WO2009119971A2 - 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 - Google Patents

생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the presence and / or reaction of the bioactive material by precisely detecting the change in electrical properties according to the biological, biochemical or chemical reaction of the bioactive material and a biochip provided therefor.
  • the present invention provides a method for precisely detecting a change in electrical characteristics, more specifically an impedance change or a capacitance change according to a biological, biochemical or chemical reaction of a bioactive material in a reaction chamber through a sensing electrode provided in the reaction chamber, and It relates to a biochip provided for this purpose.
  • the present invention provides a method for precisely detecting electrical property change, that is, impedance change or capacitance change according to a reaction between a receptor fixed to a sensing electrode and a physiologically active substance to be detected in a reaction chamber, It relates to a biochip.
  • Biochips are devices that can analyze gene information and protein information in large quantities and automatically, or can analyze the presence and function of bioactive substances relatively simply and quickly. Such biochips are actively applied in various fields such as gene and protein research, medicine, agriculture, food, environment and chemical industry.
  • Biochips use genotyping chips to check for the presence of specific genes using probes, DNA chips for the expression of specific disease-related genes, and physiology in samples such as blood or urine. It is largely divided into microfluidics chip which checks the presence and / or reaction of active substance. Genome DNA chips are now commonly used in the field of research and medical diagnostics.
  • the microarray chip refers to a chip arranged by dividing hundreds to tens of thousands of genes or proteins at regular intervals on a glass substrate using a microarray device. Oligonucleotides, double probes, are microarrayed on a glass substrate to check for the presence of specific genes with a fluorescence scanner.
  • DNA chips are being actively used in research and diagnostic fields. They can be used for gene metabolism, physiological phenomena and interrelationships between genes using technologies such as gene expression profiling and genotyping. It is also used to discover gene functions, or in diagnostic fields such as pathogenesis and progression diagnosis of specific diseases such as cancer, identification of drug action mechanisms, genetic information identification of disease causing bacteria, and mutant extraction.
  • diagnostic DNA chips began to take shape in 1994 with the commercialization of the HIV gene chip developed by Steve Forder of Dr. Affymetrix, including HIV, rheumatism, autoimmune diseases, chronic nephritis, arteriosclerosis, atopic skin and allergic diseases. Researches on diagnostic DNA chips that can diagnose chronic diseases are actively underway. In particular, the recent researches in the field of DNA chips are moving towards the development of diagnostic chips rather than research chips, and the diagnosis of various diseases such as cancer and leukemia in genotyping chips that can be applied only to the genotyping, pathogen or virus diagnostic fields. Approaches are being made to the field of possible expression chips.
  • Microfluidics chips also called bio biochips, are microchips that analyze traces of reactions of various bioactive substances in the chip while flowing traces of analytes (DNA, RNA, peptides, proteins, etc.) into the chamber within the chip.
  • the bio-bio chip detects the presence and / or reaction of the bioactive material by sensing the change of the electrical characteristics according to the reaction of the bioactive material in the reaction chamber.
  • bio-biochips are highly useful in the field of medical diagnosis because they can confirm the presence and / or reaction of physiologically active substances relatively simply and quickly by detecting electrical signals as compared to the above-described DNA chips.
  • HPV DNA chips for the diagnosis of HPV positive the virus that causes cervical cancer
  • HPV probe oligonucleotides and microarraying them on a glass substrate but directly applying a sample taken from a suspected cervical cancer group. It is impossible to diagnose HPV positive.
  • primers of fluorescence-labeled HPV virus gene should be separately prepared, PCR amplified sample is collected and sprayed on HPV DNA chip, and fluorescence emission should be checked by fluorescence scanner. Therefore, hybrid identification method (laser-induced fluorescence) using a DNA chip is an operationally cumbersome and time-consuming operation, which is expensive when labeling a sample DNA with a fluorescent material, and uses an expensive fluorescent scanner. And this has a number of problems and disadvantages, such as being impossible to carry.
  • the bio-biochip can check the presence and / or reaction of the bioactive substance relatively simply and quickly by detecting the electrical signal. That is, the bio biochip may detect whether hybrids are formed or the presence and reaction of a bioactive substance (eg, DNA) using an electrical signal rather than fluorescence. That is, in a bio biochip, the change in impedance (or capacitance) due to the reaction between the receptor and the bioactive substance fixed to the electrode or the reaction between the bioactive substances in the chip chamber is measured. This method detects and electrically detects it.
  • a bioactive substance eg, DNA
  • dNTP is decomposed into dNMP and diphosphate, and dNMP is polymerized to primers complementary to the template DNA sequence to synthesize DNA.
  • concentration of DNA increases, the impedance in the PCR reaction solution increases. It is known (see Korea Patent Publication No. 10-2004-0042021). Therefore, when the PCR reaction chamber is manufactured in the form of a biochip and electrically detected the impedance change in the reaction solution by the electrode provided in the biochip, it is possible to determine the presence or absence of a PCR reaction and the presence of a specific DNA sequence.
  • an oligonucleotide such as a primer or a probe is immobilized on an electrode of a biochip, a PCR reaction or a hybridization reaction is performed, and a capacitance change or an impedance change is measured on the electrode to which the oligonucleotide is fixed, the presence or absence of a PCR reaction or a hybridization reaction and / Alternatively, the presence of the target sequence can be easily detected electrically.
  • an electrode provided to the biochip detects a change in impedance caused by a reaction between a bioactive material and another reactant (for example, a receptor fixed to the electrode), thereby detecting whether there is a reaction and whether a specific bioactive material exists. It can be said that it is adopting the method of judgment. Therefore, in order to secure the reliability of the biochip, it is important to accurately detect the change in the impedance value at the electrode.
  • the impedance Z is expressed as the sum of the real part resistance R and the imaginary part reactance X (see Equation 1 below), and the magnitude is the square root of the resistance value R and the reactance value X. (See Equation 2 below).
  • the impedance Z has a correlation with the reactance X.
  • the reactance X is ⁇ L-1 / ⁇ C and thus has a correlation with the capacitance C. Therefore, the change in capacitance (C) value due to a biological, biochemical or chemical reaction is reflected as a change in the impedance value, and by measuring this, it is possible to check whether the bioactive substance reacts and / or the presence. As a result, the change in the capacitance value in the biochip induces a change in the impedance value, which can be seen that affects the detection sensitivity of the biochip.
  • the change in impedance according to the reaction of the bioactive material and other reactants may be influenced by two capacitance values. That is, when measuring the change in impedance value by the electrode in the biochip, the total capacitance change value (C T ) in the biochip is the capacitance change value on the surface of the sensing electrode due to the reaction of the receptor and the bioactive substance fixed to the sensing electrode. (C d ) and a capacitance value (C t ) between the virtual electrode plate and another sensing electrode separated from the capacitance change value (C d ) on the sensing electrode surface (see Equation 3 below).
  • a bioactive material in a biochip proceeds under a reaction solution contained in a reaction chamber, and the reaction solution generally includes a buffer solution or an electrolyte. Since the buffer solution and the electrolyte contain ions, the conductivity between the sensing electrodes of the biochip is affected. In addition, the influence on the conductivity between the sensing electrodes such as the buffer solution affects the capacitance value C t between the imaginary electrode plate having the buffer solution as a dielectric and the other sensing electrodes, and eventually the total capacitance change value (C T). ).
  • the capacitance depends on the dielectric constant of the inter-electrode material, and if the dielectric constant of the inter-electrode material is small, it can be seen that the capacitance is small.
  • the reaction solution such as the buffer solution described above has a small dielectric constant due to the conductivity of the ionic component, 1 / C t , which constitutes the total capacitance change value C T of Equation 3, becomes large. Therefore, when the reaction of the physiologically active substance is carried out in the buffer solution contained in the reaction chamber of the biochip, the capacitance change value C d caused by the reaction between the sensing electrode and the physiologically active substance is calculated as the virtual electrode plate having the buffer as the dielectric. It is absorbed by the capacitance value C t between the sensing electrodes.
  • the inverse value (1 / C t ) of the capacitance value C t between the imaginary electrode plate having the reaction solution containing the same ion as the buffer solution and the sensing electrode Because of the large size, the capacitance change value C d at the surface of the sensing electrode due to the reaction between the receptor fixed to the sensing electrode and the bioactive substance does not affect the total capacitance change value C T. Therefore, the electrical detection by the sensing electrode of the biochip has a problem that it is not possible to determine the presence and / or reaction of the bioactive material.
  • FIG. 1 shows that even when a specific target DNA template to be measured exists, the impedance change curve with respect to the frequency change before and after the PCR reaction is the same.
  • the capacitance change value (C d ) at the surface of the sensing electrode due to the PCR reaction between the primer ssDNA and the primer fixed to the sensing electrode Will be detected electrically. Since the capacitance change value C d on the surface of the sensing electrode after DNA amplification by the PCR reaction should be reflected as the impedance change, the pattern of the impedance change curve should also be observed before and after the PCR reaction.
  • the capacitance change value C d caused by the reaction between the sensing electrode and the physiologically active substance is absorbed by the capacitance value C t between the virtual electrode plate having the buffer solution as a dielectric and the sensing electrode.
  • the impedance change curve measured by the impedance measuring device connected to the biochip electrode is not changed before and after the PCR reaction and is observed only as a single curve (see FIG. 1). Therefore, in the conventional biochip, the capacitance change value C d caused by the reaction between the receptor fixed to the sensing electrode and the bioactive substance is the capacitance value C t between the imaginary electrode plate having the buffer solution as a dielectric and the sensing electrode. Since the two impedance change curves reflecting the total capacitance change value (C T ) are not measured, there is a problem that it is difficult to detect the response and / or presence of the actual bioactive molecules.
  • U.S. Patent Publication No. US2004 / 0110277 discloses a probe DNA attached to an electrode of a sensor cell of a biosensor.
  • the hybridization between the probe and the target DNA causes the capacitance to change, thereby changing the current value of the transistor, thereby causing a hybridization reaction.
  • a method of sensing is disclosed.
  • the capacitance change value (C d ) caused by the reaction between the receptor fixed to the sensing electrode and the bioactive substance as described above is absorbed by the capacitance value (C t ) by the buffer solution and is attached to the sensing electrode and the detection target. It is not paying attention to the problem that the reaction between the physiologically active substances is not detected electrically.
  • U.S. Patent Publication No. US2006 / 0226030 also discloses a sensor consisting of a substrate, an electrode and a catcher molecule attached to the substrate, where the catcher molecule hybridizes with a DNA single chain labeled with metallic balls (different dielectric constant from other analytes).
  • a technique for sensing a hybridization reaction by enclosing an electrode with the label to change the capacitance portion of the electrode impedance and measuring the same is disclosed.
  • the prior art discloses a method of improving the sensing sensitivity by reducing the width of the sensor electrode in the IDE to improve the sensing sensitivity of the biochip, and the capacitance change value (C d ) due to the actual reaction is the capacitance caused by the buffer solution.
  • C d capacitance change value
  • the conventional biochip and a method of confirming the presence and / or presence of a bioactive substance using the same have a problem to be improved.
  • the inventors of the present invention increase the dielectric constant of the interelectrode material in the reaction chamber of the biochip so that the amount of capacitance change due to the actual reaction on the sensing electrode surface is not distorted, and the biological, biochemical or chemical reaction of the bioactive material in the reaction chamber is not distorted.
  • the present invention is to solve the problem of not sensitively detecting the capacitance change due to the actual reaction in the biosensor electrode in the prior art as described above, the biological and biochemical of the bioactive material in the reaction chamber
  • Another object of the present invention is to provide a method for precisely detecting a change in electrical characteristics according to a chemical reaction, more specifically, a change in impedance and / or capacitance through an electrode provided in a reaction chamber, and a biochip for the same.
  • the present invention provides a method for precisely detecting a change in electrical characteristics, more specifically an impedance change or a capacitance change according to a biological, biochemical or chemical reaction of a bioactive material in a reaction chamber through a sensing electrode provided in the reaction chamber, and
  • the purpose is to provide a biochip provided for this purpose.
  • the present invention increases the dielectric constant of the interelectrode material in the reaction chamber of the biochip so that the amount of capacitance change due to the actual reaction on the sensing electrode surface is not distorted, and the biological, biochemical or chemical of the bioactive material in the reaction chamber is not distorted. It is an object of the present invention to provide a method for detecting a physiologically active substance that accurately reflects the result of a reaction, and a biochip for the same.
