CN103261892A - 分析物的电化学检测 - Google Patents
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Abstract
本文描述了一种检测分析物的方法，包括提供在其表面包含设计以与所述分析物特异性结合的探针分子的捕获电极，将所述捕获电极与样品溶液接触以使溶液中的所述分析物在所述捕获电极的表面形成探针-分析物复合物，以及在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示电极表面探针-分析物复合物的形成。所述测量在包含具有高介电常数的溶剂的测量溶液或具有高pH值的测量溶液中或用已经与包含有机溶剂的溶液接触的电极表面进行。
Description
技术领域
本发明涉及使用互补或接近互补的探针的对样品中分析物的改进的检测。具体地，本发明涉及使用包含对所述分析物特异性的探针的捕捉电极，并且因此在电极表面形成探针-分析物络合物，由此改变所述捕捉电极的电性质并且通过例如测量电信号测量所述变化并将其与参比比较来改进对分析物例如诸如核酸的电化学检测的方法。
背景技术
生物学相关分子的检测在广泛领域具有很多应用，包括医学的、法医学的、诊断的、基因组的和环境的应用。在例如包含高多样性分子(其中一些与所述分析物非常相似)的生物学样品中低浓度的感兴趣的分析物的高敏感性和高特异性的检测在上述领域中特别令人感兴趣。
为了检测核酸分子(例如DNA或RNA)，聚合酶链式反应(PCR)通常被用于快速获得遗传水平的信息。尽管PCR具有非常好的灵敏性，但该技术常常受到由来自之前运行的杂质所产生的假阳性、扩增偏倚以及容易受到酶抑制剂和不必要的引物相互作用影响的困扰。DNA微阵同样被使用并且具有能够检测并定量几十万种核酸序列的优点。然而，DNA微阵需要标记靶，其需要样品的化学修饰并且成为误差的来源(例如通过不完全的标记)。
新出现的例如核酸的无标记电化学检测领域是现有方法的有前途的备选方案(de-los-Santos-
等人，Anal Bioanal Chem(2004)378，104-11)。该技术的基本原理在于包含对感兴趣的分析物特异的探针的捕获电极。因为分析物的存在改变电极表面的静电和/或空间立体条件，因此捕获电极的电学性质取决于分析物是否与所述探针结合而改变。由于无需例如标记或扩增分析物来进行检测，工作流程被显著简化。而且，当标记分析物不是必需时，同样可进行使用这一方法的DNA微阵。
在这样的电化学检测的一个有前途的分支中，使用标志分子检测静电和/或空间立体条件的变化。标志分子是氧化还原活性分子并且它们可以在电极表面存在和不存在分析物时被还原和/或氧化。因此，当在不存在和存在探针-分析物复合物的条件下还原和/或氧化时，分析物的存在可以显示为例如电位、电流、电容和/或阻抗上的变化。作为标志分子的备选方案，可使用半导电的电极材料，在其实例中，分析物可通过扰乱电极中价带和传导带的能量水平改变电极表面的静电条件，由此产生可检测的信号(bioFET)。
而且，上文无标记的电化学检测不限于核酸检测，因为只要与分析物特异性结合的探针可以与捕获电极连接那么任何分析物都可以被检测。因此，可预见例如使用包含例如激动剂或拮抗剂分子检测受体或酶。有待通过这一方法检测的任何分析物的基本条件因此仅为其将与给定探针分子结合并且其将对检测其来说充分地改变电极表面的静电状况。
而且，一个或多个捕获电极可被并入一个系统中，其中捕获电极与电测量装置连接。这样的系统之后可被用于测量捕获电极的电性质上的变化，具体地，可通过将结合分析物的捕获电极的电性质与未结合分析物的捕获电极相比较来完成。未结合分析物的捕获电极可与结合分析物之前测量的结合分析物的捕获电极相同。
已在这一领域中获得一些进展，尤其是在使用氧化还原标志分子的核酸检测领域中。
WO2010/025547公开了生物传感设备和方法，包括设计以相应于生物分子刺激产生电化学信号的纳米结构的微电极。在一个实施方案中，微电极包含用于RNA检测的肽核酸(PNA)探针。还描述了包含探针的阵列。报道了10渺摩尔(attomolar)的检测极限。所述方法依赖于核酸在电极表面杂交并且似乎被优化至充分发挥其潜能时带正电的Ru(III)复合物的累积。于中性pH在缓冲的水性溶液中进行电化学测量。
WO2009/122159描述生物传感器设备和方法，包括在表面上具有探针分子的捕获电极。在优选的实施方案中，探针分子是用于检测DNA的PNA分子。检测方法依赖于带负电的铁氰化物/亚铁氰化物氧化还原活性分子(每种0.1mM)，其在例如带负电的DNA与探针结合时由于静电干扰从电极表面剥离。对PNA-RNA复合物的检测灵敏度显示随缓冲液的离子强度从700mM降至最适的2mM而增加。电化学测量于中性pH在磷酸盐缓冲水溶液中进行。然而，那里所用的方法的检测极限是25飞摩尔，还不能与例如PCR方法相比。
Li等人(Anal.Chem.2010，82，1166-1169)描述了当在[Fe(CN)6]3-/4-存在的情况下测量阻抗时，某些金属离子与电极表面PNA-DNA探针-分析物复合物的相互反应。显示Ni2+的存在使得能够检测15元PNA-DNA膜中单个的C-T错配。电化学测量于pH8.7在磷酸盐缓冲的水溶液中进行。未报道过检测极限。
因此，使用探针分子检测分析物的改进的方法将是有好处的，并且特别地，使用探针分子检测分析物的更敏感的方法将是有好处的。
发明内容
因此本发明的目的涉及使用包含探针分子的捕获电极检测非常少量的分析物的改进的方法和用途。
特别地，本发明的目的是提供使用包含探针分子的捕获电极检测分析物的方法和用途，其解决了现有领域中上文提到的影响检测水平的信背比(signal-tobackground ratio，即信号与背景的比)不足的问题。
本发明基于在使用包含探针分子的捕获电极测量期间所用的溶剂的物理和化学性质的特异性变化对信背比具有显著影响的令人惊讶的发现。特别地，已经发现通过例如加入某些非水性溶剂或改变溶液的pH来改变所使用的溶液的电荷补偿能力是特别有效的。据信这些溶剂的加入和pH的变化为电极表面的微环境提供了改变以更好地使得例如能够将例如DNA分析物上的酸性基团去质子化，其增强了从这些分析物检测的信号，但是也可包括其他影响。因此，溶液的电荷补偿能力就升高pH并且加入具有高介电常数的非水性溶剂的实施方案而言是统一概念。
因此，本发明的一个方面涉及检测分析物的方法，包括：
-提供在其表面包含探针分子的捕获电极，其中探针分子被设计以与所述分析物特异性结合，
-将所述捕获电极与样品溶液接触，以使溶液中的所述分析物在所述捕获电极的表面形成探针-分析物复合物，
-在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示电极表面探针-分析物复合物的形成。
本发明的另一个方面是如上文所描述的检测分析物的方法，其中在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质是在具有至少pH7.5的pH值的测量溶液中进行的。
本发明的还有另一个方面是如上文所述检测分析物的方法，其中在于所述样品溶液接触后所述捕获电极的电性质的测量是在包含具有30℃时高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液中完成的。
本发明的另一个方面是如上文所述检测分析物的方法，其中在测量所述捕获电极的电性质之前，所述捕获电极与包含至少一种有机溶剂的溶液接触。
本发明的还有一个方面是具有高于7.5的pH值的测量溶液在分析物检测中增加信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
本发明的另一个方面涉及包含具有30℃时高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液在分析物检测中增加信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
