KR101729489B1 - 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법 - Google Patents

전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 바이오 센서는 기판과, 적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자와, 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커와, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하는 서열을 갖고 상기 제1 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커와, 상기 기판 상에 형성되고 상기 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 하나가 각각 고정된 적어도 2개의 금속 전극을 포함한다. 본 발명에 따르면 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 구현할 수 있다.

Description

전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법{Biosensor utilizing conductive particles and the combination of polynucleotides corresponding to conductive particles, and method for detecting electric signal using the same}
본 발명은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 민감하면서도 특이도가 높게 검출하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 민감하면서도 특이도가 높게 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위한 다수개의 프로브들을 마이크로어레이한 후 여러 개의 형광 스팟을 스캔하여 각각 분석해야 하는 종래의 마이크로어레이 칩 방식의 검출문제를 해결하기 위한 것으로서, 전술한 바와 같은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합 그리고 특이적으로 상보적인 다수개의 폴리뉴클레오티드들의 조합들을 이용하면 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 간단하게 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
DNA 칩과 마이크로플루이딕스 칩과 같은 바이오 칩은 유전자 정보 및 단백질 정보를 대량으로 그리고 자동화하여 분석할 수 있거나, 생리활성물질의 존재여부 및 기능을 비교적 간단하고 신속하게 분석할 수 있는 장치이다. 따라서, 바이오 칩은 유전자 및 단백질 연구분야, 의약분야, 농업, 식품, 환경 및 화학산업 등 다양한 분야에서 응용이 활발하게 이루어지고 있다.
DNA 칩은 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 프로브를 사전에 제작하여 유리 슬라이드에 마이크로어레이 장비를 이용하여 집적한 칩으로서, 표적 폴리뉴클레오티드를 형광물질이 표지된 특이적 프라이머를 이용하여 증폭한 후 증폭 산물을 DNA 칩에 혼성화시키고 스캐너로 형광신호를 분석하여 시료 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 및 서열변이 등을 분석하는데 사용된다.
생체 바이오 칩 또는 랩온어칩(Lab-on-a-chip)이라고도 불리는 마이크로플루이딕스 칩은 미량의 분석대상물질(DNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등)을 칩 내의 챔버로 흘려보내면서 칩 내의 각종 생리활성물질의 반응양상을 분석하는 칩이다. 이러한 생체 바이오 칩은 전술한 DNA 칩에 비해 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인할 수 있기 때문에 의료진단분야에서 활용도가 높다.
예를 들어, 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 전기적으로 검출하는 마이크로플루이딕스 칩은 티올기가 부착된 프라이머를 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 금속 전극 표면에 고정한 후 PCR 증폭을 반응 챔버 내에서 수행한 후 전기적 변화를 검출하고, 이를 통해 표적 폴리뉴클레오티드 증폭여부의 확인을 통해 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 분석할 수 있다.
즉, 생체 바이오 칩은 형광이 아닌 전기적 신호를 이용하여 하이브리드 형성 여부 내지는 생리활성물질(예를 들어, DNA)의 존재 및 반응 여부를 검출할 수 있어 장치의 소형화와 검출 편의성의 관점에서 유리하다.
이와 관련하여 한국공개특허공보 제10-2004-0042021호에서는 생체 바이오 칩의 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 측정하거나 칩 챔버 내에서 생리활성물질들 간의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 전극이 감지하여 이를 전기적으로 검출하는 방식을 개시하고 있다. 즉, 종래의 바이오 칩에서는 생리활성물질의 반응에 따른 임피던스의 변화를 바이오 칩에 제공된 바이오 센서 전극이 감지하여 반응 유무 및 특정 생리활성물질의 존재 여부를 판단하는 방식을 채택하고 있다. 따라서, 종래의 바이오 칩의 신뢰성을 확보하기 위해서는 바이오 센서 전극에서 임피던스값 변화의 정밀한 감지가 중요하다.
그러나, 이러한 종래기술의 바이오 칩은 바이오 칩 내의 반응 챔버에 수용되는 완충용액에 의한 검출 재현성 문제와, 센싱 금속 전극으로의 비특이적 흡착 문제로 정확한 임피던스의 변화를 감지하기가 어려운 단점이 있다. 또한, 종래의 바이오 칩은 주파수 대역별로 교류를 인가하고 반응 전후에 있어 임피던스의 변화를 측정하여 대비하는 방식을 이용하는데, 반응 전후에 있어서 임피던스 변화를 보이는 교류의 주파수 대역과 임피던스 변화를 보이지 않는 교류의 주파수 대역이 존재하기 때문에 다양한 주파수 대역 별로 반응 전후에 임피던스를 측정해야 하는 불편과 이에 따른 분석의 어려움이 수반된다.
따라서, 바이오 칩의 전극에 프라이머나 프로브와 같은 올리고뉴클레오티드를 고정하고 PCR 반응이나 혼성화 반응을 진행시킨 후 올리고뉴클레오티드가 고정된 센싱 전극 사이에 직류 또는 교류 전원을 인가하여 직류 또는 교류 전류값이나 저항값의 변화를 곧바로 검출하는 것이 간편하면서도 이상적인 방법이다. 그러나, 전술한 바와 같은 PCR 반응이나 혼성화 반응에 사용되는 완충용액 문제, 복잡한 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응 문제는 전기적 검출 방식의 신뢰도를 떨어뜨리고 상용화를 어렵게 하고 있는 실정이다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0590546호에서는 증폭반응 챔버 내에 마련된 전극 표면에 프라이머 세트 중 제1 프라이머를 고정시키고, 나노입자가 표지된 제2 프라이머를 PCR 반응액에 첨가하고 전극 표면에서 PCR을 수행하여 PCR 증폭 여부를 측정할 수 있다는 내용을 개시하고 있다. 그러나 상기 대한민국 등록특허 제10-0590546호는 여전히 교류를 인가하여 임피던스를 측정하여 PCR 증폭산물을 검출하고 있어 골드 나노입자를 사용한 점 이외에는 종래기술과 크게 다른 점이 없고, 특히 골드 나노입자 간의 전기적 연결에 관한 기술적 수단이 없어 실제 재현여부가 불가능한 기술로서 생각되고 있다. 또한, 상기 종래기술에서는 제2 프라이머와 결합된 고가의 골드 나노입자가 측정하고자 하는 PCR 증폭산물의 종류별로 별도로 제작되어야 하는 불편과 비용증가의 문제점이 있다. 즉, 상기 종래기술은 PCR 증폭산물의 종류별로 제2 프라이머가 달라지기 때문에 골드 나노입자의 개질과정이 복잡해 지고 비용이 증가하는 근본적인 문제가 있는 것이다.