  • the capacitance is defined as in Equation 4 above. Therefore, in order to increase C t , there is a method of increasing the area of the electrode, narrowing the distance between the electrodes, or increasing the dielectric constant of the material between the electrodes.
  • the conventional technology uses a method of increasing sensing sensitivity by decreasing the width of the sensor electrode in the IDE of the biochip to increase the C t , but reducing the width of the electrode requires a high level of fine electrode formation technology. It is not preferable in terms of efficiency.
  • the present invention adopts a method of increasing the dielectric constant ⁇ (also referred to as permittivity) of the material between electrodes in the reaction chamber of the biochip.
  • This method can accurately reflect the result of biological, biochemical or chemical reaction of the bioactive material in the reaction chamber without distorting the amount of change in capacitance between electrodes without requiring advanced microelectrode formation technology.
  • reaction solution for the reaction of the sample to be detected is filled between the electrodes in the reaction chamber of the biochip. Therefore, it is necessary to increase the dielectric constant of this reaction solution.
  • the reaction solution for the reaction of the sample to be detected is difficult to adjust the dielectric constant by the ionic component.
  • the dielectric constant is defined as the ratio of the capacitance when a material is inserted as a dielectric between the electrodes and the capacitance when no material is inserted.
  • the dielectric constant of the dielectric is always greater than one.
  • water is known to have the largest dielectric constant, but at room temperature, the dielectric constant is about 80.
  • water such as distilled water or deionized water cannot be directly used as the reaction solution.
  • the reaction of the sample to be detected is performed under a general reaction solution, but before the reaction, a reference fluid having a large dielectric constant such as water is filled in the reaction chamber to measure impedance or capacitance value, and after completion of the reaction, the reaction solution is prepared. After removing and refilling the reference fluid having a large dielectric constant to measure impedance value or capacitance value, the presence or absence of bioactive substance and / or reaction in the sample to be detected is confirmed by comparing the impedance value or capacitance value before and after the reaction. Adopt the way.
  • the method for electrically detecting the physiologically active substance of the present invention (a) a sensing chamber in which the sample to be detected is accommodated, and a plurality of sensing for detecting the physiologically active substance in the sample to be located in the reaction chamber Providing an electrical detection device having an electrode, (b) introducing a reference fluid having a high dielectric constant into the reaction chamber, and then measuring impedance values or capacitance values between the sensing electrodes; and (c) Removing the reference fluid having a large dielectric constant from the reaction chamber, and then providing a reaction solution and a sample to be detected in the reaction chamber, and (d) reacting the sample to be detected in the reaction chamber under the reaction solution.
  • the measured impedance value or capacitance value may be represented by a curve with respect to the frequency value.
  • the curve of the impedance value or capacitance value measured in step (b) is distinguished from the curve of the impedance value or capacitance value measured in step (f), a bioactive substance or a bioactive substance is present in the sample to be detected. It may be determined that the reaction with the sensing electrode.
  • the reference fluid having a high dielectric constant is preferably a fluid having a dielectric constant of about 4 or more, and more preferably, a dielectric constant of about 80 or more.
  • Examples of the reference fluid having a large dielectric constant include distilled water or deionized water.
  • the present invention is not limited thereto, and as described above, any fluid having a dielectric constant of about 4 or more can be applied.
  • the sensing electrode is preferably formed of gold, chromium, copper or aluminum.
  • the sensing electrode is formed as an interdigitated electrode (IDE), and the spacing between each electrode may be approximately 1-20 ⁇ m, preferably approximately 1-4 ⁇ m.
  • the plurality of sensing electrodes may be coupled to a receptor that interacts with the bioactive material.
  • biomolecule is a substance that interacts with a receptor bound to the sensing electrode, a nucleic acid consisting of one or more nucleotides, a protein consisting of one or more peptides, Amino acids, sugar lipids, or low molecular weight compounds, preferably antigens, DNA, RNA, or peptide nucleic acid (PNA).
  • a nucleic acid consisting of one or more nucleotides
  • protein consisting of one or more peptides
  • Amino acids amino acids
  • sugar lipids or low molecular weight compounds
  • PNA peptide nucleic acid
  • the "receptor” is a substance that is coupled to the sensing electrode and interacts with a bioactive material, a nucleic acid consisting of one or more nucleotides, a protein consisting of one or more peptides, an amino acid, Sugar lipids, or low molecular weight compounds, preferably antibodies, probes or primers.
  • the receptor is an oligonucleotide probe
  • the bioactive material is a nucleic acid
  • the reaction solution is characterized in that the nucleic acid hybridization (nucleic acid hybridization) reaction solution.
  • the receptor is an oligonucleotide primer
  • the bioactive material is a nucleic acid
  • the reaction solution is characterized in that the PCR reaction solution.
  • biochip used in the method for detecting the physiologically active substance of the present invention may be formed in a single substrate form, but may be in a form in which two substrates are bonded to each other.
  • biochips in one embodiment of the present invention include DNA hybridization chips or PCR reaction chips.
  • An embodiment of the biochip of the present invention in which two substrates are bonded to each other includes a first substrate having a plurality of sensing electrodes coupled to a receptor interacting with a bioactive material, and a predetermined distance on the first substrate.
  • a second substrate is coupled to the first substrate to form a reaction chamber space.
  • the first substrate is formed with a plurality of sensuous electrodes on an SiO 2 insulating layer on an N-type or P-type silicon substrate, and performs electrical detection to confirm the presence and / or reaction of a bioactive material.
  • the second substrate is combined with the first substrate to form a reaction chamber space while preventing the sensing electrode of the first substrate from contacting the external environment.
  • the reaction chamber is a space in which impedance and / or capacitance between electrodes is measured after a reference fluid having a large dielectric constant is filled.
  • the reaction chamber is a space in which the reaction of the physiologically active substance present in the detection target sample is performed after the reaction solution and the detection target sample are filled.
  • the substrates may have various sizes depending on the type and number of receptors to be applied, for example, the type and number of probes or primers.
  • the substrates may have a square, rectangular, or circular shape, but the present invention is not limited thereto.
  • the first substrate is a silicon substrate
  • the second substrate is a glass substrate, but these substrates may be glass, silicon substrate, fused silica, polystyrene, polymethylacrylate, polycarbonate, gold, silver, copper, or It may be composed of any one of platinum.
  • the second substrate forming the reaction chamber space is formed through the fluid inlet in the thickness direction of the second substrate, the outlet in the thickness direction of the second substrate penetrates to the position facing the fluid inlet. It is formed.
  • the inlet and the reaction chamber and the outlet and the reaction chamber communicate with each other to allow fluid to flow.
  • a reference fluid having a large dielectric constant, a reaction solution and a sample to be detected are introduced through the inlet, and a reference fluid having a large dielectric constant, a reaction solution and a sample to be detected are discharged through the outlet.
  • a third substrate may be stacked on the second substrate to form an inlet microchannel for introducing the fluid into the inlet and an outlet microchannel for guiding the fluid from the outlet.
  • the inlet micro channel communicates with the inlet through which the reference fluid, the reaction solution and the sample to be injected are formed, and penetrates through the third substrate.
  • the outlet micro channel communicates with the outlet through which the reference fluid, the reaction solution and the sample to be detected are communicated. And penetrates through the third substrate.
  • the inlet microchannel and / or the outlet microchannel may be provided with a valve structure capable of limiting the inflow of fluid into and out of the reaction chamber.
  • the valve structure has oil embedded in a passage extending between the inlet and the reaction chamber or between the outlet and the reaction chamber in the thickness direction of the third substrate and extending therethrough.
  • nitrogen gas (N 2 ) is injected into the passage of the valve structure, the oil contained in the passage expands and the channel is blocked by the expansion of the oil, so that the fluid flows from the inlet to the reaction chamber and from the reaction chamber to the outlet.
  • the outflow of will be blocked.
  • the third substrate is preferably formed of a polydimethylsiloxane (PDMS) polymer.
  • microchannel and valve structure is formed in micron units or nano units using MEMS (Micro-Electro-Mechanical-System) technology, which is widely used in the art, and depends on the size of the receptor, the electrode size, or the reaction conditions. And the size of the valve can be adjusted.
  • MEMS Micro-Electro-Mechanical-System
  • This channel structure and the valve structure is a process of filling a fluid having a high dielectric constant in the reaction chamber before the reaction in the method of the present invention, during the reaction to remove the fluid having a high dielectric constant in the reaction chamber, the reaction solution and the detection target After filling the sample and completing the reaction, it is easy to perform the process of removing the reaction solution and refilling the fluid having a high dielectric constant.
  • an injection pump and an discharge pump for injecting and removing a fluid, a reaction solution and a sample to be detected may be provided in the biochip of the present invention, and a small motor or a gearbox may be provided as a pump driving means.
  • An impedance analyzer may be electrically connected to the plurality of sensing electrodes.
  • the biochip is a PCR reaction chip
  • the biochip and the PCR device may be configured as one set if the biochip is accommodated in a PCR device that performs the PCR reaction.
  • the capacitance change value (C d ) at the surface of the sensing electrode is absorbed by the capacitance value (C t ) by the buffer solution, the electrical, biochemical or chemical reaction of the bioactive material in the reaction chamber The characteristic change can be detected precisely.
  • the present invention increases the dielectric constant of the inter-electrode material in the reaction chamber of the biochip so that the amount of capacitance change due to the reaction between the receptor attached to the sensing electrode and the physiologically active substance to be detected is not distorted and is accurately corrected to the total capacitance change amount. Reflected there is an advantage that can accurately detect the presence and / or reaction of the bioactive material.
  • 1 is an impedance change curve measured using a conventional PCR reaction detection method.
  • Fig. 2 is a process flowchart illustrating the process of manufacturing the DNA hybridization chip used in the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view showing an electrode portion of a DNA hybridization chip manufactured according to the process of FIG. Figure 3 (a) shows the entire DNA hybridization chip electrode portion, Figure 3 (b) is an enlarged view schematically showing a part of the electrode shown in Figure 3 (a), Figure 3 (c) shows an enlarged view of a pair of finger-shaped electrodes 20a and 20b.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the metal electrode 20 of FIG. 3B taken along the line A-A '.
  • FIG. 5 is a process flowchart illustrating a process for manufacturing a PCR reaction chip used in the present invention.
  • FIG. 5A illustrates a process for manufacturing a silicon substrate of a PCR reaction chip
  • FIG. 5B illustrates a process for manufacturing a glass substrate of a PCR reaction chip
  • FIG. 5C Is a diagram showing a state in which a silicon substrate and a glass substrate are bonded together.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a PCR reaction chip to which a PDMS-based fluid control substrate is attached.
  • Figure 6 (A) shows that the fluid control substrate is attached to the glass substrate of the PCR reaction chip manufactured previously
  • Figure 6 (B) and (C) shows the PCR reaction by the valve function of the fluid control substrate The process by which fluid flow in a chip is controlled is described.
  • the physiologically active substance to be detected is DNA and the receptor bound to the sensing electrode is an oligonucleotide probe, a DNA hybridization chip for hybridization reaction between the physiologically active DNA and the probe is manufactured. do.
  • DNA hybridization chip sensors are fabricated using common methods known in the art, including silicon oxide thin film formation techniques, photolithography techniques, exposure panning techniques, development techniques, wet and / or dry etching techniques, and the like. do.
  • a sensing metal electrode in the form of an interdigitated electrode (IDE) is formed on a silicon substrate by using micro-electro-mechanical-systems (MEMS) technology, and then the oligonucleotide probe is manufactured by fixing the oligonucleotide probe to the sensing electrode.
  • IDE interdigitated electrode
  • MEMS micro-electro-mechanical-systems
  • An N-type silicon wafer 10 having a thickness of 500 ⁇ m was thermally oxidized to form an SiO 2 layer 12 of about 10,000 kV as an oxide insulating layer (step (a) of FIG. 2). Then, the insulating film layer 12 was applied with photoresist AZ 5214 (14) (step (b) of FIG. 2). After placing a mask (not shown) of a metal electrode pattern on the photoresist 14 and exposing it to ultraviolet light, the silicon wafer 10 was immersed in an AZ300MIF developer and developed and etched (step (c) of FIG. 2). .
  • a chromium (Cr) (300 micron) and gold (Au) (3000 micron) thin film 20 was deposited on the etched wafer 10 (step (d) of FIG. 2).