本发明的最后一个方面是包含至少一种有机溶剂的溶液在分析物检测中增加信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
附图说明
图1显示本发明的一个实施方案的检测的机制，其中使用PNA探针和氰铁酸盐/氰亚铁酸盐作为氧化还原活性标志分子使用金电极检测DNA。
图2A-2C显示使用不同含量(v/v)的N-甲基乙酰胺(NMAA)所记录的循环伏安图(CV)和差示脉冲伏安图(DPV)。顶部；在测量溶液中存在逐渐增加含量(0％(图2A)、50％(图2B)和90％(图2C))的NMAA的条件下电极上存在或不存在S-DNA 3599时记录的CV。底部；在测量溶液中存在逐渐增加含量(0％(图2A)、50％(图2B)和90％(图2C))的NMAA的条件下电极上存在或不存在S-DNA 3599时记录的DPV。所展示的CV是从开路电位(NMAA含量低至高：200、10和-137mV)开始并且在正向扫描的两次扫描。采用200μM K3Fe(CN)6、200μM K4Fe(CN)6和5mM PB于pH8.0记录数据。
图3A-3C显示于pH 7.0(图3A)、8.0(图3B)和9.0(图3C)用200μMK3Fe(CN)6和200μM K4Fe(CN)6在电极上存在或不存在S-DNA 3599探针时记录的CV(顶部)和DPV(底部)。所用的缓冲液是pH 7.0和8.0的5mM PB以及pH 9.0的5mM Tris-HCl。所显示的CV数据在190mV开始向正向的两次扫描。
图4A-4B显示用包含PNA3598探针的捕获电极(图4A)和包含PNA 3599探针的捕获电极(图4B)在用500nM与PNA 3598互补的DNA孵育之前和之后记录的CV(顶部)和DPV(底部)。用1mM K3Fe(CN)6和1mM Tris-HCl缓冲液pH 8.4在5μM Ru(NH3)6Cl3中记录数据。伏安图是从0开始向负向的两次扫描。
具体实施方式
定义
在详细讨论本发明之前，定义下列术语和常规：
本文背景中的“分析物”是经由与检测设备例如捕获电极表面上的探针分子结合由此选择性地形成探针-分析物复合物而对检测敏感的任何分子或物种，而存在的其他分子或物种将不与或以少得多的程度与探针分子结合。分析物的实例包括DNA、RNA、PNA、LNA小分子、有机络合物、酶、肽和蛋白。同样，分析物可以是指具有不同标记物质的复合物中所寻找的物种的组合，由此使得能够检测自身不能够诱导信号的物种。复合物可在与探针结合之前、之时或之后形成。
在本发明的背景中，“捕获电极”在最宽泛的意义上是以其表面上的探针分子为特征的检测设备的一部分，其与分析物结合。捕获电极能够在其表面上的探针-分析物复合物形成之前和之后传递所测量的信号。捕获电极的实例是修饰的金电极、纳米结构的电极和半导电的材料例如生物学场效应晶体管(bioFET)。电信号可以被传递至测量电信号的任何工具。
本文中“参比捕获电极”定义为不包含任何探针分子的电极。参比捕获电极可在其他方面与捕获电极相似，以使最好的可能参照或背景信号。其可以例如包含捕获电极的连接分子和间隔分子，但不是探针分子。勿将其与提供参比电位的标准参比电极混淆。
“探针分子”是在捕获电极表面上的特征分子，其能够与用户旨在检测其存在的特定分析物或小量分析物结合。探针分子在本发明方法所使用的条件下与捕获电极不可逆地连接或固定。连接可经由连接分子来获得。探针分子的实例包括DNA、RNA、PNA、LNA、反义吗啉环寡核苷酸、小分子、肽和蛋白。
在本发明中，可使用多种溶液。“样品溶液”是含有感兴趣的分析物(通常伴随多种其他分子和物种)的溶液。“测量溶液”是其中进行捕获电极的电性质测量以检测探针-分析物复合物的存在的溶液。“洗涤溶液”是指在本发明的背景下设计用于减少捕获电极表面上非特异分子的量同时维持存在的任一种探针-分析物复合物的溶液。这与设计用于除去连接的和/或固定的分子除外的每种物质的“清洗溶液”相反。最后可使用“参比溶液”，其是其中测量不具有探针-分析物复合物的捕获电极的电性质的溶液。这些溶液中的一些在某些实施方案中可以是一种并且相同的，例如在参比溶液和测量溶液是相同溶液的某些实施方案中。所有溶液都可被并入控制哪种溶液与电极接触的流动系统中，即捕获电极被放置在不同液体可流经的流式小室中。
“探针-分析物复合物”是当探针和分析物已经彼此结合时形成的物种。所述结合是选择性的并且可通过技术人员已知的结合力中的任一种提供并且也可以包括例如选择性共价结合但是通常是非共价结合。可以预见许多有用的探针-分析物复合物例如诸如PNA-DNA、PNA-RNA、吗啉代DNA、吗啉代RNA杂合物、小分子-蛋白复合物、蛋白-蛋白复合物以及探针和分析物的任何其他可行的组合。
捕获电极的“电性质”在最广泛的意义上是可通过探针-分析物的形成和/或捕获电极表面附近分析物的存在而变化的任何性质。电性质必须可通过捕获电极能够传递的信号来测量。例如，电性质可以是捕获电极表面的电荷分布、捕获电极表面的位阻、捕获电极表面沟道的存在或捕获电极的传导带的能量，其中后者是指BioFET应用。这些是可因探针-分析物复合物的形成变化的所有性质。
“信背比”被理解为捕获电极表面探针-分析物复合物存在的时所记录的信号和捕获电极表面不存在探针-分析物复合物时的相应信号之间的比值，即样品信号和背景信号之间的比值。背景信号可以在与样品信号相同的捕获电极上或在另一个电极上测量。
方法
本发明的第一方面是检测分析物的方法，包括
-提供在其表面包含探针分子的捕获电极，其中探针分子被设计以与所述分析物特异性结合，
-将所述捕获电极与样品溶液接触，以使溶液中的所述分析物在所述捕获电极的表面形成探针-分析物复合物，
-在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示电极表面探针-分析物复合物的形成。
发明人已经令人惊讶地发现当测量捕获电极的电性质时上文方法对溶液条件上的变化特别敏感。不限制于理论，据信信号通常受到来自分析物的无代偿电荷的静电场的空间范围的限制。据信将测量溶液的电荷补偿能力最小化显著改进了信背比并且它可通过多种方式实现。文献中已知的以相似的方式工作的一个方法是将溶液的离子浓度减少至某个有益的值。本文描述的两种方式，增加测量溶液的pH值和向测量溶液加入具有比水高的介电常数的溶剂，可利用不同的方式获得相同的效果并且可因此使用常规机制改进信背比。
在优选的实施方案中，电性质上的变化被表示为参比信号和在与样品溶液接触后测量的信号之间的比值。
参比信号可以是在参比溶液中或用参比捕获电极测量的电性质。“参比捕获电极”或参比电极可优选地是不含有任何探针分子的电极。参比电极可包含或不包含连接分子和/或间隔分子。
特别地，所用溶液的电荷补偿能力上的变化可显著增强信背比，例如通过加入高介电常数溶剂或升高溶液的pH值。本发明的这些方面描述于下文部分中。
采用加入具有高介电常数的溶剂来测量
在本发明的一个有用的实施方案中，提供了上文所描述的方法，其中包含30℃时具有高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液中进行与所述样品溶液接触后捕获电极的电性质的测量。
“非水性溶剂”意指不同于水的任何化学物质。可包含通常未被认为是溶剂的某些物质，例如在室温不是液体的物质。包含至少一种非水性溶剂的溶液仍旧也可以包含水。
也被称为相对介电常数或者εr的“介电常数”是化学上对例如溶剂的极性和/或极化性的测量。介电常数随着温度而变化，并且因此总是结合任一种给定物质的温度来定义。例如在20℃，水的介电常数是80.1，而正己烷的介电常数是1.89。各种物质的介电常数的广泛列表参见Chemical Rubber Company：Handbook of Physics and Chemistry。
当在本发明方法中应用时，加入30℃时具有高于80的介电常数的非水性溶剂对不同分析物的检测水平具有积极影响。不限制于理论，如上文所描述的，据信信号通常受到分析物无代偿电荷存在的限制。增加溶剂的介电常数有利于游离电荷的存在，因此减少电荷的代偿。所述影响是由于分析物的存在而更加有效的信号消光。
