CN106198675A - 生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法 - Google Patents

生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法 Download PDF

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王金祥
王赪胤
刘克凡
张明
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Abstract

生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法，涉及生物电化学免疫传感器技术领域，电极的基片使用的是氧化铟锡导电玻璃，在导电玻璃上通过激光刻蚀，分别制作出工作电极、对电极和参比电极。即工作电极、对电极和参比电极都是导电玻璃制作的。该导电玻璃电极制作简单，成本低廉。该电极制作的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器稳定性好。本发明可应用于人免疫球蛋白IgG抗原的检测。

Description

生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法
技术领域
本发明涉及生物电化学免疫传感器技术领域，特别是导电玻璃电极的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作技术领域。
背景技术
电化学免疫传感器是一种研究最早、种类最多的免疫传感器，它是一种将电化学检测技术与免疫学技术相结合而发展起来的一种新型免疫传感器。这种传感器是将各种各样的特异性抗原——抗体固定到电极的表面，通过固定化的分子识别物质和分析物（或借助某些标记物，如：酶或其他电活性化合物等）之间的免疫反应，把抗原和抗体这种特异性结合的信息转换为可检测的电化学信号（电流或电位等）。根据测量信号的不同，电化学免疫传感器大致可以分为电导型、电流型、电位型、电容型和阻抗型等多种类型的免疫传感器。
电化学阻抗谱分析方法（EIS）是可以用来检测修饰有生物分子的电极界面的生物学反应特性的电化学技术，是一种测量电极界面性质的有效工具。阻抗型免疫传感器的分析原理是基于抗原/抗体之间的特异性结合而降低了电活性探针分子同电极之间的电子转移速率，即增加了电子转移阻抗。通过测量免疫反应前后电子转移阻抗之差（Rct）可以实现高灵敏检测的目的。电化学交流电阻抗谱法是电化学测试技术中一类重要的方法，该方法具有频率范围宽、对体系扰动小的特点，是研究电极过程动力学、电极界面现象以及测定固体电解质电导率的有效工具。近年来，由于电化学阻抗生物传感器具有制备简便、成本低廉、易于封装、快速实时和小型化监测等特点，所以在微生物检测、医疗诊断、药物残留、工业生产、环境检测、食品分析等领域得到广泛研究。
在生物免疫电化学阻抗传感器的制备过程中，选择何种电极对生物免疫电化学阻抗传感器的准确性、重现性、一致性、选择性、成本高低等都影响其实用性。在传统的电化学免疫阻抗传感器研究中，大多是使用体积较大的固体电极，如金电极、铂电极、玻碳电极、热解石墨电极、银电极等。这些电极不仅价格昂贵，使用前还需要复杂的预处理，不但难以保证电极的一致性，而且对目标物的检测结果重现性较差，是生物免疫电化学阻抗传感器制备中的突出问题之一。
发明内容
本发明目的是提出成本低、测定结果准确的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法。
本发明采用导电层为氧化铟锡的导电玻璃作为基质，通过激光刻蚀，去除基质上的部分氧化铟锡层，形成工作电极、对电极和参比电极。
本发明制备的导电玻璃电极具有易微型化，集成化，检测时耗样量小、操作简单，实际应用性强，一般无需预处理，测定结果准确可靠等诸多优点而使生物免疫电化学阻抗传感器商品化成为可能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明方法简单，只需通过电脑控制激光仪器，对导电玻璃进行刻蚀，即可制作成三电极体系的导电玻璃电极；
2、制成的导电玻璃电极可以根据需要制作出不同的尺寸；
3、用该导电玻璃电极制成的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的检测方法简单、操作方便。
附图说明
图1是导电玻璃电极的示意图。
图2是导电玻璃的阻抗图。
图3是在导电玻璃上滴加修饰物后的阻抗变化图。
图4是IgG抗原浓度与阻抗的相对变化值的线性图。
具体实施方式
一、生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器电极的制作
1、导电玻璃电极制作的预处理：
将氧化铟锡导电玻璃切割至以下尺寸：长度为30mm、宽度为10mm。
将切割好的导电玻璃依次用丙酮、乙醇、去离子水洗涤后，再将导电玻璃浸泡在1mol/L的盐酸中，浸泡10min后用去离子水清洗。随后，将导电玻璃浸泡在由体积比为1：1：5的H2O2、NH4OH和H2O组成的混合液中，浸泡时间为60 min。最后将导电玻璃置于60℃烘箱中干燥，取得基质材料——导电层为氧化铟锡的导电玻璃。
2、导电玻璃电极的制作：
先在电脑上使用autocad软件绘制出导电玻璃的示意图（如图1所示），再用电脑（根据示意图）控制激光仪器，对导电玻璃表面的部分氧化铟锡刻蚀，形成工作电极、对电极和参比电极，取得生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器电极。
二、生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器电极的性能研究：
电化学阻抗谱（EIS）是研究电极修饰过程中电极界面变化的一种有效的检测手段。电化学阻抗谱图是由半圆和直线两部分组成，处于高频的半圆部分对应电子转移的过程，即电极表面电子转移的阻抗（Rct）等于半圆的直径，而处于低频的直线部分则对应于扩散过程，故可以用它来描述电极的界面性质。