  • Deposition of the chromium and gold thin film 20 was performed using chemical vapor deposition (CVD), vacuum evaporation or sputtering. Then, using the known lift-off process, the remaining photoresist layer 14 and a part of the thin film on the remaining photoresist layer were removed to form the metal electrode 20 (Fig. 2 (e). )step).
  • the completed DNA hybridization chip 100 is as shown in FIG.
  • the diameter R of the electrode 20 portion is approximately 2.4 mm, but the diameter of the DNA hybridization chip 100 may be as small as possible for fabrication of the electrode array type DNA hybridization chip (see FIG. 7). The better.
  • the area of the electrode 20 is approximately 3.6 mm 2 .
  • FIG. 3B is an enlarged view schematically illustrating a part of the electrode 20 shown in FIG. 3A.
  • the shape of the electrode 20 is represented by a rectangle, but the actual electrode 20 may be circular or elliptical.
  • the sensing electrodes 20 of the DNA hybridization chip 100 used in the present invention are arranged with a pair of finger-shaped electrodes 20a and 20b staggered at regular intervals from each other. It can be seen that.
  • a portion of the finger-shaped pair of electrodes 20a and 20b is enlarged.
  • the width t of each electrode 20a, 20b is about 10 micrometers, and the space
  • the electrode 20 of the DNA hybridization chip 100 fabricated in Example 1-1 was washed with oxygen plasma (150 W, 100 mtorr) for 10 seconds to completely remove impurities on the electrode 20. Then, one end (5 'or 3') of the probe DNA is fixed to the electrode 20. Of 5'-SH- (CH 2 ) 24 -GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3 'which combines a thiol group and a carbon chain (-CH 2- ) at the 5' end of the oligonucleotide for fixation. The probe is fabricated and fixed to the surface of the metal electrode 20 by a SAM (Self-Assembled Method).
  • SAM Self-Assembled Method
  • the conductive polymer coupled to the DNA may be fixed to the metal electrode surface by using a well-known SAM (Self Assembled Method) method.
  • SAM Self Assembled Method
  • the conductive polymer all known conductive polymers can be used.
  • polyacetylene, poly (p-phenylene) (Poly (p-phenylene): PPP), polypyrrole (highly conductive polymer) Polypyrrole: PPy), polyaniline, polythiophene, and the like can be used.
  • the conductive polymer and the probe DNA can be bound using a known bonding method between the polymer and the DNA.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the metal electrode 20 of FIG. 3B taken along the line A-A ', wherein the metal electrodes 20a, formed on the silicon substrate 10 with the oxide insulating film 12 interposed therebetween. 20b) shows that the probe DNA 22 is fixed.
  • the DNA hybridization chip 100 of FIG. 4 manufactured in Example 1-2 was used to detect whether a target sequence (5′-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3 ′) was present in the sample to be detected. .
  • deionized water which is a reference solution having a large dielectric constant
  • an alternating current was applied to measure the impedance value between the electrodes 20 at room temperature.
  • the size of the applied AC power was 100 mV and the frequency range where the impedance value was measured was in the range of 1 to 32 MHz.
  • the DNA hybridization chip 100 The reference solution was removed, and the sample to be detected containing the target sequence (10 pmol / ⁇ l ssDNA) and the TE buffer solution were introduced into the reaction space of the DNA hybridization chip 100. Incubated for 18 hours at room temperature according to the hybridization reaction conditions, the probe DNA 22 immobilized on the electrode 20 of the DNA hybridization chip 100 and the target sequence (5'-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3 '). SsDNA, including) was allowed to hybridize.
  • the buffer solution was completely removed from the DNA hybridization chip 100, deionized water was injected, and alternating current was applied to measure impedance values between the electrodes 20 at room temperature.
  • the size of the applied AC power was 100 mV and the frequency range where the impedance value was measured was in the range of 1 to 32 MHz.
  • FIG. 8 The results of the impedance measurement before the hybridization reaction and the impedance measurement after the hybridization reaction as described above are shown in FIG. In FIG. 8, unlike the case of FIG. 1 of the related art, when an experiment is performed on a positive detection target sample having a target sequence, an impedance measurement curve before the hybridization reaction and an impedance measurement curve after the hybridization reaction are divided into two. Observed by the dog's curve. As can be seen in Figure 8, it can be seen that the impedance value decreases when the target DNA is present in the reaction solution after the hybridization reaction proceeds. Therefore, it can be seen that when the ss-DNA becomes ds-DNA through the hybridization reaction, its conductivity increases to decrease the impedance value.
  • the capacitance change value C d due to the hybridization reaction between the probe fixed to the sensing electrode and the target ssDNA is not absorbed by the capacitance value C t by the buffer solution, but the total capacitance change value C T is obtained. ) Is reflected. Therefore, in the method of the present invention, as shown in FIG. 8, two impedance curves are observed before and after the hybridization reaction, so that the hybridization reaction and the presence of the target DNA can be easily detected.
  • the physiologically active substance to be detected is DNA and the receptor bound to the sensing electrode is an oligonucleotide primer
  • PCR which amplifies the physiologically active substance by a primer and a PCR reaction solution
  • PCR reaction chip for the amplification reaction.
  • PCR reaction chips are also fabricated using methods known in the art, such as DNA hybridization chip sensors, wherein the silicon substrate and electrode portions are formed of silicon oxide thin film formation, photolithography, exposure panning, development, wet and And / or using a dry etching technique.
  • Micro-Electro-Mechanical-Systems (MEMS) technology is used to form a sensing metal electrode in the form of an interdigitated electrode (IDE) on a silicon substrate, and then the oligonucleotide primer is manufactured by fixing to the sensing electrode.
  • MEMS Micro-Electro-Mechanical-Systems
  • IDE interdigitated electrode
  • portions of the glass substrate that are attached onto the silicon substrate are fabricated using glass wet-etching and sand blasting techniques known in the art.
  • An N-type silicon wafer 10 having a thickness of 500 ⁇ m was thermally oxidized to form an SiO 2 layer 12 of about 5000 mV as an oxide insulating film layer (step (a) of FIG. 5A).
  • IDE fine interdigitated electrode
  • a chemical mechanical polishing method was used to planarize the SiO 2 film 18 as an insulating film (step (d) in Fig. 5A). Then, the surface of the Au metal electrode was exposed by performing dry etching (RIE) or wet etching (BOE) on only the IDE electrode portion using a conventional photoresist and photolithography process, and then bonding the glass substrate 30 to be described later. A portion of the insulating film 18 to be formed was formed (step (e) in Fig. 5A).
  • CMP chemical mechanical polishing method
  • the pattern of the completed metal electrode 20 is similar to that of the metal electrode 20 of the DNA hybridization chip shown in Fig. 3A, and a pair of finger-shaped electrodes 20a and 20b are shown. These are staggered at regular intervals from each other.
  • the diameter R of the portion of the electrode 20 is approximately 8.6 mm, but the smaller the diameter is possible for the production of the electrode array type PCR reaction chip (see FIG. 7).
  • the width t of each electrode 20a, 20b is about 20 micrometers, and the space
  • the metal thin film 32 of Cr / Au (300 mW / 3000 mW) is deposited on the upper and lower surfaces of a glass substrate (manufactured by Pyrex) 30, which is usually used in a semiconductor process, by chemical vapor deposition, vacuum deposition, or Deposition was carried out using sputtering or the like (step (a) of FIG. 5B).
  • the metal thin film 32 formed thereon was patterned and wet etched to form a protective layer 32 for a later process portion of the glass substrate 30 (Fig. 5B ( b) step).
  • step (c) of FIG. 5B a portion of the glass substrate 32 not shielded by the protective layer 32 was wet etched to form a reaction chamber space of the PCR reaction chip.
  • the metal thin film 32 formed on the upper and lower portions is removed, and a blue tape (patterned blue tape) is formed on the bottom of the glass substrate 30 to form the inlet / outlet holes 36a and 36b of the PCR reaction chip. Back side can be used) Patterning 34 was performed (step (d) of FIG. 5B).
  • through holes such as inlet / outlet holes were formed in the thickness direction with respect to the glass substrate 30 by the sand blasting method known in the art (step (e) of FIG. 5B).
  • the silicon substrate 10 and the glass substrate 30 on which the metal electrode 20 formed above were bonded were bonded by using anodic bonding method as shown in FIG. 5C, and the bonded silicon substrate 10 and glass were bonded.
  • the substrate 20 was diced to produce a final PCR reaction chip 200.
  • the anodic bonding method is a method for bonding a silicon substrate and a glass substrate, by applying a high electric field and heat to move the positively charged ions (eg, Na + ions) present in the glass substrate to the opposite side of the silicon and glass grounding It is a method of bonding two substrates by forming a hydrogen bond on the surface of a silicon substrate and a glass substrate.
  • a high electric field and heat to move the positively charged ions (eg, Na + ions) present in the glass substrate to the opposite side of the silicon and glass grounding
  • a plurality of sensing metal electrodes 20 are formed on the silicon substrate 10 (see FIGS. 5 and 6A), and the target DNA template is formed on the metal electrodes.
  • the primer 22 for the (target DNA template) is fixed and bound (see FIG. 6A).
  • the silicon substrate 10 is bonded to the glass substrate 30 at a predetermined distance to form the reaction chamber space 46 (see FIGS. 5 and 6A).
  • the reaction chamber space 46 is a space in which an impedance value between electrodes is measured after the reference solution of deionized water is filled.
  • the reaction chamber space 46 is a space in which the sample to be detected and the PCR reaction solution are accommodated and the PCR reaction is performed, and the sample to be detected on the primer 22 fixed to the metal electrode 20 of the silicon substrate 10.
  • the target DNA template present in the complementary binding is a space where the PCR reaction proceeds.
  • the glass substrate 30 serves to protect the reaction chamber space 46 from the outside.
  • the glass substrate 30 is formed by penetrating the fluid inlet 36a in the thickness direction, and is formed by penetrating the outlet 36b in the thickness direction at a position opposite to the fluid inlet 36a (FIG. 5). And Figure 6A). As shown in Figs. 5 and 6A, the inlet port 36a and the reaction chamber 46, and the outlet port 36b and the reaction chamber 46 communicate with each other to allow fluid to flow.
  • a reference solution of deionized water, a PCR reaction solution and a sample to be detected are introduced through the inlet port 36a, and a reference solution of the deionized water, a PCR reaction solution and a sample to be detected are discharged through the outlet port 36b.
  • a PDMS-based fluid control substrate 40 is manufactured and attached to the glass substrate 30 of the PCR reaction chip 200 manufactured above.
  • the fluid control substrate 40 of the PCR reaction chip 200 used in the present invention is preferably made of a transparent polymer in order to be able to see the inside of the chip, particularly made of PDMS (polydimethylsiloxane) polymer.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the advantage of PDMS is that it is cheaper than silicon, easier to process, flexible and waterproof when bonded to other surfaces.
  • it is biocompatible and does not negatively affect the bioactive material.
  • BSA bovine serum albumin
  • the fluid control substrate 40 was designed by a computer aided design (CAD) program, and then the designed design was printed on a photomask and impurities were removed.
  • CAD computer aided design
  • SU-8 a negative photoresist
  • the mold was produced through the exposure and development process using.
  • the liquid PDMS was poured into the SU-8 mold, heat-treated, solidified, and separated from the mold.
  • the separated PDMS fluid control board 40 was cut according to the size of the PCR reaction chip 200, and then punched to a desired size at the positions of the inlet 42 and the outlet 48 using a punch. Thereafter, the prepared fluid control substrate 40 was plasma oxidized and bonded to the corresponding position on the glass substrate 30 of the PCR reaction chip 200.
  • 6A is a longitudinal cross-sectional view of the PCR reaction chip 200 finally attached to the fluid control substrate 40.
  • the fluid control substrate 40 is attached to the glass substrate 30 to introduce the fluid into the inlet port 36a, and the inlet micro channel 44a and the outlet microb to discharge the fluid from the outlet port 36b. 44b) is formed.
  • An inlet 42 through which a reference solution of deionized water, a PCR reaction solution, and a sample to be detected is injected is formed in the fluid control substrate 40.
  • the inlet 42 is in communication with the inlet micro channel 44a. Allow fluid to enter the reaction chamber 46.
  • the fluid control substrate 40 is formed by passing through a discharge port 48 through which a reference solution of deionized water, a PCR reaction solution, and a sample to be detected are discharged.