加入30℃时具有甚至高于80的介电常数的非水性溶剂同样可以在一些实施方案中具有另外的积极影响。因此，所述非水性溶剂可以具有30℃时高于90，例如30℃时高于100、110、120、130、140、150、160例如高于170的介电常数。优选地，非水性溶剂具30℃时80-280范围内，例如100-260、120-240、140-220、150-200范围内，诸如160-190范围内的介电常数。因为水通常存在于测量溶液中，至少在背景技术中，另一个实施方案是其中非水性溶剂所具有的介电常数在30℃时高于水的介电常数的方法。
上文素描的非水性溶剂可以选自由N-甲基甲酰胺(30℃时εr＝173)、N-甲基乙酰胺(30℃时εr＝179)、N-甲基丙酰胺(20℃时εr＝170)、N-乙基乙酰胺(30℃时εr＝125)和N-丙基丙酰胺(30℃时εr＝113)或其混合物组成的组。例如所述溶剂可以是N-甲基乙酰胺。
至少一种非水性溶剂的量或百分比(v/v)可有利地是高的以获得对检测水平的最高影响。因此，所述非水性溶剂的量是至少10％(v/v)，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％(v/v)，例如至少90％(v/v)。优选地所述非水性溶剂的量在10-100％(v/v)的范围内，例如在20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％(v/v)、80-100％(v/v)的范围内，例如在85-99.9％(v/v)的范围内。
在较高pH测量
pH值上的变化同样影响溶液的电荷代偿能力。已经令人惊讶地发现将pH增加至生理pH以上(即pH7.4以上)在本发明的方法中增加了信背比。
因此本发明的一个优选的实施方案是如上文描述的方法，其中在与所述样品溶液接触后测量捕获电极的电性质在具有至少pH7.5的pH值的测量溶液中进行。
例如，测量溶液具有至少pH7.8的pH值，例如至少pH 8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8，例如至少pH12.0。一个有用的方法是其中所述测量溶液具有至少pH8.8的pH值的方法。同样测量溶液可具有pH 7.8-13.0范围内，例如pH8.0-12.8、8.2-12.6、8.4-12.4的范围内，例如pH 8.6-12.2的pH值。可选择地，pH值可以在pH 8.6-12.0、8.7-11.5例如pH 9.0-11.0的范围内，或者在pH 7.5-13.0、7.5-12.5、7.5-11.5、7.5-11.0例如pH 7.5-10.5的范围内，或者在pH 8.0-13.0、8.0-12.5、8.0-11.5、8.0-11.0例如pH 8.0-10.5的范围内，或者在pH 8.8-13.0、8.8-12.5、8.8-11.5、8.8-11.0，例如pH 8.8-10.5的范围内，或者在9.0-13.0、9.0-12.5、9.0-11.5、9.0-11.0例如pH 9.0-10.5的范围内或者在pH 9.2-13.0、9.2-12.5、9.2-11.5、9.2-11.0例如pH 9.2-10.5的范围内。
与有机溶剂接触后测量
已经发现将包含探针分子的捕获电极在测量所述捕获电极的电性质之前与包含至少一种有机溶剂的溶液接触对信背比具有显著影响。
因此在本发明的一个有用的实施方案中，提供如上文所描述的方法，其中在测量所述捕获电极的电性质之前将捕获电极与包含至少一种有机溶剂的溶液接触。
在一个实施方案中，包含至少一种有机溶剂的溶液是样品溶液，但是其同样可以是在样品溶液之后和测量溶液之前使用的洗涤溶液。不限制于理论，据信探针-分析物复合物形成期间或之后有机溶剂的存在有助于减少非特异性探针-杂质复合物的形成，其可以例如主要由于疏水反应而形成。有机溶剂的存在可帮助减少与更特异的探针-分析物反应相比这些疏水反应的显著性，同时令人惊讶地不破坏和/或减少后者反应。
已经发现组合有机溶剂可具有另外的有益效果，因此在另外的实施方案中，上文描述的溶剂包含至少两种不同的有机溶剂。包含至少一种有机溶剂的溶液可另外地包含水、去污剂和/或电解质。
尽管在本发明方法中可预见任一种有机溶剂，但有机溶剂可选自由下列组成的组：甲酰胺，二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，四氢呋喃(THF)，乙腈，N-甲基甲酰胺，N-甲基乙酰胺，N-甲基丙酰胺，N-乙基乙酰胺和N-丙基丙酰胺，包括二甲醚和二乙醚的醚，包括戊烷、己烷、庚烷和辛烷的烷和/或包括丙醇、乙醇和甲醇的烷基醇以及其任何组合。特别地，有机溶剂可以选自四氢呋喃(THF)、乙腈和乙醇或其组合。
所述方法和测量溶液的另外的实施方案
上文所描述的本发明方法中所用的溶液是本发明的核心部分并且因此下文以测量溶液为重点更加详细地描述了它们。
首先，应当注意的是测量溶液在有用的实施方案中可以相当于样品溶液，任选地具有加入的缓冲液和/或30℃时具有高于80的介电常数的溶剂。然而，在优选的实施方案中，测量溶液与样品溶液不同，以使例如捕获电极与样品溶液相接触并且随后被转移至测量溶液。捕获电极与样品溶解接触的时间的量可变化但是在1-90、1-80、1-70、1-60分钟，例如10-90、10-80、10-70、10-60分钟。
在一个实施方案中，测量溶液的pH通过加入缓冲液来控制。缓冲液可以是技术人员已知的任何缓冲液，但是可以是选自由下列组成的组中的一种或多种：乙酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、甘氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(4-丁烷磺酸)(HEPBS)、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁烷磺酸(TABS)、N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟丙基磺酸(AMPSO)、2-(环己基氨基)乙烷磺酸酸(CHES)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸(CAPSO)、(β)-氨基异丁基醇(AMP)、3-(环己基氨基)-丙烷磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁烯磺酸(CABS)、双-三羟甲基氨基甲烷丙烷(Bis-Tris Propane)、磷酸氢二钾、四硼酸盐或其混合物。当缓冲液具有整体上的负电荷时，反离子可以是一种或多种碱金属或碱土金属离子。碱金属离子可优选地选自由锂、钠和钾离子中的一种或多种所组成的组。
所述缓冲液的浓度可根据例如测量溶液中存在多少非水性溶剂以及pH优选为多少而变化，因此其可以在0.001-1000mM，例如0.010-800、0.050-700、0.100-500、0.200-400、0.300-200、0.400-100、0.500-50、0.700-40、0.800-30mM、0.900-20mM例如1-10mM的范围内。
包含探针分子的捕获电极的电性质可以使用氧化还原活性分子来测量。因此在本发明的一个有用的实施方案中，测量溶液包含溶解的一种或多种氧化还原活性分子。
在本文的背景中也被称为“标记”的“氧化还原活性分子”是能够被氧化和/或还原的任何分子或分子复合物，例如经由电化学方法。通常，氧化还原活性分子在捕获电极表面被氧化或还原，例如由于所应用的电位，并且由此捕获电极的电性质上的变化将影响氧化还原活性分子的氧化/还原，例如氧化/还原的速率。因而对氧化还原活性分子的氧化/还原的所述影响可组成所测量的信号，其在这一特定的实施方案中传递上文提及的电性质上的变化。
