的阻抗变化产生作用。

[00122]本发明装置的电极部件，电极，电极结构及电极结构单元可有任意合适的构造，表面积或表面的修饰。例如，至少一个电极结构可有至少两个电极部件。另一例中，电极或电极结构表面区域可被促进细胞粘着的部分所修饰。任何合适的促进细胞粘着的部分均可用于本发明的装置中，如一种自组装单分子(SAM)层(如：硫醇烷(alkanethiolate)在金上，烷基硅氧烷在SiO₂或SiO_x上)，蛋白(如纤连蛋白，明胶，胶原，层粘连蛋白，促进特异性或非特异性的细胞与电极或电极阵列表面区域贴附的蛋白)，肽(如聚L赖氨酸)，聚合物层和一个带电基团。

[00123]优选地，构造电极，电极结构，和电极部件，从而电极迹线从基片表面的电极延伸到基片(如生物相容的膜)边缘或尽头，在此它们可被连于来自阻抗测量电路或信号源的线。此处电极迹线终止的基片边缘或尽头相应于基片上的连接垫。在本发明优选的方面，一个电极结构的电极部件上的迹线与另一个电极结构的电极部件的迹线是彼此绝缘的。在其中的一种排列类型上，电极迹线位于基片的隔开的区域以便于它们在所经路径不相接触。另一种排列中，电极迹线需互相交叉，一个绝缘物质层可被夹于两个电极迹线之间。装配这样的装置或设备就涉及多层微装配方法。

[00124]本装置还包括连接于一个或多个连接垫的一个或多个阻抗分析仪。电极可直接或间接连于连接垫，经此接于来自阻抗分析仪的线。优选地，连接垫位于本发明装置的边缘或周边，但这不是本发明必需的。任选的是，电极与连接垫之间的连接通过位于基片末端的连接通路实现。在本发明的示例性实施方案中，膜上装配有电极的生物相容的膜将是一个能装载样品液体的平板或流体容器的一部分，或者贴附于该平板或流体容器，或者位于该平板或流体容器中。在这些实施方案中，连接垫可以位于流体容器上，或位于带有一个或多个流体容器的平板上。

[00125]取决于用途，本发明的装置或设备可具有任意适合的尺寸。在一例中，本发明的装置可由一个合适的尺寸，使其与自动平板处理工作站相容。在这样的情况下，多个测量单元被装配在同一个板上。如图16-21，每个装置包括16个测量单元，在其中任一单元都可进行细胞迁移分析。

[00126]在本装置的下室可有任意合适的表面积。例如，下室的底面积可适于约1-10，10-100，100-300，300-700，100-1,000，700-1,000，1,000-3,000，3,000-6,000，6,000-10,000或1,000-10,000个细胞贴附。在另一例中，电极覆盖至少5％的下室底面积。还有一例，下室的底面积应小于10mm²，或小于3mm²，或小于1mm²，或小于300μm²，或小于100μm²。

[00127]电极可为任意合适的形状并被置于本装置的任意合适位置。例如，在下室的电极可位于下室底面。在优选的实施方案中，传感器面积应占据下室整个底面的至少2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％。在另一例中，下室的电极或电极结构可位于下底的侧壁上。另一例中，电极可呈针状位于室中。还有另一例中，电极可包含具有至少2个电极部件的电极结构。另一例中，电极可为矩形，圆形，或圆在矩形线上，或正弦曲线形。

[00128]在一个实施方案中，本装置的下室可包括一个细胞迁移或侵袭的调节物，如：化学引诱物或其他刺激或抑制细胞迁移/侵袭的试剂。可选择的或此外，本装置的上室也可包含细胞迁移或侵袭的调节物。

[00129]本发明的一个优选实施方案为包括本发明装置的一个系统，还包括一个界面电子装置，该界面电子装置包含阻抗测量电路和开关(如：电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路，连接到本发明装置的电极结构单元。优选地，本发明的系统还包括带有一种软件程序的计算机，该软件程序可实时测量或监测本发明装置的电极或电极结构之间的阻抗。测量的阻抗数据可以被自动的分析和处理以获取适当的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)，并显示到监视器上。

[00130]优选地，软件程序具有一种或多种的下列功能：(1)电子地转换阻抗测量电路(或分析仪)与本发明装置上的多个装置中的一个的连接；(2)控制阻抗测量电路(或分析仪)来测量电极或电极结构之间在一个或多个频率上的阻抗；(3)处理获得的阻抗数据，得到适当的与生物学相关参数(例如，细胞数目指数或细胞迁移指数)；(4)将结果显示在监视器，或储存结果；(5)在规则或不规则时间间隔上，自动执行上述的1到4的功能。

包含上下室的装置

[00131]在一方面，本发明是一个用于监测细胞迁移或侵袭的装置，它包括a)至少一个上室以放置迁移或侵袭细胞或疑有迁移或侵袭能力的细胞；b)至少一个下室；C)一个生物相容的膜，其上含多个孔，孔的大小适合于该迁移或侵袭细胞经过，此膜连接于上室和下室之间，并将上室和下室隔离开，膜上进一步包含至少两个电极，该电极位于该膜面向该下室的一面，其中该迁移或侵袭细胞经过该膜的孔，接触和/或贴附于位于该膜的电极上，使电极间的阻抗产生改变，以此用于监测该细胞的迁移或侵袭。

[00132]一般的，本发明的细胞迁移装置的各个流体容器应有足够让多个细胞贴附或生长的表面积。在一例中，本发明装置中的流体容器应有足够至少10个，优选地，至少50个细胞贴附的表面积。另一例中，本发明装置中连于阻抗分析仪的各对电极或各对电极结构应有足够至少10个，优选地，至少为50个细胞贴附的表面积。

[00133]在上面装置的一个实施方案中，生物相容的膜可进一步在面向上室的一面带有凝胶或别的包被层。此凝胶或包被层提供了一个细胞迁移/侵袭的屏障。生物相容的膜可在一面或两面有包被，比如一个在上侧面含有一种或多种胞外基质成分而在下侧面含有聚赖氨酸的包被。

[00134]上面装置的另一个实施方案中，底室可进一步包括可促进或抑制细胞迁移或侵袭的试剂。两者选一地或此外，上室也可带有可促进或抑制细胞迁移或侵袭的试剂。

[00135]本发明装置的下室可为任意形状，如圆柱形，矩形，和其它形状。下室可由多种物质制成，包括聚合物，塑料，或玻璃。下室也可为不同的体积和大小。本装置中的下室也可有任意合适的表面积。在一例中，下室的底面积可小到1mm²，也可大于50mm²。在另一例中，下室的底面积可为小于10mm²，或小于3mm²，或小于1mm²，或小于300μm²，或小于100μm²。

[00136]本发明装置的上室可为任意形状，如圆柱形，矩形，和其它形状。上室可由多种物质制成，包括聚合物，塑料，或玻璃。上室也可为不同的体积和大小。上室的底面可为带有至少一个适于细胞迁移/侵袭的孔的生物相容的容膜。此膜可以连接于上室的壁上。上室底表面的面积(即在膜上的相应面积)可为任意适于进行细胞迁移/侵袭分析的大小。例如，此面积可为小到1mm²，也可大于50mm²。在另一例中，上室的底面积可小于10mm²，或小于3mm²，或小于1mm²，或小于300μm²，或小于100μm²。

[00137]本发明包含上下室且上、下室被本发明的装置隔开的装置可由各种合适方法制作。例如，一个带有至少一个管或无底孔的顶室结构可被贴附到本发明的装置上，下室结构(带有至少一个孔的形式)也可被贴附(如：可逆地贴附)到具有贴附的膜的顶部结构上。

[00138]另一种方法是，可在一个带有一个底面的器皿(例如，一个孔或带有一个或多个孔的结构)上用，例如：装配电极的激光图案形成和激光打孔的方法，来在底面装配本发明的装置。这时，底面就是生物相容的膜。然后下室结构可贴附于上室结构上。

[00139]本发明装置可以是一个系统中的一部分，该系统包括连接于装置上至少两个电极上的阻抗分析仪或阻抗测量电路。优选地，本发明装置的电极在至少一个连接垫上连接到阻抗分析仪或阻抗测量电路上。电极可直接或间接连于至少一个连接垫，在那里它们连接到来自阻抗测量电路或阻抗分析仪的线。在一个示例性实施方案中，连接垫可位于带有一个或多个流体容器的顶室结构(顶板)；优选地，接近或位于装置底面的边界或周边。

[00140]在本发明的优选实施方案中，一个包含本发明装置(装置包含被一个生物相容的膜隔开的一个上室和一个下室)的系统也包含界面电子装置，该界面电子装置包含阻抗测量电路和开关(如：电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路，连接到本发明装置的不同的电极结构单元。优选地，本发明的系统也包括带有一种软件程序的计算机，该软件程序可实时测量或监测本发明装置的电极或电极结构之间的阻抗。测量阻抗数据可以被自动的分析和处理以获取适当的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)，并显示到监视器上。[00141]优选地，软件程序具有一种或多种的下列功能：(1)电子地转换阻抗测量电路(或分析仪)与本装置上的多个单元中的一个的连接；(2)控制阻抗测量电路(或分析仪)来测量电极或电极结构之间在一个或多个频率上的阻抗；(3)处理获得的阻抗数据，得到适当的与生物学相关参数(例如，细胞数目指数或细胞迁移指数)；(4)将结果显示在监视器，或储存结果；(5)在规则或不规则时间间隔上，自动执行上述的1到4的功能。

带有多电极或电极结构单元的装置(膜)

