JP2013541698A - 被検体の電気化学的検出 - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載の方法は、被検体を検出する方法であって、
−前記被検体に特異的に結合するよう設計されたプローブ分子を表面に有する捕捉電極を提供すること
−前記捕捉電極を試料液と接触させ、該試料液中の被検体に前記捕捉電極の表面でプローブ・被検体複合体を形成させること、および
−前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、
前記電気的特性の変化が電極表面におけるプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする方法である。
前記測定は、高誘電率の溶媒を含む測定液もしくは高ｐＨの測定液中で行われるか、または有機溶媒を含む溶液と接触させた電極表面を用いて行われる。

Description

本発明は、相補的プローブまたはほぼ相補的なプローブを使用する、サンプル中の被検体の改良された検出に関する。詳細には、本発明は、例えば核酸などの被検体の電気化学的検出を改良する方法であって、前記被検体に特異的なプローブを含む捕捉電極を用いること、前記特異的なプローブが前記電極の表面でプローブ・被検体複合体を形成して、前記捕捉電極の電気的特性を変化させること、および、例えば電気的信号を測定し基準値と比較するなどして前記変化を測定することを含む方法に関する。
生物学的に重要な分子の検出は、医薬、法医学、診断、ゲノムおよび環境などを含む幅広い分野で様々に応用されている。上記分野で特に関心を集めているのは、例えば非常に多様な分子を含み、目的の被検体に極めて類似した分子が混在する生体試料中で、低濃度の目的の被検体を高感度かつ極めて特異的に検出することである。
核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の検出には、遺伝子レベルの情報を速やかに得ることができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が一般に使用されている。ＰＣＲは感度は優れているものの、前に実施した反応による異物混入に起因する偽陽性、増幅バイアスの発生、酵素阻害剤や不要なプライマー相互作用の影響を受けやすいなどの問題もある。核酸の検出には、ＤＮＡマイクロアレイも利用されており、この方法には、何十万もの核酸配列を検出および定量できるという利点がある。しかし、ＤＮＡマイクロアレイでは、標的対象を標識する必要があり、このような標識はサンプルの化学修飾を伴うため、例えば不完全な標識などにより誤差の原因となる。
例えば核酸などを無標識で電気化学的に検出する方法は、新たな一分野であり、既存の方法に対する有望な代替法の１つである（ｄｅ−ｌｏｓ−Ｓａｎｔｏｓ−Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ （２００４） ３７８，１０４−１１８）。この手法の基本原理は、目的の被検体に特異的なプローブを含む捕捉電極に依存する。捕捉電極の電気的特性は、被検体がプローブに結合しているか否かに応じて変化する。これは、被検体の存在により電極表面の静電状態および／または立体的状態が変化するためである。この検出法は、例えば被検体の標識も増幅も必要とせずに行われるので、作業の流れは大幅に単純化される。さらに、被検体の標識を必要としないこの方法を利用したＤＮＡマイクロアレイも構築可能である。
このような電気化学的検出における１つの有望な分野においては、電極表面の静電状態および／または立体的状態の変化をマーカー分子を用いて検出する。マーカー分子は酸化還元活性分子であり、電極表面の被検体の存在下および非存在下で酸化および／または還元されうるものである。したがって、被検体の存在は、プローブ・被検体複合体の存在下および非存在下でマーカーが酸化および／または還元されて生じる変化、例えば電位、電流、静電容量および／またはインピーダンスなどの変化として示すことができる。マーカー分子の代わりに、半導体の電極材が用いられる場合もある。この場合、被検体は、電極中の価電子帯および伝導帯のエネルギー準位に摂動を与えて検出可能な信号を誘導し、電極表面の静電状態を変化させることができる（ｂｉｏＦＥＴ）。
さらに、上記した無標識の電気化学的検出法は、核酸の検出に限定されるものではなく、どのような被検体であっても、その被検体に特異的に結合するプローブを捕捉電極に吸着させることができれば、検出することができる。したがって、例えばレセプターまたは酵素を、例えばアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子を含むプローブを用いて検出することを想像してもよい。したがって、この方法により検出される被検体に求められる基本条件は、所与のプローブ分子と結合することと、電極表面の静電状態を当該被検体が検出される程度に変化させることだけである。
さらに、１以上の捕捉電極を電気的測定装置に連結して、１つのシステムとしてもよい。このようなシステムを使用することにより、捕捉電極の電気的特性の変化を測定することができる。測定は、具体的には、被検体が結合していない捕捉電極と被検体が結合した捕捉電極との電気的特性を比較することにより行ってもよい。被検体が結合していない捕捉電極は、被検体が結合した捕捉電極と同一で、被検体が結合する前に測定されるのものであってもよい。
近年、この分野、特に、酸化還元活性マーカー分子を用いた核酸検出の分野において進歩が見られる。
ＷＯ２０１０／０２５５４７は、生体分子刺激に応じて電気化学的信号を生成するよう設計されたナノ構造微小電極を含むバイオセンシング装置および方法を開示している。一実施形態において、この微小電極は、ＲＮＡ検出用のペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを含む。また、プローブを含むアレイも記載されている。検出限界は１０アトモルであることが記載されている。この方法は、核酸同士が電極表面でハイブリダイズした際に正電荷を持つＲｕ（ＩＩＩ）複合体が蓄積することに依存するものであり、可能性を最大限に発揮できるよう最適化されているようである。ここでの電気化学的測定は、中性ｐＨの緩衝水溶液中で行われている。
ＷＯ２００９／１２２１５９には、捕捉電極の表面にプローブ分子を有するバイオセンサー装置および方法が記載されている。好ましい実施形態において、このプローブ分子はＤＮＡ検出用のＰＮＡ分子である。この検出方法は、酸化還元活性分子である負電荷を持ったフェリ／フェロシアン化物（各々０．１ｍＭ）に依存するものである。この分子は、例えば負電荷を有するＤＮＡがプローブに結合すると、静電干渉により電極表面から遠ざけられる。ＰＮＡ・ＤＮＡ複合体の検出感度は、緩衝液のイオン強度を７００ｍＭから至適濃度である２ｍＭまで低下させると増大することが示されている。ここでの電気化学的測定は、中性ｐＨのリン酸緩衝水溶液中で行われている。しかし、この方法の検出限界は２５フェムトモルであり、これも例えばＰＣＲ法などには匹敵しないレベルである。
Ｌｉら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，８２，１１６６−１１６９）は、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の存在下でインピーダンスを測定する場合の、電極表面における特定の金属イオンとＰＮＡ−ＤＮＡプローブ・被検体複合体との相互作用について記載している。Ｎｉ２＋の存在により、１５−ｍｅｒのＰＮＡ−ＤＮＡフィルム中の一つのＣ−Ｔミスマッチを検出できることが示されている。ここでの電気化学的測定は、ｐＨ８．７のリン酸緩衝水溶液中で行われている。検出限界については記載されていない。
したがって、プローブ分子を用いて被検体を検出するための改良された方法は有益だろう。特に、プローブ分子を用いて被検体を検出するためのさらに感度の高い方法は有益だろう。
したがって、本発明の目的は、プローブ分子を含む捕捉電極を用いて極めて少量の被検体を検出するための改良された方法および使用に関する。
詳細には、検出レベルを左右するＳＢ比（信号／バックグラウンド比）が満足のいくものでない先行技術における前述の問題を解決するための、プローブ分子を含む捕捉電極を用いて被検体を検出するための方法および使用を提供することが本発明の目的である。
本発明は、プローブ分子を含む捕捉電極を用いて測定する際に使用する溶媒の物理的性質および化学的性質における特定の変化が、ＳＢ比に有意な影響を及ぼすという意外な発見に基づくものである。具体的には、溶液の電荷補償力を変化させることが特に有効であることが分かった。これは、例えば、特定の非水溶媒を添加するか、用いる溶液のｐＨを変化させることにより達成できる。特定の非水溶媒の添加およびｐＨを変化させると、電極表面の微小環境が変化し、その結果、例えば、ＤＮＡ被検体などの酸性基の脱プロトン化が起こり、被検体から検知される信号が増強されると考えられるが、これ以外の作用も関係している可能性がある。このように、溶液の電荷補償力は、ｐＨの上昇や高誘電率の非水溶媒の添加といった具体化されたものに関する統一的概念である。
したがって、本発明の一態様は、被検体を検出する方法であって、
−前記被検体に特異的に結合するよう設計されたプローブ分子を表面に有する捕捉電極を提供すること
−前記捕捉電極を試料液と接触させ、該試料液中の被検体に前記捕捉電極の表面でプローブ・被検体複合体を形成させること、および
−前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、
前記電気的特性の変化が電極表面におけるプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする方法に関する。
本発明の別の態様は、上記と同様に被検体を検出する方法であって、前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、ｐＨ値が７．５以上の測定液中で測定する方法である。
本発明のさらに別の態様は、上記と同様に被検体を検出する方法であって、前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液中で測定する方法である。
本発明の別の態様は、上記と同様に被検体を検出する方法であって、前記捕捉電極の電気的特性を測定する前に、前記捕捉電極を少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液と接触させる方法である。
本発明のさらに別の態様は、被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、ｐＨが７．５より高い測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用である。
本発明の別の態様は、被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用に関する。
本発明の最後の態様は、被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用である。