氧化还原分子优选地是金属络合物的盐。金属络合物有利地选自由下列组成的组：[Fe(CN)6]3-、[Fe(CN)6]4-、[Ru(CN)6]3-、[Ru(CN)6]4-、[Mn(CN)6]3-、[Mn(CN)6]4-、[W(CN)8]3-、[W(CN)8]4-、[Os(CN)6]3-、[Os(CN)6]4-、[Mo(CN)8]3-、[Mo(CN)8]4-、[Cr(CN)6]3-、[Co(CN)6]3-、[PtCl6]2-、[SbCl6]3-、[RhCl6]3-和[IrCl6]2-。特别优选地是其中氧化还原活性分子是的[Fe(CN)6]3-、[Fe(CN)6]4-或其组合的盐的方法。形成盐的反离子可以是相反电荷的任何离子。所述盐必须是至少在测量溶液中略微溶解的。优选地，当金属络合物具有整体的负电荷时，反离子是一种或多种碱金属或碱土金属离子。碱金属离子可优选地选自由锂、钠和钾离子中一种或多种所组成的组。
一种或多种氧化还原分子的最佳浓度可根据为测量溶液所选择的其他参数变化。优选的实施方案是其中测量溶液中氧化还原分子的组合浓度在0.001-100.00mM的范围内，例如在0.01-50.00、0.02-20.00、0.03-10.00、0.04-5.00mM、0.06-2.00mM、0.08-1.00mM范围内，例如在0.10-0.80mM范围内的方法。
测量溶液可有利地包含两种氧化还原分子并且它们之间的比值在1∶100-100∶1，例如1∶50-50∶1、1∶20-20∶1，例如1∶10-10∶1的范围内。两种氧化还原活性分子可以是[Fe(CN)6]4-和[Fe(CN)6]3-，其中它们之间的比值在2∶1-1∶20，例如1∶1-1∶18、1∶1-1∶15、1∶1-1∶12，例如1∶1-1∶10的范围内。
同样可应用产生传递捕获电极的电性质上的变化的信号的其他方式。一个实施方案是其中捕获电极是半导电材料的实例，其可形成生物学场效应晶体管(bioFET)中的沟道。在这样的实例中，表面上未代偿的电荷的存在将扰乱半导电材料中价带和传导带的能量水平，由此改变半导电材料的抗阻。在这一实例中，带电的载流子作为半导电材料中的空穴或电子存在，由此提供与测量溶液中氧化还原活性分子相同的功能。不限制于理论，静电力可在分析物和半导电材料中的载流子之间作用，相应于分析物和溶液中的氧化还原活性分子之间的相互作用。测量可在载流子的每一面上存在的元素之间进行，其在bioFET实例中是源极和漏极，然而在氧化还原活性分子实例中是工作电极和反离子电极上的金属。在bioFET的实例中，所描述的方法因此相似地增加信背比。
测量溶液的整体离子强度也影响本发明方法的检测水平。因此，在优选的实施方案中，测量溶液具有0.010-100mM范围内，例如0.05-90mM、0.10-70mM、0.20-50mM、0.40-40mM、0.80-20mM，例如1.00-10mM范围内的溶液强度。
如从上文理解的，捕获电极的电性质上的变化可以多种方式测量。因此，也可以不同方式记录包含任何探针-分析物复合物的捕获电极的电性质与其进行比较的基线或参照。
因此，在本发明的优选的实施方案中，在将捕获电极与样品溶液接触之前，提供另外的步骤，包括：
-测量参比溶液中的捕获电极的电性质，所述参比溶液不包含任何分析物。
如上文描述的参比溶液也可以是测量溶液，即在参比溶液中进行参比测量并且捕获电极与样品溶液以及任选地洗涤溶液接触，其中当在参比溶液中再次测量捕获电极的电性质之后，参比溶液因此实际上相当于测量溶液。
可选择地，捕获电极的电性质上的变化可被定义为与不包含任何探针分子的参比捕获电极的电性质相比在与样品溶液接触后捕获电极的电性质。参比捕获电极可任选地经过与捕获电极完全相同的步骤。勿将参比捕获电极与传统意义上的参比电极相混淆，后者用于定义参比电位。
电性质上的变化通常被表示为参比信号(例如在参比溶液中或用参比捕获电极测量的电性质)和在与样品溶液接触后测量的信号(例如使用捕获电极在测量溶液中测量的电性质)之间的比值。
捕获电极、探针和分析物
为图1中的一个实施方案描述了包含探针分子的捕获电极的基本工作原理。如电性质的定义中所描述的，它们可代表不同的物理/化学现象。因此，在优选的实施方案中，捕获电极的电性质上的变化指示由于探针-分析物复合物形成捕获电极表面的电荷和/或电荷分布和/或位阻和/或分子尺度沟道的存在上的变化。
由于上文现象的性质，本发明方法在探针分子电学上不带电荷而分析物带电时是特别有利的。例如，当使用具有电荷的标志分子时，在探针-分析物复合物的电荷与标记具有相同的正负号(即它们都是带正电或带负电的)时朝向这些标志分子的电性质上的变化被特别增强，由此将标记从捕获电极剥离，然而探针分子单独优选地不带电时，不剥离标志分子。
探针分子可以是能够与分析物形成复合物的任何分子和物种。然而优选地是其中探针分子选自由小分子、蛋白、肽、核酸和核酸类似物组成的组的方法。探针分子可有利地选自核酸和/或其衍生物和/或类似物，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、反义吗啉环寡核苷酸(morpholino)、甘油核酸(GNA)和锁核苷酸(LNA)。探针中所用的核酸、其衍生物或类似物可包含任意数目的核苷酸或核苷酸类似物单体。优选的单体数目是1-10.000，例如1-5.000、1-1.000、1-500、1-200、1-100、1-50、1-20，或者例如2-10.000、3-5.000、4-1.000、5-500、5-200、5-100，例如优选地5-50个单体单位。
因此分析物可以是能够与探针分子形成复合物的任何分子或物种。然而其中分析物选自核酸和/或其衍生物和/或类似物的方法是优选的，包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)和锁核苷酸(LNA)以及还有小分子、包括酶的蛋白和肽以及上文的任何共价结合的组合。
因此，本发明的特别有用的实施方案是其中电极表面的探针-分析物复合物是核酸、核酸类似物或其组合的杂交对的实施方案。探针可优选地是肽核酸(PNA)或反义吗啉环寡核苷酸(morpholino)。PNA和morpholino是不带电荷的而分析物优选地带电荷。因此，所述分析物优选地为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在优选的实施方案中，探针是肽核酸(PNA)而分析物的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
探针分子优选地经由连接分子与捕获电极表面连接。捕获电极同样可进一步在其表面包含间隔分子。间隔分子可以是不包含任何探针分子的连接分子。探针分子和间隔分子优选地在捕获电极的表面形成混合的单分子层。这一混合的单分子层可通过将探针分子和间隔分子同时共同固定在捕获电极的表面或者通过顺序固定来产生。探针分子与间隔分子的比例可以是0.01％至100％探针分子的任何值，但是在特定的实例中可以被优化至5％和10％之间的值(参见S.D.Kieghley等人，Biosensors&Bioelectronics 2008，24(4)，906-911)。有用的连接分子包括能够将探针分子与捕获电极表面连接的任何分子，例如烷烃、烯烃、炔烃、醇、硫醇、有机酸、醚、酯、二硫化物、硫酯、胺、酰胺、氨基酸、核苷酸、聚合物、糖、离子复合物、肽和蛋白。连接分子同样可包括两种或更多种连接起来接分子的组合并且连接分子可以在探针的固定化或共同固定化之前、之时或之后连接。特别有用的连接基团包括烷基硫醇(HS-(CH2)n-)、与硫醇连接的短的聚乙二醇或与半胱氨酸连接短的聚乙二醇。有用的间隔分子包括之前提及的连接分子(没有所连接的探针)并且可有利地选自自身能够形成自组装的单分子层或单分子层的分子，例如烷基硫醇、具有功能化的末端基团的烷基硫醇、硅烷和具有功能化的末端基团的硅烷。
可选择地，固定可通过各种其他策略完成，例如掺入聚合物中，通过生物素-亲和素连接子或通过与之前固定的互补核苷酸或类似物的杂交。
