CN108982335A - 一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片及其制作方法和计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，包括绝缘基底和等离子键和在绝缘基底上的细胞容器，所述的绝缘基底上均布有电极测量区，所述的电极测量区的一端设置有对应的测量电极，所有的电极测量区的另一端分别连接有一个共地电极；所述的细胞容器上设置有与电极测量区一一对应的检测腔室，所述的电极测量区处于检测腔室的中心。还公开了基于阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法和利用其计数的方法。基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，无需人工计算细胞数量，并且可以快速获得细胞数量结果；同时检测芯片可以重复利用，降低了平均测量成本；一次可以对多个不同浓度样本进行计数，节约了细胞计数时间。
Description
技术领域
本发明涉及悬浮细胞计数技术领域，尤其是涉及基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片及其制作方法和计数方法。
背景技术
在细胞培养、实验的过程中，需要对细胞进行各种检测，其中最为普遍的就是细胞数量的检测，通过计算细胞数量来衡量是否需要进行换液、传代等操作，以及对细胞进行相应的稀释或浓缩，达到需要的实验细胞浓度。
现有技术中常用的悬浮态细胞计数方法有血球计数板以及自动细胞计数仪，现有的计数板或计数仪在检测过程中需要一次性测量芯片或者辅助仪器，操作费时费力，而且成本高，不利于环保。例如以下专利文献：中国专利文献(公告日：2015年2月18日，公告号：CN103170377B)公开了一种血细胞分析芯片及分析系统。该系统包括该芯片、电阻抗检测单元和信号处理系统。该芯片包括第一储液池、第二储液池、第三储液池、第一液体通道、第二液体通道以及检测通道。第一储液池用于储存血细胞悬液，第二储液池用于储存可改变血细胞悬液特定性能的溶液，第三储液池用于储存废液。第一储液池通过第一液体通道和检测通道与第三储液池相连，第二储液池通过第二液体通道和检测通道与第三储液池相连。第一液体通道和第二液体通道与检测通道在同一位置交汇。检测通道上设有检测小孔。电阻抗检测单元和信号处理系统利用电阻抗法对血细胞进行分析。
中国专利文献(公告日：2010年1月6日，公告号：CN100577811C)公开了一种监测生物颗粒如细胞迁移或侵袭的装置。本装置包括一个适合于接受和保持细胞样品的上室，一个有至少两个电极的下室，和一个生物相容的有孔膜，所述膜具有适合于细胞经过膜迁移的孔隙度。膜在装置上将上室和下室分隔开。细胞经多孔膜的迁移使得迁移细胞接触到下室的一个或多个电极。所述接触引起电极间一个可测量的阻抗改变。
中国专利文献(公告日：2015年2月25日，公告号：CN 104380080 A) 公开了一种用于确定细胞悬液的细胞的数量和积聚标记细胞的装置，所述装置具有：用于传导细胞悬液的流体通道，所述流体通道具有第一横截面；流体通道上的用于计数细胞悬液中的磁性标记细胞的磁性传感器；其中流体通道具有积聚区域，所述积聚区域具有相对于第一横截面增大的第二横截面，其中在积聚区域的至少一侧上布置有磁体。
中国专利文献(公告日：2013年10月2日，公告号：CN101828192B) 公开了定量样品中的细胞的方法，这通过下述实现，使细胞裂解，随后为至少一种细胞内组分的测量。本发明的方法对于定量例如在与细胞大小相比较大的表面积或体积上的小细胞数目尤其有用。在优选实施方案中，本发明的方法使用微观流体设备执行。
针对，现有技术中的计数板或计数仪在检测过程中需要一次性测量芯片或者辅助仪器，操作费时费力，而且成本高，不利于环保等问题，急需要设计一种新的测量芯片以及测量方法来改善目前的测量条件。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有悬浮态细胞计数操作费时费力，检测板材不能够重得利用，耗材多，不能同时对多个不同浓度样本进行计数等问题，而提供一种能够同时对不同浓度样本进行计数，而且计数方便快捷，检测芯片能够重复利用，计数精确的基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片及其制作方法和计数方法。