한편, 골드 나노입자에 티올기로 개질된 올리고 뉴클레오티드를 부착시킨 후 이들 올리고 뉴클레오티드 사이의 단순한 상보적 결합에 의해 골드 나노입자들을 어셈블링하는 기술도 소개되고 있으나, 이러한 기술은 바이오 센서나 바이오 칩에 직접 적용이 어려운 기술로서 상용화에는 문제가 있었다. 또한, 골드 나노입자를 이용한 DNA의 전기적 검출에 관한 여러 종래기술들이 있으나, 이들 종래기술들은 센싱 금속 전극 간의 통전을 위해 골드 나노입자들을 기판 상의 프로브에 고정시키는 과정 이외에 은(Ag) 양이온과 하이드로퀴논의 반응에 의한 전자 발생 과정이 별도로 필요하거나(Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probe, Science 295, 1503 (2002)), 센싱 전극 간에서 골드 나노입자의 어셈블리를 위해 계속적으로 티올기를 공급하거나(Label-Free Electronic Dectection of DNA-Hybridization on Nanogapped Gold Particle Film, J. AM. CHEM. SOC. 2005, 127, 3280-3281), PNA 프로브를 사전에 이산화 실리콘 기판 상에 고정하는 과정(Electrical Detection of Oligonucleotide Using an Aggregate of Gold Nanoparticle as a Conductive Tag, Anal. Chem. 2008, 80, 9387-9394) 등을 요구하는 등 상용화를 위해서는 구현이 복잡하고 재현성도 떨어지는 문제점이 있었다.
이에 반해 전술한 마이크로어레이 칩으로도 불리는 DNA 칩은 마이크로플루이딕스 칩에서와 같은 전기적 검출 문제점은 발생하지 않지만, 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위해서는 다수개의 프로브들을 마이크로어레이한 후 여러 개의 형광 스팟을 스캔하여 각각 분석해야 하는 불편함과 각각의 형광 스팟의 강도에 대한 컷오프(cut off)값을 개별적으로 정해야 하므로 데이터의 처리가 어렵고 분석 결과의 신뢰도가 떨어지는 문제점이 있었다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 마이크로어레이 칩에서의 다수개의 형광 스팟 분석에 따른 문제점과 마이크로플루이딕스 칩에서의 전기적 변화의 검출 정확성 문제점을 모두 해결할 수 있는 새로운 기술의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
이에 본 발명자는 전술한 바와 같은 종래기술들의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서로서, 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 고안하기에 이르렀다.
본 발명은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서로서 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 민감하면서도 특이도가 높게 검출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 민감하면서도 특이도가 높게 검출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위한 다수개의 프로브들을 마이크로어레이한 후 여러 개의 형광 스팟을 스캔하여 각각 분석해야 하는 종래의 마이크로어레이 칩 방식의 검출문제를 해결하는데 그 목적이 있는 것으로서, 전술한 바와 같은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합 그리고 특이적으로 상보적인 다수개의 폴리뉴클레오티드들의 조합들을 이용하면 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 간단하게 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용한 검출 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "전도성 입자"는 금속 전극 사이의 통전을 위해 전기 전도도가 우수한 입자로서, 대응하는 폴리뉴클레오티드 링커와의 상보적 결합을 위한 올리고뉴클레오티드로 개질가능한 전도성 입자를 포함한다. 예를 들어, 골드 나노입자, 실버 파티클, 크롬 파티클, 구리 파티클, 알루미늄 파티클, 산화철 나노입자, 자성 비드 또는 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등과 같이 전도성을 갖는 당업계에 알려진 다양한 크기와 재질의 입자가 전도성 입자로서 사용될 수 있다. 즉, 전원을 인가하면 통전되어 저항값, 전류값 등의 변화를 가져올 수 있는 입자라면 어느 것이라도 전도성 입자로서 사용이 가능하다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드 링커"란 대응하는 전도성 입자에 한쪽 말단이 결합된 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖고, 또한 나머지 서열은 조합을 이루는 다른 폴리뉴클레오티드 링커와 특이적으로 결합하여 금속 전극들 사이에서 전도성 입자들의 연속적인 연결을 허용하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 링커는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브일 수 있고 다른 폴리뉴클레오티드 링커는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 링커들 중 일부는 금속 전극 표면에 고정될 수 있고, 이때 금속 전극 표면에 고정되는 폴리뉴클레오티드 링커는 한쪽 말단이 티올기와 같은 기능기로 개질될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "표적 폴리뉴클레오티드"란 시료 내에서 검출하고자 하는 단일 사슬 또는 이중 사슬의 DNA 또는 RNA로서 단일염기다형성 또는 유전자형 분석에 사용되는 특이적인 염기서열 부분을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서는,
기판과,
적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와,
상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 상보적이지 않으면서 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자와,
상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커와,
상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖고 상기 제1 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커와,
상기 기판 상에 형성되고 상기 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 하나가 각각 고정된 적어도 2개의 금속 전극을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열과 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열이 서로 특이적으로 결합하는 경우 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하게 된다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예의 바이오 센서에서는 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 연결되고, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커에 연결되며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극에서 폴리뉴클레오티드 링커들과 전도성 입자들의 연속적인 연결을 통한 적어도 2개의 금속 전극 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하게 되는 것이다.
반면에, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 결합하지 않는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극 사이의 통전이 이루어지지 않아 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 오프(OFF) 신호로서 출력하게 되는 것이다.
따라서, 본 발명의 일실시예의 바이오 센서는 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)가 특이적으로 결합하는지 여부에 따라 입력된 전기적 신호에 대한 출력신호의 온 오프 값을 결정할 수 있어 AND 게이트 개념의 센서로서 활용할 수 있게 된다. 이를 모식적으로 나타내면 다음의 수학식 1과 같다:
수학식 1
Figure 112011017644075-pat00001
L1과 L2의 서열이 특이적으로 결합하면 L1=1, L2=1이고 출력값인 Q=1;
L1과 L2의 서열이 결합하지 않으면 L1=1, L2=0이고 출력값인 Q=0.
하나의 일례로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브일 수 있고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하기로는 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 서열은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 일부 서열과 특이적으로 결합할 수 있다. 이 경우, 상기 적어도 2개의 금속 전극에는 직류 또는 교류전원을 인가하여 저항값의 변화 또는 전류값의 변화를 측정하여 표적 폴리뉴클레오티드의 시료 내 존재여부를 전기적으로 검출할 수 있다.