用作捕获电极的基础的材料优选地是导电或半导电材料，并且可选自由金(Au)、铂(Pt)、钯(Pd)、钨(W)、碳(C)、硅(Si)、镓(Ga)、砷(As)、铝(Al)、锗(Ge)、锡(Sn)、铟(In)、陶瓷、塑料、导电聚合物或其组合组成的组。特别地，电极可选自金(Au)和钯(Pd)。特别有用的材料是金(Au)。包含-SH基团的连接分子和间隔分子特别有利地与金电极连接，因为它们易于经由硫原子与金表面连接。
通过捕获电极传递的指示电性质的信号可根据所选择的检测方法变化。当使用电化学方法时，指示电极表面探针-分析物复合物形成的捕获电极的电性质的变化可被测量为阻抗、电流或电位的变化。这些性质可使用测量静电信号的工具并且使用技术人员已知的各种技术来测量，并且由此捕获电极的电性质上的变化优选地使用选自由电化学阻抗谱(EIS)，循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV)和方波伏安法(SWV)组成的组的电化学方法来测量。在某些实施方案中，可使用其他的电测量技术，例如伏安法或者测定阻抗或电阻。
通过捕获电极传递的指示电性质的信号可通过将捕获电极并入系统中来测量，其中捕获电极可与测量电信号的工具即电测量装置连接。这样的系统之后可被用于测量捕获电极的电性质上的变化。电测量装置可以是设计用于测量静电信号的任何系统。
捕获电极可以是包含多个捕获电极的阵列或生物芯片部分，例如两个或更多个捕获电极，5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、或者100个或更多个捕获电极。当在其表面包含探针分子的捕获电极作为多个传感器例如2个或更多个传感器的阵列中所用的传感器起作用时，可有利地使用本文描述的方法。因此，在优选的方法中，包含在其表面具有探针分子的捕获电极的每种传感器可分别定位并且每个传感器可被用于检测特定的分析物。在这一应用中，探针分子通常在阵列中的每个捕获电极之间变化。阵列可优选地被设计用于检测和/或鉴定细菌、真菌、病毒和/或古生菌。
用途和应用
本发明的另外的方面是包含30℃时具有高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液用于在分析物的检测中增加信背比的用途，所述检测包含测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
本发明还有另一个方面是具有高于7.5的pH值的测量溶液用于在分析物的检测中增加信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
本发明的一个其他的方面是包含至少一种有机溶剂的溶液用于在分析物的检测中增加信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的变化指示探针-分析物复合物的形成。
在上文用途方面中，“信背比”被理解为在捕获电极表面存在探针-分析物复合物时记录的信号以及捕获电极表面没有探针-分析物复合物存在时相应的信号之间的比值，即样品信号和背景信号之间的比值。背景信号可在与样品信号相同的捕获电极或在另一个电极例如参比捕获电极上测量。
应当注意的是本发明的一个方面的背景中描述的实施方案和特征同样适用于本发明的其他方面。因此，用与本文描述的方法的实施方案同样适用于所描述的用途，反之亦然。
本文中所引用的所有专利和非专利的参考通过引用全文并入本文。
现在将在下列非限制性实施例中更加详细地描述本发明。
实施例
材料和方法
使用在仪器和材料的配套上具有轻微不同的两个相应设置中的一个进行实施方案。两种配套都列于下文，用(S1)或(S2)标记。在每个实施例中，所使用的设置是特定的。
仪器
-Autolab：PGSTAT10：GPES 4.9版本，具有FRA2模块NOVA 1.5(S1)或Autolab PGSTAT128N：NOVA 1.7(S2)。实施例6使用Autolab PGSTAT302N：NOVA 1.6
-超声破碎器：Branson 1200，30W 47kHz输出(S1)或Brandelin SonorexRK31，60W 35kHz输出(S2).
-分光光度计：Nanodrop ND 1000
-超纯水(18.2M cm)(mQ)：Purelab ultra，ELGA(S1)或来自Millipore的Milli-Q Reference系统(S2)
材料
-来自Struer的抛光布(S1)
-矾土泥浆(糊剂)：100nm(40700036)Struers(S1)
-硅土悬浮剂：50nm(40700002)Struers(S1)
-Eppendorf不黏管：Axygen 2.0ml，Maxymum recovery，透明：MCT-200-L-C(S1)或SafeSeal Microcentrifuge Tubes 1.7ml，目录号11720，来自SorensonBioScience，Inc.(S2)
-电极：平面金电极直径1.6mm。来自BASi，MF-2014(S1)或来自BioLogic，A-002314(S2)
-参比电极：Ag/AgCl，饱和的KCl，CHI128，来自CH Instruments(S1)或Ag/AgCl，1M KCl，CHI111来自CH Instruments(S2)。
化学品和它们的缩写
所使用的化学品具有分析等级并且按收到的原样使用，详细说明下列：
-六氨合氯化钌，Ru(NH3)6Cl3，262005来自Sigma-Aldrich，98％(S1)
-铁氰化钾(六氰基高铁(III)酸钾，K3Fe(CN)6)，Merck，art.第4973号，专业分子(S1)或455946来自Sigma-Aldrich(S2)
-亚铁氰化钾(六氰基高铁(II)酸钾，K4Fe(CN)6)，Sigma-Aldrich 31254，＞99％(S1)或455989来自Sigma-Aldrich(S2)
-N-甲基乙酰胺(NMAA)，M26305来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
-6-巯基己-1-醇(MCH)，Fluka 63762，＞97％(GC)(S1)或725226来自Sigma-Aldrich(S2)
-氩气，Air Liquide Alphagaz 1 Argon(S1)或Air Liquide Alphagaz 2 Argon，(S2)
-磷酸盐缓冲液(PB)；磷酸钾：60211来自Sigma-Aldrich(S1)
-3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸(CAPSO)C2278来自Sigma-Aldrich(S2)
-三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基氨基甲烷碱，T1503来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
-乙二胺四乙酸(EDTA)，39692来自Sigma-Aldrich(S1)
-氯化钠，NaCl，S5886来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
-盐酸，HCl，H1758来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
-氢氧化钾，KOH，60370来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
-硝酸，HNO3(70％)，30702来自Sigma-Aldrich(S1)和(S2)
探针和寡核苷酸
设置(S1)和(S2)中探针和寡核苷酸是相同的。
所使用的探针和寡核苷酸分析物的序列和物理数据列于下文表1中。从TAG Copenhagen(tagc.com)获得寡核苷酸而使用Peptide Nucleic Acids(编辑：Peter E.Nielsen)Horizon Bioscience，第二版，2004中描述的技术合成PNA探针。
表1探针和寡核苷酸分析物的序列(eg2＝11-氨基-3，6，9-三氧杂十一酸)