[00142]在本发明一些优选的实施方案中，一个测量细胞/基片界面的电阻抗，电阻，或电容的装置，包括四个或更多的电极装配在带有至少一个孔的生物相容的膜上的同一面上，其中该生物相容的膜的至少一个表面可贴附一个或多个的细胞。优选地，这四个或更多的电极排列成一个包括两个或更多IDES或CCES的电极阵列(或电极结构阵列)，每个IDES或CCES至少有两个电极。

[00143]优选地，带有至少两个或更多IDES或CCES的设备是一种装置的一部分，其中该设备被可逆地或不可逆地贴附于一个或多个结构，所述的结构提供多个隔开的流体容器，每个容器可包含一个或多个IDES或CCES，从而这样的生物兼容膜将液体容器分隔成上室和下室。

[00144]图16为带多个顶室(1610)和多个底室(1630)的装置的示例。在该例子中，多个顶室(1610)结合到含孔的膜(1620)上，孔的大小适合细胞迁移或侵袭。每个顶室(如：1610a)有一个相应的底室(如：1630a)。每个顶室都在膜的底面有电极结构，面向底室。操作中，膜上的电极结构经不同方法连接至阻抗测量设备上。例如，电极结构经膜上导电迹线或膜上的通路连于位于膜边缘的连接垫。连接垫可由不同方法连到阻抗测量设备。一个方法是：操作中连于阻抗测量设备或电路的电线可被焊接或通过导电粘合剂连接到连接垫上。对于顶室也有不同的实施方法。一种是多个顶室为单独分离，仅在连接于同一膜(1620)上时被连接到一起。另一实施方案是，多个顶室是相互连接的并被装配在一起(如多个顶室是塑料的且由注射模塑法制成)。然后这些顶室的一部分被接于膜上。

[00145]在制作生物相容的膜时，单个传感器的面积可覆盖一个比孔或室结构覆盖面积要大一些的面积。以此确保，即使在没有精确对准的状况下，当上室结构和下室结构贴附在膜上时，孔包括膜上基本全部为传感器区域的部分。

[00146]然而，在一个多孔结构的装置中，并不要求所有的孔包含电极或电极结构。例如，在一些优选的实施方案中，一个或多个孔可包括至少一部分生物相容的膜，该部分可没有电极。这些不带电极或电极结构的一个或多个孔可作为对照，其中分析中的细胞可在显微镜下观察，或用作生物化学分析，如应用光学探测(如吸收或荧光)的基因表达，化合物检测，或存活力分析，该光学探测可任选地应用平板阅读器或其他探测工具。

[00147]在本发明的一些方面，电极被装配在膜的上侧面。在这些方面，生物相容的膜的孔径小于约5微米，优选地小于约1微米，并且在膜的上侧面优选带有一层上皮或内皮细胞。为了建立上皮细胞或内皮细胞层，上皮细胞或内皮细胞可被添加于顶室中，且上皮或内皮细胞可贴附于膜上装配的电极上，该电极可有一个促进细胞贴附的生物分子包被层。上皮细胞或内皮细胞的贴附于装配在膜上的电极可以通过测量的电极之间的阻抗改变来监测，该上皮细胞或内皮细胞可以完全或不完全在膜的表面汇合装配。能够经上皮细胞层或内皮细胞层迁移或侵袭的细胞，或可疑为能够经上皮或内皮细胞层迁移或侵袭的细胞可被加入顶室。上皮或内皮细胞层被这些细胞破坏可产生一个阻抗的改变，该阻抗改变可被本发明的系统监测。任选的是，一个或多个的影响细胞侵袭特性的化合物，可被置于装置的上室或下室中。本发明装置应用的不受限制的例子包括用于测量癌细胞迁移/侵袭特性和白细胞的迁移特性。

[00148]例如，白细胞经小血管向目标组织迁移是炎症反应的基本特性。这种迁移是趋化性的，可以在外部化学刺激物(称为化学引诱物)的存在下，被启动和增强。很多研究都集中在探究关于有迁移能力的白细胞的内在特性的分子机制，以及发现抑制白细胞病理迁移的抗炎治疗作用。可以检验细胞因子如IL-1，IL-6，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，GM-CSF，TNF-α，INF-γ，NO，TGF-β，VIP，和促生长素抑制素，细胞粘着分子如LFA-1，VLA-4，α链，MAC-1，ICAM-1，选择蛋白(L，P，E)，趋化因子和趋化因子受体，如RANTES，MIP-1，IP-10；CCR1，CCR2B和CXCR2对白细胞迁移的贡献。

[00149]称为白细胞跨内皮迁移的体外实验模型已被充分接受用于分析分子机制和用于检验迁移的抑制性化学物质或刺激物，其中白细胞在化学引诱物存在时经过确立的细胞单层迁移。在一种T细胞迁移的常规分析的例子中，Lewis大鼠的颈动脉被取出，并用于分离内皮细胞(EC)以用于白细胞迁移检测。首先确立ES细胞系MAT-1.3-5×10⁴细胞/毫升被置于用0.2％明胶包被的细胞培养插入物(聚对苯二甲酸乙二酯滤膜，3μm孔径，9.0mm直径，24孔形式；BectonDickinson)，培养1-2天直到汇合，并用重组大鼠IFN-γ(100U/ml，lifetechnology)刺激。对照细胞不经IFN-γ处理。T细胞(每个滤膜放2×10⁵细胞)在有阻断抗体或不带阻断抗体情况下加到MAT-1的汇合层上，并于细胞培养箱中培养。3-5小时后，迁移到平板的底孔的细胞可被收集并在显微镜下计数。

[00150]本发明的装置可满足对更有效地和有成本效益地分析白细胞迁移的检测系统的日益增加的需求。本发明的装置使得能够进行对白细胞跨内皮迁移和侵袭的免标记的、和实时的检测。所建议的电子装置保持了常用的滤器-室跨孔迁移装置的分析模式，包括微孔膜插入物和下室，同时微电子传感器被装配在插入物的微孔膜上，以测量细胞-基片的阻抗。此形成阵列的传感器可测得紧紧与电子传感器接触的细胞，如细胞单层以及迁移穿过单层的细胞。因此，除了可实时检测白细胞跨内皮迁移外，此装置也可监测在加入测试白细胞前，给定插入物中细胞单层的完整性，从而提高了检测方法的精确性和再现性。本发明的设备、装置及系统也可用于对其它细胞类型进行类似检测(例如，检测癌细胞经ECM或细胞层侵袭)。

[00151]另一个使用本发明的例子包括确定或测量用于药物转运或药物透性检验的细胞单层完整性的检测。对于这种检测，Caco-2细胞广泛的被应用作体外实验模型来估计药物候选物经肠上皮屏障的转运(例如，“The use of surfactants to enhance the permeability ofpeptides through Caco-2 cells by inhibition of an apically polarizedefflux system”，Nerurkar MM等人，Pharm Res.，第13(4)卷：第528-534页，1996；“Evidence for a polarized efflux system in Caco-2 cellscapable of modulating cyclosporine a transport”，Augustijins PF等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.第197卷，第360-365页，1993；“Characterization of the human colon carcinoma cell line(Caco-2)as amodel system for intestinal epithelial permeability”，Hidalgo IJ，等人，Gastroenterology，第96卷，第736-749页，1989)。一般来说，此检测方法使用在多孔系统生长的细胞在多天培养物(如10天，21天)上进行。每个系统都包括一个多孔插入板(或过滤板，因为在插入板上的各个孔的底部上都有含孔膜)，和一个多孔板。插入板(或过滤板)被放置到多孔板上，插入板上每个孔都放置在多孔板上的相应孔。Caco-2细胞在过滤板的各个孔中培养一定的天数，以实现接近间脊的分化细胞单层。单层的完整性可用各种方法检测，包括荧光黄排斥法，和TEER(跨上皮电阻)。当单层的完整性达到某种特定目标参数(如TEER在250-1,000Ohm cm²之间)，则此细胞单层可用于测量药物候选物分子通过此层的透性或转运能力。

[00152]本发明装置可用于估计细胞单层的完整性(Caco-2细胞层)。在这种应用中，电极被装配于膜的上侧面。在这些方面，生物相容的膜的孔径应小于10微米，优选的是小于3微米，甚至小于1微米。比如孔径应为约1微米或0.5微米。然后此带电极的膜用于替代上述常规的Caco测量系统的插入板(或称为过滤板)的微孔膜。与常规的Caco-2测量系统相似，Caco-2细胞在插入板中包含的孔的膜上培养。细胞单层的完整性可通过测量膜上电极之间的阻抗改变而监测。电阻抗越高，细胞单层就更加汇合或更加致密或更加紧密。建立合适的电极阻抗标准，可以表征细胞单层完整和确定细胞是否足够紧密以用于化合物的透性测量。

[00153]本发明的另一个应用是细胞毒性测试。在此应用中，装置的结构与上述Caco-2系统所用的相似，不同的是，在放置插入板(或过滤板)的多孔板上，在单个孔的底部装有电极。这样，在该装置中，电极被装配在形成插入板底部的微孔膜上，电极也被装配在多孔板的底部上。进行细胞毒性检测时，类似于上述的Caco-2检测方法，将某种细胞在插入板的膜上进行培养。例如，可用于体外模拟人体中药物化合物代谢的细胞被接种并培养在插入孔的膜上。这种膜的上侧面可以有装配上的电极，由此电极可用于监测膜上细胞的生理状态。另一方面，膜上也可以没有电极。其它方法也可用于监测细胞状态，如细胞单层的完整性，当细胞在膜上达到一定汇合或紧密度时，药物化合物被加入插入孔。这些药物化合物被膜上的细胞“处理”。药物化合物被膜上的细胞处理后的某些代谢分子被释放入溶液，并释放进入底面的孔，插入板就放置在此孔里。对于这样的毒性实验，用来检测化合物毒性的细胞，或用来检测经肠道细胞或其他细胞处理后的化合物代谢物毒性的细胞(如培养的细胞，如肝细胞，神经元细胞，肺细胞，心肌细胞或原代细胞)，是在多孔板(底孔板(the bottom wellplate))上培养的。细胞的生理状态是通过监测装配在多孔板上的电极之间的阻抗或电阻而而被监测或测量的。这样，如果药物化合物分子具有毒性作用或其来自膜上细胞的代谢物分子对位于底室的细胞是有毒性的，那么这些化合物分子或其代谢物分子会被转运或释放于下室中。由此，在下室中的细胞可被用于测量和监测这些分子。