전술한 예에서는 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)의 1개 조합을 구성하여 1개의 프로브에 의해 1개의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 경우를 설명하고 있지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커들의 다수개의 조합을 설계하여 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 검출하는 것을 배제하는 것이 아님은 물론이다.
한편, 본 발명은 직류전원의 인가에 한정되는 것이 아니고, 종래와 같이 교류전원을 이용할 수 있음은 물론이다.
한편, 상기 금속 전극에 고정되는 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 한쪽 말단이 티올기와 같은 기능기로 개질된 후 상기 금속 전극에 고정될 수 있다. 또한, 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 전도성 입자 부착을 위한 티올기와 같은 기능기로 개질된 후 각각 상기 제1 전도성 입자 및 상기 제2 전도성 입자에 결합된다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 제1 전도성 입자 및 제2 전도성 입자는 골드 파티클, 실버 파티클, 크롬 파티클, 구리 파티클, 알루미늄 파티클, 산화철 나노입자, 자성 비드 또는 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 있어서, 상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE 형태로 한정되는 것이 아니라 플러스의 전원이 인가되는 (+) 전극과 마이너스의 전원이 인가되는 (-)전극으로만으로도 형성할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 금속 전극의 폭은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 2μm ∼ 4μm이고, 상기 금속 전극 사이의 간격은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 700nm ∼ 2μm이다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 금속 전극은 금, 크롬, 구리 또는 알루미늄으로 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 그리고 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 서로 상보적인 서열의 조합을 적절히 선택하여 다양한 제1 폴리뉴클레오티드 링커, 제2 폴리뉴클레오티드 링커, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서는 단일 기판 형태의 바이오 칩으로 제작될 수 있으나, 두 개의 기판이 접합된 형태의 바이오 칩으로 제작될 수도 있다. 두 개의 기판이 접합된 형태의 본 발명의 바이오 칩의 일실시예는, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커가 고정된 적어도 2개의 금속 전극이 형성된 제1기판과, 상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함한다.
상기 제1 기판은 N형 또는 P형 실리콘 기판 상의 SiO2 절연층 위에 적어도 2개의 금속전극이 형성된 것으로서 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 특이적으로 결합하는지 여부에 따라 입력된 전기적 신호에 대한 출력신호를 내보낸다. 상기 제2 기판은 상기 제1 기판의 금속 전극이 외부 환경과 접촉되는 것을 방지하면서 상기 제1 기판과 결합하여 반응챔버 공간을 형성한다.
상기 기판들은 정사각형, 직사각형, 원형의 형상을 가질 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제1 기판은 실리콘 기판이고, 상기 제2 기판은 유리 기판인 것이 바람직하나, 이들 기판은 이외에도 유리, 실리콘 기판, 융합 실리카, 폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카보네이트, 금, 은, 구리, 또는 백금 중 어느 하나로 구성될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일실시예의 바이오 칩은 상기 제2 기판 상에 제3 기판이 적층되는 3단 방식의 바이오 칩으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법은,
(a) 적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 상보적이지 않으면서 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자를 준비하는 단계와,
(b) 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커를 준비하는 단계와,
(c) 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖고 상기 제1 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커를 준비하는 단계와,
(d) 반응 챔버 내에 위치하는 기판 상에 적어도 2개의 금속 전극을 형성하고 상기 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 하나를 상기 적어도 2개의 금속 전극에 각각 고정하는 단계와,
(e) 상기 반응 챔버 내에서 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 연결되도록 허용하고, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커에 연결되도록 허용하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열과 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열이 서로 특이적으로 결합하도록 허용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법은, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 결합하지 않는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 오프(OFF) 신호로서 출력하는 것을 특징으로 한다.
하나의 일례로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브일 수 있고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하기로는 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 서열은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 일부 서열과 특이적으로 결합할 수 있다. 이 경우, 상기 적어도 2개의 금속 전극에는 직류 또는 교류전원을 인가하여 저항값의 변화 또는 전류값의 변화를 측정하여 표적 폴리뉴클레오티드의 시료 내 존재여부를 전기적으로 검출할 수 있다.
전술한 예에서는 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)의 1개 조합을 구성하여 1개의 프로브에 의해 1개의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하는 경우를 설명하고 있지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커들의 다수개의 조합을 설계하여 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 검출하는 것을 배제하는 것이 아님은 물론이다.
한편, 본 발명은 직류전원의 인가에 한정되는 것이 아니고, 종래와 같이 교류전원을 이용할 수 있음은 물론이다.
한편, 상기 금속 전극에 고정되는 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 한쪽 말단이 티올기와 같은 기능기로 개질된 후 상기 금속 전극에 고정될 수 있다. 또한, 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 전도성 입자 부착을 위한 티올기와 같은 기능기로 개질된 후 각각 상기 제1 전도성 입자 및 상기 제2 전도성 입자에 결합된다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서, 상기 제1 전도성 입자 및 제2 전도성 입자는 골드 파티클, 실버 파티클, 크롬 파티클, 구리 파티클, 알루미늄 파티클, 산화철 나노입자, 자성 비드 또는 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서, 상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 있어서, 상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE 형태로 한정되는 것이 아니라 플러스의 전원이 인가되는 (+) 전극과 마이너스의 전원이 인가되는 (-)전극으로만으로도 형성할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서, 상기 금속 전극의 폭은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 2μm ∼ 4μm이고, 상기 금속 전극 사이의 간격은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 700nm ∼ 2μm이다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서, 상기 금속 전극은 금, 크롬, 구리 또는 알루미늄으로 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 그리고 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 서로 상보적인 서열의 조합을 적절히 선택하여 다양한 제1 폴리뉴클레오티드 링커, 제2 폴리뉴클레오티드 링커, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
본 발명에 따르면 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 구현할 수 있다.
특히, 본 발명의 바이오 센서를 이용하면 특정 시료 내에 존재하는 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드를 민감하면서도 특이도가 높게 전기적으로 검출할 수 있고, 궁극적으로는 종래 기술의 문제점인 완충용액 문제, 복잡한 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응 문제가 발생하여 전기적 검출 방식의 신뢰도를 떨어뜨리는 문제, 그리고 교류를 사용하여 임피던스의 변화를 측정하는 방식에서 나타나는 검출재현성 및 민감도 문제와, 교류 주파수 대역 설정과 관련한 문제점 및 불편을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명은 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위한 다수개의 프로브들을 마이크로어레이한 후 여러 개의 형광 스팟을 스캔하여 각각 분석해야 하는 종래의 마이크로어레이 칩 방식의 검출문제를 해결할 수 있다. 즉, 본 발명은 전술한 바와 같은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합 그리고 특이적으로 상보적인 다수개의 폴리뉴클레오티드들의 조합들을 이용하면 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 간단하게 검출할 수 있는 장점이 있는 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 올리고뉴클레오티드들에 의해 개질된 전도성 입자들을 준비하는 과정과, 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들을 준비하고 이중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드(제1 링커)를 금속전극들 각각에 고정하는 과정을 개략적으로 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지가 형성되는 과정을 설명하는 도면이다.