本发明实现其第一个技术目的所采用的技术方案是：一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，包括绝缘基底和等离子键和在绝缘基底上的细胞容器，所述的绝缘基底上均布有电极测量区，所述的电极测量区的一端设置有对应的测量电极，所有的电极测量区的另一端分别连接有一个共地电极；所述的细胞容器上设置有与电极测量区一一对应的检测腔室，所述的电极测量区处于检测腔室的中心。该基于电阻抗的悬浮态细胞计数芯片，主要包括绝缘基底和细胞容器，电极测量区均匀分布在绝缘基底上，电极测量区与细胞容器上的检测腔室一一对应并处于检测腔室的中央，每个电极测量区的其中一端都连接至同一个共地电极，另一端引向各自的测量电极，至绝缘基底边缘，便于测量。检测腔室与电极测量区重合，确保培养过程中细胞的粘附、延伸、增殖以及死亡等活动可以通过检测腔室底部的电极阵列进行有效的细胞阻抗谱检测。在室温条件下，将待检测的悬浮细胞液添加至某个检测腔室用于测量，再在另一个检测腔室添加无细胞的液体用于对照，悬浮态的细胞添加进腔室后开始沉淀，阻抗测量仪器分别测量对应的测量电极以及共地电极，细胞沉淀在电极上使得阻抗上升，通过对比有细胞测量电极与无细胞测量电极的阻抗差值，可以计算出液体中的细胞数量。该基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，能够同时对不同浓度样本进行计数，而且计数方便快捷，检测芯片能够重复利用，计数精确。无需人工计算细胞数量，并且可以快速获得细胞数量结果；同时检测芯片可以重复利用，降低了平均测量成本；一次可以对多个不同浓度样本进行计数，节约了细胞计数时间。
作为优选，所述的绝缘基底为玻璃材料件，所述的细胞容器为PDMS材料件。绝缘基底为玻璃材料件和细胞容器为PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)材料件。在镀金玻璃绝缘基底上刻蚀加工出金电极阵列作为检测电极，裸露出的玻璃部分以及金电极部分都具有亲水性，无需特殊处理即可被贴壁细胞贴附生长。同时利用有机材料PDMS制作的细胞容器易于与玻璃基底粘连，也具有表面疏水性，不易被细胞粘附从而影响检测腔室内的细胞浓度。
作为优选，所述的测量电极为金材质双电极，所述的电极测量区形状为叉指电极、双电极或大小环状电极。电阻抗法细胞检测所用的测量电极形状不一，常见的有双电极和叉指电极两种。其中双电极体系由一大一小两个电极构成，主要在大电极上进行细胞的粘附延伸增殖，小电极则不粘附细胞，测量灵敏度较高，常见于检测单个或少量细胞的活动；叉指电极则由多个插指状电极构成，细胞粘附在所有电极的表面，测量统计性较好，多用于测量大量细胞活动的统计结果。叉指电极的电极形状不一，主要为长条形以及波浪形，电极宽度为60-100μm 之间。
本发明实现其第二个发明目的所采用的技术方案是：一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，包括以下步骤：
(1)绝缘基底的加工：首先切割加工设定尺寸的绝缘基底用玻璃板材；再在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬和金，形成基片；然后在基片上通过刻蚀加工获得电极测量区及电极图形；
(2)细胞容器的加工，按照工业方法配制并硬化获得完整的PDMS，在PDMS 上加工出与绝缘基底电极测量区对应的形状的检测腔室；
(3)将绝缘基底和细胞容器通过等离子体处理键和最后获得芯片，将细胞容器和绝缘基底需要黏连的一侧用等离子体轰击后贴合，放置在90℃加热炉上烘烤 3h完成芯片的键合过程。
作为优选，在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬的厚度为15 nm～25nm，金的厚度为150nm～250nm。
作为优选，步骤(1)中电极测量区及电极图形的加工步骤：(1)清洗基片，将镀金玻璃基片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在金膜表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)刻蚀，金膜用KI-I 2溶液刻蚀，金和玻璃基底的铬用铬刻蚀液刻蚀；
(6)去除感光胶，将芯片260℃烘烤一小时，剥除剩余的感光胶；
(7)获得电极测量区及电极图形。
