CN216919288U - 细胞培养孔板及细胞培养在线检测装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及生物化学检测技术领域，公开了一种集成电学刺激与测量技术的细胞培养孔板，包括孔板底座，在底座上设置若干孔洞，孔洞底部设置电极体，所述电极体包括第一电极和第二电极，第一电极和第二电极均向对侧形成多条支极，支极间隔排列，每个支极均由重复规则结构组成，相邻支极间的图案呈交错排列，排布后的电极体形状与孔洞底部形状相匹配，所述若干孔洞阵列排布，每个孔洞中的第一电极和第二电极引出至孔板底座的两端。本实用新型还公开了所述细胞培养孔板配套的细胞培养在线检测装置。本实用新型实现对细胞培养过程中细胞状态及生长情况的控制和更精确的检测。

Description

细胞培养孔板及细胞培养在线检测装置

技术领域

本实用新型涉及生物化学检测技术领域，尤其涉及一种用于细胞生长在线检测的细胞培养孔板及细胞培养在线检测装置。

背景技术

药物研发及细胞治疗技术的发展，迫切需要具有在线、原位、无损和连续的细胞检测技术，用于对细胞培养过程中细胞生长状态、生长趋势和数量进行量化分析。该技术可广泛用于包括药物筛选、药物毒性分析、抗肿瘤药杀伤效率分析、干细胞培养工艺优化、干细胞分化状态监测、CarT细胞治疗方法验证等。

传统的细胞活性检测需要通过标记细胞，培养结束后需要进行光强度测量来得到想要的数据，该数据即CI(全称Cell Index)。这就导致实验流程很长，并且以一次实验只能得到几个甚至一个数据，效率低下，需要进行数据分析必须通过多次实验，才能够达到图形绘制和数据分析的数据量的要求。

根据细胞电学性质对细胞生长状态的测量是当前最重要的细胞在线检测方法之一。通常，该技术通过施加激励电压，以获取细胞的电学特性，例如，测量细胞的电阻、电容或阻抗等方法。目前，已有的技术通常是通过将细胞培养于电极表面，利用细胞对电极表面阻抗的影响，来获取细胞生长信息。该种方法通常采用线形叉指电极进行测量，并且所用激励电压为固定频率的正弦波形，因此该方法在测量不同类型细胞时，由于细胞取向、尺寸和形状的差异，所达到的检测灵敏度也存在差异，即单一电极体支路中叉指电极单元的设计难以满足所有指定细胞生长的高灵敏检测。

显然，为达到对特定细胞测量的较高灵敏度，需要对叉指电极的形状、间距、材料和厚度等参数进行改进或者重设计，并开发具有高准确性和稳定性的仪器系统以用于对电极表面的细胞生长进行测量，获得细胞生长状态动态变化曲线，从而广泛用于细胞生长实验中。

实用新型内容

本实用新型的目的是为了解决上述问题，提供一种细胞培养孔板及细胞培养在线检测装置,实现对细胞培养过程中细胞生长的控制和细胞生长状态的检测。

本实用新型采取的技术方案是：

一种细胞培养孔板，其特征是，包括孔板底座，在底座上设置若干孔洞，孔洞底部设置电极体，所述电极体包括第一电极和第二电极，第一电极和第二电极均向对侧形成多条支极，支极间隔排列，形成叉指形式，每个支极由重复排列的几何图案单元结构，由导线连接组成，相邻支极间的图案呈交错排列，排布后的电极体形状与孔洞底部形状相匹配，所述若干孔洞阵列排布，每个孔洞的第一电极和第二电极引出至孔板底座两端的接口。

进一步，所述支极的数量为16至100条；所述孔洞阵列为16-384 孔。

进一步，所述孔洞截面形状为圆形、方形、矩形或六边形中的一种，孔洞底部材料为玻璃、石英、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯材料中的一种，所述电极体结构通过磁控溅射或蒸镀工艺加工在孔洞底部，所述电极体外层为厚度10 nm至500nm的导电材料，所述电极体外层的导电材料为金、铂、铑、钌、银、氯化银、聚吡咯或聚3,4-乙烯二氧噻吩中的一种。