在表1中，DNA 3598和DNA 3599是实施例4、5、7、8和9中使用的测试分析物，S-DNA 3599是直接固定在用作实施例2、3和6中的模式系统的捕获电极上的测试“分析物”。PNA 3598和PNA 3599是实施例4、5、7、8和9中使用的与互补的测试分析物结合的测试探针。
实施例1-制备包含探针分子的捕获电极
使用两种不同的程序使用不同的设置进行制备过程。所述两个过程描述于下文并且标示为S1和S2，其同样相应于在具体制备中所使用的设置。
电极清洗(S1)
在将探针分子固定至捕获电极材料之前，将电极用100nm解聚的α氧化铝悬浮液在湿的抛光垫上抛光1-2分钟并且之后用50nm胶体硅悬浮液在另一块湿的抛光垫上抛光1-2分钟。每个抛光步骤之后，将电极在mQ水中超声处理几分钟。之后将电极通过在1M脱氧的H2SO4中在相对于Ag/AgCl(饱和KCl)的0.2和1.7V之间循环24次以及之后在相同溶液中将电位在-0.1和X V之间循环20次时退火来电抛光。X是通过将半峰最大值处的平均宽度(通常50mV)加至920mV附近清晰的还原峰的平均峰值位点(金氧化还原)来确定的。整个过程中将氩气通过整个溶液。
电极清洗(S2)
在将探针分子固定在捕获电极材料上之前，将电极在乙醇中漂洗，在mQ水中漂洗并且浸没在100mM脱氧的KOH溶液中。10分钟后，将电极在相对于Ag/AgCl(1M KCl)的-0.3V和1.4V之间循环10次，之后保持0V电位2分钟。整个过程中将氩气通过整个溶液。
捕获电极上自组装单分子层的结构
被吸附质的溶液，即包含探针-、连接和/或间隔分子的溶液在Eppendorf管中配制至至少30μl的总体积。将干净的电极用mQ水漂洗并且朝下插入管中，同时确保溶液覆盖整个表面。
(S1)：在孵育期间将管用Parafilm密封并且于室温保存。通过在6-巯基己-1-醇(MCH)中孵育至少1小时以及之后用水漂洗来构建用6-巯基己-1-醇修饰的电极。具有硫醇化DNA(例如S-DNA 3599)的单分子层通过在溶于固定缓冲液的溶液中的至少10μM的DNA溶液孵育至少30分钟来获得，所述缓冲液为：1M NaCl、0.8M PB pH 7.0、5mM MgCl2和1mM EDTA。孵育后，将电极用固定缓冲液、200mM PB pH 7.0、10mM PB pH 7.0和具有10mM EDTA的10mMPB清洗以去除任何残留的Mg2+。在浸入测量溶液中之前，通过在1mM MCH中孵育1小时来装填电极。通过用10μM探针和10μM MC的水溶液孵育至少三小时来制备PNA探针层(例如包含PNA 3598和PNA 3599)。之后将电极转移至100μM MCH的溶液中30-60分钟以确保电极的完全覆盖。最终，用水轻柔清洗电极。
测量之后，将工作中的电极从溶液移出，吸干，通过将它们倒置向下放置在Eppendorf管中覆盖起来，用Parafilm密封并且通过包装在铝箔中来避光。这样保存的电极显示在3周的贮存后没有单分子层分解的迹象。而且，为了确保贮存后基本没有缺损的稠密的单分子层，总是通过在使用前浸入1mM MCH中1小时来填充工作电极。已经发现这对电极上例如DNA或探针的量具有可以忽略的影响。
(S2)：
通过在6-巯基己-1-醇(MCH)中孵育至少4小时以及之后用水漂洗来构建用6-巯基己-1-醇修饰的电极。
通过在溶于MQ的DNA的10μM溶液中孵育5-10s来获得具有硫醇化的DNA(例如S-DNA 3599)的单分子层，电极通过在0.1mM MCH中孵育4小时来填充。
PNA探针层(例如包含PNA3598和PNA3599)通过用5μM探针和50μMMCH的水溶液孵育来制备。
在孵育期间将管用Parafilm密封并储存于28-31℃至少36小时。孵育后，将电极直接插入测量溶液中。
清洗(所有实施例)
清洗对于实验成功来说非常重要。所有玻璃器皿通过在15％HNO3中煮沸并且之后在多量的mQ水中漂洗来清洗。为了将污染最小化，使用直接来自纯化器的水并且在潮湿时通过聚乙烯手套来处理玻璃器皿。
实施例2-使用所加入的具有高介电常数的溶剂测量的影响
在本实施例和下文实施例中，术语“比值”被用于描述捕获电极上存在或不存在测试分析物时给出的信号(例如电流或电荷转移阻抗(Rct))之间的比值。在实施例2和3中，测试分析物包含固定在捕获电极上的一片DNA(S-DNA3599)并且与没有DNA连接的相当的捕获电极相比较。具有/不具有固定DNA的电极被描述为阳性/阴性对照。所述比值是在可达到的测量水平上的改进的度量并且因此这一模式系统对于测试溶液对测试水平的影响来说是理想的。
为了检验具有高介电常数的溶剂的存在对阳性和阴性对照测量之间的比值的影响，在顺序含有0、10、50、25、90、75和0％(vol)NMAA以及200μMK3Fe(CN)6、200μM K4Fe(CN)6和5mM PB pH 8.0的溶液中进行了CV和DPV测量。
图2中所示的CV显示两个电极的电流随逐渐增加含量的NMAA的平滑下降。DNA修饰的电极的电流最快速下降，具有在90％完全消失的信号。同样注意到还原的电流比氧化的受到更大的影响。同样来自曲线图的证据是标准还原电位随逐渐增加的NMAA含量而下降。信号在作为系列中最后一个测量的使用0％NMAA的第二次测量中几乎完全反转。同样DPV测量显示良好的系统性，所有参数随NMAA含量的平滑变化并且在没有NMAA的第二次测量时几乎完全反转。数据概括于下文表2中。还注意到较高的NMAA含量增加电极之间的差异。同样显示的是改进不是平稳的而是似乎在高NMAA含量时多得多。
表2显示从使用不同含量的NMAA以及200μM K3Fe(CN)6、200μMK4Fe(CN)6和5mM PB pH 8.0的还原DPV数据分析获得的主要数值。峰位是阳性对照和阴性对照的峰位之间的平均值。使用手动设置的多项式基线将来自90％NMAA中DNA修饰的电极的峰值定量。
表2：测量溶液中NMAA含量对测试捕获电极的电性质上的变化的影响
实施例3-使用具有高pH的溶液测量的影响
在下文描述的两个实施方案中改变缓冲液pH。在一个实施方案中，测量在pH 6.0(PB)、7.0(PB)、8.0(PB)和9.0(Tris-HCl)的5mM缓冲液中的含有200μM K3Fe(CN)6和200μM K4Fe(CN)6标记的测量溶液中进行。图3中显示所选择的结果CV。除了在pH9.0时稍微较小的电流外，用阴性对照电极于不同pH记录的CV非常相似。另一方面，来自DNA修饰的阳性对照电极的六氰基高铁酸盐信号随着pH增加而逐渐消失。
下文表3显示通过对用溶于具有不同pH的5mM缓冲液的500μMK3Fe(CN)6和500μM K4Fe(CN)6记录的DPV测量的峰值分析获得的峰高。由于pH9.0时DNA修饰电极上几乎消失的信号，通过手动定义的多项式基线分析曲线图。
表3：溶液pH值对测试捕获电极的电性质(DPV)上的变化的影响
与来自CV的数值相反，DPV数据显示无DNA的电极上随着逐渐增加的pH的信号上的逐渐下降。然而，作为来自表3的证据，来自DNA修饰的电极的峰值的高度甚至下降得更快，产生峰高度的比值随pH增加。应当注意的是在pH9.0的测量比pH8.0时令人惊讶地好了两个数量级。其原因可能是所用的缓冲液是tris-HCl缓冲液而不是在其他实例中所用的PB缓冲液。检测了这一假设并且未看到缓冲液变化的影响，即PB缓冲液也存在增加的比值。
与DPV数据中的降低的信号一致，来自没有DNA修饰的阳离子的电极的EIS数据的分析显示Rct随着pH的逐渐下降。然而Rct的比值并不单调地随pH变化，而是还显示与pH 6.0、7.0和8.0相比在pH9.0时的未预料到的大的改进(参见表4)。另一套实验在pH 7.4、8.4和9.0的1mM tris-HCl缓冲液中进行。这一套测量显示与上文描述的相同的趋向，但是用阴性对照记录的CV实际上难以区分并且Rct比值上的改进比上文实例中的更加平滑。后者实例中的数字是pH7.4、8.4和9.0分别为87、189和393，具有拟合时7、10和20％的不确定性。较平滑的转换的原因可能必须处理pH上变化的分布。