도 3은 도 2의 (c) 단계를 확대하여 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예의 IDE 형태의 금속 전극들을 도시한 평면도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 골드 나노입자와 금속전극들 사이의 SAM 반응(self-assembly reaction) 후, 골드 나노입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 골드 나노입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 골드 나노입자들의 연속적인 연결이 형성된 후에 촬영한 IDE(interdigitated electrode)의 FE-SEM 전자현미경 사진이다.
도 6은 도 5의 일부분을 확대하여 도시한 IDE(interdigitated electrode)의 FE-SEM 전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 있어서, 실리콘 기판(10)상에 산화절연막(12)을 사이에 두고 단순한 플러스 금속 전극(20a)과 마이너스 금속 전극(20b)이 형성된 경우를 도시하는 단면도이다.
도 8은 도 4에 도시된 바와 같은 플러스 단자에 양극 전원을 연결하고 마이너스 단자에 음극 전원을 연결한 후 500mV의 직류(DC)를 인가하여 측정한 전류값 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 바이오 센서를 이용하여 제작된 바이오 칩(200)의 단면을 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 올리고뉴클레오티드가 부착된 제1 및 제2 전도성 입자들의 준비
본 실시예에서는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서 적어도 2개의 금속 전극 사이에서 전도성 브릿지 형성을 위해 사용되는 적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 상보적이지 않으면서 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자를 준비한다(도 1의 (a) 참조). 본 실시예에서는 전도성 입자로서 골드 나노입자를 예로 들었으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 전도성을 갖는 나노입자라면 어느 것이라도 사용할 수 있음을 본 발명의 기술분야에 속하는 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
1) 우선, 골드 나노입자에 부착되는 아래의 같은 서열을 갖는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 티올로 개질한다.
① 제1 올리고뉴클레오티드 (G1):
5'-GTTGCCAT-3' (서열번호 3)
② 제2 올리고뉴클레오티드 (G2):
5'-AGTCGTTT-3' (서열번호 4)
제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 각각 후술하는 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 일부 서열 및 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 일부 서열과 역방향으로 상보적인(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임) 염기서열(서열번호 3 및 서열번호 4)을 결정한 후 티올기를 3'말단에 부착하여 개질된 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드로 제작한다. 그런 다음, 이들 올리고뉴클레오티드를 DTT(Dithiothreitol)로 환원 처리하여 이들 올리고뉴클레오티드 사이에 존재하는 이황화결합(disulfide bond)을 -SH기("-S-S-"→"-SH")로 전환시킴으로써 티올기의 기능기가 부착된 올리고뉴클레오티드를 수득한다. 한편, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 티올기 이외에도 다양한 나노입자 부착을 위한 기능기, 예를 들어 전도성 폴리머와 같은 기능기로 개질될 수 있다.
2) 상업적으로 입수가능한 직경 13nmm의 골드 나노입자 콜로이드(골드 클로라이드 농도 0.01%, 용량 100ml; 영국에 소재하는 BBInternational로 부터 구입) 450㎕를 상기 1)번 과정에서 티올로 개질되고 최종 농도가 1μM로 조정된 각각의 올리고뉴클레오티드(제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드) 50㎕와 혼합하여 전체 부피가 500㎕가 되도록 한다. 그리고, 2가지 혼합용액 각각을 25℃에서 24시간 동안 인큐베이션하면서 100rpm으로 지속적으로 교반하여 골드 나노 입자 콜로이드에 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 고정화시킨다.
3) 그리고 나서, 상기 2)번 과정이 완료된 2가지 혼합용액 각각에 2×농도의 에이징 버퍼(Aging Buffer)(0.1M Nacl + 0.01M 소듐 포스페이트) 500㎕를 첨가하고 실온에서 40시간 동안 인큐베이션한다. 또한, 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate)와 1M NaCl로 이루어진 SPSC 버퍼(pH 6.5)로 씻어내어 골드 나노입자에 비-공유적으로 결합된 올리고뉴클레오티드들을 제거한다.
4) 상기 3)번 과정을 통해 얻은 2가지 혼합용액 각각을 30분 동안 16,100g로 원심분리한 후 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 부착된 골드 나노입자들을 침전시킨 다음 상층액을 제거하고, 재차 에이징 버퍼 500㎕를 첨가하여 혼합한다.
5) 상기 4)번 과정을 2회 반복하여 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 부착된 골드 나노입자들 (Au-나노입자 G1 또는 Au-나노입자 G2)을 수득한다.
6) 상기 5)번 과정에서 수득된 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 부착된 골드 나노입자들 (Au-나노입자 G1 또는 Au-나노입자 G2)에 에이징 버퍼 250㎕를 첨가하여 보관한다.
7) 본 실시예를 통해 수득된 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 부착된 골드 나노입자들(Au-나노입자 G1 또는 Au-나노입자 G2)의 혼합용액은 후술하는 실시예에서의 사용 전에 버퍼를 1X PBS 버퍼로 교체한 후 30분 동안 16,100g로 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음 1X PBS 버퍼 250㎕를 첨가한다. 그리고 이 과정을 1회 더 반복한 후 1X PBS 버퍼를 첨가하여 전체 용량을 250㎕로 맞춘다.
한편, 본 실시예에서는 전도성 입자의 일례로서 골드 나노입자를 사용하였지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 예를 들어 실버 파티클, 크롬 파티클, 구리 파티클, 알루미늄 파티클, 산화철 나노입자, 자성 비드 또는 내부에 산화철을 포함하는 폴리머 비드 등과 같이 전도성을 갖는 당업계에 알려진 다양한 크기와 재질의 입자를 사용할 수 있다. 즉, 전원을 인가하면 통전되어 저항값, 전류값 등의 변화를 가져올 수 있는 입자라면 어느 것이라도 사용이 가능하다.
실시예 2 : 제1 폴리뉴클레오티드 링커(제1 링커) 및 제2 폴리뉴클레오티드 링커(제2 링커) 등의 준비
본 실시예에서는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서에 있어서 적어도 2개의 금속 전극 사이에서 전도성 브릿지 형성을 위해 사용되는 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(서열번호 3)와 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커(서열번호 1)와, 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드(서열번호 4)와는 상보적으로 결합하는 서열을 갖고 제1 올리고뉴클레오티드(서열번호 3)와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커(서열번호 2)를 준비한다(도 1 참조).
