JP2005538741A - インピーダンスによる細胞と微粒子の測定装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、米国特許第5284753号明細書は、複数ポイントのケモタキシス実験の装置と方法を提供している。この方法は、ケモタキシス因子と対象物質が底板表面の予め指定された範囲に置かれ、適当な直径の孔がついている濾過膜(membrane filter)を選んで、細胞液(cell suspensions)を濾過膜上に置き、濾過膜をケモタキシス因子含有の底板上に置く、これによって底板上のケモタキシスと対象物質を含んだ溶液は、直接細胞液下に置かれた濾過膜に触合う。このように、一定の時間が経過すると、細胞はケモタキシス因子と対象物質の影響の下で、濾過膜を通され転移されるが、その転移数量は、カウンターによって確認される。
(A)一種のドキシサイクリンによって生じた時間、使用量と関わりのあるHT1080細胞の転移・侵入を抑制する結果。
(B)全自動器機とプログラム制御によるインピーダンス測定のデータ採集システムを採用して、ドキシサイクリンのHT1080細胞の侵入あるいは転移に対する動態的抑制役割に対してリアルタイムチェックを行う。図24(B)の通り、この転移過程は、15分ごとに1回ずつ測定する。
具体的実施方式
これによって本発明の内容を制限することでなく、本発明をもっとはっきりと説明するために、下記の通り幾つかの章節に分けて詳しく説明することにする。
B.細胞の転移を測定する装置及び方法
この発明の装置には、細胞が孔付き膜によって転移され、またそれによって隔てられる上室と下室が含まれている。その中の下室には、少なくとも2つの電極が含まれており、電極は下室の底面に位置している。ある情況では、膜の下表面には、1種あるいは多種の実体分子があって、細胞の附着を防ぐことができる。この実体分子の非制限性実例としては、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)の処方が含まれる。その他の情況では、膜は化学処理(例えば、酸)、あるいは物理処理(例えば、プラズマ類の放射線処理)を経て、膜の下表面に細胞が附着しないようにして、細胞の附着を減らすのである。このように、膜を経て転移する細胞は下室の底面に附着され、下室底面の電極上にてインピーダンス値の変化を起こすのである。
図19と図20は、慮2種の多孔細胞転移侵入用装置の実施例である。図19中、装置には、複数の上室(1910)、一つの孔跨リ膜(trans−well membrane)(1920)、複数の下室(1930)などが含まれている。複数の上室は、細胞がこれを通じて転移されるために、孔の大きさの適している孔付き膜(1920)と連結されており、各上室(1910a)は、お互いに対応する下室(1930a)がある。各下室の底面には、2つの電極があって、上室に向いている。電極含有の下室の構造は、アメリカ特許申請番号60/435、400のB章に述べている細胞の観察測定に用いられるベースインピーダンス装置あるいは器材と同じであるかあるいは相似していた。また、アメリカ特許申請番号60/435、400のB章中、装置、多孔プレット関連の内容は、多孔プレットと電極含有構造のベースの組立て方法や、電極と外部インピーダンス測定回路の方法についての説明であって、その全てがここにおいて、細胞の転移あるいは侵入を測定する下室と底面に適していた。測定の際、下室に位置する電極構造は、異なる方法によって、インピーダンス測定回路や器材に連結することができ、上室から転移してくる下室の電極に附着している細胞を測定する。測定されたインピーダンスは、細胞数(あるいは細胞の転移指数)の計算に用いられ、これによって、上室から転移されてきた下室の細胞数が反映できる。
上・下室で構成された装置
複数の電極あるいは電極構造付きのユニット器材(膜)
測定の場合、膜上の電極は、異なる方法によって、インピーダンス分析器に連結する。例えば、電極構造は、膜上の電気輸送導線によって、膜果ての連結盤に連結する。連結盤は異なる方法によってインピーダンス分析器に連結する。一つの方法は、測定の際、インピーダンス分析器に連結する導線は、溶接あるいは導電接着剤によって連結盤に連結する。上室にとっても異なる実施方法がある。その一つは、1種の複数上室を単独に分離して、同一膜において、一緒に連結(1620)される場合連結する。もう1つの実例は、複数の上室がお互いに連結され、一緒に加工されている(例えば、複数の上室は、プラスチック射出成形によって作られている。)。それからこれらの上室の整体は、膜に付けられる。
多角的で、隔離膜付きの2室システム
多角インサート・トレーシステム