表4显示通过用溶于具有不同pH值的5mM缓冲液中的500μM K3Fe(CN)6和500μM K4Fe(CN)6记录的EIS数据的分析获得的Rct。因为pH9.0时DNA修饰的电极的大的Rct，将数据拟合至缺少Warburg阻抗的回路。为了获得电荷转移阻抗，将EIS数据拟合至作为等效电路的修饰的Randles回路。在这一回路中，来自双层充电的阻抗与包含电阻器的电荷转移的阻抗，Rct，平行连接以说明电荷转移阻抗和广义Warburg阻抗以说明扩散。系统未说明的阻抗通过溶液电阻来建模，其与上文的串联。现有的相位元件也被用于说明来自双层充电的阻抗和扩散影响。
表4：测量溶液pH值对测试捕获电极(EIS)的电性质上的变化的影响
实施例4-探针-分析物的形成和分析物的检测
制备包含具有不同探针序列的捕获电极的两个传感器以检验对DNA杂交的响应是否对应于之前的使用测试捕获电极的实施例中所描述的差异。将电极通过在10μM PNA以及10μM MCH中孵育3小时并且之后在100μM MCH中孵育30分钟来用探针PNA 3598和PNA 3599修饰。在浸入参比溶液之前，用水短暂漂洗电极。
通常，探针分子与分析物的杂交通过如S.D.Kieghley等人，Biosensors&Bioelectronics 2008，24(4)，906-911中所描述的将捕获电极于37℃在样品溶液中200mM PB pH 7.0以及400mM K2SO4中孵育30分钟来进行。在孵育之前，将所有溶液在92℃的加热块上加热至少五分钟并且在液体减速旋转之前在冰上冷却至少十分钟并且在冰上保存直到使用。将电极朝下放置在含有40和150μl之间的样品溶液的低粘性浅底Eppendorf管中。之后将管用几层Parafilm密封以避免孵育期间的蒸发。孵育之后，将电极用杂交缓冲液，10mM tris-HCl pH 7.4，以及5mM NaCl轻柔漂洗并且直接转移至测量溶液中。
在用与PNA 3598互补的500nM DNA孵育30分钟之前和之后在捕获电极上进行测量溶液中一系列的测量。在含有5μM Ru(NH3)6Cl3和1mM K3Fe(CN)6的水溶液中进行CV和DPV。所有测量溶液用1mM Tris-HCl缓冲液pH 8.4进行缓冲。根据之前的实验，加入Ru(NH3)6Cl3对于Fe(CN)6 3-和探针层之间的相互作用是无害的。
当与互补的分析物接触时检测信号变化，并且由此所测量的电流的比例非常大。DNA孵育之后，用由PNA 3599修饰的电极记录的CV具有来自Fe(CN)6 3-/4-的仅仅稍微较小的电流以及对氧化和还原峰值电流分别4％和13％的淬灭。另一方面，用PNA3599修饰的电极显示对来自Fe(CN)6 3-/4-的电流的似乎完全的淬灭。CV示于图4中。
DPV同样反应出这一表现。与孵育前的值相比，来自用PNA 3599修饰的电极的峰值电流下降15％而来自用PNA 3598修饰的电极的峰值电流下降99.93％。后者相应于1450的比值。
实施例5-测量前与有机溶剂接触的影响
首先在45分钟之后在测量溶液中重复在实施例4中描述的测量(即使用与PNA 3598互补的500nM 3598DNA)。注意到所有电流下降5％左右，但是其他方面的信号未受损。之后，将电极经历依次使用乙醇、四氢呋喃和乙腈的5s漂洗。每次用有机溶剂漂洗后，将电极用水冲洗并且通过实施例4中描述的测量溶液中的还原DPV来表征。测量之间的流逝的时间分别是34、35和12分钟。表5显示结果。
表5：有机溶剂漂洗对包含PNA 3598和3599探针以及DNA3598分析物的捕获电极的电性质上的变化的影响。
注意到来自包含PNA 3598探针的捕获电极的电流和来自包含PNA 3599探针的捕获电极的电流两者都随着时间而单调下降，同时来自用包含PNA 3598探针的捕获电极还原铁氰化物的电流维持在-5nA。所得到的结论因此是用上文的有机溶剂漂洗对杂交没有损害并且它们因此适合用于除去用不包含有机溶剂的水溶液无法去除的非特异性分析物的漂洗步骤。
实施例6-用具有高pH并且具有所加入的具有高介电常数的溶剂的溶液测量的
影响
在实施例6中，使用标记为S2的材料、方法和制备。
在实施例6中，测试分析物包含固定在捕获电极上的一片DNA(S-DNA3599)并且与没有DNA连接的相当的捕获电极相比较。具有/不具有固定的DNA的电极描述为阳性/阴性对照。比值是可达到的检测水平上的改进的度量并且因此这一模式系统对于测试溶液对检测水平的影响来说是理想的。用两种不同量的DNA通过分别在S-DNA 3599溶液中孵育5s和10s来固定两种阳性对照。
为了检验具有高pH和采用所加入的具有高介电常数的溶剂对阳性和阴性对照的测量之间的比值的影响，在包含90％NMAA，200μM K3Fe(CN)6，200μMK4Fe(CN)6和依次pH 8.0(Tris-HCl)、pH 8.4(Tris-HCl)、pH 9.0(Tris-HCl)、pH 9.5(Tris-HCl)、pH 8.0(Tris-HCL)的5mM缓冲液的溶液中进行DPV测量。
DVP测量显示优良的系统化，所有参数随pH量平滑变化并且几乎在pH8.0的第二次测量时完全反转。数据概括于下文表6中。再次注意到较高的pH增加电极之间的差异。
表6小时从在90％NMAA以及200μM K3Fe(CN)6、200μM K4Fe(CN)6和5mM Tris-HCl中不同溶液pH的还原DPV数据的分析获得的关键数目。将阳性对照与两种不同量的DNA孵育。
表6：在测量溶液90％NMAA含量中pH对测试捕获电极的电性质上的变化的影响
实施例7-使用具有高pH值的溶液的测量和使用所加入的具有高介电常数的溶
剂的测量对传感器的影响
在实施例7和8中，使用标记为S2的材料、方法和制备。
在实施例7和8中，测试分析物包含与固定的PNA探针(PNA 3599)杂交的一片DNA(DNA 3599)并且与没有与相似的PNA探针(PNA 3599)杂交的DNA连接的相当的捕获电极相比较。具有/不具有固定的DNA的电极描述为阳性/阴性对照。比值是可达到的检测水平上改进的度量并且因此这一模式系统对于测试溶液对检测水平的影响来说是理想的。
使用PNA 3599制备阳性和阴性电极。
在实施例7中，阳性和阴性电极的SWV最初在100μM K3Fe(CN)6、100μMK4Fe(CN)6和1mM Tris-HCL pH 7.4的溶液中测量。测量之后紧接着，将电极在含有5mM Tris-HCL pH 8.0，90％NMAA以及10nM或100nM DNA 3599(阳性电极)或者无DNA(阴性电极)的杂交溶液中孵育30分钟。小心保持无DNA的阴性电极远离来自阴性电极的具有DNA的污染。
在孵育之前，所有DNA溶液于92℃在加热块上加热至少五分钟并且在液体减速旋转之前在冰上冷却至少十分钟并且保存在冰上直到使用。将电极朝下放置在含有30μl样品溶液的低粘性浅底Eppendorf管中。之后将管用几层Parafilm密封以避免在孵育期间蒸发。
为了检验改变测量溶液的pH值的影响，在含有溶于1mM缓冲液pH 7.4(Tris-HCl)、8.6(Tris-HCl)、9.5(CAPSO)和10.5(CAPSO)的100μM K3Fe(CN)6和100μM K4Fe(CN)6标记的测量溶液中测量阳性电极和阴性电极的SWV。随后，以首先0％MNAA之后90％NMAA在含有溶于1mM缓冲液pH 10.5(CAPSO)的500μM K3Fe(CN)6和500μM K4Fe(CN)6的测量溶液中测量测量阳性电极和阴性电极的SWV。在于每个新的pH值测量之前，将电极在相应于所述随后的测量的类型和pH值的除气的100mM缓冲液的溶液中孵育10分钟。将溶液维持避光并且在整个孵育中用氩气扫气。这获得了电极对变化的pH值的迅速调整。
下文表7显示通过用溶于不同pH值的1mM缓冲液中100μM K3Fe(CN)6和100μM K4Fe(CN)6记录的SWV测量的峰值分析获得的峰高。b和a表示DNA孵育之前和之后于pH7.4的测量。10.5-5是在溶于1mM CAPSO pH 10.5的500μM K3Fe(CN)6和500μM K4Fe(CN)6中记录的。10.5-5N是在溶于1mM CAPSOpH 10.5和90％NMAA的500μM K3Fe(CN)6和500μM K4Fe(CN)6中记录的。