1) 우선, 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 5'말단 부분은 실시예 1에서 설명한 제1 올리고뉴클레오티드의 염기서열(서열번호 3)과 역방향으로 상보적인(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임) 염기서열을 갖도록 설계하고, 또한 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 5'말단 부분은 실시예 1에서 설명한 제2 올리고뉴클레오티드의 염기서열(서열번호 4)과 역방향으로 상보적인(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임) 염기서열을 갖도록 설계한다.
2) 그런 다음, 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 나머지 염기서열과 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 나머지 염기서열은 서로에 대해 역방향으로 상보적(즉, 5'-3' 방향을 기준으로 할 때 서로 엇갈리게 상보적임)이 되도록 결정한 후 최종적으로 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 염기서열(서열번호 1)과 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 염기서열(서열번호 2)을 결정하여 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 제2 폴리뉴클레오티드 링커를 제작한다. 필요에 따라 제작된 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 당업계에 널리 알려진 클로닝 기법이나 PCR 증폭방법을 이용하여 증폭할 수 있다. 예를 들어, PCR 반응 수행은 Promega의 PCR Core System Ⅱ PCR 키트(PCR 반응을 간편하게 수행하기 위해 판매하는 PCR 반응 용액; 미국 Promega사 제품)와 제1 폴리뉴클레오티드 링커 및 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 템플리트 DNA를 이용하여 이루어질 수 있다.
3) 이와 같이 제작된 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 염기서열은 다음과 같다. 밑줄친 부분은 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 염기서열 부분이다.
① 제1 폴리뉴클레오티드 링커 (L1):
5'-ATGGCAACTATACGCGCTAG-3' (서열번호 1)
② 제2 폴리뉴클레오티드 링커 (L2):
5'-AAACGACTCTAGCGCGTATA-3' (서열번호 2)
4) 하나의 일례로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브일 수 있고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 한편, 본 발명은 전술한 바와 같은 염기서열에 제한되는 것이 아니며 서로 상보적인 서열의 조합을 적절히 선택하여 다양한 제1 폴리뉴클레오티드 링커, 제2 폴리뉴클레오티드 링커, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다. 본 실시예에서는 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)의 1개 조합을 구성하여 1개의 프로브에 의해 1개의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 경우를 설명하고 있지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커들의 다수개의 조합을 설계하여 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 검출하는 것을 배제하는 것이 아님은 물론이다.
5) 그리고, 반응 챔버 내에 자유롭게 존재하는 제1 폴리뉴클레오티드 링커 뿐만 아니라 후술하는 금속 전극에 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 고정될 필요가 있다(도 1의 (b) 참조). 금속 전극에 고정되는 제1 폴리뉴클레오티드 링커는, 예를 들어 링커의 3' 말단에 PEG(폴리에틸렌글리콜) 또는 탄소사슬(-CH2-)의 스페이서를 결합시키고 다시 그 말단에 티올(thiol)기와 같은 기능기를 결합시킨 후, 티올기를 이용한 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)를 바이오 센서 내에 형성된 금속 전극 표면에 고정시킨다. 당업계에 널리 알려진 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 웨이퍼 상에 IDE 형태 또는 단순한 (+) 전극과 (-)전극을 형성하고 이 위에 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 3' 말단을 고정한다. 이러한 금속 전극 형성과 폴리뉴클레오티드의 금속 전극 고정은 당업자라면 공지된 기술에 따라 용이하게 실시할 수 있다(대한민국 등록특허 제10-0969667호 및 제10-0969671호 등 참조). 이에 대한 내용은 후술하도록 한다.
6) 한편, 본 발명의 바이오 센서는 전술한 바와 같이 제1 폴리뉴클레오티드 링커가 제2 폴리뉴클레오티드 링커와 특이적으로 결합하게 되면 후술하는 기판 상에 형성된 금속 전극에 인가되는 입력 전기신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 바이오 센서를 이용하면 특정 시료 내에 존재하는 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드를 민감하면서도 특이도가 높게 전기적으로 검출할 수 있고, 궁극적으로는 종래 기술의 문제점인 완충용액 문제, 복잡한 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응 문제가 발생하여 전기적 검출 방식의 신뢰도를 떨어뜨리는 문제, 그리고 교류를 사용하여 임피던스의 변화를 측정하는 방식에서 나타나는 검출재현성 및 민감도 문제와, 교류 주파수 대역 설정과 관련한 문제점 및 불편을 해결할 수 있다.
실시예 3: 금속 전극 및 바이오 센서의 제작
본 발명의 일실시예에서 사용되는 바이오 센서는 당업계에 알려진 일반적인 방법을 이용하여 제작하는데, 산화 실리콘 박막 형성 기술, 포토리소그래피(photolithography)기술, 노광 패너팅 기술, 현상 기술, 습식 및/또는 건식 에칭 기술 등을 사용하여 제작한다. 그리고, MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 기판 상에 IDE(Interdigitated Electrode) 형태의 금속 전극을 형성한 후, 실시예 2에서 설명한 바와 같은 고정용 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)를 금속 전극에 고정하는 방식으로 제작된다(도 2의 (a) 및 (b) 단계 참조). 본 발명의 일실시예에서 사용되는 바이오 센서 및 이를 포함하는 바이오 칩은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 당업자라면 용이하게 제작할 수 있으므로 그 상세한 설명을 생략한다(대한민국 등록특허 제10-0969667호 및 제10-0969671호 등 참조).
도 4에는 후술하는 바이오 칩(200)을 구성하는 바이오 센서(100)의 평면도가 도시되어 있다. 도 4의 (a)에서 도시된 바이오 센서(100)는 IDE(interdigitated electrode) 형태의 금속 전극(20)과 이러한 IDE 형태의 금속 전극(20)의 양 단자(21a, 21b)에 전선이 연결되어 구성되어 있다.
도 4의 (b)는 도 4의 (a)에 도시된 IDE 형태의 금속 전극(20)과 양 단자(21a 21b)를 확대하여 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 4의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 IDE 형태의 금속 전극(20)은 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)이 서로 일정한 간격을 두고 엇갈리게 배열되어 있다. 그리고, 포지티브 전위가 인가되는 플러스 단자(21a)에 IDE 금속 전극(20)의 플러스 금속 전극들(20a)이 분기되어 전기적으로 연결되어 있고, 네거티브 전위가 인가되는 마이너스 단자(21b)에 IDE 금속 전극(20)의 마이너스 금속 전극들(20b)이 분기되어 전기적으로 연결되어 있다.