[00154]在上述应用的一种变化方法中，在底孔中的细胞可经特殊装配(如改变基因)以增加其对药物候选物分子或来自药物候选物分子的代谢分子的敏感性。在这种情况下，位于底孔的细胞用于传感和监测当药物候选物化合物分子被膜上的细胞“处理”时的代谢产物分子。底孔的细胞可为任何细胞类型，包括神经元细胞，心脏细胞(heartcell)，肝细胞等。底孔上的电极有一定的形状以适合于测量电阻抗，以此可监测细胞状态。底孔上的电极也可有适合于测量其它参数的形状，如可用来对可兴奋细胞(如神经元细胞，心脏细胞等)作胞外记录。在这种情况下，在底孔中的这种可兴奋细胞的胞外记录，可作为一种传感机制或方法以监测来自插入板孔中的代谢分子。在时域和频谱分析测得的胞外记录信号的改变，可被用作药物候选物分子被代谢后的特定代谢分子的类型和/或浓度的指示物。一些利用可兴奋细胞测量和传感毒性分子或非毒性分子的例子记载于“Portable cell-basedbiosensor system for toxin detection”，Pancrazio，J.J.，等人，Sensorsand Actuators B Chemical，第53卷，第179-185页(1998)；Geneticallyengineered cell-based biosensors for specific agent classification，DeBusschere B.D.，等人，Proceedings of the International Solid-StateSensors and Actuators Conference-TRANSDUCERS′99，Sendai，日本，6月7-10日，(1999)。

[00155]在这些实施方案的其他方面，电极被装配在膜的下侧面。在这种情况下，生物相容的膜的孔径大于约1微米，优选地小于约30微米，膜的上侧面优选地，带有至少一种利于细胞粘着到膜的下侧面的物质。膜的上侧面可带有至少一种胞外基质成分，或优选地，包含可形成基质的多种胞外基质成分，例如，Matrigel^TM。例如，Matrigel^TM基底膜基质(BD Bioscience)是由Engelbreth-Holm-Swarm(REHS)小鼠肉瘤，一种含有丰富的胞外基质蛋白的肿瘤中提取的溶解的基底膜制剂。它的主要成分为层粘连蛋白，其次是胶原IV，硫酸乙酰肝素，蛋白聚糖，巢蛋白和触觉蛋白。它含有TGF-β，成纤维细胞生长因子，组织纤溶酶原激活物，和其他天然存在于EHS肿瘤中的生长因子。

[00156]可选择的或另外，膜的上侧面可带有一上皮细胞层或内皮细胞层。细胞经上皮细胞层或内皮细胞层的迁移/侵袭可由本发明的装置进行监测。而且任选的是，一种或多种影响细胞侵袭/迁移行为的化合物可被置于装置的下室。任选的是，一种或多种影响细胞侵袭/迁移行为的化合物可被置于装置的上室。

[00157]本发明包括测量细胞/基片界面的电阻抗，电阻，或电容的装置，其中包含两个或多个电极的生物相容的膜可逆或不可逆地贴附到带有两个或多个提供细胞迁移单元下室的孔的第一平板上，并可逆或不可逆地贴附到提供管状结构的第二平板上，该管状结构提供细胞迁移单元的上室(如：用一个无底的微孔板)，这样每个细胞迁移单元包括一个IDES或CCES。在某些方面，膜可以不可逆地贴附到下部的含孔板上。在另一些方面，膜可以不可逆地贴附到形成上室的上部的含管的平板上。在膜不可逆地贴附到下部平板的情况时，应提供一些方法，用来向下室加培养基和任选的其它试剂或检测用的组分(例如，下室可在其侧壁开口以添加培养基)。

[00158]这种装置可用于检测置于装置上室中的一个或多个细胞的迁移或侵袭。在使用本发明的装置时，装置是可放置细胞和培养基的平板或流体容器的一部分，或是贴附于该平板或流体容器，或处于该平板或流体容器内，这样，在有合适的细胞培养基时，一个或多个细胞在装配有至少两个电极的膜侧面上的贴附或脱附作用，可用装置由阻抗，电容，电阻的改变测得。

[00159]本发明还包括用于测量细胞/基片界面电阻抗、电阻或电容的系统，该系统包括这里描述的装置，其中包括带有多个电极结构的膜和一个可连接到多个电极的阻抗分析仪，该多个电极结构被多个液体容器包围住。阻抗分析仪(或阻抗测量电路)也可操作地连接于电极上。阻抗可被在任何适宜的频率范围内分析或测得，如频率范围在约1Hz-约100MHz之间，或10Hz-5MHz之间。阻抗分析仪和装置中电极间的连接可是直接的或间接的。例如，电极可延伸至连接垫，并在连接垫上与阻抗分析仪相连接。另一例中，电极或电极部件经一导电连接通路连于连接垫。

[00160]在本发明优选的一个实施方案中，一个包括本发明装置的系统也包括界面电子装置，该界面电子装置包括阻抗测量电路和开关(如：电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路，连接到本发明装置的不同电极结构单元。本发明的系统还包括带有一种软件程序的计算机，该软件程序可实时测量或监测本发明装置的电极或电极结构之间的阻抗。测得的阻抗数据可被自动分析和处理以获得合适的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)，并显示到监视器上。

[00161]优选地，软件程序有一种或多种如下功能：(1)电子地转换阻抗测量电路(或分析仪)与本发明装置中的多个单元中的一个的连接；(2)控制阻抗测量电路(或分析仪)测量电极或电极结构之间在一个或多个频率上的阻抗；(3)处理获得的阻抗数据以得到合适的与生物学相关的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)；(4)监视器将结果显示在监视器，或储存结果；(5)在规则或不规则的时间间隔内自动执行上述1-4的功能。

多元的，带有隔离膜的二室系统

[00162]本发明还包括测量细胞/基片界面的电阻抗，电阻，或电容的装置，包括一个带有两个或多个孔的平板，每一个孔都带有一层膜，其上有至少两个电极和一个或多个小孔，该膜将孔分隔为上室和下室，膜还带有一个适于细胞贴附和生长的表面。

[00163]此装置可用于检测置于装置上室时的一个或多个细胞的迁移或侵袭。在使用本发明的装置时，由于置于上室的细胞中的至少一部分的迁移或侵袭的行为，一个或多个细胞在装配有至少两个电极膜侧面上的贴附或脱附作用，可由阻抗，电容或电阻的改变测得。

[00164]本发明的装置可由任何适当的方法制造。例如，带有孔且其上装配有一个或多个电极的膜，可贴附到无底孔结构上以构成顶室，而后再贴附到一个可形成底室的带孔的结构。或者，装置也可先贴附到一个可形成底室带孔结构，而后包含管状结构(无底孔)的顶部部分贴附其上构成上室。当底板不可逆的贴附在膜上，且膜覆盖了底室的全部上表面时，应该提供一些装置(例如，下室的侧壁上的孔)用来将培养基或任选的其他试剂放入下室。如果培养基已被加入底室，则这可以实现。另一个方法是在一个多孔板(如具有薄的聚碳酸酯膜作为底部的多孔板)的孔底面装配使电极形成图案并形成孔，然后贴附可形成底室的带孔的底部结构。

[00165]根据膜和电极材料可用任何适当的方法来装配在膜上装配孔和电极。也可根据构建顶室和底室的程序采用装配孔和电极的方法。例如，孔可由离子轰击后再蚀刻，或用激光钻孔制成。在基片上装配电极的方法在前面已进行了描述，且在孔底面的装配可包括这样的技术，如激光图式形成(或激光融蚀)。电极可在膜被打孔前先装配到膜上，或者可选择地，也可先在膜上打孔再在表面上装配电极。电极和孔在膜上的位置可以具有相对应的关系，即，孔位于与电极表面相应的区域。

[00166]本发明还包括一个用于测量细胞/基片界面电阻抗，电阻，或电容的测量系统，它包括这里描述的一个装置，其装置带有一个多孔板，每个孔都有一个含有至少两个电极和一个或多个孔的生物相容的膜，该装置还包含可连接到多个电极的一个阻抗分析仪。阻抗分析仪(或阻抗测量电路)也可操作地连接于电极上。阻抗可被在任何合适的频率范围内分析或测得，例如频率范围在约1Hz-约100MHz之间，或10Hz-5MHz之间。阻抗分析仪和装置上电极间的连接可是直接的或间接的。例如，电极可延伸至连接垫，在此与阻抗分析仪相连接。在另一个例子中，电极或电极部件经一导电连接通路连到连接垫。

[00167]本发明一个优选的实施方案为一种包含本发明多孔板装置的系统，该系统还包括界面电子装置，该界面电子装置包括阻抗测量电路和开关(如电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路，连接到本发明装置不同的电极结构单元。优选地，本发明的系统还包括带有一种软件程序的计算机，该软件程序可实时测量或监测本发明装置的电极和电极结构间的阻抗。测得的阻抗数据可被自动分析和处理，以获取合适的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)，并显示到监视器上。