本発明の一実施形態における検出の仕組みの一例を示した図である。この図において、ＤＮＡは、金電極、ＰＮＡプローブおよび酸化還元活性マーカー分子であるフェリ／フェロシアン化物を用いて検出される。 Ａ〜Ｃは、Ｎ−メチルアセトアミド（ＮＭＡＡ）の含有量（ｖ／ｖ）を様々に変化させて記録したサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）および微分パルスボルタモグラム（ＤＰＶ）を示した図である。上図；電極上にＳ−ＤＮＡ３５９９が存在する場合および存在しない場合について、測定液中のＮＭＡＡの含有量を増加（０％（図２Ａ）、５０％（図２Ｂ）９０％（図２Ｃ））させて記録したＣＶ。下図；電極上にＳ−ＤＮＡ３５９９が存在する場合および存在しない場合について、測定液中のＮＭＡＡの含有量を増加（０％（図２Ａ）、５０％（図２Ｂ）および９０％（図２Ｃ））させて記録したＤＰＶ。示したＣＶは、開放電位（ＮＭＡＡ含有量の低い方から高い方へ順に、２００ｍＶ、１０ｍＶおよび−１３７ｍＶ）から正方向へ走査した２回目のスキャンである。これらのデータは、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ ＰＢ ｐＨ８．０を用いて記録したものである。 Ａ〜Ｃは、電極上にＳ−ＤＮＡ３５９９プローブが存在する場合および存在しない場合について、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を用いて、ｐＨ７．０（図３Ａ）、ｐＨ８．０（図３Ｂ）ならびにｐＨ９．０（図３Ｃ）で記録したＣＶ（上図）ならびにＤＰＶ（下図）を示した図である。ｐＨ７．０およびｐＨ８．０では５ｍＭ ＰＢを、ｐＨ９．０では５ｍＭトリス塩酸を緩衝液として用いた。示したＣＶデータは、１９０ｍＶから正方向へ走査した２回目のスキャンである。 Ａ〜Ｂは、ＰＮＡ３５９８に相補的なＤＮＡ（５００ｎＭ）を用いたインキュベーションの前後に、ＰＮＡ３５９８プローブを含む捕捉電極で記録したＣＶ（上図）およびＤＰＶ（下図）（図４Ａ）、ならびにＰＮＡ３５９９プローブを含む捕捉電極で記録したＣＶ（上図）およびＤＰＶ（下図）（図４Ｂ）を示した図である。これらのデータは、５μＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、１ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および１ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．４を用いて記録したものである。これらのボルタモグラムは、０から負方向へ走査した２回目のスキャンである。
定義
本発明についてさらに詳細に説明する前に、下記の用語および決まり事について定義する。
本発明において「被検体」は、捕捉電極などの検出装置の表面に備えられたプローブ分子に結合することにより検出される任意の分子または化学種である。このような分子または化学種は、それ以外の分子または化学種がプローブ分子に結合しないか結合してもごくわずかであるのに対して、プローブ分子に結合することにより選択的にプローブ・被検体複合体を形成する。被検体としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、低分子、無機複合体、酵素、ペプチドおよびタンパク質などが挙げられる。また、被検体は、目的の化学種と種々の標識物質とを組み合わせて形成される複合体を意味する場合もあり、このような組合せによって、それ自体では信号を発生させることができない化学種でも検出が可能になる。このような複合体の形成は、プローブとの結合前もしくは結合後またはプローブと結合している間に行ってもよい。
本発明において「捕捉電極」は、最も広義には、被検体と結合するプローブ分子を表面に有することを特徴とする、検出装置の一部を意味する。捕捉電極は、その表面でプローブ・被検体複合体が形成される前後で測定される信号を伝達することができる。捕捉電極としては、修飾が施された金電極、ナノ構造電極および半導体材料（例えば生体用電界効果トランジスタ（ｂｉｏＦＥＴ））が挙げられる。この電気信号を、電気信号を測定するための任意の手段に伝達してもよい。
「基準捕捉電極」は、本明細書において、いかなるプローブ分子も含まない電極と定義される。その点を除けば、基準捕捉電極は、捕捉電極と同じであってよく、最良の基準信号すなわちバックグラウンド信号を提供する。基準捕捉電極は、例えば、捕捉電極のリンカー分子およびスペーサー分子を含んでもよいが、プローブ分子は含まない。基準捕捉電極を、基準電位を提供する標準参照電極と混同してはならない。
「プローブ分子」は、捕捉電極の表面に備えられた分子であって、ユーザが検出しようとする１種の特定の被検体または少種の被検体に結合することができる分子である。プローブ分子は、本発明の方法で使用する条件下では、捕捉電極に不可逆的に吸着または固定されている。捕捉電極への吸着は、リンカー分子を介して達成してもよい。プローブ分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノアンチセンスオリゴ、低分子、ペプチドおよびタンパク質などが挙げられる。
本発明においては、多種の「溶液」が使用される可能性がある。「試料液」は、目的の被検体を含み、通常それ以外の種々の分子や化学種も共に含む溶液である。「測定液」は、プローブ・被検体複合体の有無を検出することを目的とした、捕捉電極の電気的特性の測定が行われる溶液である。本発明において「すすぎ液」は、捕捉電極表面のプローブ・被検体複合体を維持したまま、該捕捉電極表面の非特異的分子の量を低減させることを目的とした溶液である。これは、吸着した分子および／または固定されている分子以外はすべて除去することを目的とした「洗浄液」とは対照的なものである。さらにあと１つ、「基準液」を使用してもよく、基準液は、プローブ・被検体複合体を含まない捕捉電極の電気的特性を測定するために用いられる溶液である。いくつかの実施形態において、この中の複数の溶液が同じであってもよく、例えば、いくつかの実施形態においては、基準液と測定液とは同じ溶液である。これらすべての溶液を、どの溶液を電極と接触させるかを制御するフローシステムに組み込むこと、すなわち、捕捉電極を、別々の液体を通過させることのできるフローチャンバーに配置することも可能である。
「プローブ・被検体複合体」は、プローブと被検体とが互いに結合して形成される化学種である。この結合は選択的で、当業者に公知の任意の結合力によってもたらされるものであってよく、例えば選択的共有結合などを含むが、一般に、非共有結合である。多くの有用なプローブ・被検体複合体が想定されるが、例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、モルフォリノ−ＤＮＡハイブリッド、モルフォリノ−ＲＮＡハイブリッド、低分子−タンパク質複合体、ペプチド−タンパク質複合体、およびこれら以外の、プローブと被検体からなる実現可能な任意の組み合わせなどが挙げられる。
捕捉電極の「電気的特性」は、最も広義には、プローブ・被検体複合体の形成および／または捕捉電極の表面の近くの被検体の存在によって変化する可能性のあるあらゆる特性を意味する。電気的特性は、捕捉電極による伝達が可能な信号を介して検出できるものでなくてはならない。電気的特性としては、例えば、捕捉電極の表面における電荷分布、捕捉電極の表面における立体嵩、捕捉電極の表面におけるチャネルの存在、捕捉電極の伝導帯のエネルギーなどが挙げられる。最後の例はＢｉｏＦＥＴを使用した場合を表す。これらの特性はすべて、プローブ・被検体複合体の形成時に変化しうるものである。
「ＳＢ比」は、捕捉電極の表面にプローブ・被検体複合体が存在する場合に記録される信号と、捕捉電極の表面にプローブ・被検体複合体が存在しない場合に記録される信号との比率、すなわちサンプル信号とバックグラウンド信号との比率として理解される。バックグラウンド信号は、サンプル信号と同じ捕捉電極で測定してもよく、また別の電極で測定してもよい。
方法
本発明の第一の態様は、被検体を検出する方法であって、
−前記被検体に特異的に結合するよう設計されたプローブ分子を表面に有する捕捉電極を提供すること
−前記捕捉電極を試料液と接触させ、該試料液中の被検体に前記捕捉電極の表面でプローブ・被検体複合体を形成させること、および
−前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、
前記電気的特性の変化が電極表面におけるプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする方法である。
本発明者らは、捕捉電極の電気的特性を測定していた際に、驚くべきことに、上記の方法が溶液条件の変化に対して特に感度が高いことを発見した。理論による制約を受けないが、信号は通常、被検体の非補償電荷による静電界の空間的な広がりによって制限されると考えられる。測定液の電荷補償力を最小限に抑えることによりＳＢ比は有意に改善されると考えられ、これは様々な方法で達成することができる。文献より公知の、同様に機能する方法として、溶液のイオン強度を効果の得られる特定の値まで低下させる方法が挙げられる。本明細書に記載した２つの方法、すなわち測定液のｐＨを上昇させる方法、および誘電率が水より高い溶媒を測定液へ添加する方法においては、同様の効果が得られる様々な手段を用いてもよく、そうして一般的なメカニズムによりＳＢ比を改善してもよい。
好ましい実施形態において、電気的特性の変化は、基準信号と、試料液と接触させた後に測定した信号との比率として示される。
基準信号は、基準液中で測定される電気的特性であってもよく、また基準捕捉電極を用いて測定される電気的特性であってもよい。「基準捕捉電極」すなわち基準電極は、いかなるプローブ分子も含まない電極であることが好ましい。基準電極は、リンカー分子および／またはスペーサー分子を含んでもよく、含まなくてもよい。
特に、使用する溶液の電荷補償力を変化させることで、ＳＢ比が有意に向上するが、これは、高誘電率の溶媒の添加または該溶液のｐＨの上昇などによって達成される。下記の章では、本発明のこれらの態様について説明する。
高誘電率の溶媒を添加した場合の測定
本発明の有用な一実施形態において、上記した方法であって、前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液中で測定する方法が提供される。
「非水溶媒」は、水以外のあらゆる化学物質を意味する。これには、慣例では溶媒と見なされない物質もいくつか含まれ、例えば室温で液体でない物質なども含まれる。少なくとも１種の非水溶媒を含む溶液が、さらに水を含んでもよい。
比誘電率（εｒ）とも称される「誘電率」は、化学分野において、例えば溶媒などの極性および／または分極率を示す１つの指標である。誘電率は温度によって変化するため、いかなる物質の誘電率も常に温度と共に定義される。例えば、２０℃における誘電率は、水は８０．１であり、ｎ−ヘキサンは１．８９である。種々の物質の誘電率を幅広く示したリストについては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ社のＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（物理化学の手引き）を参照のこと。