表7：测量溶液pH值和NMAA含量对传感器捕获电极的电性质(SWV)上的变化的影响。比值是阴性电极(0nM DNA)的峰高除以阳性电极的峰高。底部两个实验比较采用和不采用90％NMAA的测量。
与实施例3中的模式系统相同，SWV数据显示在所有电极上信号随着pH增加的逐渐降低。然而，如来自表6的证据，来自阳性电极的峰的高度比来自阴性电极的峰的高度下降快得多，产生峰高随pH的逐渐增加的比值。具有最高DNA含量的电极比具有较低DNA含量的下降得多。已经建立了改变所使用的缓冲液没有影响比值的其他的实验。
最后两个测量显示增加的标记浓度降低比值而向测量溶液加入90％NMAA大大增加比值。
实施例8-测量前与有机溶剂接触的影响(2)
重复如实施例4中所描述的但是包括在与样品溶液接触和浸入测量溶液之间的漂洗步骤的测量，所述漂洗步骤包括有机溶剂例如四氢呋喃(THF)、乙腈和乙醇以及其某些组合的使用。对于这一实施例，制备具有污染物例如不互补的核酸或痕量的细胞碎片的样品溶液。
实验显示信背比通常在用有机溶剂漂洗时增加并且其比如实施例4中使用杂交缓冲液时增加得更多。当在对于测量溶液来说较高pH值使用这一方法，以及与测量溶液中例如NMAA的存在相结合时可见相同的影响。
实施例9-测量电荷代偿对bioFET的影响
用PNA探针进行bioFET并且用于测量由互补DNA链的结合产生的电流和电阻上的变化。整个实验过程的进一步的细节可在Uno等人中找到。I-V表征显示PNA-DNA双链体导致阈值电压VT上的正向移动和饱和漏极电流ID的减少。确定测量溶液中使用NMAA和高pH值的影响以显著增加阈值电压和饱和漏极电流上的变化。
bioFET由p型硅基质和两个n掺杂区(源极和漏极)组成，其由被栅绝缘层覆盖的短的沟道分开。栅绝缘层是两层SiO2-Si3N4，并且每层厚100nm。栅区的长度在10和300μm之间而宽度固定在200μm。
PNA 3598通过在栅表面上引入的马来酰亚胺基团、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的琥珀酰亚胺基团和PNA中末端半胱氨酸的硫醇基团之间的加成反应固定在氮化硅栅绝缘层上。表面上的马来酰亚胺基团通过与SiO2表面的APTES反应以及之后的在适当条件下与6-(马来酰亚胺基)己酸硫代琥珀酰亚胺酯的反应引入。
I-V表征是使用标准电测量装置在源极和漏极之间测量的并且被用作参比。
之后将bioFET浸入含有100nM DNA 3598的杂交溶液中30分钟。将bioFET在杂交溶液中清洗并且浸入1mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4的测量溶液中，并且测量I-V表征。整个一系列测量中测量溶液变为缓冲的溶液并且增加pH值和NMAA浓度。
与参比测量相比可见阈值电压上的移动和饱和漏极电流上的下降随着pH值的增加以及NMAA浓度上的增加以明显的幅度增加。
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Claims (17)
1.一种检测分析物的方法，其包括：
-提供在其表面包含探针分子的捕获电极，其中所述探针分子被设计以与所述分析物特异性结合，
-将所述捕获电极与样品溶液接触，以使溶液中的所述分析物在所述捕获电极的表面形成探针-分析物复合物，
-在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示出电极表面探针-分析物复合物的形成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质是在具有至少pH7.5的pH值的测量溶液中进行的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述测量溶液具有至少pH8.8的pH值。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在与所述样品溶液接触后测量所述捕获电极的电性质是在包含具有30℃时高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液中进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非水性溶剂选自由N-甲基甲酰胺、N-甲基乙酰胺、N-甲基丙酰胺、N-乙基乙酰胺和N-丙基丙酰胺组成的组。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的方法，其中所述非水性溶剂的量是至少10％(v/v)，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％(v/v)，例如至少90％(v/v)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在测量所述捕获电极的电性质之前所述捕获电极与包含至少一种有机溶剂的溶液接触。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述电性质上的改变被表示为参比信号和与所述样品溶液接触之后所测量的信号之间的比值。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述参比信号是在参比溶液中测量的电性质或者所述参比信号是不包含任何探针分子的参比捕获电极的电性质。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述测量溶液包含溶解的一种或多种氧化还原活性分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述氧化还原活性分子是选自由[Fe(CN)6]3-、[Fe(CN)6]4-、[Ru(CN)6]3-、[Ru(CN)6]4-、[Mn(CN)6]3-、[Mn(CN)6]4-、[W(CN)8]3-、[W(CN)8]4-、[Os(CN)6]3-、[Os(CN)6]4-、[Mo(CN)8]3-、[Mo(CN)8]4-、[Cr(CN)6]3-、[Co(CN)6]3-、[PtCl6]2-、[SbCl6]3-、[RhCl6]3-和[IrCl6]2-组成的组的金属络合物的盐。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述探针分子是电学上不带电的而所述分析物是带电的。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述探针分子选自由小分子、蛋白、肽、核酸和核酸类似物所组成的组。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述探针是肽核酸(PNA)而所述分析物是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
15.包含具有30℃时高于80的介电常数的至少一种非水性溶剂的测量溶液用于增加分析物检测中的信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示出探针-分析物复合物的形成。
16.具有高于7.5的pH值的测量溶液用于增加分析物检测中的信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示出探针-分析物复合物的形成。
17.包含至少一种有机溶剂的溶液用于增加分析物检测中的信背比的用途，所述检测包括测量在其表面包含探针分子的捕获电极的电性质，其中所述电性质上的改变指示出探针-分析物复合物的形成。
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