한편, IDE 형태의 금속전극의 면적은 약 1㎛ ×1㎛에서 수백 ㎛ ×수백 ㎛의 면적일 수 있고, 제1 폴리뉴클레오티드 링커 및 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 양과 올리고뉴클레오티드에 의해 개질된 전도성 입자들의 양에 맞추어 전체 IDE의 면적을 선정할 수 있다.
도 4의 (c)에는 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)을 일부 확대한 것이 도시되어 있다. 각 금속 전극(20a, 20b) 폭(t)은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 2μm ∼ 4μm이고, 금속 전극 사이의 간격(d)은 대략 10nm ∼ 100μm일 수 있으며 바람직하기로는 대략 700nm ∼ 2μm이다. 후술하는 실험에서는 정량적 분석을 위해 IDE 형태의 금속 전극의 면적을 약 500㎛ ×500㎛으로 하고, 금속 전극 사이의 간격(d)은 약 1.7μm 그리고 각 금속 전극의 폭(t)은 약 4μm로 하였다.
한편, 도 5에는 도 4의 금속전극들과 골드 나노입자들 사이의 SAM 반응(self-assembly reaction) 후, 골드 나노입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 골드 나노입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 골드 나노입자들의 연속적인 연결이 형성된 후에 촬영한 IDE(interdigitated electrode)의 FE-SEM 전자현미경 사진이 도시되어 있고, 도 6에는 도 5의 일부분을 확대하여 도시한 IDE(interdigitated electrode)의 FE-SEM 전자현미경 사진이 도시되어 있다. 도 5 및 도 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 바이오 센서에서는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결이 형성되는 것을 알 수 있다.
도 7에는 실리콘 기판(10)상에 산화절연막(12)을 사이에 두고 단순한 플러스 금속 전극(20a)과 마이너스 금속 전극(20b)이 형성된 경우가 도시되어 있다.
또한, 도 4 및 도 7에 도시된 금속 전극(20a, 20b) 상에는 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)가 고정된다. 즉, 전술한 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)(서열번호 1)의 3' 말단에 PEG(폴리에틸렌글리콜) 또는 탄소사슬(-CH2-)의 스페이서를 결합시키고 다시 그 말단에 티올(thiol)기와 같은 기능기를 결합시킨 후, 티올기를 이용한 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)를 플러스 금속 전극들(20a) 및 마이너스 금속 전극들(20b) 표면에 고정시킬 수 있다. 이러한 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 금속 전극 고정은 당업자라면 공지된 기술에 따라 용이하게 실시할 수 있으므로 그 상세한 설명을 생략한다(대한민국 등록특허 제10-0969667호 및 제10-0969671호 등 참조).
한편, 티올기 외에도 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 전도성 폴리머를 결합시킨 후, 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 결합되어 있는 전도성 폴리머를 공지된 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 금속 전극 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 전도성 폴리머로는 공지된 전도성 폴리머가 모두 사용될 수 있으며, 예를 들어, 특히 고전도성 폴리머인 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 폴리(p-페닐렌) (Poly(p-phenylene): PPP), 폴리피롤(Polypyrrole: PPy), 폴리아닐린(Polyaniline), 폴리티오펜(Polythiophene) 등이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머와 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)는 폴리머와 DNA간의 공지된 결합방법을 이용하여 결합시킬 수 있다.
실시예 4: 바이오 칩의 제작
한편, 도 4에 도시된 바와 같은 금속 전극(20a, 20b)들과 이러한 금속 전극(20a, 20b)에 고정된 제1 폴리뉴클레오티드 링커(22)를 이용하여 반응 챔버 공간(46)을 갖는 전극 어레이형 바이오 칩(200)을 구성할 수 있다. 그 일례가 도 9에 도시되어 있다. 이러한 형태의 전극 어레이형 바이오 칩(200)의 제작은 전술한 바와 같은 공지기술을 이용하여 제작할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
도 9에는 유리 웨이퍼(30)를 사이에 두고 상부 전극이 형성된 실리콘 기판(10a)과 하부 전극이 형성된 실리콘 기판(10b)이 접합된 3단 구조의 바이오 칩이 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 예를 들어 실리콘기판(10)이 직접 결합된 2단 구조의 바이오 칩, IDE 전극이 형성된 챔버를 갖는 바이오 칩 등을 포함할 수 있다.
도 9에 도시된 바이오 칩(200)은 상부 전극이 형성된 실리콘 기판(10a)과 하부 전극이 형성된 실리콘 기판(10b)이 삼차원적으로 서로 마주 보는 구조로 되어 있다. 상기 바이오 칩(200)에서 상부 실리콘 기판(10a) 및 하부 실리콘 기판(10b) 상에는 각각 상부 금속 전극 및 하부 금속 전극이 형성되어 있다. 상부 금속 전극 및 하부 금속 전극은 각각 산화절연막(12a, 12b)을 사이에 두고 실리콘 기판(10a, 10b)상에 형성되어 있고, 포지티브 전위가 인가되는 플러스 단자(미도시)에 전기적으로 연결되는 플러스 금속 전극들(20a)과, 네거티브 전위가 인가되는 마이너스 단자(미도시)에 전기적으로 연결되는 마이너스 금속 전극들(20b)로 구성되어 있다.
한편, 도 9에 도시된 바와 같이, 상부 실리콘 기판(10a)은 유리 웨이퍼(30)에 의해 일정한 거리를 두고 하부 실리콘 기판(10b)과 접합되어 반응 챔버 공간(46)을 형성한다. 상기 반응 챔버 공간(46)은 반응 용액(완충용액, 선택적으로 라이게이즈와 같은 효소 포함), 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1), 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2) 또는 검출 대상 시료, 제1 올리고뉴클레오티드(G1)가 결합된 제1 전도성 입자 및 제2 올리고뉴클레오티드(G2)가 결합된 제2 전도성 입자가 수용되어 어닐링 반응 등이 수행되는 공간이다. 상부 실리콘 기판(10a)에는 두께 방향으로 유체 유입구(36a)가 관통되어 형성되어 있으며, 상기 유체 유입구(36a)에 대향하는 위치에 두께 방향으로 유출구(36b)가 관통되어 형성되어 있다. 상기 유입구(36a)와 상기 반응챔버(46), 그리고 상기 유출구(36b)와 상기 반응챔버(46)는 유체가 유동될 수 있도록 연통되어 있다. 상기 유입구(36a)를 통해 반응 용액, 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1), 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2) 또는 검출 대상 시료, 제1 올리고뉴클레오티드(G1)가 결합된 제1 전도성 입자, 제2 올리고뉴클레오티드(G2)가 결합된 제2 전도성 입자, 세척용액 등이 유입되고 상기 유출구(36b)를 통해 반응 용액, 반응 후 용액, 세척용액 등이 유출된다.