本発明の方法において、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を添加することにより、驚くべきことに、種々の被検体の検出レベルに対して好ましい効果が得られる。理論による制約を受けないが、上述した通り、信号は、通常、被検体の非補償電荷の存在により制限されると考えられる。溶液の誘電率の増大により、自由電荷が存在しやすくなるため、電荷の補償が低減する。その結果、被検体の存在によって、信号は極めて効率的に消衰する。
またいくつかの実施形態において、３０℃における誘電率が８０よりさらに高い非水溶媒を添加することにより、より一層の好ましい効果が得られる可能性がある。したがって、３０℃における非水溶媒の誘電率は、９０より高くてもよく、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０より高くてもよく、例えば１７０より高くてもよい。好ましくは、３０℃における非水溶媒の誘電率は、８０〜２８０の範囲であり、例えば１００〜２６０、１２０〜２４０、１４０〜２２０、１５０〜２００の範囲であり、例えば１６０〜１９０の範囲である。通常（少なくとも先行技術において）、測定液には水が存在するため、本発明の別の実施形態は、３０℃における前記非水溶媒の誘電率が水より高いことを特徴とする方法である。
上記の非水溶媒は、Ｎ−メチルホルムアミド（εｒ＝１７３（３０℃））、Ｎ−メチルアセトアミド（εｒ＝１７９（３０℃））、Ｎ−メチルプロパンアミド（εｒ＝１７０（２０℃））、Ｎ−エチルアセトアミド（εｒ＝１２５（３０℃））およびＮ−プロピルプロパンアミド（εｒ＝１１３（３０℃））からなる群より選択してもよく、またはそれらの混合物であってもよい。例えば、上記の非水溶媒はＮ−メチルアセトアミドであってもよい。
検出レベルに最大の影響を与えるには、添加する前記少なくとも１種の非水溶媒の量または割合（ｖ／ｖ）は高い方が有利である。したがって、前記非水溶媒の量は、少なくとも１０％（ｖ／ｖ）であり、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｖ／ｖ）であり、例えば少なくとも９０％（ｖ／ｖ）である。好ましくは、前記非水溶媒の量は、１０〜１００％（ｖ／ｖ）の範囲であり、例えば２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％（ｖ／ｖ）、８０〜１００％（ｖ／ｖ）の範囲であり、例えば８５〜９９．９％（ｖ／ｖ）の範囲である。
高ｐＨにおける測定
ｐＨの変化も溶液の電荷補償力に影響を与える。本発明の方法においてｐＨを生理的なｐＨより高くする（すなわちｐＨ７．４より高くする）ことにより、驚くべきことに、ＳＢ比が向上することが分かった。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、上記した方法であって、前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、ｐＨ値が７．５以上の測定液中で測定する方法である。
例えば、測定液のｐＨ値は、少なくとも７．８であってよく、例えば少なくとも８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８であってもよく、例えば少なくとも１２．０であってもよい。本発明の有用な方法の１つとして、前記測定液のｐＨ値が少なくとも８．８である方法が挙げられる。また、測定液のｐＨ値は、７．８〜１３．０の範囲であってよく、例えば８．０〜１２．８、８．２〜１２．６、８．４〜１２．４の範囲であってもよく、例えば８．６〜１２．２の範囲であってもよい。あるいは、測定液のｐＨ値は、８．６〜１２．０、８．７〜１１．５の範囲であってよく、例えば９．０〜１１．０の範囲であってもよく；または７．５〜１３．０、７．５〜１２．５、７．５〜１１．５、７．５〜１１．０の範囲であってよく、例えば７．５〜１０．５の範囲であってもよく；または８．０〜１３．０、８．０〜１２．５、８．０〜１１．５、８．０〜１１．０の範囲であってよく、例えば８．０〜１０．５の範囲であってもよく；または８．８〜１３．０、８．８〜１２．５、８．８〜１１．５、８．８〜１１．０の範囲であってよく、例えば８．８〜１０．５の範囲であってもよく；または９．０〜１３．０、９．０〜１２．５、９．０〜１１．５、９．０〜１１．０の範囲であってよく、例えば９．０〜１０．５の範囲であってもよく；または９．２〜１３．０、９．２〜１２．５、９．２〜１１．５、９．２〜１１．０の範囲であってよく、例えば９．２〜１０．５の範囲であってもよい。
有機溶媒との接触後の測定
プローブ分子を含む捕捉電極を、その電気的特性を測定する前に少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液と接触させることも、ＳＢ比に有意な影響を及ぼすことが分かった。
したがって、本発明の有用な一実施形態において、上記した方法であって、前記捕捉電極の電気的特性を測定する前に、前記捕捉電極を少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液と接触させる方法が提供される。
一実施形態において、少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液は試料液であるが、さらに、試料液の後および測定液の前に適用されるすすぎ液であってもよい。理論による制約を受けないが、プローブ・被検体複合体の形成される間または形成された後に有機溶媒が存在すると、プローブと不純物との非特異的な複合体の形成が抑制されると考えられる。非特異的な複合体の形成は、例えば主に疎水的相互作用によるものである。有機溶媒の存在下では、このような疎水的相互作用の意義は、プローブと被検体とのより特異的な相互作用より低くなるが、後者の相互作用は意外にも妨害および／または抑制されない。
複数の有機溶媒を組み合わせて使用することにより、より一層有益な効果が得られることが分かった。したがって、さらなる実施形態においては、上記の溶液は少なくとも２種の異なる有機溶媒を含む。少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液が、水、界面活性剤および／または電解質をさらに含んでもよい。
本発明の方法において、いかなる有機溶媒を想定してもよいが、例えば有機溶媒は、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルプロパンアミド、Ｎ−エチルアセトアミドおよびＮ−プロピルプロパンアミド；ジメチルエーテル、ジエチルエーテルなどのエーテル；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタンなどのアルカン；ならびに／またはプロパノール、エタノール、メタノールなどのアルキルアルコール；ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。特に、有機溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリルおよびエタノールから選択してもよく、またはこれらの組み合わせであってもよい。
本発明の方法と測定液のさらなる実施形態
本発明の方法で使用する上記の種々の溶液は、本発明の中核である。したがって、本発明の方法で使用する上記の種々の溶液について、測定液に重きをおきながら、より詳細に以下に説明する。
まず、測定液は、有用な一実施形態において、試料液と同一であってよく、さらに、３０℃における誘電率が８０より高い緩衝液および／または溶媒が添加されていてもよいことに留意されたい。しかし、好ましい実施形態においては、例えば、捕捉電極は試料液と接触させた後、測定液に移されるというように、測定液と試料液とは別々のものである。捕捉電極を試料液と接触させる時間は様々であってよいが、１〜９０分、１〜８０分、１〜７０分、１〜６０分であってよく、例えば１０〜９０分、１０〜８０分、１０〜７０分、１０〜６０分であってもよい。
一実施形態において、測定液のｐＨは緩衝剤の添加により制御される。緩衝剤は、当業者に公知の任意の緩衝剤であってよく、例えば、酢酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、トリス、トリシン、トリズマ、ビシン、グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸（ＴＡＢＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、（β）−アミノイソブチルアルコール（ＡＭＰ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、ビス−トリスプロパン、オルトリン酸水素塩、四ホウ酸塩およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１以上であってもよい。緩衝剤の総電荷が負である場合、対イオンは１以上のアルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンであってよい。アルカリ金属イオンは、リチウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンの１以上からなる群より選択されることが好ましい。
前記緩衝剤の濃度は、例えば測定液中の非水溶媒量および好ましいｐＨ値などによって変化しうるものであり、該濃度は０．００１〜１０００ｍＭの範囲であってよく、例えば０．０１０〜８００ｍＭ、０．０５０〜７００ｍＭ、０．１００〜５００ｍＭ、０．２００〜４００ｍＭ、０．３００〜２００ｍＭ、０．４００〜１００ｍＭ、０．５００〜５０ｍＭ、０．７００〜４０ｍＭ、０．８００〜３０ｍＭ、０．９００〜２０ｍＭの範囲であってもよく、例えば１〜１０ｍＭの範囲であってもよい。
プローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性は、酸化還元活性分子を用いて測定することができる。したがって、本発明の方法の有用な一実施形態において、測定液は１以上の酸化還元活性分子を含む。
本発明において「マーカー」とも称する「酸化還元活性分子」は、例えば電気化学的手法によって、酸化および／または還元されうる任意の分子または分子複合体である。通常、酸化還元活性分子は、例えば印加電圧により、捕捉電極表面で酸化または還元されるため、捕捉電極の電気的特性の変化は、酸化還元活性分子の酸化／還元（例えば酸化／還元速度）に影響を及ぼすだろう。したがって、この実施形態においては、酸化還元活性分子の酸化／還元に対するこのような影響が、前述した電気的特性の変化を伝達する測定信号を構成してもよい。