进一步，细胞贴壁培养于所述孔洞底部，培养过程中细胞个体覆盖在电极体区域，并跨越在第一电极和第二电极之间。

一种细胞培养在线检测装置，其特征是，包括底座和细胞培养孔板，在底座上设置孔板槽，所述细胞培养孔板设置在所述孔板槽内，在所述底座内设置控制单元，所述细胞培养孔板上的电极体连接至控制单元，所述控制单元包括主控电路、信号参考源、多路复用器和信号测量电路，所述主控电路控制参考信号源产生激励信号，所述多路复用器分别连接至细胞培养孔板上的各第一电极，所述多路复用器在主控电路控制下，将信号测量电路的信号输入端与其中一个第一电极连接，信号测量电路的信号输出端与所有第二电极连接，信号参考源和信号测量电路连接，信号测量电路对信号参考源输出信号进行调理后，将激励信号输出至所有第二电极，与多路复用器选定的第一电极形成回路，用于对细胞施加电刺激或对细胞电学性质进行测量，监控其生长状态。

进一步，所述控制单元在第二电极上周期性地产生10mV至10V 电压幅值、1Hz至1kHz频率和1％至50％占空比的脉冲，所述脉冲调整细胞在电极表面的排布和状态。

进一步，所述控制单元测量电极的电流幅值和相位变化数据，进行归一化处理后作为细胞生长状态指标，并分析其随时间变化，获得细胞生长趋势信息。

进一步，所述输出到第二电极的激励信号为具有正弦波、方波、三角波以及脉冲等波形的电压信号，所述输出到第二电极的激励信号的幅值为1mV至150mV。

进一步，所述控制单元还包括校准电路，所述校准电路通过多路复用器连接至信号测量电路，所述控制单元存储有校准数据，所述信号测量电路通过信号校准电路对信号测量结果进行校准，并储存校准结果用于对后续测量数据进行补偿。

进一步，所述主控电路还连接芯片在位检测电路，芯片在位检测电路连接至细胞培养孔板，检测细胞培养孔板装载状态并反馈至控制单元。

进一步，所述主控电路还连接到存储单元，存储单元用于存储检测数据。

进一步，所述主控电路通过通讯电路与上位机软件连接，将测量电路采集的数据发送至上位机，并接收上位机发出的指令执行操作。

进一步，所述主控电路上还连接状态指示灯。

进一步，在所述孔板槽上设置翻盖，所述翻盖合上时，将所述细胞培养孔板固定在孔板槽和翻盖内，在所述细胞培养孔板上方设置可拆卸的透明观察窗。

本实用新型的有益效果是：

(1)细胞培养孔板的电极设计，可针对特定尺寸、形状和理化性质的细胞，通过调节结构单元宽度和角度进行参数化设计，以提高检测的灵敏度；

(2)电极采用菱形或六边形单元结构交错排列的设计，有助于提高不同尺寸和空间取向细胞的检测灵敏度；

(3)电极几何形状有利于包括光刻、激光刻蚀和溅射等多种工艺的加工；

(4)细胞培养在线检测装置通过多路复用器选择通道，可在单次检测中对任意通道进行测量；

(5)通过在细胞上施加电刺激信号来调控细胞生长；

(6)通过校准电路对测量结果进行自动校准补偿。

附图说明

附图1是本实用新型的细胞培养孔板的立体示意图；

附图2是圆形电极的平面示意图；

附图3是对应附图2的支极的折弯部放大图；

附图4是长方形形状的电极的平面示意图；

附图5是对应附图4的支极的菱形放大图；

附图6是菱形形状的电极的平面示意图；

附图7是圆形形状的电极的平面示意图；

附图8是对应附图7的支极的六边形放大图；

附图9是细胞培养在线检测装置的立体结构示意图；

附图10是细胞培养在线检测装置的翻盖打开时的立体结构示意图；

附图11是细胞培养在线检测装置的控制单元框图；

附图12是多个通道的细胞在干预前后的生长情况曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型细胞培养孔板及细胞培养在线检测装置的具体实施方式作详细说明。