[00168]优选地，软件程序有一种或多种如下功能：(1)电子地转换阻抗测量电路(或分析仪)与本装置中的多个单元中的一个的连接；(2)在一个或多个频率下控制阻抗测量电路(或分析仪)测量电极或电极结构之间在一个或多个频率上的阻抗；(3)处理获得的阻抗数据，得到合适的与生物学相关的参数(如：细胞数目指数或细胞迁移指数)；(4)将结果显示在监视器，或储存结果；(5)在规则或不规则的时间间隔内自动执行上述1-4的功能。

多元插入托盘系统

[00169]本发明还包含一个测量细胞/基片界面电阻抗，电阻，或电容的装置，该装置包括一个插入托盘，它有一个或多个插入室，每个室都包含液体不能渗透的壁和包含两个或多个电极的多孔生物相容的膜，该膜构成一个或多个插入室的至少一个的底部。优选地，这种装置还包括一个带有一个或多个孔的平板，从而本发明的插入托盘适合于此平板。优选地，插入托盘有多个插入室和一个相应的包含多个孔的平板，插入托盘的设计，使插入室与平板上的孔对齐，并可放进平板上的孔。优选地，每个插入结构放进平板的孔内，这样，平板上的孔构成下室，而插入托盘的插入物构成细胞侵袭/迁移单元的上室。

[00170]本发明还包括一个测量细胞/基片界面的电阻抗，电阻，或电容的装置，其中插入托盘带有形成上室的底部的生物兼容膜，并可逆地装入到第一个平板上，该平板包含两个或多个提供细胞迁移单元下室的孔，从而优选地，这样每个细胞迁移单元包括一个IDES或CCES单元。

[00171]这种装置可用于检测置于装置上室中时的一个或多个细胞的迁移或侵袭，在加入合适的细胞培养基时，细胞在装配有至少两个电极的膜侧面上的贴附或脱附作用，可用装置由阻抗，电容或电阻的改变测得。

[00172]本发明还包括一个测量细胞/基片界面电阻抗，电阻，或电容的系统，该系统包含插入托盘和多孔板装置，还包括一个可连接于膜插入物上多个电极的阻抗分析仪。优选地，阻抗分析仪(或阻抗测量电路)也可操作地连接于电极上。阻抗可被在任何适宜的频率范围内分析或测得，例如：频率范围在约1Hz-约100MHz之间，或10Hz-5MHz之间。阻抗分析仪和装置电极间可经位于插入托盘上的连接垫连接。

[00173]图17展示了一种示例性实施方案的装置的示意图示，它包括插入托盘(顶板1710)和多孔底板(1730)。底板(1730)包含多个底室。顶板(1710)包含多个插入孔(1715)。每一插入孔的底面为膜(1720)，其底面有电极结构，面向底室。操作中，顶板(1710)被放入到底板上(1730)。位于各个插入孔底面的电极结构以多种方式连接于阻抗测量设备上。例如，位于膜底面的电极结构可经位于插入孔外面的导电通路(1780)被接于插入孔外缘的连接点(1790)。当插入孔插入底板时，这个连接点(1790)可进一步被连接于底板的连接垫(1795)。这个位于底板上的连接垫(1795)可操作地连接到阻抗测量电路上。在另一个例子中，膜底面的电极结构可被连接于膜上的连接垫处(未显示)。当插入孔插入到底板时，此连接垫可接触性地连接于底室的针状或其它形状的连接点(1790)。

[00174]在本发明的一个优选的实施方案中，本发明包括插入托盘和多孔板装置的系统，还包括界面电子装置，该界面电子装置包括阻抗测量电路和开关(如电子开关)，以控制和转换阻抗测量电路，连接到本发明装置的不同的电极结构单元。

[00175]本发明还包括监测细胞迁移或侵袭的方法，包括提供上述的用于细胞迁移或侵袭的装置，将细胞置放于上述装置的上室，及监测电极间的阻抗的改变以监测细胞迁移或侵袭。

[00176]在应用时，本发明是关于监测细胞迁移或侵袭的方法，该方法包括：a)提供上述用于监测细胞迁移或侵袭的装置；b)将迁移或侵袭细胞或疑为迁移或侵袭的细胞置入装置的上室，使其由上室经聚合物膜的孔进入下室；和c)监测电极间的阻抗的改变以监测细胞迁移或侵袭。

[00177]本发明提供的方法可用于监测任何与细胞迁移或侵袭有关的适当参数。例如，此方法可基于监测的阻抗，用于监测迁移或侵袭进入到下室的细胞的量或数目。

[00178]本发明提供的方法可用于决定，某被测化合物是否可调节细胞迁移或侵袭，即，使之上升或降低，或可用于筛选这种调节物。例如，可以进行这种方法，其中在存在或者不存在被测化合物的情况下，监测细胞的迁移，且这种方法可以用于确定此被检测化合物是否可调节细胞的迁移或侵袭。在另一例中，可以进行此方法，其中当细胞的迁移或侵袭被迁移或侵袭刺激物刺激，且此方法可用于筛选被检测化合物以获得对激动剂的拮抗剂。

[00179]本发明的方法也可用于监测正常细胞迁移或侵袭。可选择地，本发明的方法可用于监测异常细胞迁移或侵袭，如肿瘤或癌细胞的转移。在一种特定的实施方案中，此方法可用于监测肿瘤细胞，内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞，成肌细胞，神经元和神经胶质细胞等的迁移或侵袭。

[00180]下面讲述一个本装置及其操作方法的例子。用于监测细胞迁移/侵袭的装置包括一个上室或者一个插入物和底室或者一个下孔，其由聚合物膜(例如：微孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜)隔离开。聚合物膜带有多个大小合适于侵袭细胞通过的孔。底室或下孔上的微电极阵列带有至少2组电极部件(即2个电极阵列)。电极阵列有合适的形状，从而当细胞被加入到并贴附于电极平面时，电极阵列间的阻抗会发生改变。电极阵列的例子包括，交错的平行电极阵列，双平行螺旋形电极阵列，和园状形电极阵列。此监测细胞迁移/侵袭的装置还包括一个阻抗分析仪，以确定两组微电极间的阻抗。

[00181]操作中，将被检测细胞置入顶室。恰当的试剂(例如：可刺激或抑制细胞迁移/侵袭的细胞迁移/侵袭调节物，或疑为细胞迁移/侵袭调节物的试剂)在细胞置入顶室期间或之后被添加入顶室。底室装有合适的缓冲液或细胞培养基。放入底室的缓冲液或培养基可带有合适的试剂，如化学引诱物，或其它可刺激或抑制细胞迁移的细胞迁移调节物以及疑为细胞迁移/侵袭调节物的试剂。当细胞经跨室膜上的孔由顶室进入底室，落到并贴附于位于底室的电极结构上时，引起的电极间阻抗改变将被测量和分析。优选地，电极区域(即：传感器区域)覆盖底室底面表面的绝大部分区域。优选地，底孔的表面积被减小一些以提高敏感性。为了覆盖一个较大的动态范围，可由多个不同大小的底室组成一个系列，这样每个面积范围都可覆盖细胞数目范围，例：1-10，10-100，100-1,000，1,000-10,000等。

[00182]下面讲述本装置和其操作方法的另一个例子。装置包括由聚合物膜(如：微孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜)隔离开的一个上室和一个下室。聚合物膜带有多个大小合适于侵袭细胞通过的孔。聚合物膜上的孔的大小和数目必须被精确控制，以合适于不同的细胞数目和不同的细胞大小。一个电极位于顶室一个电极位于底室。当细胞侵袭并穿过隔离两室的膜上的孔时，两个电极上的电阻抗将会发生改变。可监测跨膜阻抗的电极可用于提供迁移过程的信息。

检测细胞时的阻抗频谱

[00183]图25(A)显示在两种条件下，装配在玻璃基片上的“圆在线上”电极结构所测电阻的典型频谱：装配(a)空心标记为含HT1080细胞的组织培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中不久(10分钟以内，细胞尚未贴附到电极和基片表面上)；(b)实心标记，为含HT1080细胞的培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中之后2小时40分钟(细胞已贴附到电极和基片表面上)。在含有细胞的培养基被加入孔中后短时间内(10分钟内)，细胞没有足够时间贴附到电极上。这一点可这样证实，即含有细胞的培养基加入孔中的电极结构测得的阻抗(电阻和电抗)和不含细胞的培养基加入孔中所得的值是相同的或几乎相同的。在不含细胞的培养基被加到电极上的条件下，或在含有细胞的培养基加到电极上，但细胞没有足够时间贴附到电极结构上的条件下，一般说来，高频时(如1MHz左右或以上)阻抗(电阻和电抗)主要由电极形状和引入到电极结构的溶液中培养基的电性质(导电性和介电常数)决定。在低频时，存在一种“电极极化作用”，产生了随频率而变的电阻和电容(见例如Schwan，H.P.，“Linear andnonlinear electrode polarization and biological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，第20卷，第269-288页，1992；Jaron，D.，Schwan，HP和Geselowitz.，“A mathematical model for the polarization impedanceof cardiac pacemaker electrodes”，in Med.Biol.Eng.，第6卷，第579-594页)。在含有细胞的培养基被放入孔中之后2小时40分钟的条件下，且该孔被置于组织培养箱中2小时40分钟，细胞有足够时间贴附和扩散(可由显微镜下，检查在不被电极覆盖区域上的细胞印证)。由于细胞膜的非导电性，电极结构的电阻频谱发生改变。一般，在中间频率(1kHz-100kHz)有增加。在低频或高频区域有小的改变。