酸化還元活性分子は、好ましくは金属錯体の塩である。金属錯体が、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−、［Ｒｕ（ＣＮ）６］３−、［Ｒｕ（ＣＮ）６］４−、［Ｍｎ（ＣＮ）６］３−、［Ｍｎ（ＣＮ）６］４−、［Ｗ（ＣＮ）８］３−、［Ｗ（ＣＮ）８］４−、［Ｏｓ（ＣＮ）６］３−、［Ｏｓ（ＣＮ）６］４−、［Ｍｏ（ＣＮ）８］３−、［Ｍｏ（ＣＮ）８］４−、［Ｃｒ（ＣＮ）６］３−、［Ｃｏ（ＣＮ）６］３−、［ＰｔＣｌ６］２−、［ＳｂＣｌ６］３−、［ＲｈＣｌ６］３−および［ＩｒＣｌ６］２−からなる群より選択される場合、有利である。特に、酸化還元活性分子が［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−もしくは［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−の塩、または［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−と［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−の組み合わせの塩である方法が好ましい。塩を形成する対イオンは反対の電荷を有する任意のイオンであってよい。上記した塩は、少なくとも、少しは測定液に溶解することが必要である。金属錯体の総電荷が負である場合、前記対イオンは１以上のアルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンであることが好ましい。アルカリ金属イオンは、リチウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンの１以上からなる群より選択されることが好ましい。
前記１以上の酸化還元活性分子の最適な濃度は、測定液に関して選択されるそれ以外のパラメーターによって変化しうる。好ましい実施形態は、測定液中の酸化還元活性分子の総濃度が、０．００１〜１００．００ｍＭの範囲であり、例えば０．０１〜５０．００ｍＭ、０．０２〜２０．００ｍＭ、０．０３〜１０．００ｍＭ、０．０４〜５．００ｍＭ、０．０６〜２．００ｍＭ、０．０８〜１．００ｍＭの範囲であり、例えば０．１０〜０．８０ｍＭの範囲である方法である。
２種の酸化還元活性分子が測定液中に含まれる場合、有利である。このとき、２種の酸化還元活性分子の比率は１：１００〜１００：１の範囲であってよく、例えば１：５０〜５０：１、１：２０〜２０：１の範囲であってもよく、例えば１：１０〜１０：１の範囲であってもよい。前記２種の酸化還元活性分子は、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−および［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−であってよく、このとき、それらの比率は２：１〜１：２０の範囲であってよく、例えば１：１〜１：１８、１：１〜１：１５、１：１〜１：１２の範囲であってもよく、例えば１：１〜１：１０の範囲であってもよい。
捕捉電極の電気的特性の変化を伝達する信号を発生させる方法として、他の手段を用いることもできる。一実施形態として、捕捉電極が半導体材料である場合が挙げられ、半導体材料は生体用電界効果トランジスタ（ｂｉｏＦＥＴ）においてチャネルを形成しうる。この場合、電極表面に非補償電荷が存在すると、半導体材料の価電子帯および伝導帯のエネルギー準位に摂動が加わり、それによって、半導体材料の抵抗率が変化する。この場合、電荷を有する電流担体は、半導体材料中で正孔または電子として存在するため、測定液の酸化還元活性分子と同じ働きをする。理論による制約を受けないが、被検体と半導体材料の電流担体との間に静電力が働くと考えられ、この静電力は、溶液中の被検体と酸化還元活性分子との間の相互作用に相当する。測定は、電流担体の両側に存在する素子間で実施することができる。前記素子は、ｂｉｏＦＥＴの場合は、ソースおよびドレインであり、酸化還元活性分子の場合は、作用電極および対極の金属である。ｂｉｏＦＥＴの場合も、上記の方法により同様にＳＢ比が向上する。
測定液の総イオン強度も、本発明の方法の検出レベルに影響を及ぼす。したがって、好ましい実施形態において、測定液のイオン強度は、０．０１０〜１００ｍＭの範囲であり、例えば０．０５〜９０ｍＭ、０．１０〜７０ｍＭ、０．２０〜５０ｍＭ、０．４０〜４０ｍＭ、０．８０〜２０ｍＭの範囲であり、例えば１．００〜１０ｍＭの範囲である。
このように、捕捉電極の電気的特性の変化は様々な方法によって測定することができる。したがって、任意のプローブ・被検体複合体を含む捕捉電極の電気的特性の比較対象として使用されるベースラインすなわち基準も、様々な方法で記録することができる。
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態においては、捕捉電極を試料液と接触させる前にさらに別の工程が提供され、該工程は、被検体を一切含まない基準液中で捕捉電極の電気的特性を測定することを含む。
上述の基準液は測定液であってもよい。すなわち、基準液中で基準測定を実施した後、捕捉電極を試料液、次いで任意ですすぎ液と接触させ、その後再び基準液中で捕捉電極の電気的特性を測定する。このように基準液が測定液と同一であることは効果的である。
あるいは、捕捉電極の電気的特性の変化を、いかなるプローブ分子も含まない基準捕捉電極の電気的特性に対する、試料液と接触させた後の捕捉電極の電気的特性として定義してもよい。基準捕捉電極は、捕捉電極と全く同じ工程を経てもよい。基準捕捉電極は、基準電位を定義するために用いられる従来の意味での基準電極と混同すべきではない。
電気的特性の変化は、通常、基準信号（例えば基準液中または基準捕捉電極を用いて測定される電気的特性）と、試料液と接触させた後に測定される信号（例えば測定液中で捕捉電極を用いて測定される電気的特性）との比率として示される。
捕捉電極、プローブおよび被検体
プローブ分子を含む捕捉電極の基本的な作動原理を、一実施形態として図１に示す。電気的特性の定義で述べたように、これらは様々な物理的／化学的な現象を表しうる。したがって、好ましい実施形態において、捕捉電極の電気的特性の変化は、プローブ・被検体複合体形成による捕捉電極表面の電荷、電荷分布、立体嵩および／または分子チャネルの存在の変化を示す。
上記の現象の性質から、本発明の方法において、プローブ分子が電気的に帯電しておらず、被検体が帯電している場合は特に有益である。例えば、電荷を有するマーカー分子を用いる場合、プローブ・被検体複合体の電荷がマーカーの電荷と同符号（すなわち、いずれも負電荷を持つ、またはいずれも正電荷を持つ）の時には捕捉電極からマーカーが遠ざけられ、一方、プローブ分子のみが捕捉電極に存在する時には、該プローブ分子が帯電していない好ましい状態であれば、マーカー分子は遠ざけられないことから、マーカー分子に対する電気的特性の変化は特に増強される。
プローブ分子は、被検体と複合体を形成することができれば、いかなる分子または化学種であってもよいが、プローブ分子が低分子、タンパク質、ペプチド、核酸および核酸類似体からなる群より選択される方法が好ましい。プローブ分子が、核酸ならびに／またはその誘導体および／もしくは類似体、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノアンチセンスオリゴ（モルフォリノ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）などから選択される場合、有利である。プローブに用いられる核酸またはその誘導体もしくは類似体に含まれるヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドアナログモノマーの数は、任意の数であってよい。好ましいモノマー単位の数は、１〜１０，０００であり、例えば１〜５，０００、１〜１，０００、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜２０であり、または例えば２〜１０，０００、３〜５，０００、４〜１，０００、５〜５００、５〜２００、５〜１００であり、好ましくは５〜５０である。
また被検体も、プローブ分子と複合体を形成することができれば、いかなる分子または化学種であってもよいが、被検体が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）などを含む核酸ならびに／またはその誘導体および／もしくは類似体、さらに低分子、酵素やペプチドなど含むタンパク質、ならびに共有結合で結合したそれらの任意の組み合わせから選択される方法が好ましい。
したがって、本発明の特に有用な一実施形態は、電極表面のプローブ・被検体複合体が、ハイブリダイズした１対の核酸、核酸類似体またはそれらの組み合わせである方法である。プローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノアンチセンスオリゴ（モルフォリノ）であることが好ましい。ＰＮＡおよびモルフォリノは電荷を持たないが、被検体は電荷を持っていることが好ましい。したがって、被検体は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であることが好ましい。好ましい実施形態において、プローブはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、被検体はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。
プローブ分子は、リンカー分子を介して捕捉電極の表面に吸着されていることが好ましい。また、捕捉電極は、表面にスペーサー分子をさらに含んでもよい。スペーサー分子は、プローブ分子を含まないリンカー分子であってよい。捕捉電極の表面に、プローブ分子およびスペーサー分子が混合単層を形成していることが好ましい。この混合単層は、捕捉電極の表面にプローブ分子とスペーサー分子を同時に共固定するか、または順次固定することによって作製することができる。スペーサー分子に対するプローブ分子の比率は、０．０１％〜１００％の任意の数値であってよいが、特定の場合には、５％〜１０％の間の値に最適化することもできる（Ｓ．Ｄ．Ｋｉｅｇｈｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００８，２４（４），９０６−９１１を参照のこと）。有用なリンカー分子は、捕捉電極の表面にプローブ分子を連結することができる任意の分子を含み、例として、アルカン、アルケン、アルキン、アルコール、チオール、有機酸、エーテル、エステル、二硫化物、チオエステル、アミン、アミド、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリマー、糖類、イオン複合体、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。また、リンカー分子は、２種以上を組み合わせて連結させたリンカー分子を含んでもよく、このようなリンカー分子の連結は、プローブの固定または共固定を行う前、行っている間または行った後に行ってもよい。特に有用なリンカー群は、アルキルチオール（ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−）、チオールに連結した短鎖ポリエチレングリコール、およびシステインに連結した短鎖ポリエチレングリコールを含む。有用なスペーサー分子は、前述した（プローブが吸着していない）リンカー分子を含むが、アルキルチオール、機能性末端基を有するアルキルチオール、シランおよび機能性末端基を有するシランなどの自己組織化単層膜または単層膜を本質的に形成することができる分子から選択される場合、有利である。
また固定は、ポリマー中への組み込み、ビオチンアビジンリンカーの使用、または先に固定した相補的なヌクレオチドまたは類似体とのハイブリダイゼーションなどの他の様々な手法によっても行うことができる。