参见附图1,细胞培养孔板1包括孔板底座2，在底座2上设置若干孔洞3，孔洞3的数量为阵列排布的16孔至384孔，一般为16、 48、96、384等孔位。

参见附图2，附图2是一种形式的孔洞3的底部形状，在每个孔洞3底部设置电极体4，电极体4包括第一电极5和第二电极6，第一电极5和第二电极6均向对侧形成多条支极7，支极7的数量为16 至100条为宜，根据培养细胞的大小确定。支极7间隔排列，每个支极7均为之字形结构，排布后的电极体4形状与孔洞3底部形状相匹配，根据图中的圆形孔洞3，电极体4也形成圆形。

参见附图3,支极7的之字形折弯部宽度为d，折弯角度ω，根据实际细胞类型，确定宽度d和角度ω的具体数值，使得细胞生长过程与支极7之间接触位置达到最佳配合。

参见附图4,附图4为长方形的孔洞3的底部的电极形状。第一电极5和第二电极6围成长方形形状，支极7为16条，由多个菱形连接而成，相邻的支极7上的菱形交错排列。

参见附图5,对应的菱形参数中，ω＝133°，d＝100μm。

参见附图6,附图6为菱形的孔洞3的底部电极形状。第一电极5和第二电极6围菱形形状，支极7为20条，从菱形电极的顶部开始排列至底部，支极7由多个菱形连接而成，相邻的支极7上的菱形交错排列。对应于附图5中的菱形参数，ω＝70°，d＝50μm。

电极体4的两个电极分别引出线至孔板底座2的一端，多个孔洞3的两个电极分别排布在孔板底座2上两端，孔板底座2两端的引出线在孔板底座2的下表面设置成触点。

在此基础上，孔洞3的截面形状可为圆形、方形、矩形或六边形。参见附图7、8,第一电极5和第二电极6围成圆形形状，支极7为16 条，由多个正六边形连接而成，相邻的支极7上的正六边形交错排列。各方向相邻的正六边形之间的间距相等。正六边形的外接圆直径r根据细胞不同进行不同的设置。

孔洞3底部材料可以是玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯等材料，电极体结构通过磁控溅射或蒸镀工艺加工在孔洞3底部，电极体外层为厚度10nm至500nm的导电材料，电极体外层的导电材料为金、铂、铑、钌、银、氯化银、聚吡咯或聚 3,4-乙烯二氧噻吩。

测量时，可将细胞贴壁培养于孔洞3底部，通过调整支极的重复规则结构单元的角度和宽度，使培养过程中大部分细胞个体覆盖在电极体区域，并跨越在第一电极5和第二电极6之间。

参见附图9、10,细胞培养孔板1安装在细胞培养在线检测装置8 内。细胞培养在线检测装置8的底座上设置孔板槽9，细胞培养电极通道孔板细胞培养孔板1设置在孔板槽9内，孔板槽9的两端设置电极触头，细胞培养孔板1安装后，孔板底座2两端的触点与孔板槽9两端的电极触头接触电连接，用于将细胞培养孔板1内的电极与细胞培养在线检测装置8电连接。

在孔板槽9上设置翻盖10，翻盖10合上时，将细胞培养孔板1 封闭在孔板槽9和翻盖10内，在翻盖10上方设置透明观察窗。在细胞培养孔板1内添加细胞及相关培养辅料后，合上翻盖10，整个细胞培养在线检测装置8放入培养箱中培养并进行测量。

参见附图11,在底座内设置控制单元，孔板槽两端的电极触头连接至控制单元，控制单元包括主控电路、信号参考源、多路复用器和信号测量电路，主控电路控制参考信号源产生激励信号，多路复用器连接至细胞培养孔板上的电极，多路复用器与信号测量电路连接，信号测量电路对多路复用器选择的电极通路进行信号测量。

控制单元还包括校准电路，校准电路通过多路复用器连接至信号测量电路，控制单元存储有校准数据，信号测量电路通过信号校准电路对信号测量结果进行校准。主控电路还连接芯片在位检测电路，芯片在位检测电路连接至细胞培养孔板，检测细胞培养孔板装载状态并反馈至控制单元。