  • the discharge port 48 is formed through the discharge microchannel 44b. In communication with the fluid to allow fluid to exit the reaction chamber 46.
  • the fluid control substrate 40 penetrates in the thickness direction of the fluid control substrate 40 between the inlet 42 and the reaction chamber 46 and between the outlet 48 and the reaction chamber 46. Then, a passage 52 extending in the longitudinal direction is formed (see Figs. 6A and 6B).
  • This passage 52 acts as a valve for the inlet micro channel 44a and / or the outlet micro channel 44b. That is, the passage 52 has a silicon oil 50 embedded therein, and as shown in FIG. 6C, when nitrogen gas N 2 is injected into the passage 52 in which the silicon oil 50 is embedded, the passage 52 is disposed. In this case, the silicon oil 50 contained therein expands and the channels 44a and 44b are blocked by the expansion of the silicon oil 50. Accordingly, the fluid control substrate 40 blocks the inflow of the fluid from the inlet 42 to the reaction chamber 46 and the outflow of the fluid from the reaction chamber 46 to the outlet 48 to control the flow of the fluid.
  • the electrode 20 of the PCR reaction chip 200 manufactured in Example 3-1 was cleaned with a Pirahna solution (mixed with H 2 SO 4 and H 2 O 2 at 70:30) for 30 minutes, and then the electrode ( The impurities in phase 20) were completely removed.
  • an upstream primer and a downstream primer is fixed to the electrode 20 in the electrode 20.
  • Both upstream and downstream primers may be fixed to the electrode 20, or only one primer may be fixed to the electrode, and the other primer may be mixed in a PCR reaction solution to proceed with the PCR reaction.
  • 5'-SH- (CH 2 ) 24 -GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3 ' which combines a thiol group and a carbon chain (-CH 2- ) at the 5' end of the oligonucleotide for fixation.
  • a downstream primer of upstream primer and 5'-SH- (CH 2 ) 24 -AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G-3 ' was prepared, and this was prepared by SAM (Self-Assembled Method) on the surface of the metal electrode 20. Fix it. Specifically, 10 pmol / ⁇ l of SH-ssDNA upstream primer and / or downstream primer was reacted for 18 hours in a TE buffer environment. As a result, the primer ssDNA 22 is fixed to the surface of the metal electrode 20 by reaction of the -SH group of the primer and the metal surface.
  • the fixing procedure of the primer to the metal surface performed in this example is substantially the same as the fixing procedure of the probe in Example 1-2 as shown in FIG.
  • Example 3-2 Using the PCR reaction chip 200 (see FIG. 6) to which the primer prepared in Example 3-2 was immobilized, it was detected whether a target DNA template exists in the sample to be detected and whether the PCR reaction was performed.
  • deionized water which is a reference solution having a large dielectric constant
  • an alternating current was applied to measure impedance values between the electrodes 20 at room temperature.
  • the size of the applied AC power was 100 mV and the frequency range where the impedance value was measured was in the range of 1 to 32 MHz.
  • PCR reaction chip 200 Remove the reference solution and transfer Promega's PCR Core System II PCR kit (PCR reaction solution sold for easy PCR reaction; Promega USA) and DNA template into the reaction chamber 46 of the PCR reaction chip 200. Introduced. PCR reactions were performed 25 to 35 cycles according to the PCR reaction time and reaction temperature for each PCR cycle recommended by Promega.
  • the PCR reaction solution was completely removed from the PCR reaction chip 200, deionized water was injected, and alternating current was applied to measure impedance values between the electrodes 20 at room temperature.
  • the size of the applied AC power was 100 mV and the frequency range where the impedance value was measured was in the range of 1 to 32 MHz.
  • FIG. 9 The results of the impedance measurement before the PCR reaction and the impedance measurement after the PCR reaction as described above are shown in FIG. 9.
  • FIG. 9 unlike the case of FIG. 1 of the related art, when an experiment is performed on a positive detection target sample having a target DNA template, an impedance measurement curve before the PCR reaction and an impedance measurement curve after the PCR reaction are divided into 2. Observed by the dog's curve.
  • the impedance value decreases when the target DNA template is present in the reaction solution after the PCR reaction proceeds. Therefore, when the ss-DNA becomes ds-DNA through the PCR reaction, it can be seen that the conductivity increased and the impedance value decreased.
  • the capacitance change value (C d ) due to the PCR reaction of the primer and the target DNA template fixed to the sensing electrode is not absorbed by the capacitance value (C t ) by the buffer solution, but the total capacitance change value (C t ). T ) is reflected. Therefore, in the method of the present invention, as shown in FIG. 9, two impedance curves are observed before and after the PCR reaction, so that the PCR reaction and the presence of the target DNA template can be easily detected.
  • the impedance measurement value is smaller than the impedance value in the case of a positive as shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다. 본 발명에서는 검출대상 시료의 반응은 일반적인 반응용액 하에서 수행하되, 반응 전에 반응 챔버 내에 물과 같은 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하고, 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정한 후, 반응 전후의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교함으로써 검출대상 시료 내에 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인하는 방식을 채택한다.

Description

생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩
본 발명은 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 센싱 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내에서 센싱 전극에 고정된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응에 따른 전기적 특성 변화, 즉 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩에 관한 것이다.
바이오 칩은 유전자 정보 및 단백질 정보를 대량으로 그리고 자동화하여 분석할 수 있거나, 생리활성물질의 존재여부 및 기능을 비교적 간단하고 신속하게 분석할 수 있는 장치이다. 이러한 바이오 칩은 유전자 및 단백질 연구분야, 의약분야, 농업, 식품, 환경 및 화학산업 등 다양한 분야에서 응용이 활발하게 이루어지고 있다.
바이오칩은 프로브를 이용하여 특정 유전자의 존재여부를 체크하는 유전자형 DNA 칩(genotyping chip), 특정 질환 관련 유전자의 발현 양상을 체크하는 유전자발현양상 DNA 칩(expression chip) 그리고 혈액이나 소변과 같은 시료 내의 생리활성물질의 존재여부 및/반응여부를 체크하는 마이크로플루이딕스 칩(microfluidics chip)으로 크게 나뉜다. 현재 연구분야 및 의료 진단분야에서 보편적으로 상용화되어 사용되고 있는 것은 유전자형 DNA 칩이다.
일반적으로 마이크로어레이 칩이라 함은 수백에서 수만 종류의 유전자나 단백질을 마이크로어레이 장치를 이용하여 유리 기판 상에 일정 간격으로 찍어서 배열한 칩을 의미한다. 이중 프로브인 올리고뉴클레오티드를 유리 기판 상에 마이크로어레이하여 특정 유전자의 존재여부를 형광 스캐너로 확인하는 것이 DNA 칩이다.
DNA 칩은 연구용 분야와 진단 분야에서 활발히 활용되고 있는데, 유전자발현양상(gene expression profiling) 분야 및 유전자형(genotyping) 분야 등의 기술을 활용하여 세포 내 신진대사, 생리학적 현상 및 각 유전자들 간의 상호연관성 등 유전자기능을 밝혀내는데 활용되거나, 암과 같은 특정 질환의 발병기전 및 진행진단, 약물작용기전 규명, 질병 원인균의 유전자 정보확인 및 변이 색출 등과 같은 진단분야 등에서도 활용되고 있다.
진단용 DNA 칩 개발은 1994년 Affymetrix의 스티브 포더 박사가 개발한 HIV 유전자 칩의 상용화로부터 시장이 형성되기 시작했고, HIV, 류머티즘, 자기면역 질환, 만성 신장염, 동맥경화증, 아토피성 피부 및 알레르기 질환 등의 만성질환 등을 진단할 수 있는 진단용 DNA 칩 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 최근의 DNA 칩 분야의 연구는 연구용 칩 보다는 진단용 칩으로 연구개발 방향이 움직이고 있고, 유전자형, 병원균 또는 바이러스의 진단 분야에만 적용이 가능한 유전자형(genotyping) 칩에서 암, 백혈병 등 다양한 질병의 진단이 가능한 유전자발현양상(expression) 칩 분야에 대한 접근이 이루어지고 있다.
또한, 최근에는 IT 및 나노기술과 접목하여 1개의 칩으로 여러 질병을 동시에 감지하고 각자의 유전정보로부터 발병 가능성까지 예측할 수 있게 해주는 마이크로플루이딕스 칩(Lab-on-a-chip) 기술이 주목을 받고 있다. 생체 바이오 칩이라고도 불리는 마이크로플루이딕스 칩은 미량의 분석대상물질(DNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등)을 칩 내의 챔버로 흘려보내면서 칩 내의 각종 생리활성물질의 반응양상을 분석하는 칩이다. 이러한 생체 바이오 칩은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 반응에 따른 전기적 특성의 변화를 칩 내에 설치된 전극이 감지하여 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 검출한다.
이러한 생체 바이오 칩은 전술한 DNA 칩에 비해 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인할 수 있기 때문에 의료진단분야에서 활용도가 높다.
예를 들어, 자궁경부암의 발생 원인 바이러스인 HPV 양성 여부의 진단을 위한 HPV DNA 칩은 HPV 프로브 올리고뉴클레오티드를 준비하고 이를 유리 기판 상에 마이크로어레이한 것이지만, 자궁경부암 의심군으로부터 채취한 시료를 바로 적용해서는 HPV 양성 여부의 진단이 불가능하다. 즉, 형광이 표지된 HPV 바이러스 유전자의 프라이머를 별도로 준비하고 채취된 시료를 PCR 증폭시킨 후 HPV DNA 칩에 뿌려주고 형광의 발광여부를 형광 스캐너로 확인해야 한다. 따라서, DNA 칩을 이용한 하이브리드 확인 방식(레이저유발형광법; laser-induced fluorescence)은 조작상 번거롭고 시간이 소요되는 작업으로서, 형광물질로 시료 DNA를 표지할 때 고비용이 소용되고, 고가의 형광 스캐너의 사용과 이로 인해 휴대가 불가능하다는 점 등 여러 가지 문제점과 단점을 가지고 있다.
이에 비해 생체 바이오 칩은 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인할 수 있다. 즉, 생체 바이오 칩은 형광이 아닌 전기적 신호를 이용하여 하이브리드 형성 여부 내지는 생리활성물질(예를 들어, DNA)의 존재 및 반응 여부를 검출할 수 있다. 즉, 생체 바이오 칩에서는 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 측정하거나 칩 챔버 내에서 생리활성물질들 간의 반응에 의한 임피던스(또는 커패시턴스)의 변화를 전극이 감지하여 이를 전기적으로 검출하는 방식을 이용하고 있다.
예를 들어, PCR 과정에서 dNTP는 dNMP와 디포스페이트로 분해됨과 동시에 dNMP는 주형 DNA 서열에 상보적인 프라이머에 중합되어 DNA가 합성되고, DNA의 농도의 증가에 따라 PCR 반응용액 내의 임피던스는 증가하는 것으로 알려져 있다(한국공개특허공보 제10-2004-0042021호 참조). 따라서, PCR 반응 챔버를 바이오칩 형태로 제작하고 이러한 바이오칩에 제공된 전극에 의해 반응 용액 내의 임피던스 변화를 전기적으로 검출하면 PCR 반응의 유무 및 특정 DNA 염기서열의 존재 유무를 판단할 수 있게 된다.
또한, 바이오 칩의 전극에 프라이머나 프로브와 같은 올리고뉴클레오티드를 고정하고 PCR 반응이나 혼성화 반응을 진행시킨 후 올리고뉴클레오티드가 고정된 전극에서의 커패시턴스 변화 또는 임피던스 변화를 측정하면 PCR 반응이나 혼성화 반응 유무 및/또는 타겟 염기서열의 존재를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있게 된다.
일반적으로 바이오 칩에서는 생리활성물질과 다른 반응물질(예를 들어, 전극에 고정된 수용체)의 반응에 따른 임피던스의 변화를 바이오 칩에 제공된 전극이 감지하여 반응 유무 및 특정 생리활성물질의 존재 여부를 판단하는 방식을 채택하고 있다고 할 수 있다. 따라서, 바이오칩의 신뢰성을 확보하기 위해서는 전극에서 임피던스값 변화의 정밀한 감지가 중요하다. 일반적으로 임피던스(Z)는 실수부인 저항(R)과, 허수부인 리액턴스(X)의 합으로 표시되고(하기 수학식 1 참조), 그 크기는 저항값(R)과 리액턴스값(X)의 제곱근에 해당된다(하기 수학식 2 참조).