捕捉電極に用いられる基本的な材料は、導体材料または半導体材料であることが好ましく、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ウォルフラム（Ｗ）、炭素（Ｃ）、シリコン（Ｓｉ）、ガリウム（Ｇａ）、ヒ素（Ａｓ）、アルミニウム（Ａｌ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、スズ（Ｓｎ）、インジウム（Ｉｎ）、セラミックス、プラスチック、導電性高分子およびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。特に、捕捉電極の材料は、金（Ａｕ）およびパラジウム（Ｐｄ）から選択することができる。特に有用な材料は金（Ａｕ）である。−ＳＨ基を含むリンカー分子およびスペーサー分子は、硫黄原子を介して金表面に容易に吸着できるので、金電極に関しては特に有利である。
捕捉電極により伝達される、電気的特性を示す信号は、選択した検出方法によって変化しうる。電気化学的方法を使用した場合、電極表面のプローブ・被検体複合体の形成を示す捕捉電極の電気的特性の変化を、インピーダンス、電流または電位の変化として測定してもよい。このような特性は、電気的信号を測定する手段および当業者に公知の種々の手法を用いて測定することができる。したがって、捕捉電極の電気的特性の変化は、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）および矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）からなる群より選択される電気化学的方法を用いて測定されることが好ましい。いくつかの実施形態においては、ボルタンメトリー、インピーダンス測定または抵抗測定など、他の電気的測定法を用いてもよい。
捕捉電極により伝達される、電気的特性を示す信号の測定は、電気的信号を測定する手段、すなわち電気的測定装置に該捕捉電極が連結されたシステムにより実施してもよい。このようなシステムを使用することにより、捕捉電極の電気的特性の変化を測定することができる。電気的測定装置は、電気的信号の測定用に設計されたものであれば、いかなるシステムであってもよい。
捕捉電極は、複数の捕捉電極、例えば２以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上または１００以上の捕捉電極を含むアレイまたはバイオチップの一部であってよい。表面にプローブ分子を含む捕捉電極が、複数のセンサー、例えば２以上のセンサーから構成されるアレイで用いられるセンサーとして機能する場合、本明細書に記載の方法が有利に適用される。したがって、好ましい方法においては、表面にプローブ分子を有する捕捉電極を含む各センサーの場所がそれぞれ識別可能であり、各センサーをそれぞれ特定の被検体の検出に適用することができる。この用途においては、通常、アレイ中の各捕捉電極のプローブ分子は異なる。このようなアレイは、細菌類、真菌類、ウイルスおよび／または古細菌の検出および／または同定を目的として設計されていることが好ましい。
使用および応用
本発明のさらなる態様は、被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用である。
本発明のさらに別の態様は、被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、ｐＨが７．５より高い測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用である。
本発明の別の態様は、被検体の検出においてＳＮ比を向上させるための、少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用である。
使用に関する上記の態様において、「ＳＢ比」は、捕捉電極の表面にプローブ・被検体複合体が存在する場合に記録される信号と、捕捉電極の表面にプローブ・被検体複合体が存在しない場合に記録される信号との比率、すなわちサンプル信号とバックグラウンド信号との比率として理解される。バックグラウンド信号は、サンプル信号と同じ捕捉電極で測定してもよく、また基準捕捉電極などの別の電極で測定してもよい。
本発明の個々の態様において記載した実施形態および特徴は、本発明のその他の態様にも適応されることに留意すべきである。したがって、本明細書に記載した方法に適応される実施形態は、本明細書に記載した使用にも適用され、またその逆も成立する。
本願において引用されるすべての特許文献および非特許文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
下記の非限定的実施例において、本発明についてさらに詳細に説明する。
材料および方法
実験は、機器装備および材料の構成がわずかに異なる２つの設定のうちいずれかを用いて行った。２つの設定について以下に記載するが、それぞれ（Ｓ１）または（Ｓ２）と表記する。各実施例において、使用した設定を明記する。
機器装備
−Ａｕｔｏｌａｂ：ＰＧＳＴＡＴ１０：ＧＰＥＳバージョン４．９、ＦＲＡ２モジュール搭載、ＮＯＶＡ１．５（Ｓ１）またはＡｕｔｏｌａｂ ＰＧＳＴＡＴ１２８Ｎ：ＮＯＶＡ１．７（Ｓ２）。実施例６ではＡｕｔｏｌａｂ ＰＧＳＴＡＴ３０２Ｎ：ＮＯＶＡ１．６を使用。
−ソニケーター：Ｂｒａｎｓｏｎ１２００（出力３０Ｗ、４７ｋＨｚ）（Ｓ１）またはＢｒａｎｄｅｌｉｎ Ｓｏｎｏｒｅｘ ＲＫ３１（出力６０Ｗ、３５ｋＨｚ）（Ｓ２）
−分光光度計：Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ １０００
−超純水（１８．２Ｍｃｍ）（ｍＱ）：ＥＬＧＡ社Ｐｕｒｅｌａｂ ｕｌｔｒａ（Ｓ１）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅシステム（Ｓ２）
材料
−Ｓｔｒｕｅｒｓ社研磨布（Ｓ１）
−アルミナスラリー（ペースト）：１００ｎｍ（４０７０００３６）（Ｓｔｒｕｅｒｓ社）（Ｓ１）
−シリカ懸濁液：５０ｎｍ（４０７００００２）（Ｓｔｒｕｅｒｓ社）（Ｓ１）
−非吸着エッペンドルフチューブ：Ａｘｙｇｅｎ社２．０ｍｌ、Ｍａｘｙｍｕｍ ｒｅｃｏｖｅｒｙタイプ、透明：ＭＣＴ−２００−Ｌ−Ｃ（Ｓ１）またはＳｏｒｅｎｓｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社ＳａｆｅＳｅａｌ Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅｓ １．７ｍｌ、カタログ番号１１７２０（Ｓ２）
−電極：直径１．６ｍｍの平板金電極。ＢＡＳｉ社、ＭＦ−２０１４（Ｓ１）またはＢｉｏＬｏｇｉｃ社、Ａ−００２３１４（Ｓ２）
−基準電極：ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ａｇ／ＡｇＣｌ、飽和ＫＣｌ、ＣＨＩ１２８（Ｓ１）またはＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ａｇ／ＡｇＣｌ、１Ｍ ＫＣｌ、ＣＨＩ１１１（Ｓ２）
化学物質およびその略語
使用した化学物質は分析用グレードであり、入手したものをそのまま使用した。以下に明記する。
−塩化ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）（Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３）、２６２００５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、９８％（Ｓ１）
−フェリシアン化カリウム（ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）、Ｍｅｒｃｋ社、製品番号４９７３、分析用グレード（Ｐｒｏ ａｎａｌｙｓｉ）（Ｓ１）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４５５９４６（Ｓ２）
−フェロシアン化カリウム（ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、３１２５４、＞９９％（Ｓ１）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４５５９８９（Ｓ２）
−Ｎ−メチルアセトアミド（ＮＭＡＡ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｍ２６３０５（Ｓ１）および（Ｓ２）
−６−メルカプトヘキサン−１−オール（ＭＣＨ）、Ｆｌｕｋａ社、６３７６２、＞９７％（ＧＣ）（Ｓ１）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、７２５２２６（Ｓ２）
−アルゴン、Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ社、Ａｌｐｈａｇａｚ １ Ａｒｇｏｎ（Ｓ１）またはＡｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ社、Ａｌｐｈａｇａｚ ２ Ａｒｇｏｎ（Ｓ２）
−リン酸塩緩衝液（ＰＢ）；リン酸カリウム：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、６０２１１（Ｓ１）
−３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃ２２７８（Ｓ２）
−トリス（トリズマ）塩基、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ１５０３（Ｓ１）および（Ｓ２）
−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、３９６９２（Ｓ１）
−塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓ５８８６（Ｓ１）および（Ｓ２）
−塩酸（ＨＣｌ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｈ１７５８（Ｓ１）および（Ｓ２）
−水酸化カリウム（ＫＯＨ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、６０３７０（Ｓ１）および（Ｓ２）
−硝酸（ＨＮＯ３）（７０％）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、３０７０２（Ｓ１）および（Ｓ２）
プローブおよびオリゴヌクレオチド
プローブおよびオリゴヌクレオチドは、設定（Ｓ１）と（Ｓ２）で同一である。
使用したプローブおよびオリゴヌクレオチド被検体の配列および物性データを、以下の表１に示す。オリゴヌクレオチドはＴＡＧ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ社（ｔａｇｃ．ｃｏｍ）より購入した。ＰＮＡプローブはＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（編者：Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、第２版（２００４））に記載の方法を用いて合成した。
Figure 2013541698
表１中、ＤＮＡ３５９８およびＤＮＡ３５９９は、実施例４、５、７、８および９で使用した試験被検体であり、Ｓ−ＤＮＡ３５９９は、実施例２、３および６で捕捉電極に直接固定してモデルシステムとして使用した試験「被検体」である。ＰＮＡ３５９８およびＰＮＡ３５９９は、実施例４、５、７、８および９で、相補的な試験被検体と共に使用した試験プローブである。