作为优选，步骤(2)中检测腔室的制作：(1)选择并清洗硅单晶圆片，将硅单晶圆片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20 分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在硅单晶圆片表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)浇注PDMS，将配置好的PDMS浇注在硅单晶圆片表面，根据所需的检测腔室厚度调节相应的浇注深度；
(6)剥离获得PDMS腔室，将浇注PDMS后的硅圆片在加热炉上80℃加热1.5h，使PDMS硬化，剥离后获得检测腔室。
本发明实现其第三个发明目的所采用的技术方案是：一种利用基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，包括以下步骤：
S1、将基于阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；
S2、取待测的悬浮细胞样本，添加至其中一个检测腔室作为测量；或者取不同浓度待测的悬浮细胞样本，分别添加至不同的检测腔室进行测量；或者取同一浓度的不同加液量的待检测悬浮细胞，分别添加至不同的检测腔室进行测量；
S3、静置后，分别测量对应的测量电极以及共地电极间阻抗；
S4、根据测得的阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
作为优选，步骤S2中还可以在其中一个检测腔室内部添加无细胞的培养液作为对照，同时测量该检测腔室对应的测量电极以及共地电极间阻抗，作为对照。
作为优选，所述的阻抗分析仪还连接有一上位机，并通过上位机直接编写LabVIEW程序控制以及记录阻抗数据，并直接换算得到悬浮细胞数量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，无需人工计算细胞数量，并且可以快速获得细胞数量结果；同时检测芯片可以重复利用，降低了平均测量成本；一次可以对多个不同浓度样本进行计数，节约了细胞计数时间。
附图说明
图1是本发明基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的一种俯视图；
图2是本发明基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的一种整体组装结构示意图；
图3是添加不同浓度细胞在检测腔定后阻抗随时间变化的曲线图；
图4是阻抗与细胞浓度关系图；
图5是有细胞及无细胞下的阻抗相对变化图；
图6是不同浓度细胞阻抗相对变化图；
图7是不同加液量下细胞阻抗变化图；
图中：1、绝缘基底，2、细胞容器，3、电极测量区，4、测量电极，5、共地电极，6、检测腔室。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案作进一步详细说明。本申请所用的试剂或溶液均可通过市购获得。正性光刻胶SU-8 3010(苏州汶颢微流控技术有限公司)；铬刻蚀液(JET929，长沙金昕电子材料有限公司)。
如图1、图2所示，一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，包括绝缘基底 1和等离子键和在绝缘基底1上的细胞容器2，绝缘基底1上均布有电极测量区 3，电极测量区3的一端设置有对应的测量电极4，电极测量区3的另一端分别连接有一个共地电极5；细胞容器2上设置有与电极测量区3一一对应的检测腔室6，电极测量区3处于检测腔室6的中心。绝缘基底1为玻璃材料件，细胞容器2为PDMS材料件。测量电极4为金材质双电极，电极测量区3形状为叉指电极、双电极或大小环状电极。本实施例中电极测量区3双电极长度6mm，宽度1mm，电极间距0.2mm，芯片上所有电极测量区的形状尺寸都完全相同，测量阻抗频率为200kHz。细胞容器2厚度1cm，通过圆冲加工出直径8mm的检测腔室6，检测腔室6主要用于检测时培养细胞，因此只需满足在面积尺寸上与检测电极相符且有一定厚度，能容纳一定量的培养液即可。通过测量测量电极4 与共地电极5之间的阻抗值来得出检测腔室6内的细胞数量。
该基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，由绝缘基底1、电极和细胞容器2三部分构成。通过测量测量电极与共地电极之间的阻抗值来得出检测腔室内的细胞数量。其中绝缘基底为玻璃基底。电极由测量电极4和共地电极5构成，位于绝缘基底上方，电极与检测腔室6对应位置为电极测量区3。细胞容器2与绝缘基底1紧密贴合，细胞容器2上的检测腔室6用于放置待测的悬浮态细胞。