[수학식 1]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000001
[수학식 2]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000002
따라서, 임피던스(Z)는 리액턴스(X)와 상관관계를 갖게 된다. 또한, 리액턴스(X)는 ωL-1/ωC이므로 커패시턴스(C)와 상관관계를 갖는다. 따라서, 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 의한 커패시턴스(C)값의 변화는 임피던스값의 변화로 반영되고, 이를 측정함으로써 생리활성물질의 반응여부 및/또는 존재여부를 체크할 수 있다. 결국, 바이오칩에서 커패시턴스값의 변화는 임피던스값의 변화를 유도하고 이는 바이오칩의 검출감도에 영향을 줌을 알 수 있다.
그런데, 생리활성물질과 다른 반응물질(예를 들어, 전극에 고정된 수용체)의 반응에 따른 임피던스의 변화는 2가지 커패시턴스값에 의해 영향을 받을 수 있다. 즉, 바이오칩 내에서 전극에 의해 임피던스값의 변화를 측정할 경우 바이오 칩 내의 전체 커패시턴스 변화값(CT)은 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)과, 상기 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)과는 분리된 가상의 전극판과 다른 센싱 전극 간 커패시턴스값(Ct)을 포함하게 된다(하기 수학식 3 참조).
[수학식 3]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000003
통상, 바이오 칩에서 생리활성물질은 반응 챔버에 수용된 반응용액 하에서 반응이 진행되는데, 상기 반응용액은 일반적으로 완충용액이나 전해질을 포함하고 있다. 완충용액과 전해질은 이온을 포함하고 있기 때문에 바이오 칩의 센싱 전극 간의 도전성에 영향을 주게 된다. 그리고 이러한 완충용액 등의 센싱 전극 간 도전성에 대한 영향은 완충용액을 유전체로 하는 상기 가상의 전극판과 다른 센싱 전극 간 커패시턴스값(Ct)에 영향을 주고, 결국에는 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 영향을 준다.
한편, 하기 수학식 4에 정의된 바와 같이 커패시턴스는 전극 간 물질의 유전상수에 의해 의존하고 전극 간 물질의 유전상수가 작으면 커패시턴스는 작음을 알 수 있다.
[수학식 4]
Figure PCTKR2009000285-appb-I000004
그런데, 전술한 완충용액과 같은 반응 용액은 이온 성분의 전도성으로 인해 유전상수가 작기 때문에 수학식 3의 전체 커패시턴스 변화값(CT)을 구성하는 성분인 1/Ct는 크게 된다. 따라서, 바이오 칩의 반응 챔버에 수용된 완충용액 환경 하에서 생리활성물질의 반응을 진행시키면 센싱 전극과 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)은 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 버리게 된다. 즉, 상기 수학식 3에서 알 수 있는 바와 같이, 완충 용액과 같은 이온을 포함하는 반응용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)의 역수값(1/Ct)이 크기 때문에 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)은 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 영향을 주지 못하게 된다. 따라서, 바이오칩의 센싱 전극에 의한 전기적 검출로는 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 판단할 수 없게 되는 문제가 발생한다.
이와 관련하여 도1에는 측정대상이 되는 특정 타겟 DNA 템플리트가 존재하는 경우에도 PCR 반응 전후에 있어서 주파수 변화에 대한 임피던스 변화 곡선이 동일한 것이 도시되어 있다. 만약, 종래기술의 바이오 칩이 생리활성물질인 특정 타겟 DNA 템플리트의 PCR 반응을 정밀하게 측정한다면 센싱 전극에 고정된 프라이머와 템플리트 ssDNA 간의 PCR 반응에 의한 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)을 전기적으로 검출해야 할 것이다. 그리고, 이러한 PCR 반응에 의한 DNA 증폭 후 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)은 임피던스 변화로 반영되어야 하므로 PCR 반응 전후에 있어서 임피던스 변화 곡선의 패턴도 변화되는 것이 관찰되어야만 할 것이다.
그러나, 앞서 설명한 바와 같이 센싱 전극과 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)은 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 버리기 때문에 바이오칩 전극에 연결된 임피던스 측정장치에서 측정된 임피던스 변화곡선은 PCR 반응 전후에 있어서 변화가 없고 단일 곡선으로만 관찰된다(도1 참조). 따라서, 종래의 바이오 칩에서는 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액을 유전체로 하는 가상의 전극판과 센싱 전극 사이의 커패시턴스값(Ct)에 의해 묻히게 되어 전체 커패시턴스 변화값(CT)을 반영하는 2개의 임피던스 변화 곡선이 측정되지 않으므로 실제 생리활성분자의 반응여부 및/또는 존재여부를 감지하기가 어려운 문제점이 있었다.
이와 관련하여 미국특허공개 US2004/0110277호에는 바이오센서의 센서 셀의 전극에 프로브 DNA 부착되어 있고 이 프로브와 타겟 DNA와의 혼성화에 의해 커패시턴스가 변화하고 이에 의해 트랜지스트의 전류값이 변동하여 혼성화 반응을 센싱하는 방식이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같은 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 센싱 전극에 부착된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응이 전기적으로 검출되지 못하는 문제에 대해서는 주목하고 있지 않다.
또한, 미국특허공개 US2006/0226030호에는 기판, 전극 및 기판에 부착된 캐처 분자로 구성된 센서로서, 캐처 분자가 금속성 볼(다른 분석물질과는 다른 유전상수 지님)로 표지된 DNA 단일 사슬과 혼성화되면 혼성화 결과, 전극을 상기 표지가 둘러싸서 전극 임피던스의 커패시턴스 부분이 변화하고 이를 측정함으로써 혼성화 반응을 센싱하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 이 역시 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질 간의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 실제 반응에 따른 전기적 특성 변화를 민감하게 체크하지 못하는 문제에 대해서 주목하고 있지 않다.
그 밖에 종래기술은 바이오 칩의 센싱 민감도 향상을 위해서 IDE에서 센서 전극의 폭을 줄여 센싱 민감도를 향상시키는 방식을 개시하고 있을 뿐, 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되어 커패시턴스 변화 및 임피던스 변화를 민감하게 감지하지 못하는 문제에 대해서는 인식하고 있지 않다.
따라서, 종래의 바이오칩 및 이를 이용하여 생리활성물질의 반응여부 및/또는 존재여부를 확인하는 방법은 개선되어야 할 문제점이 있었다.
이에 본 발명의 발명자들은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극 표면에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영하도록 한 생리활성물질을 검출하는 방법 및 바이오칩을 고안하기에 이르렀다.
본 발명은 전술한 바와 같은 종래기술에 있어서 바이오 센서 전극에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화를 민감하게 감지하지 못하는 문제를 해결하는데 그 목적이 있는 발명으로서, 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 및/또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화, 보다 상세하게는 임피던스 변화 또는 커패시턴스 변화를 반응 챔버 내에 제공된 센싱 전극을 통해 정밀하게 검출하는 방법 및 이를 위해 제공되는 바이오칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극 표면에서의 실제 반응에 의한 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영하도록 한 생리활성물질을 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩을 제공하는 그 목적이 있다.
전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해서는 센싱 전극에 고정된 수용체와 생리활성물질의 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않도록 할 필요가 있다. 이를 위해 1/Ct값을 작게, 즉 Ct값을 크게 할 필요가 있다.
그런데, 전술한 바와 같이 커패시턴스는 상기 수학식 4와 같이 정의된다. 따라서, Ct를 크게 하는 위해서는 전극의 면적을 크게 하거나, 전극 간 간격을 좁게 하거나, 또는 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하는 방법이 있다.
종래 기술은 전술한 바와 같이 바이오 칩의 IDE에서 센서 전극의 폭을 줄여Ct를 크게 함으로써 센싱 민감도를 높이는 방식을 사용하고 있으나 전극의 폭을 줄이는 것은 고도의 미세전극형성 기술이 요구되어 비용 면이나 효율 면에서 바람직하지 못하다.
이러한 점을 감안하여 본 발명에서는 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수 ε(또는 유전율이라고도 함)를 크게 하는 방식을 채택하고 있다. 이러한 방법은 고도의 미세전극 형성기술을 요하지 않으면서도 전극 간 커패시턴스의 변화량이 왜곡되지 않고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응의 결과를 정확하게 반영할 수 있다.
그런데, 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 사이에는 검출대상 시료의 반응을 위한 반응 용액이 채워진다. 따라서, 이러한 반응 용액의 유전 상수를 높이는 것이 필요하다. 그러나, 검출대상 시료의 반응을 위한 반응용액은 이온 성분에 의해 유전상수의 조정이 어렵다.
일반적으로, 유전상수는 전극 사이에 유전체로서 어떤 물질을 넣을 때의 정전 용량과 아무것도 넣지 않은 경우의 정전 용량의 비로 정의되는데, 일반적으로 유전체의 유전율은 항상 1보다 크다. 액체의 경우에는 물이 유전상수가 가장 큰 것으로 알려져 있는데 실온에서 유전상수는 대략 80 정도로 알려져 있다. 그러나, 검출대상 시료의 반응을 위해서는 증류수나 탈이온수와 같은 물을 반응용액으로 직접 사용할 수 없다.
따라서, 본 발명에서는 검출대상 시료의 반응은 일반적인 반응용액 하에서 수행하되, 반응 전에 반응 챔버 내에 물과 같은 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하고, 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 채워 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정한 후, 반응 전후의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교함으로써 검출대상 시료 내에 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 확인하는 방식을 채택한다.
구체적으로, 본 발명의 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법은, (a) 검출대상 시료가 수용되는 반응 챔버와, 상기 반응 챔버 내에 위치하고 상기 검출대상 시료 내의 생리활성물질의 검출을 위한 복수개의 센싱 전극을 구비하는 전기적 검출장치를 제공하는 단계와, (b) 상기 반응 챔버 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와, (c) 상기 반응 챔버로부터 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 제거한 후, 상기 반응 챔버 내에 반응용액 및 검출대상 시료를 제공하는 단계와, (d) 상기 반응용액 하에서 상기 검출대상 시료를 상기 반응 챔버 내에서 반응시키는 단계와, (e) 상기 반응용액을 상기 반응 챔버로부터 제거하는 단계와, (f) 상기 반응 챔버 내로 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와, (g) 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값과 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계 및 (f)단계에서는 교류전원을 이용하는 측정장치에 의해 각각의 주파수별로 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정할 수 있다. 이 경우, 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값은 주파수값에 대한 곡선으로 표현될 수 있다. 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선이 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선과 구분되는 경우 상기 검출대상 시료 내에 생리활성물질이 존재하거나 생리활성물질이 센싱 전극과 반응하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 유전상수가 약 4 이상인 유체인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 유전상수가 약 80 이상인 것이 바람직하다. 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체의 예로는 증류수 또는 탈이온수(deionized water)를 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 전술한 바와 같이 유전상수가 약 4이상인 유체이면 적용가능하다.
본 발명의 일실시예에서 있어서, 상기 센싱 전극은 금, 크롬, 구리 또는 알루미늄으로 형성하는 것이 바람직하다. 상기 센싱 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되고, 각 전극 사이의 간격은 대략 1-20μm일 수 있고, 대략 1-4μm인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서 있어서, 상기 복수개의 센싱 전극에는 상기 생리활성물질과 상호작용을 하는 수용체가 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 "생리활성물질(biomolecule)"은 상기 센싱 전극에 결합된 수용체와 상호작용을 하는 물질로서, 하나 내지 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 하나 내지 그 이상의 펩타이드로 구성된 단백질, 아미노산, 당 지질, 또는 저분자 화합물이고, 바람직하게는 항원, DNA, RNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, "수용체"는 상기 센싱 전극에 결합되어 생리활성물질과 상호작용을 하는 물질로서, 하나 내지 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 하나 내지 그 이상의 펩타이드로 구성된 단백질, 아미노산, 당 지질, 또는 저분자 화합물이고, 바람직하게는 항체, 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에서 상기 수용체는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 상기 생리활성물질은 핵산이며, 상기 반응용액은 핵산 혼성화(nucleic acid hybridization) 반응 용액인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서 상기 수용체는 올리고뉴클레오티드 프라이머이고, 상기 생리활성물질은 핵산이며, 상기 반응용액은 PCR 반응 용액인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 사용되는 바이오 칩은 단일 기판 형태로 형성될 수 있으나, 두 개의 기판이 접합된 형태일 수도 있다. 이러한 본 발명의 일실시예의 바이오 칩의 예로서 DNA 혼성화 칩 또는 PCR 반응 칩을 들 수 있다.