実施例１−プローブ分子を含む捕捉電極の準備
準備は、２つの異なるプロトコールでそれぞれ異なる設定を使用して行った。以下に２つの操作手順を説明するが、それぞれＳ１およびＳ２と表記する。この表記は、それぞれの準備で使用する設定にも対応している。
電極の洗浄（Ｓ１）
捕捉電極材料にプローブ分子を固定する前に、電極を、粒度１００ｎｍの非凝集性αアルミナ懸濁液を塗布した湿式研磨パッドで１〜２分間研磨し、次いで、粒度５０ｎｍのコロイドシリカ懸濁液を塗布した別の湿式研磨パッドで１〜２分間研磨した。それぞれの研磨工程が終了する度に、電極をｍＱ水中、超音波で数分間処理した。次に、１Ｍ脱酸素Ｈ２ＳＯ４中、Ａｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）を対極として電位を０．２〜１．７Ｖの間で２４回繰り返し掃印させることによって、電極を電解研磨した。次いで、同じ溶液中、電位を−０．１〜ＸＶの間で２０回繰り返し掃印させることによりアニール処理をした。Ｘは、９２０ｍＶ付近のクリアな還元ピーク（金酸化物の還元）の平均ピーク位置にピークの半分高さの平均幅（通常５０ｍＶ）を加えることにより決定した。上記の操作を行う間、溶液にアルゴンパージを行った。
電極の洗浄（Ｓ２）
捕捉電極材料にプローブ分子を固定する前に、電極をエタノールですすぎ、次いでｍＱ水ですすいだ後、１００ｍＭ脱酸素ＫＯＨ溶液に浸漬した。１０分後、電極にＡｇ／ＡｇＣｌ（１Ｍ ＫＣｌ）を対極として電位を−０．３Ｖ〜１．４Ｖの間で１０回繰り返し掃印させ、次いで、０Ｖで２分間維持した。上記の操作を行う間、溶液にアルゴンパージを行った。
捕捉電極上への自己組織化単層膜の構築
吸着質の溶液、すなわちプローブ分子、リンカー分子および／またはスペーサー分子を含む溶液をエッペンドルフチューブに調製して、全量を少なくとも３０μｌとした。洗浄した電極をｍＱ水ですすぎ、電極表面全体が溶液で覆われているのを確かめながら、電極の表面を下にしてチューブ内に挿入した。
（Ｓ１）：
インキュベーション中、チューブはパラフィルムで封をして室温で保存した。６−メルカプトヘキサン−１−オール修飾電極は、１ｍＭ ６−メルカプトヘキサン−１−オール（ＭＣＨ）中で少なくとも１時間インキュベーションした後、水ですすぐことにより作製した。チオール化ＤＮＡ（例えばＳ−ＤＮＡ３５９９）を有する単層膜は、固定用緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、０．８Ｍ ＰＢ ｐＨ７．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した１０μＭ以上のＤＮＡ溶液中で少なくとも３０分間インキュベーションすることにより得た。インキュベーション後、電極を固定用緩衝液、２００ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０、および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ＰＢですすぎ、残存するＭｇ２＋を取り除いた。電極を測定液に浸漬する前に、１ｍＭ ＭＣＨ中で１時間インキュベーションすることにより埋め戻し（ｂａｃｋｆｉｌｌｅｄ）を行った。ＰＮＡプローブ層（例えばＰＮＡ３５９８およびＰＮＡ３５９９を含む）は、１０μＭプローブおよび１０μＭ ＭＣＨを含む水溶液中で少なくとも３時間インキュベーションすることにより作製した。次いで、電極を１００μＭ ＭＣＨ溶液に移し、３０〜６０分間浸漬して、電極が完全に覆われるようにした。最後に、電極を水で優しくすすいだ。
測定後、作用電極を溶液から取り出し、軽く叩いて水気を切った後、上下を逆転させてエッペンドルフチューブを被せて、パラフィルムで封をし、アルミホイルで包んで遮光した。このようにして保存すると、電極を３週間保存しても単層膜の分解の兆候は見られなかった。それでもやはり、保存後もほとんど欠けのない密な単層膜を保つために、作用電極は、必ず使用前に１ｍＭ ＭＣＨに１時間浸漬して埋め戻しを行った。この操作による、例えば電極上のＤＮＡ量またはプローブ量などへの影響は無視できることが分かった。
（Ｓ２）：
６−メルカプトヘキサン−１−オール修飾電極は、０．１ｍＭ ６−メルカプトヘキサン−１−オール（ＭＣＨ）中で少なくとも４時間インキュベーションした後、水ですすぐことにより作製した。チオール化ＤＮＡ（例えばＳ−ＤＮＡ３５９９）を有する単層膜は、ＭＱに溶解した１０μＭのＤＮＡ溶液中で５〜１０秒インキュベーションすることにより得た。電極を測定液に浸漬する前に、０．１ｍＭ ＭＣＨ中で４時間インキュベーションすることにより埋め戻しを行った。ＰＮＡプローブ層（例えばＰＮＡ３５９８およびＰＮＡ３５９９を含む）は、５μＭプローブおよび５０μＭ ＭＣＨを含む水溶液中でインキュベーションすることにより作製した。インキュベーション中、チューブはパラフィルムで封をして２８〜３１℃で少なくとも３６時間保存した。インキュベーション後、そのまま電極を測定液に挿入した。
清浄度（すべての実施例）
清浄度は、実験を成功させる上で非常に重要なことであった。すべてのガラス器具は、１５％ＨＮＯ３中で煮沸した後、大量のｍＱ水ですすぐことにより洗浄した。異物混入を最小限にするために、精製装置から供給される水を直接使用し、濡れているガラス器具はポリエチレン手袋をして取り扱うこととした。
実施例２−高誘電率の溶媒を添加した場合の測定による影響
実施例２以降の実施例において、用語「比率」は、捕捉電極上に試験被検体が存在する状態で得られる信号と存在しない状態で得られる信号（信号とは、例えば電流または電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）である）との比率を示すために使用する。実施例２および３において、試験被検体は１種のＤＮＡ断片（Ｓ−ＤＮＡ３５９９）を含み、これを捕捉電極に固定して、ＤＮＡが吸着していない同等な捕捉電極と比較した。固定化ＤＮＡを有する電極を陽性対照と表記し、固定化ＤＮＡを持たない電極を陰性対照として表記する。比率は、達成可能な検出レベルの改善を示す１つの指標である。したがって、このモデルシステムは、溶液が検出レベルに与える影響を調べる上で理想的なものである。
高誘電率の溶媒の存在が、陽性対照の測定値と陰性対照の測定値との比率に与える影響を検討するために、ＣＶ測定およびＤＰＶ測定を、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ ＰＢ ｐＨ８．０を含み、さらに０、１０、５０、２５、９０、７５または０％（ｖｏｌ）（測定順序はこの順）のＮＭＡＡを含む溶液中で実施した。
図２に示すＣＶから、ＮＭＡＡ含有量が増加するにつれて、両電極とも電流が滑らかに減少することが分かる。ＤＮＡ修飾電極の方が電流の減少は速やかであり、９０％ＮＭＡＡでは、信号はほぼ完全に消滅している。また、還元電流は酸化電流より大きな影響を受けることにも留意されたい。また、プロットから、ＮＭＡＡ含有量が増加するにつれて標準還元電位が低下するということも分かる。この連続測定の最後の測定として実施した、２回目の０％ＮＭＡＡにおける測定では、信号はほぼ完全に元に戻っている。また、ＤＰＶ測定では、ＮＭＡＡ含有量とともにすべてのパラメーターが滑らかに変化するという見事な規則性が示され、また、２回目にＮＭＡＡなしで実施した測定ではほぼ完全に元に戻ることも示された。これらのデータを以下の表２にまとめた。ＮＭＡＡ含有量が高いと、陽性対照電極と陰性対照電極との差が大きくなることに留意されたい。滑らかな改善ではないが、ＮＭＡＡ含有量が高い場合に、大きな改善が見られるようである。
表２は、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ ＰＢ ｐＨ８．０を用い、ＮＭＡＡの含有量を様々に変化させて測定を行った還元ＤＰＶデータの分析から得られた重要な数値を示す。ピーク位置は、陽性対照と陰性対照のピーク位置の平均である。９０％ＮＭＡＡにおけるＤＮＡ修飾電極のピークは、多項式を用いて手動で設定したベースラインを使って定量化した。
Figure 2013541698
実施例３−高ｐＨの溶液を使用した場合の測定による影響
以下に説明する２つの実験は、ともに緩衝液のｐＨを変えて行った。片方の実験では、ｐＨ６．０（ＰＢ）、ｐＨ７．０（ＰＢ）、ｐＨ８．０（ＰＢ）またはｐＨ９．０（トリス塩酸塩）の５ｍＭ緩衝液にマーカーとして２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を溶解した測定液中で測定を行った。得られたＣＶの中から抜粋したものを図３に示す。種々のｐＨにおいて陰性対照電極で記録したＣＶは、ｐＨ９．０で電流がわずかに減少したことを除けば極めて類似している。一方、ＤＮＡ修飾した陽性対照電極からのヘキサシアノ鉄酸塩による信号は、ｐＨが高くなるにつれて徐々に消失している。
以下の表３は、５００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および５００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含む５ｍＭ緩衝液中、種々のｐＨで記録したＤＰＶの測定値をピーク分析して得られたピーク高さを示す。ｐＨ９．０ではＤＮＡ修飾電極の信号はほぼ消失していることから、多項式を用いてベースラインを手動で設定することによってプロットを分析した。
Figure 2013541698
ＣＶから得られたデータとは異なり、ＤＰＶデータでは、ｐＨが高くなるにつれてＤＮＡ修飾のない電極で信号が徐々に減少することが示されている。しかし、表３から明らかなように、ＤＮＡ修飾電極のピーク高さの減少度はこれよりさらに大きいため、ｐＨの上昇とともにピーク高さの比率は増大している。ｐＨ９．０の測定値が、驚くべきことにｐＨ８．０の時より２桁高い値であることは注目すべき点である。この理由として、他のｐＨ値では緩衝液としてＰＢを使用しているのに対して、ｐＨ９．０ではトリス塩酸塩緩衝液を使用したことが考えられる。この仮説を検証したところ、緩衝液の違いによる影響は見られなかった。すなわち、比率の改善はＰＢ緩衝液でも見られた。
ＤＰＶデータで信号が減少するのに同調して、ＤＮＡ修飾されたカチオンを持たない電極のＥＩＳデータの分析から、ｐＨの上昇とともに電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）が漸増することが示されている。電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）の比率はｐＨによって単調に変化するものではないが、それでも、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０およびｐＨ８．０と比べると、ｐＨ９．０で予想外の大きな改善が示されている（表４を参照のこと）。一方、上記とは別に実施した一連の実験では、ｐＨ７．４、ｐＨ８．４またはｐＨ９．０の１ｍＭトリス塩酸塩緩衝液中で測定を行った。この一連の測定においても、上記と同じ傾向が示されたが、陰性対照で記録した各ＣＶの識別は実質的に不可能であり、電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）比率の改善は上記の場合より滑らかであった。Ｒｃｔ比率は、ｐＨ７．４で８７、ｐＨ８．４で１８９、ｐＨ９．０で３９３であり、フィッティングの不確実性はそれぞれ、７％、１０％および２０％である。より滑らかな変化が見られた理由は、ｐＨ分布を変えたことに関係があるかもしれない。