主控电路还连接到存储单元，存储单元用于存储检测数据。主控电路通过通讯电路连接至上位机软件。

主控电路控制参考信号源产生一定频率、波形、振幅和相位的激励信号。包括：正弦、脉冲、三角和方波。信号测量电路将激励信号进行放大输出，并同时监测输出信号和经过细胞培养孔板上的电流信号，单次测量中采用频率扫描的方式，获得不同频率下的细胞响应信号，用于后续分析。

通过多路复用器选择通道，接触探针与细胞培养孔板的各个传感电极连接，可在单次检测中对任意通道进行测量。多路复用器可将信号测量电路与校准电路连接，用于信号测量结果的自动校准；校准数据由主控电路保存，用于对后续实际测量的结果进行补偿。芯片在位检测用于实时对传感阵列芯片是否正确装载进行检测。

状态指示灯用于指示当前设备状态，包括待机、运行、故障、校准。

主控电路通过通信电路与上位机通信，上位机通过细胞培养在线检测装置8上的接口11将测量结果实时发送至上位机软件；如果运行过程中出现上位机软件通信中断的情况，测量数据将保存在设备的存储单元中，并在通信恢复后发送给上位机。

测量过程如下：细胞培养孔板上的电极体连接至控制单元，可通过控制单元对细胞施加电刺激或测量细胞的电学性质，控制单元包括主控电路、信号参考源、多路复用器和信号测量电路，主控电路控制参考信号源产生激励信号，多路复用器分别连接至细胞培养孔板上的各第一电极，多路复用器在主控电路控制下，将信号测量电路的信号输入端与其中一个第一电极连接，信号测量电路的信号输出端与所有第二电极连接，信号参考源和信号测量电路连接，信号测量电路对信号参考源输出信号进行调理后，将激励信号输出至所有第二电极，与多路复用器选定的第一电极形成回路，实现对细胞电刺激或细胞信号测量。

对细胞的电刺激的目的是通过外部作用调整细胞在电极表面的排布和状态，其表现为以一定周期连续产生一系列10mV至10V电压幅值、1Hz至1kHz频率和1％至50％占空比的脉冲。

细胞信号测量的目的是通过测量覆盖在电极上细胞的总体电学量来估算贴附在孔板底部的细胞数量，从而推测细胞生长的变化趋势，细胞信号测量的原理是通过输出一系列不同频率的激励信号在第二电极上，并同时测量所选第一电极上的电流幅值和相位变化，通过将初始细胞培养状态下的信号作为参比，对所测量电流幅值和相位变化数据进行归一化处理，作为细胞生长状态指标，并通过一定时间间隔记录细胞生长状态指标，绘制“细胞生长状态指标-时间”曲线以对细胞生长趋势进行可视化。

控制单元控制输出到第二电极的激励信号为具有正弦波、方波、三角波以及脉冲等波形的电压信号，输出到第二电极的激励信号的幅值为1mV至150mV。

细胞生长趋势的可视化，可用于包括干细胞培养工艺的优化、抗癌药物的癌细胞杀伤效果分析、抗生素对微生物的抑制作用、功能细胞体外培养情况的监测。

应用中，将本实用新型的细胞培养在线检测装置的孔板中加入待测细胞及培养液，再将细胞培养在线检测装置放入培养箱中，实时研究细胞的生长、适应性与行为，监视细胞侵袭和迁移，监测由广泛的分子靶标引起的细胞毒性反应，实时捕获干细胞分化为体细胞的过程，持续监测细胞的粘附与伸展等。可用于癌症免疫疗法。

参见附图12，附图12为SKOV3卵巢癌肿瘤细胞杀伤实验。提前一天在细胞培养孔板底部分别铺20000个肿瘤细胞，第二天在对应孔板中分别铺效靶比为2.5：1和5：1的NC-T与CAR-T细胞，一共4组，其中，2.5：1为50000个细胞，5：1为100000个细胞。曲线1和曲线2分别为效靶比是2.5：1和5：1的空白对照NC-T实验组；曲线3 和曲线4分别为效靶比是2.5：1和5：1的CAR-T细胞实验组。实验结果表明了CAR-T细胞可以显著杀伤肿瘤细胞。