该基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片加工过程如下：首先获取一块洁净的玻璃，将其通过切割的方式加工至合理的尺寸作为绝缘基底；再在玻璃表面通过金属溅射沉积的方式依次沉积20nm铬和200nm金；然后通过刻蚀加工图形，添加光刻胶并曝光获取待刻蚀的图形，使用KI-I2刻蚀液刻蚀金，使用硝酸铈铵刻蚀铬，获得电极图案；继而加工细胞容器，配制并硬化获得完整的PDMS，加工出与绝缘基底对应的形状以及所需的检测腔室；最后通过等离子体处理键和获得芯片。
该基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，具体包括以下步骤：
(1)绝缘基底1的加工：首先切割加工设定尺寸的绝缘基底用玻璃板材；再在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬和金，形成基片；然后在基片上通过刻蚀加工获得电极测量区及电极图形；
(2)细胞容器2的加工，按照工业方法配制并硬化获得完整的PDMS，在PDMS 上加工出与绝缘基底电极测量区对应的形状的检测腔室；
(3)将绝缘基底1和细胞容器2通过等离子体处理键和最后获得芯片，将细胞容器2和绝缘基底1需要黏连的一侧用等离子体轰击后贴合，放置在90℃加热炉上烘烤3h完成芯片的键合过程。
在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬的厚度为20nm，金的厚度为200nm。
步骤(1)中电极测量区及电极图形的加工步骤：(1)清洗基片，将镀金玻璃基片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在金膜表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)刻蚀，金膜用KI-I 2溶液(I 2、KI、去离子水质量比1:4:40)刻蚀，金和玻璃基底的铬用铬刻蚀液刻蚀；
(6)去除感光胶，将芯片260℃烘烤一小时，剥除剩余的感光胶；
(7)获得电极测量区及电极图形。
步骤(2)中检测腔室的制作：(1)选择并清洗硅单晶圆片，将硅单晶圆片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在硅单晶圆片表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)浇注PDMS，将配置好的PDMS浇注在硅单晶圆片表面，根据所需的检测腔室厚度调节相应的浇注深度；
(6)剥离获得PDMS腔室，将浇注PDMS后的硅圆片在加热炉上80℃加热1.5h，使PDMS硬化，剥离后获得检测腔室。
在检测腔室的对应位置用圆冲打出通孔即可获得培养液通道和细胞培养检测腔室。本实施例中用直径7mm的圆冲加工出检测腔室，浇注的PDMS厚度为10mm，每个检测腔室的面积为38.465mm 2，容积为384.65μl。
在室温条件下，将待检测的悬浮细胞液添加至某个检测腔室用于测量，再在另一个检测腔室添加无细胞的液体用于对照，悬浮态的细胞添加进腔室后开始沉淀，阻抗测量仪器分别测量对应的测量电极以及共地电极，细胞沉淀在电极上使得阻抗上升，通过对比有细胞测量电极与无细胞测量电极的阻抗差值，可以计算出液体中的细胞数量。
利用基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，具体包括以下步骤：
S1、将基于阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；
S2、取待测的悬浮细胞样本，添加至其中一个检测腔室作为测量；或者取不同浓度待测的悬浮细胞样本，分别添加至不同的检测腔室进行测量；或者取同一浓度的不同加液量的待检测悬浮细胞，分别添加至不同的检测腔室进行测量；
S3、静置后，分别测量对应的测量电极以及共地电极间阻抗；
S4、根据测得的阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
步骤S2中还可以在其中一个检测腔室内部添加无细胞的培养液作为对照，同时测量该检测腔室对应的测量电极以及共地电极间阻抗，作为对照。