表４は、５００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および５００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含む５ｍＭ緩衝液中、種々のｐＨで記録したＥＩＳデータの分析により得られた電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）を示す。ｐＨ９．０におけるＤＮＡ修飾電極の電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）値が大きいため、ワールブルグインピーダンスのない回路にデータをフィッティングさせた。電荷移動抵抗は、ＥＩＳデータを等価回路であるランドール回路を改変したものにフィッティングさせることにより求める。この回路では、二重層充電によるインピーダンスが、電荷移動抵抗によるものと説明される、抵抗器を含む電荷移動のインピーダンス（Ｒｃｔ）と、拡散によるものと説明される、一般化されたワールブルグインピーダンスとに並列接続されている。この系における説明できない抵抗は、上記のインピーダンスと直列に接続された液抵抗として扱う。二重層充電によるインピーダンスおよび拡散効果を説明するために、定位相要素を用いる。
Figure 2013541698
実施例４−プローブ・被検体複合体の形成および被検体の検出
それぞれ異なるプローブ配列を有する捕捉電極を含む２つのセンサーを準備し、ＤＮＡハイブリダイゼーションに対する応答が、試験捕捉電極を用いた先の実施例に記載した差異と一致するか否かを調べた。電極を、１０μＭ ＭＣＨと共に１０μＭ ＰＮＡ中で３時間インキュベーションした後、１００μＭ ＭＣＨ中で３０分間インキュベーションすることにより、プローブＰＮＡ３５９８またはＰＮＡ３５９９による修飾を行った。電極を基準液に浸漬する前に、軽く水ですすいだ。
概して、プローブ分子と被検体とのハイブリダイゼーションは、Ｓ．Ｄ．Ｋｉｅｇｈｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００８，２４（４），９０６−９１１に記載されているように、試料液中の捕捉電極を、４００ｍＭ Ｋ２ＳＯ４を含む２００ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．０中、３７℃で３０分間インキュベーションすることにより行った。インキュベーションの前に、すべての溶液を、加熱ブロックを用いて９２℃で少なくとも５分間加熱し、次いで、氷上で少なくとも１０分間冷却した。その後、スピンダウンして液を落とし、使用するまで氷上で保存した。電極は、表面を下にして、４０〜１５０μｌの試料液を含む低吸着浅底エッペンドルフチューブに挿入した。次いで、インキュベーション中の蒸発を避けるために、チューブにパラフィルムを何重か巻いて封をした。インキュベーションの後に、電極をハイブリダイゼーション緩衝液（５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ７．４）で優しくすすぎ、そのまま測定液に移した。
測定液中における一連の測定は、捕捉電極をＰＮＡ３５９８に相補的なＤＮＡ（５００ｎＭ）で３０分間インキュベーションする前と後に行った。ＣＶおよびＤＰＶは、５μＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３および１ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含む水溶液中で実施した。測定液はすべて、１ｍＭトリス塩酸塩緩衝液ｐＨ８．４で緩衝化したものである。先の実験より、Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を添加しても、Ｆｅ（ＣＮ）６ ３−とプローブ層との相互作用は妨げられないことが分かっている。
相補的な被検体との接触により検出された信号の変化、すなわち測定電流の比率は極めて大きいものであった。ＰＮＡ３５９９修飾電極で記録したＣＶによれば、ＤＮＡでインキュベーションした後の、Ｆｅ（ＣＮ）６ ３−／４−による電流はごくわずかに減少しただけで、酸化ピーク電流で４％、還元ピーク電流で１３％消失したに過ぎない。一方、ＰＮＡ３５９８修飾電極では、一見して、Ｆｅ（ＣＮ）６ ３−／４−による電流が完全に消失していることが分かる。これらのＣＶを図４に示す。
ＤＰＶでも上記と同様の挙動が見られた。インキュベーション前の数値と比較すると、ＰＮＡ３５９９修飾電極のピーク電流は１５％減少し、ＰＮＡ３５９８修飾電極のピーク電流は９９．９３％減少した。後者の比率は１４５０に相当する。
実施例５−測定前に有機溶媒と接触させた場合の影響
実施例４に記載の（すなわち、ＰＮＡ３５９８に相補的なＤＮＡ３５９８ ５００ｎＭを用いる）測定を、４５分後に再び測定液中で実施した。いずれの電流も約５％減少したが、それ以外の点においては信号に変化は見られなかった。次いで、電極をエタノール、テトラヒドロフランおよびアセトニトリルの順で５秒ずつすすいだ。それぞれの有機溶媒ですすぐ度に、電極を水洗いして、実施例４に記載の測定液中で還元ＤＰＶを測定した。測定から測定までの時間は、それぞれ３４分、３５分および１２分であった。これらの結果を表５に示す。
Figure 2013541698
ＰＮＡ３５９８プローブを含む捕捉電極の電流、ＰＮＡ３５９９プローブを含む捕捉電極の電流のいずれも経時的に単調減少するが、ＰＮＡ３５９８プローブを含む捕捉電極の、フェリシアン化物の還元による電流が−５ｎＡ以内にあることに留意されたい。したがって、これより導かれる結論は、上記の有機溶媒ですすぐことはハイブリダイゼーションに重大な影響を及ぼすものではないということである。したがって、上記の有機溶媒は、有機溶媒を含まない水溶液では除去することが困難な非特異的被検体を除去するすすぎ工程での使用に適している。
実施例６−高ｐＨの溶液を使用し、高誘電率の溶媒を添加した場合の測定による影響
実施例６においては、Ｓ２と記された材料、方法および準備を採用した。
実施例６において、試験被検体は１種のＤＮＡ断片（Ｓ−ＤＮＡ３５９９）を含み、これを捕捉電極に固定して、ＤＮＡが吸着していない同等な捕捉電極と比較した。固定化ＤＮＡを有する電極を陽性対照と表記し、固定化ＤＮＡを持たない電極を陰性対照として表記する。比率は、達成可能な検出レベルの改善を示す１つの指標である。したがって、このモデルシステムは、溶液が検出レベルに与える影響を調べる上で理想的なものである。２つの陽性対照にはそれぞれ異なる量のＤＮＡが固定されており、この固定は、Ｓ−ＤＮＡ３５９９溶液中で５秒または１０秒インキュベーションすることにより行った。
高ｐＨおよび高誘電率の溶媒の添加が、陽性対照の測定値と陰性対照の測定値との比率に与える影響を検討するために、ＤＰＶ測定を、９０％ＮＭＡＡ、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含み、さらに５ｍＭ緩衝液ｐＨ８．０（トリス塩酸塩）、ｐＨ８．４（トリス塩酸塩）、ｐＨ９．０（トリス塩酸塩）、ｐＨ９．５（トリス塩酸塩）またはｐＨ８．０（トリス塩酸塩）（測定順序はこの順）を含む溶液中で実施した。
ＤＰＶ測定により、ｐＨ値とともにすべてのパラメーターが滑らかに変化するという見事な規則性が示され、また、２回目にｐＨ８．０で実施した測定ではほぼ完全に元に戻ることも示された。これらのデータを以下の表６にまとめた。ｐＨ値が高くなるにつれて、陽性対照電極と陰性対照電極との差が増大することに留意されたい。
表６は、２００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、２００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ トリス塩酸塩と共に９０％ＮＭＡＡを含む溶液中、種々のｐＨで測定を行った還元ＤＰＶデータの分析から得られた重要な数値を示す。２つの陽性対照は異なる量のＤＮＡでインキュベーションしたものである。
Figure 2013541698
実施例７−高ｐＨの溶液を使用した場合の測定および高誘電率の溶媒を添加した場合の測定がセンサーに与える影響
実施例７および８においては、Ｓ２と記された材料、方法および準備を採用した。
実施例７および８において、試験被検体は１種のＤＮＡ断片（ＤＮＡ３５９９）を含み、これを固定化ＰＮＡプローブ（ＰＮＡ３５９９）とハイブリダイズさせて、同じＰＮＡプローブ（ＰＮＡ３５９９）を有するものの該プローブにＤＮＡがハイブリダイズしていない同等な捕捉電極と比較した。ＤＮＡを有する電極を陽性電極と表記し、ＤＮＡを有さない電極を陰性電極として表記する。比率は、達成可能な検出レベルの改善を示す１つの指標である。したがって、このシステムは、溶液が検出レベルに与える影響を調べる上で理想的なものである。
陽性電極および陰性電極はＰＮＡ３５９９を用いて準備した。
実施例７において、まず、１００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および１ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ７．４を含む溶液中で陽性電極および陰性電極のＳＷＶを測定した。測定後、そのまま電極を、５ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８．０、９０％ＮＭＡＡおよび１０ｎＭまたは１００ｎＭのＤＮＡ３５９９を含むハイブリダイゼーション溶液（陽性電極）、またはＤＮＡを含まず５ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８．０および９０％ＮＭＡＡを含むハイブリダイゼーション溶液（陰性電極）中で３０分間インキュベーションした。ＤＮＡを有さない陰性電極に陽性電極からのＤＮＡが混入しないように注意した。
インキュベーションの前に、すべてのＤＮＡ溶液を、加熱ブロックを用いて９２℃で少なくとも５分間加熱し、次いで、氷上で少なくとも１０分間冷却した。その後、スピンダウンして液を落とし、使用するまで氷上で保存した。電極は、表面を下にして、３０μｌの試料液を含む低吸着浅底エッペンドルフチューブに挿入した。次いで、インキュベーション中の蒸発を避けるために、チューブにパラフィルムを何重か巻いて封をした。
測定液のｐＨを変えた場合の影響を検討するために、ｐＨ７．４（トリス塩酸塩）、ｐＨ８．６（トリス塩酸塩）、ｐＨ９．５（ＣＡＰＳＯ）またはｐＨ１０．５（ＣＡＰＳＯ）の１ｍＭ緩衝液にマーカーとして１００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および１００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を溶解した測定液中で、陽性電極および陰性電極のＳＷＶを測定した。続いて、ｐＨ１０．５（ＣＡＰＳＯ）の１ｍＭ緩衝液にマーカーとして５００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および５００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を溶解した測定液中、まず０％ＮＭＡＡで、次いで９０％ＮＭＡＡで陽性電極および陰性電極のＳＷＶを測定した。異なるｐＨで測定する前には、その都度、電極を、次の測定に対応した種類およびｐＨの緩衝液を脱気して調製した１００ｍＭ溶液中で１０分間インキュベーションした。溶液は暗所に保存し、インキュベーション中は溶液にアルゴンパージを行った。こうすることによって、電極を、新たなｐＨに速やかに合わせることができる。