将本发明制成的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器电极置于含0.1 mol/L 氯化钾的0.005 mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾溶中，开路电位：0 V，取得导电玻璃的阻抗图，如图2所示。
从图2 中可以看出采用本发明制成的导电玻璃电极的电化学阻抗谱图由半圆和直线两部分组成，这说明了导电玻璃电极是适合用于电化学阻抗测定的。
三、以人免疫球蛋白（IgG）为例，对本发明以上工艺制作的生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器进行测定：
原料说明：本发明使用的铁氰化钾（AR）、亚铁氰化钾（AR）、磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钠（AR）、硝酸钾（AR）购自国药集团化学试剂有限公司。链霉亲和素化的磁珠、生物素化的IgG抗体、IgG抗原购自江苏省苏北人民医院。实验中所用的水均为去离子水，autolab电化学工作站购自荷兰autolab公司。
1、溶液的配制：
配制含0.1 mol/L 氯化钾的0.005 mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾混合溶液：先将铁氰化钾和亚铁氰化钾混合，形成铁氰化钾含量为0.005 mol/L的铁氰化钾和亚铁氰化钾混合溶液。再将氯化钾加入铁氰化钾和亚铁氰化钾混合溶液中，形成氯化钾含量为0.1 mol/L的氯化钾/铁氰化钾/亚铁氰化钾混合溶液。
配制0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH =7）。
分别配制不同浓度的IgG（0.741、7.41、14.82、74.1、741、1482、11280 ng/mL）。
2、选用正面具有氧化铟锡的导电玻璃，先在超声波中超洗干净，并干燥，取得洁净的导电玻璃基体。
然后在导电玻璃基体的背面粘上一块磁铁，用来吸附磁珠与抗体的复合物。
3、用移液枪分别移取120 μL链霉亲和素化的磁珠和120 μL生物素化的IgG抗体到离心管中，在38℃的恒温水浴槽中，温浴30 min，将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的IgG抗体结合，取得磁珠与抗体的复合物。
将磁珠与抗体的复合物滴在导电玻璃基体的正面，用PBS缓冲液清洗电极表面，去除磁珠未吸附的抗体，将上述电极浸于氯化钾/铁氰化钾/亚铁氰化钾混合溶液中，开路电位设为 0 V，频率设为0.01～1000000 Hz。用autolab电化学工作站测量阻抗R0 。
4、将上述处理的电极放置在1 wt % BSA 溶液中温育60 min，用于封闭电极上的非特异性活性位点。用PBS缓冲液清洗电极，将上述电极浸于含0.1 mol/L 氯化钾的0.005mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾溶中，开路电位设为 0 V，频率设为0.01- 1000000 HZ，用autolab电化学工作站测量阻抗R1。
5、用移液枪移取10 μL IgG（0.741 ng/mL）抗原滴在工作电极上，在38℃的恒温水浴槽中，温浴60 min。用PBS缓冲液清洗电极，将上述电极浸于含0.1 mol/L 氯化钾的0.005mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾溶中，开路电位设为 0 V，频率设为0.01- 1000000 Hz，用autolab电化学工作站测量其阻抗R2。同理，依次完成对其它浓度（7.41、14.82、74.1、741、1482、11280 ng/mL）的电化学阻抗测定。
6、计算加IgG抗原前后阻抗变化的相对值，公式如下：
上式中：
△：变化值。
R1：1 wt % BSA滴加在磁珠和IgG抗体复合物修饰的电极后的电化学阻抗值。
R2：IgG抗原滴加在由1 wt % BSA，磁珠－IgG抗体修饰后电极后的电化学阻抗值。
7、在含0.1 mol/L 氯化钾的0.005 mol/L铁氰化钾/亚铁氰化钾溶的阻抗图,开路电位：0 V（a）裸电极的阻抗图,（b）在电极滴加上磁珠和IgG抗体复合物后的阻抗图（c）滴加1% BSA 后的阻抗图（d）滴加IgG抗原后的阻抗图。取得图3的在导电玻璃上滴加修饰物后的阻抗变化图。
从图3的电化学阻抗图谱中可以看出电极的逐步修饰过程。裸导电玻璃电极的阻抗谱（曲线a）Rct很小，说明氧化还原探针在裸玻碳电极表面的R ct很小。固定上链霉亲和素的磁珠和生物素化的IgG抗体复合物之后，Rct明显增加（曲线b），这是由于抗体的分子结构阻碍了电子的传递，它同时也证明链霉亲和素的磁珠和生物素化的IgG抗体复合物成功地固定到了电极上。当封闭了牛血清蛋白后，Rct变大（曲线c）。随后，当IgG抗原结合到单克隆抗体的修饰电极表面时，与曲线c相比，电化学反应阻抗Rct（曲线d）明显增大。这个结果可以说明IgG抗原与导电玻璃电极表面的单克隆抗体成功结合，形成了无活性电子和传质封闭层，极大地阻碍了铁氰化物在玻碳电极表面的扩散过程。
8、图4是使用original软件，以IgG抗原浓度为横坐标，阻抗的相对变化值为纵坐标作图而得，通过线性拟合，得出下表。
方程 y = a + b*x
权重 不作权重
残差平方和 43.34719
校正的相关系数平方 0.99976
数值 标准误差
截距（b） 43.82391 1.01804
斜率（a） 0.04145 2.26903×10-4
用该导电玻璃电极制作的电化学阻抗免疫传感器检测IgG的线性范围是0.0741~11280ng/mL，线性相关系数0.99976，方程为y=43.82391 + 0.04145x 。

Claims (1)

1.生物免疫电化学阻抗集成芯片传感器的制作方法，其特征在于采用导电层为氧化铟锡的导电玻璃作为基质，通过激光刻蚀，去除基质上的部分氧化铟锡层，形成工作电极、对电极和参比电极。
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