두 개의 기판이 접합된 형태의 본 발명의 바이오 칩의 일실시예는, 생리활성물질과 상호작용하는 수용체가 결합되어 있는 복수개의 센싱 전극이 형성된 제1기판과, 상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함한다.
상기 제1기판은 N형 또는 P형 실리콘 기판 상의 SiO2 절연층 위에 복수개의 센성 전극이 형성된 것으로서 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부의 확인을 위한 전기적인 검출을 수행한다. 상기 제2기판은 상기 제1기판의 센싱 전극이 외부 환경과 접촉되는 것을 방지하면서 상기 제1기판과 결합하여 반응챔버 공간을 형성한다.
상기 반응챔버는 유전상수가 큰 레퍼런스 유체가 채워진 후 전극 간 임피던스 및/또는 커패시턴스가 측정되는 공간이다. 또한, 상기 반응챔버는 반응용액 및 검출대상 시료가 채워진 후, 검출대상 시료 내에 존재하는 생리활성물질의 반응이 수행되는 공간이다. 상기 센싱 전극에 수용체가 부착되어 있는 경우에는 상기 반응 챔버 내의 생리활성물질과 상기 수용체가 반응하고 이러한 반응 결과로 전극 간 임피던스 및/또는 커패시턴스의 변화가 일어나게 된다.
상기 기판들은 적용되는 수용체의 종류 및 수, 예를 들어 프로브 또는 프라이머의 종류 및 수 등에 따라 다양한 사이즈를 가질 수 있다. 또한, 상기 기판들은 정사각형, 직사각형, 원형의 형상을 가질 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제1기판은 실리콘 기판이고, 상기 제2기판은 유리 기판인 것이 바람직하나, 이들 기판은 이외에도 유리, 실리콘 기판, 융합 실리카, 폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카보네이트, 금, 은, 구리, 또는 백금 중 어느 하나로 구성될 수 있다.
또한, 상기 반응 챔버 공간을 형성하는 상기 제2기판에는 상기 제2기판의 두께 방향으로 유체 유입구가 관통되어 형성되어 있으며, 상기 유체 유입구에 대향하는 위치에 상기 제2기판의 두께 방향으로 유출구가 관통되어 형성되어 있다. 상기 유입구와 상기 반응챔버, 그리고 상기 유출구와 상기 반응챔버는 유체가 유동될 수 있도록 연통된다. 상기 유입구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유출된다.
또한, 상기 제2기판 상에는 제3기판이 적층되어 상기 유입구로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널과, 상기 유출구로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널이 형성될 수 있다. 유입 마이크로 채널에는 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있고, 유출 마이크로 채널에는 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있다.
또한, 상기 유입 마이크로 채널 및/또는 유출 마이크로 채널에는 반응 챔버 내로의 유체의 유입 및 반응 챔버로부터 유체의 유출을 제한할 수 있는 밸브 구조가 제공될 수 있다. 상기 밸브구조는 상기 주입구와 상기 반응챔버 사이에서, 또는 상기 배출구와 상기 반응챔버 사이에서 상기 제3기판의 두께 방향으로 관통된 후 연장된 통로로서 연장된 통로에는 오일이 내장되어 있다. 이러한 밸브구조의 통로에 질소가스(N2)가 주입되면 통로에 내장된 오일이 팽창하고 오일의 팽창에 의해 상기 채널이 막히게 되어 주입구로부터 반응챔버로의 유체의 유입 그리고 반응챔버로부터 배출구로의 유체의 유출이 차단되게 되는 것이다. 상기 제3기판은 PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 형성되는 것이 바람직하다.
전술한 마이크로 채널과 밸브 구조는 당업계에서 널리 사용되고 있는 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-System) 기술을 이용하여 마이크론 단위 내지는 나노 단위로 형성하되, 수용체의 크기, 전극 크기, 또는 반응조건에 따라 채널과 밸브의 크기를 조정할 수 있다.
이러한 채널 구조와 밸브 구조는 전술한 본 발명의 방법에 있어서 반응 전에 는 반응 챔버 내에 유전상수가 큰 유체를 채워 넣는 과정, 반응시에는 반응 챔버에서 유전상수가 큰 유체를 제거하고 반응용액 및 검출대상시료를 채워넣는 과정, 그리고 반응 완료 후에는 반응용액을 제거하고 유전상수가 큰 유체를 다시 채워 넣은 과정의 수행을 용이하게 한다. 이를 위해 유체, 반응용액 및 검출대상시료의 주입 및 제거를 위한 주입펌프 및 배출펌프가 본 발명의 바이오칩에 제공될 수 있고 펌프 구동수단으로서 소형모터나 기어박스가 제공될 수 있다.
한편, 상기 복수개의 센싱전극에는 임피던스측정기(Impedence analyzer)가 전기적으로 연결될 수 있다. 바이오 칩이 PCR 반응 칩인 경우에는 PCR 반응을 수행하는 PCR 기기에 바이오 칩이 수용되도록 구성하면 바이오 칩과 PCR 기기가 하나의 세트로서 구성이 가능하다. 이때 PCR 기기는 임피던스 측정 장치를 포함하는 것을 사용하고, 바이오 칩의 센싱 전극에 상기 내장된 임피던스 측정 장치를 전기적으로 연결하도록 세트로서 구성하면 바람직하다.
본 발명은 센싱 전극 표면에서의 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되는 문제에도 불구하고 반응 챔버 내의 생리활성물질의 생물학적, 생화학적 또는 화학적 반응에 따른 전기적 특성 변화를 정밀하게 검출할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 바이오 칩의 반응 챔버 내의 전극 간 물질의 유전상수를 크게 하여 센싱 전극에 부착된 수용체와 검출대상이 되는 생리활성물질 간의 반응에 따른 커패시턴스 변화량이 왜곡되지 않고 전체 커패시턴스 변화량에 정확하게 반영되어 생리활성물질의 존재여부 및/또는 반응여부를 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도1은 종래의 PCR 반응 검출 방식을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
도2는 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩을 제조하는 공정을 설명하는 공정 순서도이다.
도3은 도2의 공정에 따라 제작된 DNA 혼성화 칩의 전극부분을 도시하는 평면도이다. 도3의 (a)는 DNA 혼성화 칩 전극 부분 전체를 도시하고 있고, 도3의 (b)는 도3의 (a)에 도시된 전극의 일부를 확대하여 모식적으로 도시하고 있으며, 도3의 (c)는 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)을 일부 확대하여 도시하고 있다.
도4는 도3의 (b)의 금속전극(20)을 A-A'선을 따라 절취한 횡단면도이다.
도5는 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩을 제조하는 공정을 설명하는 공정 순서도이다. 도5의 (A)는 PCR 반응 칩의 실리콘 기판을 제조하는 공정을 설명하고 있고, 도5의 (B)는 PCR 반응 칩의 유리 기판을 제조하는 공정을 설명하고 있으며, 도5의 (C)는 실리콘 기판과 유리 기판이 접합된 상태를 나타내는 도면이다.
도6은 PDMS 기반의 유체제어 기판이 부착된 PCR 반응 칩을 도시하는 단면도이다. 도6의 (A)는 유체제어 기판이 앞서 제작된 PCR 반응 칩의 유리기판 상에 부착된 것을 도시하고 있으며, 도6의 (B) 및 (C)는 유체제어 기판의 밸브 기능에 의해 PCR 반응 칩 내에서의 유체의 유동이 제어되는 과정을 설명하고 있다.
도7은 전극 어레이형 칩을 나타내는 도면이다.
도8은 본 발명의 DNA 혼성화 반응 검출 방법을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
도9는 본 발명의 PCR 반응 검출 방법을 이용하여 측정한 임피던스 변화 곡선이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: DNA 혼성화 칩의 제작
본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 있어서, 검출대상 생리활성물질이 DNA이고 센싱 전극에 결합되는 수용체가 올리고뉴클레오티드 프로브인 경우 생리활성물질인 DNA와 프로브의 혼성화 반응을 위한 DNA 혼성화 칩을 제작한다.
DNA 혼성화 칩 센서는 당업계에 알려진 일반적인 방법을 이용하여 제작하는데, 산화 실리콘 박막 형성 기술, 포토리소그래피(photolithography)기술, 노광 패너팅 기술, 현상 기술, 습식 및/또는 건식 에칭 기술 등을 사용하여 제작한다. 상세하게는 MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 기판 상에 IDE(Interdigitated Electrode)형태의 센싱 금속 전극을 형성한 후, 올리고뉴클레오티드 프로브를 센싱 전극에 고정하는 방식으로 제작된다.
아래에서는 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩의 제조과정을 단계별로 설명한다.
실시예 1-1: 전극이 형성된 실리콘기판의 제작
이하에서는 도2를 참조하여 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩(100)의 기판(10)과 전극(20)을 형성하는 과정을 간략히 설명한다.
두께가 500μm인 N-형 실리콘 웨이퍼(10)를 열산화시켜 산화 절연막층인 약 10,000Å의 SiO2 층(12)을 형성하였다(도2의 (a)단계). 그런 다음, 상기 절연막층(12)을 포토레지스트 AZ 5214(14)로 도포하였다(도2의 (b)단계). 상기 포토레지스트(14) 상에 금속 전극 패턴의 마스크(미도시)를 올려놓고 자외선에 노광시킨 후 상기 실리콘 웨이퍼(10)를 AZ300MIF 현상액에 담가 현상하고 에칭처리하였다(도2의 (c)단계). 상기 에칭된 웨이퍼(10)상에 크롬(Cr)(300Å) 및 금(Au)(3000Å) 박막(20)을 증착시켰다(도2의 (d)단계). 상기 크롬 및 금 박막(20)의 증착은 화학기상증착(chemical vapor deposition; CVD), 진공 증착(vacuum evaporation) 또는 스퍼터링(sputtering)을 이용하여 수행하였다. 그런 다음, 알려진 리프트-오프(lift-off) 공정을 이용하여 남겨진 포토레지스트층(14)과 이 남겨진 포토레지스트층 상의 박막의 일부를 제거하여 금속 전극(20)을 형성하였다(도2의 (e)단계). 그리고, 금속 전극을 IDE 형태로 형성하기 위해 추가적으로 포토레지스트 AZ4620(16)을 도포하고 당업계에 잘 알려진 포토리소그래피 공정을 이용하여 미세한 IDE(Interdigitated Electrode) 형태로 전극(20)을 패터닝하였다(도2의 (f)단계).
완성된 DNA 혼성화 칩(100)은 도3에 도시된 바와 같다. 도3의 (a)에서 도시된 DNA 혼성화 칩(100)은 전극(20) 부분의 직경(R)이 대략 2.4mm이나, 전극 어레이형 DNA 혼성화 칩(도7 참조) 제작을 위해서는 가능한 직경이 작을 수록 좋다. 전극(20) 면적은 대략 3.6 mm2이다.
도3의 (b)는 도3의 (a)에 도시된 전극(20)의 일부를 확대하여 모식적으로 나타낸 도면이다. 이해를 돕기 위해 전극(20)의 형상은 사각형으로 표시하였으나, 실제 전극(20)은 원형 또는 타원형일 수 있다. 도3의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 사용되는 DNA 혼성화 칩(100)의 센싱 전극(20)은 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)이 서로 일정한 간격을 두고 엇갈리게 배열되어 있음을 알 수 있다.
한편, 도3의 (c)에는 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)을 일부 확대한 것이 도시되어 있다. 각 전극(20a, 20b) 너비(t)는 대략 10μm이고, 전극 간 간격(d)은 대략 4μm이다.
실시예 1-2: 전극에 올리고뉴클레오티드 프로브 고정
우선, 실시예 1-1에서 제작된 DNA 혼성화 칩(100)의 전극(20)을 산소 플라즈마(150W, 100mtorr)로 10초간 세정하여 전극(20)상의 불순물을 완전히 제거하였다. 그런 다음, 상기 전극(20)에 프로브 DNA의 한쪽 말단(5' 또는 3')을 고정시킨다. 고정을 위해 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 티올(thiol)기와 탄소사슬(-CH2-)을 결합시킨 5'-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3'의 프로브를 제작하고, 이를 금속 전극(20)의 표면에 SAM(Self- Assembled Method)으로 고정시킨다. 구체적으로 10 pmol/㎕의 SH-ssDNA 프로브를 MgCl2 용액 환경 하에서 18시간 반응시켰다. 그 결과, 프로브의 -SH기와 금속 표면의 반응으로 금속 전극(20) 표면에 프로브 DNA(22)가 고정된다(도4 참조).