[00184]图25(B)显示在两种与图25(A)相同条件下相同电极结构所测得的电抗频谱：(a)空心标记显示为含HT1080细胞的组织培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中不久(10分钟以内，细胞尚未贴附到电极和基片表面上)；(b)实心标记，为含HT1080细胞的培养基被添加到在孔的底面含电极结构的孔中之后2小时40分钟(细胞已贴附到电极和基片表面上)。在含有细胞的培养基被加入孔中后短时间内(10分钟内)，细胞没有足够时间贴附到电极上。这一点可这样证实，即含有细胞的培养基加入孔中的电极结构测得的阻抗(电阻和电抗)和不含细胞的培养基加入孔中所得的值是相同的或几乎相同的。如上所述，在不含细胞的培养基被加到电极上的条件下，或在含有细胞的培养基加到电极上，但细胞没有足够时间贴附到电极结构上的条件下，一般说来，高频时(如1MHz左右或以上)电阻主要由电极形状和引入到电极结构的溶液的导电性决定。在低频时，存在一种“电极极化作用”，产生了随频率而变的电阻和电容。(见例如Schwan，H.P.，“Linear and nonlinear electrode polarization andbiological materials”，in Ann.Biomed.Eng.，第20卷，第269-288页，1992；Jaron，D.，Schwan，HP和Geselowitz.，“A mathematical modelfor the polarization impedance of cardiac pacemaker electrodes”，inMed.Biol.Eng.，第6卷，第579-594页)。在含有细胞的培养基被放入孔中之后2小时40分钟的条件下，且该孔被置于组织培养箱中2小时40分钟，细胞有足够时间贴附和扩散(可由显微镜下，检查在不被电极覆盖的区域上的细胞印证)。在这样的条件下，由于细胞膜的非导电性，电极结构的电抗频谱发生改变。与电阻改变不同的是，电抗的主要相对变化发生在高频时，在此处由于细胞贴附于电极上而使电抗的总量级显著增加。

[00185]如果取细胞贴附时测得的电阻和无细胞贴附时测得的电阻比率(即电阻或串联电阻的相对变化)，并绘图以显示该比率为频率的函数，一般，我们得到峰状曲线(图25(C))。在低频时，在阻抗(这里指电阻)有很小改变或没有改变，比率近似于1。随着频率的增高，比率增加直至峰值。频率继续增加，比率在高频时降低直至约1。在此需指出的是，也可绘制电抗和电容值的相对改变，并用此相对改变以监测和反映细胞贴附于电极表面上的状况(见图25(D))。进一步地，用并联电阻和电抗来表达阻抗的方法也可被用于描述由于细胞在电极表面的贴附引起的阻抗改变。

[00186]电阻比率(细胞贴附于电极的电阻与无细胞贴附于电极的电阻比率)的峰值和在峰值处的频率除其他情况之外也依赖于如下因素，如有多少细胞贴附于电极表面，这种贴附有多么紧密，细胞的大小，细胞的质膜和胞内成分的介电性质如何。在我们测试过的许多细胞类型中，我们发现，在相似生理条件下对于相同类型的细胞，越多细胞贴附于电极表面，将导致比率的峰值越高，和在此峰值处的频率也越高。

[00187]与图25(A)，25(B)，和25(C)中的结果相比较，图26(A)，26(B)，26(C)显示，孔内加有较多细胞时，类似的“圆在线上”电极的电阻，电抗，和电阻比率的频谱，其中该孔在底孔中包含“圆在线上”电极结构，图27(A)，27(B)，27(C)显示的是贴附于电极细胞数目较少时的结果。

[00188]图28A显示在不同数目的细胞加入到含有相同“圆在线上”电极的孔中的条件下，电阻比率的频谱。例如，接种大约500个细胞引起最多17％的在频率为～2kHz时串联电阻改变，接种大约3,200个和7,000个细胞分别引起182％和517％的在频率为～5和30kHz时串联电阻改变。同样，串连电抗的改变也可用于说明细胞数目和电抗改变的量级之间的关系。(见图28B，例如：在250kHz处的电抗值可用于演示细胞数目和电抗改变量级之间的关系)。进一步说，如果用并联电阻和电抗来表达测得的阻抗，那么也可证明细胞数目和并联电阻和/或并联电抗改变量级的依赖关系。

关于细胞数目指数的推导

[00189]基于测得的阻抗，细胞数目(更确切的说，活细胞数目，或贴附的细胞数目)和细胞贴附状态之间的互相依赖关系，可由测得的阻抗频谱推得一种称做“细胞数目指数”(或细胞指数)的参数。各种方法可用于计算这种“细胞数目指数”。在下文中，我们举例说明几种基于当细胞贴附于电极结构相对于细胞未贴附于电极结构时电阻或电抗改变来计算该细胞数目指数的方法。无细胞贴附但在电极结构上含有相同的细胞培养基时的阻抗(电阻和电抗)有时被称为基线阻抗。基线阻抗可由一种或多种以下方法获得：(1)当不含细胞的培养基置于带有电极结构的孔中测得的阻抗，其中此培养基与用于监测细胞贴附条件时测量阻抗的培养基相同；(2)含有细胞的培养基加入到在孔底部含有电极结构的孔中不久(如10分钟)后测得的阻抗(在加入含有细胞的培养基后短期内，细胞尚无足够时间贴附于电极表面。该“短期”时间长短有赖于细胞类型和/或电极表面的表面处理或修饰)；(3)当孔内的全部细胞被某种处理方法(如：高温处理)或试剂(如：洗涤剂)杀死后测得的电极结构阻抗(如用这种方法，那么该处理和/或试剂应不影响电极上培养基的介电特性)。

[00190]在一例中，细胞数目指数可如下方法计算：

(1)在每一测量频率，用测得的电阻值(当细胞贴附于电极时)除以基线电阻，得到电阻比率，

(2)寻找或确定频谱中电阻比率最大值，

(3)最大电阻比率减一。

[00191]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相同生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。

[00192]在另一例中，细胞数目指数可用如下方法计算：

(1)在每一测量频率，用测得的电阻值(当细胞贴附于电极时)除以基线电阻得到电阻比率，

(2)寻找或确定频谱中电阻比率最大值，

(3)计算最大电阻比率的对数值(如基于10或e＝2.718)。

[00193]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相同生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。

[00194]在另一例中，细胞数目指数可如下计算：

(1)在每一测量频率，用测得的电抗值(当细胞贴附于电极时)除以基线电抗得到电抗比率，

(2)寻找或确定频谱中电抗比率最大值，

(3)最大电抗比率减一。

[00195]在这种情况下，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞或仅有极少量细胞存在于或贴附于电极表面。高的“细胞数目指数”指，对于相同类型的细胞，和在相同生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极表面。

[00196]在另一例中，细胞数目指数可由如下方法计算：

(1)在每一测量频率，用测得的电阻值(当细胞贴附于电极时)除以基线电阻以得到电阻比率，

(2)在每一测量频率中，将电阻比率值减一而得到电阻的相对改变值，

(3)将所有相对改变值求积分。

[00197]在这种情况下，“细胞数目指数”基于多频率点获得，而不是如上述举例中的在单个的峰值频率得到的。同样的，零值或接近于零值的“细胞数目指数”指没有细胞存在于电极表面。高的“细胞数目指数”指，对于相同类型和在相同生理条件下的细胞，有更多的细胞贴附于电极。

[00198]值得指出的是，利用阻抗信息来监测电极上的细胞状态，并不是一定要计算上述的“细胞数目指数”。实际上，可以选择直接用阻抗值(如在单一固定的频率下，或在最高相对变化频率时，或在多频率时)作为细胞状态的指示。

[00199]但本发明比较优选的还是用算出“细胞数目指数”，并用这样的指数来监测细胞状态。应用“细胞数目指数”来监测贴附和/或存活力状态具有如下几个优点：

[00200]第一，可以用细胞数目指数比较不同电极形状的性能。

[00201]第二，对于一种给定的电极形状，可以通过测量不同数目的细胞被放到电极上时得到的阻抗值，建立“标准曲线”，以显示细胞数目和细胞数目指数之间的相互关系(在这种试验中，重要的是要确保接种的细胞很好的贴附到电极表面)。用这样的校准曲线，当进行新的阻抗测量时，可以从新测得的细胞数目指数而估计细胞数目。

[00202]第三，细胞数目指数也可用于比较不同的表面条件。对于相同电极形状和相同的细胞数目，有较大细胞数目指数的表面处理，表明此电极表面更适于细胞贴附和/或表明了用于细胞贴附的更好表面。

C.实施例

[00203]如下实施例用于阐明而不是限制本发明。

实施例一

8种不同类型的电极在有细胞贴附或无细胞贴附时的电阻和电容性电 抗

[00204]图3为8个不同类型电极在NIH3T3细胞贴附或无NIH3T3细胞贴附时的阻抗和电容性电抗的图解。电极2AA，2AB，2AC，2AD，和3A的直径是1mm；电极2BE，3B，和3C的直径是3mm。每个电极类型的特征是不同的，示于表2。电极表面包被有化学和生物分子。在此实验中使用纤连蛋白。包被后，NIH3T3细胞被接种在电极的表面。电阻和电抗(电容性电抗)在接种后0小时(接种细胞后立即)和接种后2小时被测量。(A，B)8种不同类型电极的电阻和电容性电抗，它们是频率的函数。在所有5种贴附有NIH3T3细胞的电极类型中(接种细胞后2小时)，相比于无细胞贴附的相应微电极(接种细胞后0小时)可见电阻的增加和电容性电抗的减少。(B)条线图概括了在所示给定频率的电阻和电容性电抗改变。在这里，电容性电抗值是绝对值。电阻和电容性电抗改变仅在贴附有NIH3T3细胞的电极上可见。