細胞測定際のインピーダンスのスペクトラム
細胞数指数(cell number index)の導き出し
(1)各周波数において、測定された抵抗値(細胞が電極に附着された場合)を基準抵抗値 で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)スペクトラム中から抵抗比率の最大値を選ぶ。
(3)抵抗比率の最大値―1。
(1)各周波数において、測定された抵抗値(細胞が電極に附着された場合)を基準抵抗値 で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)スペクトラム中から抵抗比率の最大値を選ぶ。
(3)最大抵抗比率の対数値を算出する(対数の底は10、あるいはe=2.71 8)。
(1)各周波数において、測定されたリアクタンス値(細胞が電極に附着された場合)を基 準リアクタンス値で割るとリアクタンスの率が得られる。
(2)スペクトラム中からリアクタンス率の最大値を選ぶ。
(3)リアクタンス率の最大値―1。
(1)各周波数において、測定されたリアクタンス値(細胞が電極に附着された場合)を基 準リアクタンス値で割ると抵抗の比率が得られる。
(2)各周波数の測定値中、抵抗の比率値から1を引くと、抵抗の相対変化値が得られる。
(3)あらゆる相対変化値を積分計算する。
C.用例
例1
8種の異なる電極に細胞の附着がある場合と細胞の附着がない場合の抵抗と電気容量リア クタンス
例2
3B電極で行う細胞の定量測定
例3
3Cと3B電極によるNIH3T3細胞とPEA細胞増殖に対するリアルタイムチェック
例4
3C電極による4種の異なるタイプ細胞インピーダンスの測定
接種3時間後、NIH3T3細胞、HUVEC細胞及びPAE細胞の抵抗は、著しく増加していたが、HEP−G2細胞の抵抗は、4時間経っても僅か微量の増加があって、肝細胞は電極上の附着が比較的遅いと言うことを説明している。HEP−G2細胞の抵抗は、徹夜培養後、安定した増加の傾向を見せ(データ上では、表していない)、接種してから119時間後台になっていた。
例5
抵抗測定の重複性
例6
下室底部に位置している電極の細胞転移装置による
非侵入性NIH3T3細胞と侵入性HT1080細胞の侵入及び転移の比較
例7
電極構造がインサート構造の孔付き膜に位置している細胞転移装置による
非侵入性NIH3T3細胞と侵入性HT1080細胞の侵入及び転移の比較
例8
電極構造がインサート構造の孔付き膜上に位置している細胞転移装置による
ドキシサイクリンが腫瘍細胞の侵入・転移に対する抑制効果のリアルタイムチェック
(A)一種のドキシサイクリンによって生じたHT1080細胞の転移と侵入に対する抑 制作用である。この抑制作用は、実験時間とドキシサイクリンの用量と関わりがあ る。
(B)全自動設備とソフトウェアによってインピーダンスの測定やデータの収集が制御さ れるので、ドキシサイクリンがHT1080細胞の侵入と転移に対する動態的抑制 作用をリアルタイムチェックができる。図24(B)に示しているように、15分 ごとに1回ずつ、連続的に細胞の転移過程を測定する。
電極は、インサート構造の孔付き膜上に加工された細胞転移装置(図23に述べている)で、薬物が腫瘍細胞の移転・侵入に対する作用を動態的に観測することに使われる。細胞転移装置によって、ドキシサイクリンがHT1080細胞の転移・侵入に対する抑制作用を測定する場合、その結果は、時間と用量に関わりがある。簡単に言うと、室温にて、孔付き膜(孔の直径10μm)と測定電極をファイブロネクチン(50μm/ml)に入れて、1時間コーティングする。それから燐酸塩緩衝液で洗う。また、HT1080細胞は、パンクレアチンで消化させて、106の懸濁液にする。そして、下室の中に異なる濃度のドキシサイクリン培養液(1ml)を入れる。ドキシサイクリンの溶媒DMSOを対照物質とする。各インサート構造に200μlのドキシサイクリンあるいは対照物含有のHT1080細胞(2×105個細胞)懸濁液を入れる。インピーダンス分析器は、自動的に各インサート構造の電極構造を自動に連結して、ドキシサイクリンが含まれているのとドキシサイクリンが含まれていない場合の細胞の転移と進入を連続的かつリアルタイムチェックが行われる。転移指数(あるいは細胞転移指数)の算出方法は、図22と23に示したものと同じである。
例9
転移のリアルタイムチェック装置
1.電子細胞チップの設計
2.電子細胞チップの細胞測定メカニズム
3.抵抗の測定による電極附着細胞数の測定
4.テスト器材による種類の異なる細胞の測定
5.細胞の増殖
6.テスト器材の細胞測定における定量性と感度
7.テスト器材の測定重複性
D.方法
電子器材で細胞の転移を測定する方法
1.電極のコーティング