한편, 티올기 외에도 프로브 DNA와 전도성 폴리머를 결합시킨 후, DNA와 결합되어 있는 전도성 폴리머를 공지된 SAM(Self Assembled Method) 방법을 이용하여 금속 전극 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 전도성 폴리머로는 공지된 전도성 폴리머가 모두 사용될 수 있으며, 예를 들어, 특히 고전도성 폴리머인 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 폴리(p-페닐렌) (Poly(p-phenylene): PPP), 폴리피롤(Polypyrrole: PPy), 폴리아닐린(Polyaniline), 폴리티오펜(Polythiophene) 등이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머와 프로브 DNA는 폴리머와 DNA간의 공지된 결합방법을 이용하여 결합시킬 수 있다.
도4는 도3의 (b)의 금속전극(20)을 A-A'선을 따라 절취한 횡단면도로서, 산화절연막(12)을 사이에 두고 실리콘 기판(10)상에 형성된 금속전극(20a, 20b)에 프로브 DNA(22)가 고정된 모습이 도시되어 있다.
실시예 2: DNA 혼성화 칩을 이용한 타겟 염기서열의 검출
실시예 1-2에서 제작된 도4의 DNA 혼성화 칩(100)을 이용하여 검출대상 시료 내에 타겟 염기서열(5'-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3')이 존재하는지 여부를 검출하였다.
우선, DNA 혼성화 칩(100)의 전극들(20)간 반응 공간 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 용액인 탈이온수를 도입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
그런 다음, DNA 혼성화 칩(100)에서 레퍼런스 용액을 제거하고, 전술한 타겟 염기서열(10 pmol/㎕의 ssDNA)을 포함하는 검출대상 시료와 TE 완충용액을 DNA 혼성화 칩(100)의 반응 공간 내로 도입하였다. 18시간 동안 실온에서 혼성화 반응조건에 따라 인큐베이션시켜 DNA 혼성화 칩(100)의 전극(20)에 고정된 프로브 DNA(22)와 타겟 염기서열(5'-GAC GAC TGA ATC CGG TGA GAA TGG-3')을 포함하는 ssDNA가 혼성화되도록 하였다.
다시, DNA 혼성화 칩(100)에서 상기 완충용액을 완전히 제거하고 탈이온수를 주입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
전술한 바와 같은 혼성화 반응 전의 임피던스 측정값과 혼성화 반응 후의 임피던스 측정값의 결과를 도8에 나타내었다. 도8에서는 종래기술의 도1의 경우와는 달리, 타겟 염기서열을 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우 혼성화 반응 전의 임피던스 측정값 곡선과 혼성화 반응 후의 임피던스 측정값 곡선이 구분되어 2개의 곡선으로 관찰되었다. 도8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혼성화 반응 진행 후 반응 용액 내에 타겟 DNA가 존재할 경우 임피던스값은 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서, ss-DNA가 혼성화 반응을 통하여 ds-DNA로 되었을 때 그 전도성이 증가하여 임피던스값이 감소하였음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 방법에서는 센싱 전극에 고정된 프로브와 타겟 ssDNA의 혼성화 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않고 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 반영된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 도8에 도시된 바와 같이 혼성화 반응 전후에 있어서 임피던스값의 변화곡선이 2개로 관찰되므로 혼성화 반응 여부 및 타겟 DNA 존재여부를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있다.
한편, 타겟 염기서열이 없는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 도8에 도시된 바와 같이 임피던스 측정값이 포지티브인 경우의 임피던스 값 보다 작음을 알 수 있다.
실시예 3: PCR 반응 칩의 제작
본 발명의 생리활성물질을 검출하는 방법에 있어서, 검출대상 생리활성물질이 DNA이고 센싱 전극에 결합되는 수용체가 올리고뉴클레오티드 프라이머인 경우, 프라이머 및 PCR 반응용액에 의해 생리활성물질인 DNA가 증폭되는 PCR 증폭 반응을 위한 PCR 반응 칩을 제작한다.
PCR 반응 칩 역시 DNA 혼성화 칩 센서와 같이 당업계에 알려진 방법을 이용하여 제작하는데, 실리콘 기판과 전극 부분은 산화 실리콘 박막 형성 기술, 포토리소그래피(photolithography)기술, 노광 패너팅 기술, 현상 기술, 습식 및/또는 건식 에칭 기술 등을 사용하여 제작한다. MEMS(Micro-Electro-Mechanical-Systems)기술을 이용하여 실리콘 기판 상에 IDE(Interdigitated Electrode) 형태의 센싱 금속 전극을 형성한 후, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 센싱 전극에 고정하는 방식으로 제작된다. 또한, 실리콘 기판 상에 부착되는 유리 기판 부분은 당업계에 알려진 글래스 습식 에칭(glass wet-etching) 및 샌드 블라스트(sand blasting) 기술을 이용하여 제작한다.
아래에서는 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩의 제조과정을 단계별로 설명한다.
실시예 3-1: 실리콘기판, 전극 및 유리기판 제조
도5를 참조하여 본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩(200)의 제조과정을 설명한다.
1. 실리콘 기판 및 금속 전극의 형성
두께가 500μm의 N-형 실리콘 웨이퍼(10)를 열산화시켜 산화 절연막층인 약 5000Å의 SiO2 층(12)을 형성하였다(도5A의 (a)단계). 통상의 포토리소그래피 공정을 이용하여 Ti/Au (300Å/3000Å)의 금속 전극(20)을 패터닝하고, 이온 밀링 공정을 이용한 건식 에칭으로 IDE 전극으로 형성되지 않는 부분을 제거하여 미세한 IDE(Interdigitated Electrode) 전극 부분을 형성하였다(도5A의 (b)단계). 그런 다음, 상기 패터닝된 금속 전극(20)위에 화학기상증착법, 진공 증착법 또는 스퍼터링 등을 이용하여 1μm 이상의 SiO2 막(18)을 증착시킨 후(도5A의 (c)단계), 화학 기계적 연마법(CMP)을 이용하여 절연막인 SiO2 막(18)을 평탄화하였다(도5A의 (d)단계). 그리고 나서, 통상의 포토레지스트와 포토리소그래피 공정을 이용하여 IDE 전극 부분만을 건식 에칭(RIE) 또는 습식 에칭(BOE)을 수행하여 Au 금속 전극 표면이 노출되도록 하였고, 후술하는 유리기판(30)과 접합되는 절연막(18) 부분을 형성하였다(도5A의 (e)단계).
도시하지는 않았으나, 완성된 금속 전극(20)의 패턴은 도3의 (a)에 도시한 DNA 혼성화 칩의 금속 전극(20)의 패턴과 유사하고, 손가락 형상의 한 쌍의 전극(20a, 20b)이 서로 일정한 간격을 두고 엇갈리게 배열되어 있다. 전극(20) 부분의 직경(R)은 대략 8.6mm이나, 전극 어레이형 PCR 반응 칩(도7 참조) 제작을 위해서는 가능한 직경이 작을 수록 좋다. 각 전극(20a, 20b) 너비(t)는 대략 20μm이고, 전극 간 간격(d)은 대략 20μm이다.
2. 유리 기판의 제작 및 PCR 반응 칩의 제작
도5B에 도시된 바와 같이, 반도체 공정에서 통상 사용되는 유리 기판(Pyrex사 제품)(30)의 상하 면에 Cr/Au (300Å/3000Å)의 금속 박막(32)을 화학기상증착법, 진공 증착법 또는 스퍼터링 등을 이용하여 증착시켰다(도5B의 (a) 단계). 통상의 포토리소그래피 공정을 이용하여 상부에 형성된 금속 박막(32)을 패터닝하고 습식 에칭을 수행하여 유리 기판(30) 중 추후 공정 처리되는 부분에 대한 보호층(32)을 형성하였다(도5B의 (b)단계). 그런 다음, PCR 반응 칩의 반응 챔버 공간 형성을 위해 보호층(32)에 의해 차폐되지 않는 유리기판(32) 부분을 습식 에칭처리하였다(도5B의 (c)단계). 그리고 상부 및 하부에 형성된 금속 박막(32)을 모두 제거하고, PCR 반응 칩의 유입/유출 구멍(36a, 36b)형성을 위해 유리기판(30)의 밑면에는 블루 테이프(패터닝을 할 수 있는 블루 테이프이면 사용가능) 패터닝(34)을 수행하였다(도5B의 (d)단계). 그런 다음, 당업계에 알려진 샌드 블라스트 공법에 의해 유리기판(30)에 대해 두께 방향으로 유입/유출 구멍 등의 관통구를 형성하였다(도5B의 (e)단계).
앞서 제작된 금속 전극(20)이 형성된 실리콘 기판(10)과 유리 기판(30)을 도5C에 도시된 바와 같이 양극 접합법(anodic bonding)을 이용하여 접합하였고, 접합된 실리콘 기판(10)과 유리 기판(20)을 다이싱하여 최종 PCR 반응 칩(200)을 제작하였다.
상기 양극 접합법은 실리콘 기판과 유리 기판을 접합시키기 위한 방법으로서, 높은 전기장과 열을 가하여 유리 기판 내에 존재하는 양전하를 띤 이온(예를 들면, Na+ 이온)들을 실리콘과 유리가 접지하는 반대편으로 이동시켜 실리콘 기판과 유리 기판의 표면에서 수소결합을 형성시켜 두 기판을 접합시키는 방법이다.
두 개의 기판이 접합된 형태의 PCR 반응 칩(200)에서 상기 실리콘 기판(10)에는 복수개의 센싱 금속 전극(20)이 형성되어 있고(도5 및 도6A 참조), 이 금속 전극에는 타겟 DNA 템플리트(target DNA template)에 대한 프라이머(22)가 고정되어 결합되어 있다(도6A 참조). 그리고 이러한 실리콘 기판(10)은 유리기판(30)과 일정한 거리를 두고 접합되어 반응 챔버 공간(46)을 형성한다(도5 및 도6A 참조).
상기 반응 챔버 공간(46)은 탈이온수의 레퍼런스 용액이 채워진 후 전극 간 임피던스값이 측정되는 공간이다. 또한, 상기 반응 챔버 공간(46)은 검출 대상 시료와 PCR 반응 용액이 수용되어 PCR 반응이 수행되는 공간으로서, 실리콘 기판(10)의 금속 전극(20)에 고정된 프라이머(22)에 검출 대상 시료 내에 존재하는 타겟 DNA 템플리트가 상보적 결합을 이루면 PCR 반응이 진행되는 공간이다.
따라서, 이러한 PCR 반응에 따른 금속 전극(20)간 임피던스 변화를 전기적으로 검출하게 되면 검출 대상 시료 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재하는지 여부를 검출할 수 있는 것이다.
유리기판(30)은 반응 챔버 공간(46)을 외부로부터 보호하는 역할을 한다. 또한, 유리기판(30)에는 두께 방향으로 유체 유입구(36a)가 관통되어 형성되어 있으며, 상기 유체 유입구(36a)에 대향하는 위치에 두께 방향으로 유출구(36b)가 관통되어 형성되어 있다(도5 및 도6A 참조). 도5 및 도6A에 도시된 바와 같이, 상기 유입구(36a)와 상기 반응챔버(46), 그리고 상기 유출구(36b)와 상기 반응챔버(46)는 유체가 유동될 수 있도록 연통되어 있다. 상기 유입구(36a)를 통해 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구(36b)를 통해 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 유출된다.
3. PDMS 기반 유체제어 기판의 제작
한편, PCR 반응 칩(200) 내에서의 유체의 유동을 제어하기 위해서 PDMS 기반의 유체제어 기판(40)을 제작하여 앞서 제작된 PCR 반응 칩(200)의 유리기판(30)상에 부착한다.