表2.已检验的一些电极的概括。

电极结构名称	基片材料	电极结构类型	尺寸(微米)	活性区域直径
					2CF	玻璃	交错	48/28	6mm
2BE	玻璃	交错	48/18	3mm
					2AA	玻璃	交错	80/50	1mm
2AB	玻璃	交错	80/15	1mm
					2AC	玻璃	交错	50/30	1mm
2AD	玻璃	交错	50/10	1mm
3C	玻璃	“圆在线上”	60/160/180	3mm
					3B	玻璃	“圆在线上”	30/80/90	3mm
3A	玻璃	“圆在线上”	30/80/90	1mm
						塑料(Kapton)	交错	50/50

[00205]电极2AA，2AB，2AC，2AD，2BE和2CF是交错电极，电极宽和间隙宽的值分别为80/50，80/15，80/30，50/10，48/18和48/28。

[00206]电极3A，3B和3C是圆在杆上(或“圆在线上”)电极，它们的杆(或线)宽和杆(或线)间隙，电极圆直径的值分为30/80/90，30/80/90和60/160/180。

实施例二

用3B电极进行细胞定量检测

[00207]图4显示用3B电极进行细胞定量检测。连续稀释的NIH3T3细胞(细胞数目10,000，5,000，2,500，1,250，和625)被加入纤连蛋白包被的3B电极表面。在接种后0小时(接种后立即)和接种后16小时测量电阻和电容性电抗。曲线显示在所示给定频率时电阻和电容性电抗数据。曲线T0为无细胞贴附时电极的基线电阻和电容性电抗。曲线T0-T16表示细胞贴附于电极后电阻和电容性电抗的改变值。该3B电极可测量少于600个细胞。该3B电极对NIH3T3细胞的动态定量范围是10,000到500之间。

实施例三

用3C和3B实时监测NIH3T3和PAE细胞增殖

[00208]图5显示用3C和3B电极实时监测NIH3T3和猪主动脉内皮(PAE)细胞增殖。2,500个NIH3T3细胞和2,500个PAE细胞被接种在包被电极上。NIH3T3细胞接种在纤连蛋白包被的电极上，PAE细胞接种在明胶包被的电极上。每天测量电阻和电容性电抗以监测细胞增殖。第0天指细胞接种后立即测量。在此图中所示电容性电抗值为绝对值。在这两种细胞类型中，电阻和电容性电抗值随培养时间(天数)增加而增加，显示了细胞增殖。NIH3T3细胞在第4天达到平台期，而PAE细胞在第5天达到平台期，提示NIH3T3细胞比PAE细胞增殖快。

实施例四

用3C电极对4种不同类型细胞阻抗的比较

[00209]图6示意用3C电极对4种不同类型细胞阻抗的比较。4种细胞类型的电阻是用3C电极测量的。这4种细胞类型是NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)，HEP-G2细胞(人肝细胞)，PAE细胞(猪内皮细胞)，和HUVEC细胞(人内皮细胞)。对NIH3T3和HEP-G2，电极用纤连蛋白包被；对PAE和HUVEC电极用明胶包被。将两个电极用于所示的各个细胞类型。对于NIH3T3和HEP-G2，在每个电极上接种10,000个细胞；对于HUVEC和PAE，在每个电极上接种20,000个细胞。在接种后0小时，和3或4小时测量电阻和电容性电抗(此处仅显示电阻数据)。对HEP-G2，接种后119小时测量电阻。在3或4小时，NIH3T3细胞，HUVEC细胞和PAE细胞的电阻可见明显增加。而相反，HEP-G2的电阻则在接种后4小时仅有微量的增加，这显示肝细胞在电极上贴附较慢。HEP-G2在过夜培养后电阻稳定上升(数据未显示)，并在接种后119小时才达到平台。

实施例五

电阻测量的重复性

[00210]图7显示电阻测量的重复性。在接种HUVEC细胞的7组电极(3B)上检测重复性。电极包被了明胶后在每组电极上接种15,000个HUVEC细胞。在接种后立即(t0)，20小时和30分钟时测量每组电极的电阻。电阻值在20小时培养后可见明显增加，显示细胞贴附于电极上。t0时的平均电阻值为47.4，标准差为3.9；在20小时30分时，平均电阻值为284.8，标准差为17.2。t0的变异系数是8.3％，20小时30分时的变异系数是6.1％。

实施例六

用下室底面整合有电极结构的细胞迁移装置

确定的非侵袭性NIH3T3细胞和侵袭性HT1080细胞的侵袭和迁移活 性的比较

[00211]图22为非侵袭性NIH3T3细胞和具侵袭性HT1080细胞在我们的电子细胞迁移装置中的侵袭和迁移活性的对比，如图1所示，此装置的电极结构整合于下室的底面。在实验中，细胞迁移装置采用了传统的跨孔迁移装置的外形，但有一个电极传感芯片(即：装配有电极结构的玻璃基片)被安装于每个下室的底面。当细胞经微孔膜迁移后，落到并贴附于电极结构上，细胞-基片阻抗被阻抗分析仪测得和定量。两个细胞系NIH3T3细胞系和HT1080细胞系用于检验细胞迁移装置。NIH3T3细胞系是非侵袭性细胞系，而HT1080细胞系是已被证实的侵袭性细胞系，并在体外迁移实验和体内迁移实验中都有很强的侵袭和迁移活性。NIH3T3细胞(购于ATCC)和HT1080细胞(购于ATCC)都被培养于含10％FBS的DMEM培养液中。在迁移实验时，两种类型的细胞被用胰酶消化并计数。然后制成细胞悬液。因为电极传感芯片(即：装配有电极结构的玻璃基片)被整合或包括于一个24孔的跨孔迁移装置上，标准的跨孔迁移检测方法也可在我们的电子细胞迁移装置上实施。简短的说，位于插入物下室和微孔膜上的电子传感器先以胞外基质蛋白包被。实验中，电极传感器和微孔膜在室温下用50μg/ml的纤连蛋白包被一小时。用磷酸缓冲盐溶液洗涤后，细胞培养基(10％FBS DMEM)被加入下室中，此处安装有预先被包被的电极传感器。然后，一个插入物被放入下室中。在每个插入物中加入各2×10⁵个细胞的NIH3T3或HT1080细胞。电极结构经由电子传感芯片上的连接垫与阻抗分析仪相连接。侵袭和迁移活性可在不打扰实验的状况下被实时监测。在图中，Y轴显示细胞迁移指数，此指数基于在实验过程的不同时间和实验开始时(实验的基线电组，无细胞贴附)在不同频率下的所测得的电极结构电阻进行计算。计算细胞迁移指数的方法相似于计算“细胞数目指数”的方法，它基于在给定时间测量的电阻和基线电阻的最大比率。细胞迁移指数和到达底室的细胞数目以及细胞侵袭和迁移活性密切相关。X轴为每次测量的时间间隔。如图显示，HT1080细胞的侵袭和迁移活性随时间稳定地增长。相反，非侵袭性NIH3T3细胞在整个实验过程中显示不可探测的侵袭活性。此结果与以前所报道的应用常规跨孔方法的细胞系是一致的。而且，本发明的用于此处的细胞迁移装置可提供对癌细胞侵袭和迁移活性实时的，连续的，免标记的测量。

实施例七

用电极结构置于插入物微孔膜上的细胞迁移装置

确定的非侵袭性NIH3T3细胞和侵袭性HT1080细胞的侵袭和迁移活 性的比较

[00212]图23(A)显示用电极结构置于插入物(相似于图17所示结构)微孔膜上的细胞迁移装置(图40(B))上非侵袭性NIH3T3细胞和侵袭性HT1080细胞的侵袭和迁移活性的比较。在此细胞迁移装置中，一个电极结构单元被安装于插入物的底面(图23(B))。因此，当细胞经胞外基质层侵袭，经微孔膜迁移时，侵袭细胞直接贴附于电极结构上，并且这里细胞与电极的相互作用可被检测，电极结构间的阻抗可被测量并量化。两个细胞系NIH3T3细胞系和HT1080细胞系用于检验细胞迁移装置。NIH3T3细胞系是非侵袭性细胞系，HT1080细胞系是侵袭性细胞系，该细胞系在体外迁移实验和体内迁移实验中都有很强的侵袭和迁移活性。NIH3T3细胞(购于ATCC)和HT1080细胞(购于ATCC)都培养于含10％FBS的DMEM中。在迁移实验时，两种细胞被用胰酶消化并计数。然后制成细胞悬液。由于带有装配的电极结构的微孔膜可被结合到适合商业上的24孔迁移装置的插入孔上，所以标准跨孔迁移检测方法可在我们的细胞迁移装置上实施。简短的说，插入物的微孔膜和内置的电极传感器阵列先包被上胞外基质蛋白。在该实验中，膜电极传感器和微孔膜在室温下，均用50μg/ml的纤连蛋白包被一小时。用磷酸缓冲盐溶液洗涤后，细胞培养基(10％FBS DMEM)被加入下室，此处安装有预先被包被的电极传感器。然后，一个插入物被放入下室中。在每个插入物中加入各2×10⁵个细胞的NIH3T3或HT1080细胞。如图23(B)所示，电线通过导电粘合剂结合到膜上的连接垫，然后再与阻抗分析仪相接。电线与连接垫盘的结合区用生物相容的，基于聚硅氧烷的粘合剂覆盖上。侵袭和迁移活性可在不打扰实验的状况下被实时监测。为了验证传感器的测量结果，在实验结束后，用100％甲醇固定经膜迁移后贴附于微孔膜上电极传感器的细胞5分钟，后再用吉姆萨染液(Sigma Diagnostics)染色30分钟。(A)测量NIH3T3和HT1080细胞的侵袭和迁移活性。Y轴显示细胞迁移指数，此指数基于在实验过程不同时间和实验开始时(实验的基线电阻，无细胞贴附)在不同频率下所测得的电极结构电阻进行计算。计算细胞迁移指数的方法相似于计算“细胞数目指数”的方法，它基于在给定时间测量的电阻和基线电阻的最大比率。细胞迁移指数和到达底室的细胞数目以及细胞侵袭和迁移活性密切相关。X轴为每次测量的时间间隔。如图显示，HT1080细胞的迁移活性随时间增加而增多。非侵袭性NIH3T3细胞的迁移活性弱于HT1080。(B)吉姆萨染色将位于微孔膜另一面的电子传感器阵列上的迁移细胞染色。如图所示，HT1080的颜色密度高于NIH3T3细胞，这与在微孔膜上电极结构间的阻抗测得值获得的结果是相一致的。和图22中所描述装置不同的是，在该图中电极结构测量的是迁移并落到下室的底面的细胞，而本例的装置可以探测和测量一旦细胞经微孔膜迁移时的细胞迁移。因此，用这种在膜上装配有电极结构的细胞迁移装置检测细胞迁移可以比图22所描述的装置更直接和快速。