阻抗分析仪还连接有一上位机，并通过上位机直接编写LabVIEW程序控制以及记录阻抗数据，并直接换算得到悬浮细胞数量。
基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，在检测前选择阻抗分析仪，在一定的频段对被测物的阻抗进行精确的测量。选用LCR仪(型号：4284A， Agilent)对电极上阻抗进行精确测量。LCR仪后侧有GPIB-USB接口，可以通过上位机直接编写LabVIEW程序控制以及记录数据。阻抗分析仪通过导线经金属夹片与基于阻抗的悬浮细胞计数芯片上的检测电极相连，测量阻抗值，并由 GPIB-USB线传输数据至上位机。上位机采集的阻抗信息保存在LabVIEW中，用于进一步分析处理。
使用的检测电极为均匀叉指电极，加工后电极宽度约62μm，相邻两个电极间距约98μm，假设两平行叉指电极间为均匀场，细胞完全粘附后最大长度约为30μm，则测量电压应该小于653.3mV，当测量电压小于200mV时，则可以确保任何长度的细胞都能正常存活。
基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的检测对象就是体外培养的动物细胞，实验的过程细胞，实验的过程就是在细胞培养的过程中对其细胞整体状态进行监测，为了保持实验数据的稳定性以及可重复性。本实施例中，所使用的癌细胞为HepG HepG 2，一种源自于15岁白人肝癌组织，易于获得的癌细胞，并且事先培养为悬浮细胞。具体的实验步骤如下：第一步，将培养瓶中细胞吸出后离心，加1ml培养液重新悬浮，测量细胞浓度后稀释至所需的细胞浓度，取200 μl添加至培养室；第二步，细胞添加到培养室后静置10min，在设定好的频率点记录细胞阻抗值；第三步，测量结束后吸去细胞悬液，用200μl DPBS吹打一次，准备下一次实验。
在不同浓度悬浮细胞的阻抗测量实验中，如果需要在短时间内获得稳定的阻抗测量结果，则应该在检测腔室内添加少量的细胞悬液，这样原本在培养液中均匀分布的细胞从顶部沉淀至底部电极附近的时间较短，阻抗趋于稳定值的时间也较短；如果需要更显著的区分不同浓度的细胞，则应该添加更多的细胞悬液，这样最终沉淀在电极附近的细胞数量也越多，不同浓度之间的阻抗差距更为明显。
为了在不同浓度的细胞之间获得更大的阻抗差异以及保持实验条件的一致，选择在检测腔室中添加200μl不同浓度的细胞。
取一份足量的细胞悬液，在实验开始时以及实验结束时使用自动细胞计数仪分别测量其细胞浓度(时间间隔约7.5h)，测得的结果如表1-1、1-2。
表1-1实验开始时Jurkat细胞浓度
表1-2实验结束时Jurkat细胞浓度
在显著性检验中，比较两组的活细胞浓度可知P-value＝0.13>0.05，因此两者差异不具有显著性；对比两者的活细胞浓度平均值，分别为3.81×106cells/ml和3.61 ×106cells/ml，也不具有显著差异。因此可以认定在整个实验过程中预先配置的细胞浓度始终都保持稳定。
在此基础上，为了能够更好地区分不同浓度细胞之间的阻抗差异以及统一实验条件，在检测腔室中添加200μl不同浓度的细胞并测量阻抗变化，实验步骤同上，测量持续约48min，得到阻抗变化曲线如图3。在这一组实验中，使用的最大浓度为7.8×106cells/ml，因为在实际培养过程中悬浮细胞浓度一般不会超过4.0×106cells/ml，并且当细胞浓度过高时(超过1.0×107cells/ml)，细胞间的相互抑制作用明显，培养液内细胞会大量死亡。
从图3中可以看出，当细胞浓度大于2.0×105cells/ml时，稳定后阻抗值随细胞浓度提高而明显提高；而细胞浓度小于2.0×105cells/ml时，阻抗基本和无细胞的对照组相当。在加液量相同的前提下，不同细胞浓度阻抗达到较为稳定的时间也比较接近。
为了建立细胞浓度与阻抗值之间的关系，选定一个时间点处(本实施例以40min为准)的阻抗值作为对应浓度的阻抗值，得出阻抗与细胞浓度的关系，如图4。图中共8个点表示不同细胞浓度对应的阻抗，其中空心的两个点细胞浓度分别为5.0×104、1.0×105cells/ml，实心的六个点细胞浓度分别为2.0×105、 5.0×105、1.0×106、1.9×106、3.8×106、7.8×106cells/ml。可以看出，低浓度时，阻抗值随细胞浓度变化并不明显。因此主要探究2.0×105cells/ml至7.8×106 cells/ml浓度范围内的细胞与阻抗之间的关系。