본 발명에 사용되는 PCR 반응 칩(200)의 유체제어 기판(40)은 칩 내부를 볼 수 있게 하기 위해 투명 중합체로 제작되는 것이 바람직한데, 특히PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 제작되는 것이 바람직하다. PDMS의 장점은 실리콘보다 값이 싸고 공정이 쉬우며 유연하고 다른 표면과 접합할 때 방수가 가능하다는 것이다. 또한, 생물 친화적이기 때문에 생리활성물질에 부정적인 영향을 주지 않는다. 그러나 단백질과 세포와 같은 소수성 성분의 비특이적 흡착이 발생할 수 있으므로, 반응성 도료의 증착 또는 그라프트 공중합 처리를 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유체제어 기판(40)의 주입구(42), 채널(44a, 44b) 및 배출구(48)를 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅하면 소수성 성분의 비특이적 흡착을 최소화할 수 있다.
먼저, 유체제어 기판(40)을 CAD(computer aided design) 프로그램에 의해 고안한 후, 고안된 디자인을 포토마스크(photomask)에 인쇄하고 불순물을 제거하였다. 실리콘 웨이퍼 위에 네거티브형 포토레지스트인 SU-8을 스핀코팅하고, 유체제어기판(40)의 주입구(42), 밸브구조(52), 마이크로 채널(44a, 44b) 및 배출구(48) 패턴의 포토 마스크를 사용한 노광 및 현상 공정을 통해 주형을 제작하였다. 그리고, 액체 상태의 PDMS를 상기 SU-8 주형에 붓고 열처리를 가해 굳힌 뒤 주형으로부터 분리해 내었다. 분리된 PDMS 유체제어기판(40)을 PCR 반응 칩(200)의 크기에 따라 자른 뒤 펀치를 이용하여 주입구(42)와 배출구(48) 등의 위치에 원하는 크기로 구멍을 뚫었다. 그런 다음, 상기 제작된 유체제어기판(40)을 플라즈마 산화하여 PCR 반응 칩(200)의 유리 기판(30)상의 대응하는 위치에 접착시켰다.
이와 같이 유체제어 기판(40)이 부착되어 최종적으로 제작된 PCR 반응 칩(200)의 종단면도가 도6A에 도시되어 있다.
상기 유체제어 기판(40)이 상기 유리기판(30)상에 부착됨으로써 유입구(36a)로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널(44a)과, 유출구(36b)로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널(44b)이 형성된다. 유체제어 기판(40)에는 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구(42)가 관통되어 형성되어 있는데, 이 주입구(42)는 상기 유입 마이크로 채널(44a)과 연통되어 유체가 반응 챔버(46) 내로 유입될 수 있게 해 준다. 또한, 유체제어 기판(40)에는에는 탈이온수의 레퍼런스 용액, PCR 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구(48)가 관통되어 형성되어 있는데, 이 배출구(48)는 상기 유출 마이크로 채널(44b)과 연통되어 반응 챔버(46)로부터 유체가 외부로 배출될 수 있게 해 준다.
또한, 상기 유체제어 기판(40)에는 상기 주입구(42)와 상기 반응챔버(46) 사이, 그리고 상기 배출구(48)와 상기 반응챔버(46) 사이에서 유체제어 기판(40)의 두께 방향으로 관통된 후 길이방향으로 연장된 통로(52)가 형성되어 있다(도6A 및 도6B 참조). 이러한 통로(52)는 유입 마이크로 채널(44a) 및/또는 유출 마이크로 채널(44b)에 대한 밸브기능을 수행한다. 즉, 상기 통로(52)에는 실리콘 오일(50)이 내장되어 있는데, 도6C에 도시된 바와 같이 실리콘 오일(50)이 내장된 통로(52)에 질소가스(N2)가 주입되면 통로(52)에 내장된 실리콘 오일(50)이 팽창하고 실리콘 오일(50)의 팽창에 의해 상기 채널(44a, 44b)이 막히게 된다. 따라서, 유체제어 기판(40)은 주입구(42)로부터 반응챔버(46)로의 유체의 유입 그리고 반응챔버(46)로부터 배출구(48)로의 유체의 유출을 차단하여 유체의 흐름을 제어하게 되는 것이다.
실시예 3-2: 전극에 올리고뉴클레오티드 프라이머 고정
우선, 실시예 3-1에서 제작된 PCR 반응 칩(200)의 전극(20)을 Pirahna 용액 (H2SO4 및 H2O2 을 70:30으로 혼합한 것)으로 30분간 세정하여 전극(20)상의 불순물을 완전히 제거하였다.
그런 다음, 상기 전극(20)에 업스트림 프라이머(upstream primer)와 다운스트림 프라이머(downstream primer)의 한쪽 말단(5' 또는 3')을 전극(20)에 고정시킨다. 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머 모두를 전극(20)에 고정시킬 수도 있고, 이중 하나의 프라이머만을 전극에 고정시키고 나머지 하나의 프라이머는 PCR 반응용액에 섞어서 PCR 반응을 진행할 수 있다. 고정을 위해 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 티올(thiol)기와 탄소사슬(-CH2-)을 결합시킨 5'-SH-(CH2)24-GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C-3'의 업스트림 프라이머와 5'-SH-(CH2)24-AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G-3'의 다운스트림 프라이머를 제작하고, 이를 금속 전극(20)의 표면에 SAM(Self- Assembled Method)으로 고정시킨다. 구체적으로 10 pmol/㎕의 SH-ssDNA 업스트림 프라이머 및/또는 다운스트림 프라이머를 TE 완충용액(TE buffer) 환경 하에서 18시간 반응시켰다. 그 결과, 프라이머의 -SH기와 금속 표면의 반응으로 금속 전극(20) 표면에 프라이머 ssDNA(22)가 고정된다. 본 실시예에서 수행된 금속 표면으로의 프라이머의 고정 과정은 도4에 도시된 바와 같은 실시예 1-2에서의 프로브의 고정 과정과 실질적으로 동일하다.
실시예 4: PCR 반응 칩을 이용한 PCR 반응의 분석
실시예 3-2에서 제작된 프라이머가 고정된 PCR 반응 칩(200)(도6 참조)을 이용하여 검출대상 시료 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재하는지 여부 및 PCR 반응 수행여부를 검출하였다.
우선, PCR 반응 칩(200)의 반응 챔버(46) 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 용액인 탈이온수를 도입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
그런 다음, PCR 반응 칩(200)에서 레퍼런스 용액을 제거하고, Promega의 PCR Core System Ⅱ PCR 키트(PCR 반응을 간편하게 수행하기 위해 판매하는 PCR 반응 용액; 미국 Promega사 제품)와 DNA 템플리트를 PCR 반응 칩(200)의 반응 챔버(46) 내로 도입하였다. Promega에서 권장하는 각 PCR 사이클 마다의 PCR 반응시간과 반응온도에 맞추어 PCR 반응을 25 내지 35 사이클 진행하였다.
다시, PCR 반응 칩(200)에서 상기 PCR 반응용액을 완전히 제거하고 탈이온수를 주입한 후, 교류를 인가하여 전극들(20) 간의 임피던스값을 실온에서 측정하였다. 인가된 교류전원의 크기는 100mV이고 임피던스값이 측정된 주파수 대역은 1~32 MHz 범위였다.
전술한 바와 같은 PCR 반응 전의 임피던스 측정값과 PCR 반응 후의 임피던스 측정값의 결과를 도9에 나타내었다. 도9에서는 종래기술의 도1의 경우와는 달리, 타겟 DNA 템플리트를 갖는 포지티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우 PCR 반응 전의 임피던스 측정값 곡선과 PCR 반응 후의 임피던스 측정값 곡선이 구분되어 2개의 곡선으로 관찰되었다. 도9에서 확인할 수 있는 바와 같이, PCR 반응 진행 후 반응 용액 내에 타겟 DNA 템플리트가 존재할 경우 임피던스값은 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서, ss-DNA가 PCR 반응을 통하여 ds-DNA로 되었을 때 그 전도성이 증가하여 임피던스값이 감소하였음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 방법에서는 센싱 전극에 고정된 프라이머와 타겟 DNA 템플리트의 PCR 반응에 의한 커패시턴스 변화값(Cd)이 완충용액에 의한 커패시턴스값(Ct)에 흡수되지 않고 전체 커패시턴스 변화값(CT)에 반영된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 도9에 도시된 바와 같이 PCR 반응 전후에 있어서 임피던스값의 변화곡선이 2개로 관찰되므로 PCR 반응 여부 및 타겟 DNA 템플리트 존재여부를 전기적으로 용이하게 검출할 수 있다.
한편, 타겟 DNA 템플리트가 없는 네거티브 검출대상 시료를 대상으로 실험을 수행한 경우에는 도9에 도시된 바와 같이 임피던스 측정값이 포지티브인 경우의 임피던스 값 보다 작음을 알 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 검출대상 시료가 수용되는 반응 챔버와, 상기 반응 챔버 내에 위치하고 상기 검출대상 시료 내의 생리활성물질의 검출을 위한 복수개의 센싱 전극을 구비하는 전기적 검출장치를 제공하는 단계와,
    (b) 상기 반응 챔버 내로 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와,
    (c) 상기 반응 챔버로부터 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 제거한 후, 상기 반응 챔버 내에 반응용액 및 검출대상 시료를 제공하는 단계와,
    (d) 상기 반응용액 하에서 상기 검출대상 시료를 상기 반응 챔버 내에서 반응시키는 단계와,
    (e) 상기 반응용액을 상기 반응 챔버로부터 제거하는 단계와,
    (f) 상기 반응 챔버 내로 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체를 다시 도입한 후, 상기 센싱 전극들 간의 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 단계와,
    (g) 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값과 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값을 비교하는 단계를 포함하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계 및 (f)단계에서는 교류전원을 이용하는 측정장치에 의해 각각의 주파수별로 임피던스값 또는 커패시턴스값을 측정하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값은 주파수값에 대한 곡선으로 표현되고, 상기 (b)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선이 상기 (f)단계에서 측정된 임피던스값 또는 커패시턴스값의 곡선과 구분되는 경우 상기 검출대상 시료 내에 생리활성물질이 존재하거나 생리활성물질이 상기 센싱 전극과 반응하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 유전상수가 4 이상인 유체인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체는 증류수 또는 탈이온수(deionized water)인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센싱 전극은 IDE(interdigitated electrode)로서 형성되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 센싱 전극의 각각의 전극 사이의 간격은 1-4μm인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센싱 전극에는 상기 생리활성물질과 상호작용을 하는 수용체가 결합되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 수용체는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법.
  10. 복수개의 센싱 전극이 형성된 제1기판과,
    상기 제1기판 상에 일정한 거리를 두고 상기 제1기판과 결합하여 반응 챔버 공간을 형성하는 제2기판을 포함하고,
    상기 반응 챔버 공간을 형성하는 상기 제2기판에는 상기 제2기판의 두께 방향으로 유체 유입구가 관통되어 형성되어 있고 상기 유체 유입구에 대향하는 위치에 상기 제2기판의 두께 방향으로 유출구가 관통되어 형성되어 있으며,
    상기 유입구와 상기 반응 챔버 공간, 그리고 상기 유출구와 상기 반응 챔버공간은 유체가 유동될 수 있도록 연통되고,
    상기 유입구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유입되고 상기 유출구를 통해 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 유출되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제2기판 상에는 제3기판이 적층되어 상기 유입구로 유체를 도입안내하는 유입 마이크로 채널과, 상기 유출구로부터 유체를 배출안내하는 유출 마이크로 채널을 형성하고,
    상기 유입 마이크로 채널에는 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 주입되는 주입구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있으며,
    상기 유출 마이크로 채널에는 상기 유전상수가 큰 레퍼런스 유체, 반응용액 및 검출대상 시료가 배출되는 배출구가 연통되어 상기 제3기판을 관통하여 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유입 마이크로 채널 또는 상기 유출 마이크로 채널에는 상기 반응 챔버 공간 내로의 유체의 유입 또는 상기 반응 챔버 공간으로부터 유체의 유출을 제한할 수 있는 밸브 구조가 제공되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 밸브구조는 상기 주입구와 상기 반응 챔버 공간 사이에서, 또는 상기 배출구와 상기 반응 챔버 공간 사이에서 상기 제3기판의 두께 방향으로 관통된 후 연장된 통로로서, 이러한 연장된 통로에는 오일이 내장되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3기판은 PDMS(polydimethylsiloxane) 중합체로 형성되는 것을 특징으로 하는 생리활성물질을 전기적으로 검출하기 위한 바이오 칩.
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