实施例八

用电极结构位于插入物微孔膜上的细胞迁移装置

实时监测强力霉素对癌细胞侵袭和迁移的抑制效果

[00213]图24为用电极结构位于插入物(类似于图17所示结构)微孔膜上的细胞迁移装置实时监测强力霉素对癌细胞侵袭和迁移的抑制效果。(A)一种由强力霉素引起的对HT1080细胞侵袭和迁移的抑制作用，该抑制作用是依赖于时间和剂量的。(B)使用具有软件控制的测量阻抗的数据采集的全自动设备，来实时监测强力霉素对HT1080细胞侵袭和迁移的动态抑制作用。如图24(B)所示，每隔15分钟连续监测一次迁移过程。电极装配在插入孔微孔膜上的细胞迁移装置(如图23所描述)被用于药物对癌细胞侵袭和迁移的抑制作用进行动态监测。在细胞迁移装置上测量到强力霉素(Sigma)对HT1080细胞侵袭和迁移的剂量和时间依赖性的抑制作用。简短地说，用纤连蛋白(50μg/ml)在室温下包被微孔膜(孔直径10μm)和电极结构1小时，再用磷酸缓冲盐溶液洗涤。HT1080细胞用胰酶消化并制成10⁶细胞/ml的悬液。在下室中加入含有不同浓度的强力霉素的1ml培养基。强力霉素的溶剂DMSO被用为载体对照。在每个插入物中，加入含强力霉素或含载体的200μlHT1080细胞悬液(2×10⁵个细胞)。用一个阻抗分析仪自动地且电子地切换到不同插入孔的电极结构。在电极结构和细胞连接后，有强力霉素和没有强力霉素时的侵袭和迁移活性可在不打扰实验的状况下在不同的时间间隔进行监测。迁移指数(或细胞迁移指数)计算方法与图22和23所示相同。

实施例九

实时监测迁移的装置

1.电子细胞芯片设计

[00214]图8所示是一个电子细胞芯片设计图。此图显示5个代表性的电子细胞芯片设计。不同形状和大小的金电极位于玻璃基片的中间。玻璃基片的尺寸为1cm×1cm。金电极经玻璃基片边缘的连接电极垫连于电检测界面。

2.电子细胞芯片上对细胞检测的机制

[00215]电极可用一个串联的电阻-电容电路(RC Circuit)表示(Warburg，E..Ann.Phys.1901，6，125-135.)，导体电解液的电阻和电容均可按f-κ变化，其中0＜κ＜1，f是频率。对于在无细胞情况下的裸露电极(图9)，R_sol的数值或集中电阻简单地等于高频时测得电阻的渐近值(Z＝Z0)。对包被化学物质或蛋白的无细胞的电极来说，电组或阻抗是几乎相同的(Luong，J.H.T.，M.Habibi-Rezaei，J.Meghrous，C.Xiao，和A.Ka men.2001.Monitoring motility，spreading andmortality of adherent insect cells using an impedance sensor.Anal.Chem.73，1844-1848.)。相反，当细胞贴附于电极上并扩散后电极的阻抗值明显增加(Z＝Zcell)。阻抗增加值与在电极上的细胞-电极粘着和被覆盖的面积相关。因此，对于给定的细胞种类(贴壁细胞)，细胞数目的改变可用相应的阻抗值改变表示。

3.通过测量阻抗检测贴附于电极上的细胞

[00216]作为对比研究的基础，制作了一个测试装置。该装置包括一个电子细胞芯片(图8)，一个固定在印刷电路板上的电子界面，和一个安装于芯片上的培养孔。因此，基本测试用装置只包含一个检测单元。

[00217]首先测试了两组形状不同的芯片设计。设计1含一个直径1mm的电极，设计2含一个直径3mm的电极。在这两种设计电极的检测面积不同。NIH3T3细胞(购于ATCC)用于检测。每一次检测时，应用两个装置，一个放培养基，另一个放细胞。测试装置的电极在室温下用纤连蛋白(50μg/ml)包被1小时。包被后，向测试装置中加入100μl的NIH3T3细胞悬液(10,000个细胞)或100μl的培养基。在接种后立即(t0)和接种后2小时(t2)，由1,260阻抗分析仪(Solartron Inc。英国)测得不同频率时的电阻和电容性电抗。在t0时，有细胞的装置和不含细胞的装置的电阻和电容性电抗是相似的。在t2时，有细胞的装置在不同频率下可见电阻值明显上升，而不含细胞的装置的电阻没有改变，显示细胞在电极上的贴附和扩散。两种设计显示的结果相似(数据未显示)。

4.用测试装置测量不同种类细胞

[00218]装置进一步用4种不同的细胞类型进行检验，包括两种原代人类细胞类型，HUVEC(由ATCC购得)和原代人类肝细胞(ScienCell Inc.San Diego，California购得)和两种细胞系，NIH3T3细胞系和PAE细胞系(猪主动脉内皮细胞，由ATCC购得)。如图6所示所有细胞种类在接种3或4小时后电阻值明显上升。

5.细胞增殖

[00219]在测试装置上用PAE细胞对细胞增殖进行检测。在该研究中，用不同密度(8,000和1,000细胞)接种PAE细胞，以持续监测不同细胞接种密度时的细胞增殖率。然后在不同的时间间隔，在不干扰培养的情况下测量电阻。如图10所示，在两个装置中，电阻值随着培养时间的上升而稳定的上升，显示培养过程中细胞数目的上升。值得注意的是，高细胞接种密度的装置的电阻值比低细胞接种密度的装置的电阻值升高得快，这一点通过在光学显微镜下的观察得到了证实(数据未显示)。这些结果表明装置可持续，实时地监测细胞增殖，而不需要对这种测量进行标记。

6.在测试装置上测量细胞时的定量和敏感性

[00220]通过实验，对装置在进行细胞检测时的定量能力和敏感性与MTT检测法进行了比较。MTT检测法是常用于细胞定量的一种方法⁴⁸。连续稀释的NIH3T3细胞被加入测试装置或96孔微量滴定板中(图11)。在37℃，5％CO₂条件下培养过夜后通过测量电阻抗，或通过MTT染色进行测量。如图28所示，两种方法测得的数据非常接近。用装置测得的电阻可用于线性定量。事实上，本装置的敏感性水平与MTT检测法相当(少于600个细胞)。

7.测试装置检测的重复性

[00221]通过三种不同种类的细胞，实验确定了测试装置的电阻测量的重复性。在此，以原代人类肝细胞得到了显示本装置性能的代表性结果。实验中，使用6个装置，且在细胞接种后即刻(t0)和4小时(t4)测量电阻。并计算t0和t4时的CVs(图7)。CV_t0代表为装置的变差，而CV_t4代表装置加上细胞贴附和扩散的变差。如图7所示，测试装置的电阻测量在t0和t4时的CV很小，其重复性很好。用下面描述的修改后的装置，那么CV会进一步降低。

D.方法

[00222]在迁移检测中，多孔基片上的塑料孔中预先充满含有化学引诱物的缓冲溶液。然后将带有塑料平板的跨膜孔(购自BDBiosciences)插入该检测装置中的塑料孔。在加入细胞到跨膜孔后，检测在1kHz到1MHz频率范围内的电极阻抗。为了使电场对细胞没有影响或影响最小，在电极上使用5或10mV。详细规程见下面描述。

在电子装置上进行迁移分析的规程

1.电极包被：

[00223]用细胞粘附分子包被电极。纤连蛋白包被条件是，室温50μl的50μg/ml的纤连蛋白加入各个单元一小时，然后用PBS洗3遍。明胶包被条件是，50μl的1％的凝胶，在37℃下，加入各个单元30分钟，室温再加入50μl的0.5％的戊二醛25分钟，以固定包被的明胶，然后用PBS洗涤，再在室温下加入50μl的0.1M甘氨酸30分钟，以阻断自由的醛基。再用PBS洗涤3遍。可选择地提供预先包被的装置。

2.ECM包被

[00224]50μl的ECM溶液加入插入物，并在室温下温育过夜。取决于检测要求，在检测中可用的ECM材料包括BD Magtrgel基质(BDBiosciences)，纤连蛋白(Sigma)，胶原(Sigma或BD Biosciences)，和层粘连蛋白(BD Biosciences)。用PBS洗涤插入物。也可提供预先包被的插入物。