从2.0×105cells/ml开始，阻抗值与细胞浓度的对数呈线性关系，由此得到拟合曲线如图4。在这个范围内，拟合得到的R2＝0.9534，证明了线性函数的拟合优度较强。因而在实际测量应用中，可以通过这个阻抗与细胞浓度的关系推算添加的悬浮细胞浓度，进而算出具体的悬浮细胞数目。
实施例1：
本实施例为单一浓度悬浮细胞计数方法。具体计数方法如下：将基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；取待测的悬浮细胞样本，在其中一个检测腔室中添加200μl待测的有细胞培养液，在另一个检测腔室内部添加无细胞的培养液，测量添加后各自的阻抗变化，并将有细胞检测腔室内阻抗变化和无细胞参考检测腔室内阻抗变化绘制成图像(如图5)。具体是，分别测量对应的测量电极以及共地电极，细胞沉淀在电极上使得阻抗上升，通过对比有细胞测量电极与无细胞测量电极的阻抗差值，可以计算出液体中的细胞数量。
比较有细胞及无细胞情况下阻抗变化图可以看出，检测腔室添加细胞后，细胞的粘附、延伸和增殖，以及一段时间的培养后代谢产物堆积和养分消耗减少引发的细胞死亡脱落等细胞活动都会带来显著的阻抗变化，相对的，仅添加培养液而无细胞的检测腔室，在整个测量过程中的阻抗除了刚开始阶段略有下降外，其余时间都基本稳定。由此说明基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片能够体现细胞活动所带来的阻抗变化，从而根据测得的阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
实施例2：
本实施例为多种不同浓度悬浮细胞数量进行计数。对于多种不同浓度细胞溶液同样可以根据测量其阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
将无细胞培养液和2.28×106、3.8×106、7.6×106cells/ml的细胞溶液，分别添加在不同的检测腔室中，测量其阻抗相对变化。
具体的实验步骤如下：第一步，将基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；
第二步，取待测的不同浓度悬浮细胞样本各200μl，分别添加至不同的检测腔室进行测量；
第三步，静置后分别测量不同浓度细胞对应的电极间阻抗；连续测量记录阻抗变化，直至阻抗发生明显下降为止，此时细胞死亡脱落成为主要的细胞活动，从添加细胞到阻抗明显下降，作为一个完整的实验过程。从而得到不同浓度细胞阻抗相对变化图(见图6)，从而根据测得的阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
实施例3：
该实施例为同一浓度的不同加液量的待检测悬浮细胞的细胞数量。具体操作为：将基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；
分别在检测腔室内添加60、100、200μl 3.8×106cells/ml细胞，静置后分别测量对应的电极间阻抗；得出相应的阻抗变化曲线(见图7)，直接换算得到悬浮细胞数量。
从图7中可以看出，不同的加液量之间初始阶段的阻抗值非常接近，加液量越大，则所有细胞从最顶部沉淀至最底部的时间也越长，最终沉淀的细胞数量也越多，所以阻抗曲线趋于稳定的时间以及稳定后的阻抗值都随之明显增加。
电阻抗法估测悬浮细胞浓度的方法，与血球计数板相比，无需人工在显微镜下计数，尤其在几个检测腔室并行的情况下还可以一次性测量多个对象，省时省力；与自动细胞计数仪相比，它操作简单、成本低廉并且无需消耗一次性检测芯片。
Claims (10)
1.一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，其特征在于：包括绝缘基底(1)和等离子键和在绝缘基底(1)上的细胞容器(2)，所述的绝缘基底(1)上均布有电极测量区(3)，所述的电极测量区(3)的一端设置有对应的测量电极(4)，所有的电极测量区(3)的另一端分别连接有一个共地电极(5)；所述的细胞容器(2)上设置有与电极测量区(3)一一对应的检测腔室(6)，所述的电极测量区(3)处于检测腔室(6)的中心。
2.根据权利要求1所述的基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，其特征在于：所述的绝缘基底(1)为玻璃材料件，所述的细胞容器(2)为PDMS材料件。