从图中可以看出，在击杀癌细胞前，细胞正常生长，在1200分钟时，在CAR-T细胞实验组的通道中加入CAR-T细胞，随后通道中癌细胞的细胞生长趋势(Cell index)出现下降，而空白对照组的细胞不受影响。

以上仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims (14)

1.一种细胞培养孔板，其特征在于：包括孔板底座，在底座上设置若干孔洞，孔洞底部设置电极体，所述电极体包括第一电极和第二电极，第一电极和第二电极均向对侧形成多条支极，支极间隔排列，形成叉指形式，每个支极由重复排列的几何图案单元结构，由导线连接组成，相邻支极间的图案呈交错排列，排布后的电极体形状与孔洞底部形状相匹配，所述若干孔洞阵列排布，每个孔洞的第一电极和第二电极引出至孔板底座两端的接口。

2.根据权利要求1所述的细胞培养孔板，其特征在于：所述支极的数量为16至100条；所述孔洞阵列为16-384孔。

3.根据权利要求1所述的细胞培养孔板，其特征在于：所述孔洞截面形状为圆形、方形、矩形或六边形中的一种，孔洞底部材料为玻璃、石英、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯材料中的一种，所述电极体结构通过磁控溅射或蒸镀工艺加工在孔洞底部，所述电极体外层为厚度10nm至500nm的导电材料，所述电极体外层的导电材料为金、铂、铑、钌、银、氯化银、聚吡咯或聚3,4-乙烯二氧噻吩中的一种。

4.根据权利要求1所述的细胞培养孔板，其特征在于：细胞贴壁培养于所述孔洞底部，培养过程中细胞个体覆盖在电极体区域，并跨越在第一电极和第二电极之间。

5.一种细胞培养在线检测装置，其特征在于：包括底座和细胞培养孔板，在底座上设置孔板槽，所述细胞培养孔板设置在所述孔板槽内，在所述底座内设置控制单元，所述细胞培养孔板上的电极体连接至控制单元，所述控制单元包括主控电路、信号参考源、多路复用器和信号测量电路，所述主控电路控制参考信号源产生激励信号，所述多路复用器分别连接至细胞培养孔板上的各第一电极，所述多路复用器在主控电路控制下，将信号测量电路的信号输入端与其中一个第一电极连接，信号测量电路的信号输出端与所有第二电极连接，信号参考源和信号测量电路连接，信号测量电路对信号参考源输出信号进行调理后，将激励信号输出至所有第二电极，与多路复用器选定的第一电极形成回路，用于对细胞施加电刺激或对细胞电学性质进行测量，监控其生长状态。

6.根据权利要求5所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述控制单元在第二电极上周期性地产生10mV至10V电压幅值、1Hz至1kHz频率和1％至50％占空比的脉冲，所述脉冲调整细胞在电极表面的排布和状态。

7.根据权利要求5所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述控制单元测量电极上的电流幅值和相位变化数据，进行归一化处理后作为细胞生长状态指标，并分析其随时间变化，获得细胞生长趋势信息。

8.根据权利要求5所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述输出到第二电极的激励信号为具有正弦波、方波、三角波以及脉冲波形的电压信号，所述输出到第二电极的激励信号的幅值为1mV至150mV。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述控制单元还包括校准电路，所述校准电路通过多路复用器连接至信号测量电路，所述控制单元存储有校准数据，所述信号测量电路通过信号校准电路对信号测量结果进行校准，并储存校准结果用于对后续测量数据进行补偿。

10.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述主控电路还连接芯片在位检测电路，芯片在位检测电路连接至细胞培养孔板，检测细胞培养孔板装载状态并反馈至控制单元。

11.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述主控电路还连接到存储单元，存储单元用于存储检测数据。

12.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述主控电路通过通讯电路与上位机软件连接，将测量电路采集的数据发送至上位机，并接收上位机发出的指令执行操作。

13.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：所述主控电路上还连接状态指示灯。

14.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养在线检测装置，其特征在于：在所述孔板槽上设置翻盖，所述翻盖合上时，将所述细胞培养孔板固定在孔板槽和翻盖内，在所述细胞培养孔板上方设置可拆卸的透明观察窗。

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