3.接种细胞

[00225]100μl细胞悬液(10⁵个细胞)加入预先包被的插入物，与此同时100μl含有化学引诱物的条件培养基加入电极细胞芯片室。将插入物放入室中后，测量阻抗为t0。装置在37℃，5％CO₂，100％湿度室条件下温育。通过在不同时间间隔测量阻抗，可实时监测迁移。

4.数据采集

[00226]用捆绑于购买的1260阻抗分析仪(Solartron Analytical)上的软件程序(125505S Z plot)进行数据储存和分析。

E.参考文献

[00227]在此处将下列文献引入作为参考：

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[00280]以上的实施例，仅起说明的作用，它们并不是用来限制本发明的范围的。可能有许多相对以上描述的实施例的变化。因为对以上实施例的修改或变化对本领域技术人员而言是显而易见的，所以本发明仅受限于下面权利要求的范围。

Claims (44)

1.一种测量细胞-基片界面的电阻抗、电阻、或电容的装置，包括两个或多个电极装配在带有至少一个孔的生物相容的膜的一面上，其中装置上有适于细胞贴附或生长的表面。

2.在权利要求1中所述的装置，其中所述的生物相容的膜包含玻璃、蓝宝石、硅、硅上的二氧化硅，一种或多种塑料，或一种或多种聚合物，其厚度在2微米至500微米之间。

3.在权利要求2中所述的装置，其中所述的生物相容的膜带有一层包被物质，以使一种或多种细胞在其上贴附，其中所述的包被物质任选地包含括胞外基质成分。

4.在权利要求1中所述的装置，其中所述的两个或多个电极中的至少两个电极有基本相同的表面积。

5.在权利要求4中所述的装置，其中所述的有基本相同表面积的至少两个电极具有交错或同心的结构。

6.在权利要求5中所述的装置，其中至少两个电极的形状为：圆在线上，菱形在线上，齿型，或正弦曲线状。

7.在权利要求5中所述的装置，其上的电极宽度为20微米到250微米；其中电极部件间隙宽度为3微米到80微米；而且，其中电极部件宽度和间隙宽的比率的范围在1∶3到20∶1之间，其中电极部件间隙为用于检测细胞-基片界面的电阻抗，电阻，或电容的细胞宽度的0.2到3倍。

8.在权利要求4中所述的装置，放置在一个流体容器中。

9.在权利要求8中所述的装置，还包括一个连接于至少两个电极的阻抗分析仪。

10.在权利要求9中所述的装置，其中装配有所述电极的生物相容的膜的暴露面的表面区域包含基本均匀分布的电极部件，其中所述电极分布在装配有两个或多个电极的生物相容的膜的暴露面的表面区域的至少50％上。

11.在权利要求1中所述的装置，其中所述两个或多个电极包括至少四个电极，其中这些至少四个电极排列成一个由两个或多个交错电板结构单元(IDES)或同心电板结构单元(CCES)构成的电极结构阵列，每个单元包括至少两个电极。

12.一种包括权利要求11中所述装置的装置，其中所述的生物相容的膜是可逆的或不可逆的贴附到一个提供多个隔开的流体容器的结构上，这样至少一个流体容器带有单个的IDES或CCES结构单元，在其中，就每一个带有单个IDES或CCES的隔开的流体容器来说，装配有所述电极的生物相容的膜的暴露一面的表面区域包含基本均匀分布的电极或电极部件。

13.一种包括权利要求12中所述装置的用于分析细胞-基片界面的电阻抗、电阻、或电容的系统，还包括一个阻抗分析仪连接于至少四个电极。

14.在权利要求8中所述的装置，其中装置将流体容器的上室与下室分隔开。

15.在权利要求14中所述的装置，其中至少两个电极装配在膜的上侧面。

16.在权利要求15中所述的装置，其中所述的膜的上侧面带有一层细胞，其中所述细胞为Caco-2细胞。

17.在权利要求16中所述的装置，其中所述的膜的上侧面带有一层细胞，所述细胞为上皮细胞或内皮细胞。

18.在权利要求17中所述的装置，其装置用于检测一个或多个细胞经所述的上皮细胞层或内皮细胞层的迁移或侵袭，且其下室、或上室、或下室和上室都包括至少一种已知的或疑是的调节所述一个或多个细胞迁移或侵袭的化合物。

19.在权利要求14中所述的装置，其中至少两个电极装配在所述的膜的下侧面上，其中所述的至少一个孔的直径在1微米到25微米之间。

20.在权利要求19中所述的装置，其中所述的膜包含至少一种物质以促进细胞在膜的下侧面上贴附。

21.在权利要求19中所述的装置，其中所述的膜在其上侧面包含至少一个生物分子包被，至少一个胞外基质成分，一个上皮细胞层或内皮细胞层，或其组合。

22.在权利要求21中所述的装置，其中装置用于检测一个或多个细胞的迁移或侵袭，且其下室、或上室、或下室和上室都包括至少一种已知的或疑是的调节细胞迁移或侵袭的化合物。

23.一种测量细胞-基片界面的电阻抗、电阻、或电容的装置，包括一个平板，其上包含有两个或更多的孔，其中至少两个孔包括权利要求1中所述的装置，这里的每个装置将每个孔分隔成上室和下室。

24.在权利要求23中所述的装置，其中两个或更多电极位于膜的下侧面上。

25.在权利要求23中所述的装置，其中两个或更多电极位于膜的上侧面上。

26.一种包括权利要求12所述装置的用于测量细胞-基片界面的电阻抗、电阻、或电容的装置，其中生物相容的膜可逆地或不可逆地贴附到带有两个或更多的孔的第一平板上，这些孔提供细胞迁移单元下室；且可逆地或不可逆地贴附到第二平板上，所述第二平板提供管状结构，所述管状结构提供细胞迁移单元的上室，这样每个细胞迁移单元包含单个IDES或CCES。

27.在权利要求26中所述的装置，其中所述的电极结构阵列位于生物相容的膜的下侧面上。

28.在权利要求26中所述的装置，其中所述的电极结构阵列位于生物相容的膜的上侧面上。

29.一种分析细胞-基片界面的电阻抗、电阻、或电容的装置，包括：

a)一个带有两个或多个孔的平板；以及

b)一个合适于所述平板的插入托盘，其中插入托盘带有一个或多个插入室，每个插入室带有：

i)不渗透流体的壁；以及

ii)权利要求1中所述的装置，构成所述一个或多个插入室的每一个的底面；

而且其中每个插入室可适合于所述平板的一个孔，这样平板的孔构成下室，插入物构成细胞迁移/侵袭单元的上室。

30.在权利要求29中所述的装置，其中所述至少两个电极装配在所述生物相容的膜的上侧面。

31.在权利要求29中所述的装置，其中所述至少两个电极装配在所述生物相容的膜的下侧面，其中所述至少一个孔的直径为1微米到25微米之间。

32.一种监测细胞迁移或侵袭的方法，包括：

a)提供一个权利要求13中所述的装置；

b)将细胞放置于所述装置的上室中；以及

c)监测电极间的阻抗变化来监测细胞的迁移或侵袭。

33.在权利要求32中所述的方法，还包括，往所述装置的下室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物，或者往所述装置的上室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物。

34.一种监测细胞迁移或侵袭的方法，包括：

a)提供一个权利要求26中所述的装置；

b)将细胞放置于所述装置的上室中；以及

c)监测电极间的阻抗变化来监测细胞的迁移或侵袭。

35.在权利要求34中所述的方法，还包括，往所述装置的下室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物，或者往所述装置的上室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物。

36.一种监测细胞迁移或侵袭的方法，包括：

a)提供一个权利要求29中所述的装置；

b)将细胞放置于所述装置的上室中；以及

c)监测电极间的阻抗变化来监测细胞的迁移或侵袭。

37.在权利要求36中所述的方法，还包括，往所述装置的下室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物，或者往所述装置的上室添加一种已知的或疑是的细胞迁移或细胞侵袭的调节物。

38.在权利要求8中所述的装置，其装置将流体容器的下室和上室分隔开，且其中至少两个电极装配在膜的上侧面，且其中生物相容的膜的孔的直径为少于3微米。

39.在权利要求38中所述的装置，还包括一个阻抗分析仪。

40.一种分析细胞单层完整性的方法，包括：在权利要求39中所述装置的上室中培养细胞；通过使用阻抗分析仪监测装配在膜上的电极间的阻抗，以监测至少一个室中的细胞单层完整性。

41.一种测量细胞-基片界面电阻抗、电阻、或电容的系统，包括：

a)权利要求26中所述装置；

b)一个阻抗分析仪；

c)电子界面，包括电子开关，以控制和转换所述的阻抗分析仪，连接到装置上的不同的电极结构单元。

42.在权利要求41中所述的系统，还包括一个软件程序，能够实时测量和监测所述装置上电极间或电极结构间阻抗值。

43.在权利要求42中所述的系统，其中所述的软件程序包括下列至少一种功能：

a)控制电子开关，以将阻抗分析仪连接到装置上的多个电极结构单元中的一个；

b)控制阻抗分析仪，以测量电极结构间在一个或多个频率时的阻抗；

c)处理获得的阻抗数据，以得到适当的生物学相关参数(如细胞数目指数)；

d)将结果显示在监视器上，或储存结果；以及

e)在规则或不规则的时间间隔自动执行上述(a)到(d)的功能。

44.在权利要求10中所述的装置，其中所述电极分布在装配有两个或多个电极的生物相容的膜的暴露面的表面区域的至少90％上。

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