3.根据权利要求1所述的基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片，其特征在于：所述的测量电极(4)为金材质双电极，所述的电极测量区(3)形状为叉指电极、双电极或大小环状电极。
4.一种权利要求1所述的基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)绝缘基底的加工：首先切割加工设定尺寸的绝缘基底用玻璃板材；再在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬和金，形成基片；然后在基片上通过刻蚀加工获得电极测量区及电极图形；
(2)细胞容器的加工，按照工业方法配制并硬化获得完整的PDMS，在PDMS上加工出与绝缘基底电极检测区对应的形状的检测腔室；
(3)将绝缘基底和细胞容器通过等离子体处理键和最后获得芯片，将细胞容器和绝缘基底需要黏连的一侧用等离子体轰击后贴合，放置在90℃加热炉上烘烤3h完成芯片的键合过程。
5.根据权利要求4所述的一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，其特征在于：步骤(1)中在玻璃板材表面通过金属溅射沉积的方式沉积铬的厚度为15nm～25nm，金的厚度为150nm～250nm。
6.根据权利要求4所述的一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，其特征在于：步骤(1)中电极测量区及电极图形的加工步骤：(1)清洗基片，将镀金玻璃基片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在金膜表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)刻蚀，金膜用KI-I2溶液刻蚀，金和玻璃基底的铬用铬刻蚀液刻蚀；
(6)去除感光胶，将芯片260℃烘烤一小时，剥除剩余的感光胶；
(7)获得电极测量区及电极图形。
7.根据权利要求4所述的一种基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的制作方法，其特征在于：步骤(2)中检测腔室的制作：(1)选择并清洗硅单晶圆片，将硅单晶圆片用乙醇及去离子水冲洗后用氮气吹干，在加热炉上80℃加热20分钟蒸干水分；
(2)涂覆感光胶，将正性光刻胶通过匀胶机旋转涂覆在硅单晶圆片表面，前烘处理固定感光胶；
(3)曝光，将准备好的掩膜紧贴在感光胶表面，采取接触式曝光的方式进行紫外曝光，曝光之后后烘处理固定图案；
(4)显影，用显影液浸泡感光胶直至掩膜上的图案出现，取出用酒精、去离子水洗净；
(5)浇注PDMS，将配置好的PDMS浇注在硅单晶圆片表面，根据所需的培养室厚度调节相应的浇注深度；
(6)剥离获得PDMS腔室，将浇注PDMS后的硅圆片在加热炉上80℃加热1.5h，使PDMS硬化，剥离后获得检测腔室。
8.一种利用权利要求1所述的基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、将基于阻抗的悬浮细胞计数芯片放置于水平桌面并将其检测电极通过导线经金属夹片与阻抗分析仪相连；
S2、取待测的悬浮细胞样本，添加至其中一个检测腔室作为测量；或者取不同浓度待测的悬浮细胞样本，分别添加至不同的检测腔室进行测量；或者取同一浓度的不同加液量的待检测悬浮细胞，分别添加至不同的检测腔室进行测量；
S3、静置后，分别测量对应的测量电极以及共地电极间阻抗；
S4、根据测得的阻抗值，直接换算得到悬浮细胞数量。
9.根据权利要求8所述的一种利用基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，其特征在于：步骤S2中还可以在其中一个检测腔室内部添加无细胞的培养液作为对照，同时测量该检测腔室对应的测量电极以及共地电极间阻抗，作为对照。
10.根据权利要求8所述的一种利用基于电阻抗的悬浮细胞计数芯片的计数方法，其特征在于：所述的阻抗分析仪还连接有一上位机，并通过上位机直接编写LabVIEW程序控制以及记录阻抗数据，并直接换算得到悬浮细胞数量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181211 |
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