실시예 5: 어닐링 반응 수행 및 전기적 신호의 검출
1) 도 2의 (b) 내지 (d)에서는 본 실시예에서 수행되는 혼성화(어닐링) 반응을 개략적으로 설명하고 있다. 도 3에서는 도 2의 (c) 과정을 확대하여 도시하고 있다.
2) 예를 들어, 본 실시예에서는 실시예 3 및 실시예 4에 따라 기판 상에 금속 전극(+) 및 금속 전극(-)을 형성하고(도 2의 (a)), 이러한 금속 전극들 상에 3'말단이 티올로 개질된 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)를 SAM 방법을 이용하여 고정한다(도 2의 (b)). 즉, 전술한 바와 같이 실시예 3 및 실시예 4에 따라 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)가 고정된 적어도 2개의 금속 전극과, 혼성화(어닐링) 반응 수행을 위한 반응 챔버 공간을 형성한 후 혼성화(어닐링) 반응을 수행한다(도 2 의 (c) 및 도 3 참조).
3) 그런 다음, 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1), 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2), 제1 올리고뉴클레오티드(G1)가 결합된 제1 전도성 입자 및 제2 올리고뉴클레오티드(G2)가 결합된 제2 전도성 입자를 반응 챔버 내로 도입하여, 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(서열번호 3)와 제1 폴리뉴클레오티드 링커(서열번호 1), 그리고 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드(서열번호 4)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(서열번호 2)가 아래와 같은 조건(표 1 및 표 2 참조)하에서 어닐링(혼성화)되도록 한다(도 2의 (c) 및 도 3 참조).
어닐링(혼성화) 반응 조건
과정 온도 시간
어닐링(혼성화) 25℃ 2시간
어닐링(혼성화) 용액 조성
성분 사용량 최종 농도
25mM MgCl2 12㎕ 3mM
5X 완충 용액 20㎕ 1X
폴리뉴클레오티드 링커들 및 올리고뉴클레오티드들이 결합된 전도성 입자의 콜로이드(0.01%) 65.5㎕
1% BSA 2.5㎕ 0.025%
총 계 100㎕
4) 상기와 같은 조건 하에서 어닐링 반응이 진행되면, 금속 전극에 고정된 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 5'말단 부분의 서열 5'-ATGGCAAC-3'과 제1 전도성 입자에 3'말단이 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(G1)의 서열 5'-GTTGCCAT-3'이 서로 엇갈리게 상보적으로 결합되어 연결되고, 상기 금속 전극에 고정된 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)에 연결된 제1 전도성 입자의 다른 제1 올리고뉴클레오티드(G1)의 서열 5'-GTTGCCAT-3'과 자유로운 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 5'말단 부분의 서열 5'-ATGGCAAC-3' 역시 서로 엇갈리게 상보적으로 결합되어 연결된다(도 2의 (d) 참조).
5) 또한, 자유로운 제2 전도성 입자에 3'말단이 결합된 제2 올리고뉴클레오티드(G2)의 서열 5'-AGTCGTTT-3'과 자유로운 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)의 5'말단 부분의 서열 5'-AAACGACT-3'이 서로 엇갈리게 상보적으로 결합되어 연결되고, 자유로운 제1 전도성 입자에 3'말단이 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(G1)의 서열 5'-GTTGCCAT-3'과 자유로운 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 5'말단 부분의 서열 5'-ATGGCAAC-3'이 서로 엇갈리게 상보적으로 결합되어 연결된다(도 2의 (d) 참조).
6) 그리고, 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(G1)와 상보적으로 결합된 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)의 3'말단 부분의 서열 5'-TATACGCGCTAG-3'이, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드(G2)와 상보적으로 결합된 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)의 3'말단 부분의 서열 5'-CTAGCGCGTATA-3'과 서로 특이적으로 결합하게 된다(도 2의 (d) 참조).
7) 따라서, 전술한 4)번, 5)번, 6번 과정을 대략 2시간 동안 상기 표 1 및 표 2의 조건 하에서 수행하면 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드(G1)가 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 연결되고, 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드(G2)는 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)에 연결되며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)가 서로 특이적으로 결합하여 적어도 2개의 금속 전극 사이에서 폴리뉴클레오티드 링커들과 전도성 입자들의 연속적인 연결을 통해 통전을 위한 전도성 브릿지를 형성하게 된다. 한편, 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate)와 1M NaCl로 이루어진 SPSC 버퍼(pH 6.5)로 씻어내어 비-공유적으로 결합된 올리고뉴클레오티드들과 폴리뉴클레오티드 링커들을 제거한다.
8) 상기 7)번의 반응이 끝난 후, 시린지 펌프를 이용하여 500㎕/분의 유속으로 PBS 완충용액을 반응 챔버에 흘려 보내어 반응하지 않은 전도성 입자인 골드 나노입자 콜로이드들과 폴리뉴클레오티드 링커들을 씻어낸 후, 도 4에 도시된 바와 같은 플러스 단자(21a)에 양극 전원을 연결하고 마이너스 단자(21b)에 음극 전원을 연결한 후 500mV의 직류(DC)를 인가하여 저항값 및 전류값을 측정한다. 전기적 검출은 반응 챔버 내에 PBS 완충용액을 채운 환경에서도 가능하나 탈이온수, 질소 또는 공기환경에서도 전기적 검출이 가능하다. 그 결과는 도 8에 도시되어 있다.