2.ECMコーティング(胞外ベースコーティング)
3.細胞の接種
4.データの収集
E. 参考文献
www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/drug_discovery/insert_systems/fluoroblok_growth/
120 孔跨り膜
130 下室
150 電極
210 上室
230 下室
240 インピーダンス分析器
Claims (19)
- 細胞など生物微粒子の転移・侵入を測定する器材には、下記のものが含まれる。
イ.細胞のサンプルを入れる上室。
ロ.少なくとも2つの電極と1つの底面がある下室、及び
ハ.細胞の転移、マイクロ孔通り抜けのために、充分な生物コンパーチブル孔付き
膜を有しており、その孔付き膜は、器材上において上室と下室を隔てるように設置 されている。
細胞が、孔付き膜を経て転移して、転移された細胞は、下室に位置している1つあるいは複数の電極と接触する。この接触は、電極間にて、測定可能のインピーダンス変化を引き起こすのである。 - さらに、一種あるいは多種の少なくとも2つの電極の表面に固定されている捕捉試剤を含み、これらの捕捉試剤が、標的細胞と微粒子と結合することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の器材。
- 電極が下室の膜の表面に位置していることを特徴とする、請求項1に記載の器材。
- 下室に充分な表面積があり、下記数の細胞が附着されるようになされていることを特徴とする、請求項3に記載の器材:1−10、10−100、100−300、300−700、100−1000、1000−3000、3000−6000、6000−10000、1000−10000。
- 下室に位置している膜の表面積において、その電極が少なくとも5%の面積を覆うことを特徴とする、請求項3に記載の器材。
- 下室の面積が1mm2以下であることを特徴とする、請求項3に記載の器材。
- さらに、少なくとも2つの電極が連結されているインピーダンス分析器が含まれることを特徴とする、請求項1に記載の器材。
- 生物コンパーチブル孔付き膜が、絶縁材料を含んでいることを特徴とする、請求項1に記載の器材。
- 絶縁材料は、ガラス、ケイ素、ケイ素上の二酸化ケイ素、あるいは、一種または多種のマルチ重合体が含まれることを特徴とする、請求項8に記載の器材。
- 生物コンパーチブル孔付き膜の厚さが、2μm〜500μmであることを特徴とする、請求項8に述べている器材。
- 生物コンパーチブル孔付き膜が、一種あるいは多種の細胞がそれに附着することを促進するための、一層のコーティング物質をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の器材。
- さらに、下記のものが含まれることを特徴とする、請求項1に記載の器材。
イ.少なくとも2つの電極と連結しており、少なくとも2つの電極から伸ばされた導線、 及び
ロ.導線とインピーダンス分析器を電気で繋がせる方式。 - 細胞の転移あるいは侵入を測定する方法として、下記のものが含まれる。
イ.請求項1または2の器材を提供する。
ロ. 細胞を器材の上室に入れる。それから、
ハ.電極間にインピーダンスの変化があるかどうかを確認する。この電極間のイピー ダンス値の変化は、細胞が生物コンパーチブル孔付き膜を通じて、侵入・転移されたこ とを反映している。 - さらに、一種の既知あるいは疑わしい細胞転移調節因子を器材の下室に入れる、手順“ロ”を含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- さらに、一種の既知あるいは疑わしい細胞転移調節因子を器材の上室に入れる、手順“ロ”を含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- それに使われている細胞は、哺乳動物の細胞であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- それに使われている哺乳動物の細胞は、悪性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- それに使われている哺乳動物の細胞は、神経細胞であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- それに使われている細胞には、一種あるいは多種の微生物が含まれることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
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