以下の表７は、１００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および１００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含む１ｍＭ緩衝液中、種々のｐＨで記録したＳＷＶの測定値をピーク分析して得られたピーク高さを示す。ｐＨ７．４での測定におけるｂとａは、ＤＮＡでインキュベーションする前と後を表す。１０．５−５は、５００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６および５００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含む１ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．５中で記録した結果を示す。１０．５−５Ｎは、５００μＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５００μＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および９０％ＮＭＡＡを含む１ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．５中で記録した結果を示す。
Figure 2013541698
 各比率は、陰性電極（０ｎＭ ＤＮＡ）のピーク高さを陽性電極のピーク高さで除した値である。下の２つの実験は、ＮＭＡＡなしと９０％ＮＭＡＡとでの測定を比較したものである。
実施例３のモデルシステムと同様に、ＳＷＶデータでも、ｐＨが高くなるにつれてすべての電極で信号が徐々に減少することが示されている。しかし、表６から明らかなように、陽性電極のピーク高さの減少度は陰性電極のピーク高さの減少度よりさらに大きいため、ｐＨの上昇とともにピーク高さの比率は高くなっている。この減少度は、ＤＮＡ含量が高い（１００ｎＭ）電極の方が、ＤＮＡ含量が低い電極よりも大きい。その他の実験より、使用する緩衝液を変えても比率には影響がないことが示された。
最後の２つの測定から、マーカー濃度の増加により比率が小さくなること、および測定液に９０％ＮＭＡＡを添加することにより比率が大幅に増大することが分かった。
実施例８−測定前に有機溶媒と接触させた場合の効果（２）
試料液との接触と、測定液への浸漬との間に、有機溶媒（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、およびエタノールならびにそれらからなる特定の組み合わせなど）を用いたすすぎ工程を実施することを除いては、実施例４と同様の測定を繰り返し実施する。この実施例では、混入物、例えば非相補的な核酸、微量の細胞片などを含む試料液を準備する。
これらの実験から、有機溶媒ですすいだ場合、ＳＢ比が概して改善され、実施例４のようにハイブリダイゼーション緩衝液を使用した場合よりもさらに改善されることが分かった。この方法を測定液のｐＨが高い場合や、測定液が例えばＮＭＡＡを含む場合に採用しても、同様の効果が得られる。
実施例９−電荷補償がｂｉｏＦＥＴに与える影響の評価
ｂｉｏＦＥＴをＰＮＡプローブを用いて作製し、これを用いて相補的ＤＮＡ鎖の結合による電流および電気抵抗の変化を測定する。実験全体の手順については、Ｕｎｏらにさらに詳細に記載されている。Ｉ−Ｖ特性により、ＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成されると閾値電圧（ＶＴ）が正方向へシフトし、飽和ドレイン電流（ＩＤ）が減少することが示されている。測定液におけるＮＭＡＡの使用および高ｐＨにより、閾値電圧および飽和ドレイン電流の変化を有意に増大できるか否かを検証する。
ｂｉｏＦＥＴは、２つのｎドープ領域（ソースおよびドレイン）を備えたｐ型シリコン基板からなる。この２つの領域は、ゲート絶縁体で被覆された短チャネルによって分離されている。ゲート絶縁体はＳｉＯ２−Ｓｉ３Ｎ４からなる二重層であり、各層の厚さは１００ｎｍである。ゲート領域の長さは１０〜３００μｍであるが、幅は２００μｍに固定されている。
ＰＮＡ３５９８は、ゲート表面に導入されたマレイミド基と、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドのスクシンイミド基と、ＰＮＡ中の末端システインのチオール基との間の付加反応によって窒化ケイ素ゲート絶縁体上に固定される。表面のマレイミド基は、ＳｉＯ２表面とのＡＰＴＥＳ反応の後、適切な条件下におけるＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドとの反応によって導入される。
標準的な電気的測定装置を用いて、Ｉ−Ｖ特性をソースとドレインとの間で測定し、これを基準として用いる。
次いで、ｂｉｏＦＥＴを、１００ｎＭ ＤＮＡ３５９８を含むハイブリダイゼーション溶液に３０分間浸漬する。ｂｉｏＦＥＴをハイブリダイゼーション溶液ですすいだ後、１ｍＭトリス塩酸塩緩衝液ｐＨ７．４を含む測定液に浸漬して、Ｉ−Ｖ特性を測定する。一連の測定は、測定液を、ｐＨおよびＮＭＡＡ濃度を増加させた種々の緩衝液に変えて実施する。基準測定に対する閾値電圧の変化量および飽和ドレイン電流の減少量は、ＮＭＡＡ濃度の増加によってもｐＨの上昇によっても有意に増大することが分かった。
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Claims (17)

  1. 被検体を検出する方法であって、
    −前記被検体に特異的に結合するよう設計されたプローブ分子を表面に有する捕捉電極を提供すること
    −前記捕捉電極を試料液と接触させ、該試料液中の被検体に前記捕捉電極の表面でプローブ・被検体複合体を形成させること、および
    −前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、
    前記電気的特性の変化が電極表面におけるプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする方法。
  2. 前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、ｐＨ値が７．５以上の測定液中で測定する請求項１に記載の方法。
  3. 前記測定液のｐＨ値が少なくとも８．８である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記試料液と接触させた後の前記捕捉電極の電気的特性を、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液中で測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記非水溶媒がＮ−メチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルプロパンアミド、Ｎ−エチルアセトアミドおよびＮ−プロピルプロパンアミドからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記非水溶媒の量が、少なくとも１０％（ｖ／ｖ）であり、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％（ｖ／ｖ）であり、例えば少なくとも９０％（ｖ／ｖ）である、請求項４〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記捕捉電極の電気的特性を測定する前に、前記捕捉電極を少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液と接触させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記電気的特性の変化が、基準信号と、試料液と接触させた後に測定した信号との比率として示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記基準信号が、基準液中で測定される電気的特性、またはいかなるプローブ分子も含まない基準捕捉電極の電気的特性である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記測定液が１以上の酸化還元活性分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記酸化還元活性分子が、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−、［Ｒｕ（ＣＮ）６］３−、［Ｒｕ（ＣＮ）６］４−、［Ｍｎ（ＣＮ）６］３−、［Ｍｎ（ＣＮ）６］４−、［Ｗ（ＣＮ）８］３−、［Ｗ（ＣＮ）８］４−、［Ｏｓ（ＣＮ）６］３−、［Ｏｓ（ＣＮ）６］４−、［Ｍｏ（ＣＮ）８］３−、［Ｍｏ（ＣＮ）８］４−、［Ｃｒ（ＣＮ）６］３−、［Ｃｏ（ＣＮ）６］３−、［ＰｔＣｌ６］２−、［ＳｂＣｌ６］３−、［ＲｈＣｌ６］３−および［ＩｒＣｌ６］２−からなる群より選択される金属錯体の塩である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記プローブ分子が電気的に帯電しておらず、前記被検体が帯電している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記プローブ分子が、低分子、タンパク質、ペプチド、核酸および核酸類似体からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記プローブがペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、前記被検体がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 被検体の検出においてＳＢ比（信号／バックグラウンド比）を向上させるための、３０℃における誘電率が８０より高い非水溶媒を少なくとも１種含む測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用。
  16. 被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、ｐＨが７．５より高い測定液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用。
  17. 被検体の検出においてＳＢ比を向上させるための、少なくとも１種の有機溶媒を含む溶液の使用であって、前記検出が、表面にプローブ分子を含む捕捉電極の電気的特性を測定することを含み、前記電気的特性の変化がプローブ・被検体複合体の形成を示すことを特徴とする使用。
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