9) 도 8에서는 종래기술의 경우와는 달리, 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)가 서로 특이적으로 결합하지 않는 경우, 예를 들어, 프로브인 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)에 대한 표적 폴리뉴클레오티드 템플리트를 갖지 않는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 직류인가 후에도 전류값의 변화가 없으나, 표적 폴리뉴클레오티드 템플리트를 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 직류인가 후에 대략 1.6 ∼ 1.8 mA의 전류값이 측정되었다. 따라서, 본 발명을 이용하면 직류인가에 대한 LOW 또는 HIGH 값의 측정으로 제1 폴리뉴클레오티드 링커(L1)와 제2 폴리뉴클레오티드 링커(L2)가 서로 특이적으로 결합하는지 여부, 예를 들어 검출대상 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부를 민감하면서도 특이적으로 판정할 수 있다. 또한, 저항값을 측정하면 표적 폴리뉴클레오티드 템플리트를 갖지 않는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 저항값이 약 1.4MΩ이고 표적 폴리뉴클레오티드 템플리트를 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 저항값이 약 300Ω으로서, 검출 대상 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드 템플리트의 존재여부에 따라 저항값이 크게 차이가 나는 것을 알 수 있다. 따라서, 직류인가 후 검출된 현저히 작은 저항값으로부터도 검출대상 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부를 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 의해 전도성 입자와 폴리뉴클레오티드가 연결되고, 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드들의 조합이 존재할 때 상기 조합의 폴리뉴클레오티드들 사이의 특이적 결합에 의해 금속 전극들 사이에서 폴리뉴클레오티드들과 전도성 입자들의 연속적인 연결(체인형성)을 통한 금속 전극들 사이의 전도성 브릿지 형성에 의해 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 정밀하고 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서를 구현할 수 있는 것이다.
추가로, 본 발명을 이용하면 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 검출하기 위한 다수개의 프로브들을 마이크로어레이한 후 여러 개의 형광 스팟을 스캔하여 각각 분석해야 하는 종래의 마이크로어레이 칩 방식의 검출문제를 해결할 수 있는데, 본 발명에 따른 바이오 센서는 전술한 바와 같은 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합 그리고 특이적으로 상보적인 다수개의 폴리뉴클레오티드들의 조합들을 활용할 경우 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 간단하게 검출할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
10: 실리콘 기판
10a: 상부 전극이 형성된 실리콘 기판
10b: 하부 전극이 형성된 실리콘 기판
12, 12a, 12b: 산화절연막
20: 금속 전극
20a: 플러스 금속 전극 20b: 마이너스 금속 전극
30: 유리 웨이퍼
36a: 유입구 36b: 유출구
100: 바이오 센서 200: 바이오 칩
<110> KIM, Sung Jin <120> Biosensor utilizing conductive particles and the combination of polynucleotides corresponding to conductive particles, and method for detecting electric signal using the same <130> P10-0220KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First polynucleotides linker <400> 1 atggcaacta tacgcgctag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second polynucleotides linker <400> 2 aaacgactct agcgcgtata 20 <210> 3 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> A thiol group is attached at the 3'terminal of the first oligonucleotides and the first oligonucleotides bind to a nanoparticle using the thiol group <400> 3 gttgccat 8 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second oligonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> A thiol group is attached at the 3'terminal of the second oligonucleotides and the second oligonucleotides bind to a nanoparticle using the thiol group <400> 4 agtcgttt 8

Claims (23)

  1. 기판과,
    적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 상보적이지 않으면서 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자와,
    상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커와,
    상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖고 상기 제1 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커와,
    상기 기판 상에 형성되고 상기 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 하나가 각각 고정된 적어도 2개의 금속 전극을 포함하고,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브이고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드인, 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열과 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열이 서로 특이적으로 결합하는 경우 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 연결되고, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커에 연결되며,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 결합하지 않는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 오프(OFF) 신호로서 출력하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커들의 다수개의 조합을 설계하여 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 검출하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 금속 전극에는 직류 또는 교류전원을 인가하여 저항값의 변화 또는 전류값의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되거나 일반적인 (+) 전극과 (-)전극으로 형성되는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 금속 전극의 폭은 10nm ∼ 100μm이고, 상기 금속 전극 사이의 간격은 10nm ∼ 100μm인 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 금속 전극에 고정되는 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 한쪽 말단이 기능기로 개질된 후 상기 금속 전극에 고정되고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 전도성 입자 부착을 위한 기능기로 개질된 후 각각 상기 제1 전도성 입자 및 상기 제2 전도성 입자에 결합되는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서.
  11. 제1항에 정의된 바이오 센서를 포함하는 바이오 칩.
  12. 제11항에 있어서,
    단일 기판 형태 또는 두 개의 기판이 접합된 형태이며, 두 개의 기판이 접합된 형태인 경우에는 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커가 고정된 적어도 2개의 금속 전극이 형성된 제1기판과, 상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제2기판 상에 제3기판이 추가로 적층되는 3단 방식의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 칩.
  14. 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 제1 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제1 전도성 입자와, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열과는 상보적이지 않으면서 다른 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단이 결합된 복수개의 제2 전도성 입자를 준비하는 단계와,
    (b) 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖는 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커를 준비하는 단계와,
    (c) 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하는 일부 서열을 갖고 상기 제1 올리고뉴클레오티드와는 상보적으로 결합하지 않는 복수개의 제2 폴리뉴클레오티드 링커를 준비하는 단계와,
    (d) 반응 챔버 내에 위치하는 기판 상에 적어도 2개의 금속 전극을 형성하고 상기 복수개의 제1 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 하나를 상기 적어도 2개의 금속 전극에 각각 고정하는 단계와,
    (e) 상기 반응 챔버 내에서 상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 연결되도록 허용하고, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커에 연결되도록 허용하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열과 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커의 상기 일부 서열을 제외한 나머지 서열이 서로 특이적으로 결합하도록 허용하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 시료 내에 검출대상이 되는 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 프로브이고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커는 상기 프로브와 특이적으로 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드인, 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 경우 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 제1 전도성 입자에 결합된 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 연결되고, 상기 제2 전도성 입자에 결합된 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커에 연결되며,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 특이적으로 결합하는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 온(ON) 신호로서 출력하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 링커와 상기 제2 폴리뉴클레오티드 링커가 서로 결합하지 않는 경우에는 상기 적어도 2개의 금속 전극은 입력된 전기적 신호를 오프(OFF) 신호로서 출력하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커들의 다수개의 조합을 설계하여 다수개의 표적 폴리뉴클레오티드들을 다수개의 프로브들에 의해 한번의 전기적 신호의 검출로서 검출하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  20. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 금속 전극에는 직류 또는 교류전원을 인가하여 저항값의 변화 또는 전류값의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  21. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 금속 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되거나 일반적인 (+) 전극과 (-)전극으로 형성되는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 금속 전극의 폭은 10nm ∼ 100μm이고, 상기 금속 전극 사이의 간격은 10nm ∼ 100μm인 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
  23. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 금속 전극에 고정되는 제1 폴리뉴클레오티드 링커는 한쪽 말단이 기능기로 개질된 후 상기 금속 전극에 고정되고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 전도성 입자 부착을 위한 기능기로 개질된 후 각각 상기 제1 전도성 입자 및 상기 제2 전도성 입자에 결합되는 것을 특징으로 하는 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법.
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