CN1499194A - 用电信号检测pcr产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。所述方法包括(a)在含PCR溶液容器中装配至少一对电极；(b)进行PCR；(c)在电极间产生电场；以及(d)检测PCR溶液中的电介质特性变化。因此，PCR产物可以进行实时检测。

Description

用电信号检测PCR产物的方法
                            发明背景
发明领域
本发明涉及一种利用电信号检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。
相关技术描述
代表性的生物传感器包括酶传感器以及利用免疫体系免疫应答的免疫传感器。但是，由于人类基因组计划的完成得到了大量DNA信息，因此，人类遗传疾病早发现和治疗的可能性和期望随之增加，DNA芯片快速出现成为另一种类型的生物传感器。目前，开发生物传感器中活跃的研究领域是探询获得低制造成本、快速、准确、易操作特性、以及小型化(便携性)的可能性。从这个角度上讲，用DNA信息进行人类疾病早期检测的DNA传感器也必须符合上述要求以增加国际市场竞争力。
一种基本的遗传检测为PCR DNA检测，自从其在1980年代后期发明以来已经在临床、生物以及遗传实验室得到广泛应用。
传统的PCR通过在PCR反应的终点对进行凝胶电泳显示出扩增的DNA的定性结果，但有很多问题例如DNA定量检测的不准确。因此，实时PCR开发用来通过检测荧光强度定量检测扩增的DNA，荧光强度与扩增的DNA浓度成比例，利用光学检测系统进行检测。
DNA的定量检测对疾病治疗和DNA表达的研究而言是必须的。例如，为了保证感染乙型肝炎病毒(HBV)的病人得到成功的医学治疗，必须定期利用实时PCR检测血浆中HBV的浓度以测试HBV的药物抗性。
常规的实时PCR需要多种光学装置例如激光源、微型反射镜、显微镜和滤镜，以及昂贵的荧光染料。并且，因为常规的实时PCR芯片基于荧光检测的原理，从微型化(芯片上)和经济效率的角度讲，存在许多缺点。
为了解决该问题，有人尝试用毛细管电泳(CE)利用电学方法检测DNA的努力[Christa L.Colyer等，Journal of Chromatography A，Volume 781，Issues 1-2，26 September 1997，pp.271-276；F.Laugere等，Sensors andActuators B：Chemical，Volume 83，Issues 1-3，15March 2002，pp.104-108；Pumera et al.，Anal.Chem.，2002，74(9)，pp.1968-1971)。该方法可以进行定性分析，但进行定量分析时存在很多问题。并且，在PCR完成后，用微型通道将PCR产物转移到CE检测系统是一个费力的过程，而且需要高电压。因此，不满足经济效率和微型化的要求。
Miles等提交了一项美国专利申请，其以申请号2002/007254A1进行了公开，该发明申请的思想是在PCR过程中，随着DNA的浓度增加，阻抗下降而传导性增加。但是，Miles的关于阻抗在PCR过程中随着DNA的浓度增加而下降的思想与本发明者证实的事实刚好相反。因此，本专利申请来自对PCR反应的机理的不同理解。
在PCR过程中，dNTPs解离成dNMPs以及许多二磷酸盐。同时，利用与模板DNA互补的引物dNMPs聚合成DNA。在这种情况下，Miles等的公开只考虑了副产物二磷酸盐的电迁移率。但是，考虑到随着DNA浓度的增加，由在DNA合成过程中所有带电的dNMPs、引物和模板导致整体电迁移率下降，由于电迁移率的下降从而PCR反应的阻抗升高。此外，Miles的发明涉及进行终点检测的PCR芯片而不是实时PCR芯片。并且，也存在必须用离子化的标记探针以检测扩增的PCR产物的问题。
                            发明概述
本发明提供了一种通过测量PCR溶液中的电信号检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。
本发明提供了一种检测PCR产物的方法，包括：(a)在含PCR溶液的容器中，装配至少一对电极；(b)进行PCR；(c)在电极间产生电场；并且(d)检测PCR溶液中的电介质特性变化。
                             附图简介
本发明的上述及其他特征以及优点，通过对代表性的技术方案并参考下面附图进行详细的描述而变得更清楚；
图1为装配有电极的PCR管的视图；
图2为一种含装配电极PCR室的PCR芯片实例的视图；
图3至5分别为图2的PCR芯片的平视图、纵向剖面图以及横向剖面图；
图6和7为图2的PCR芯片的聚合反应室(polymerization chamber)和电极的加工方法视图；
图8为在对照PCR循环中阻抗实部(impedance real part)为频率的函数的变化曲线；
图9为在对照PCR循环中阻抗幅值(impedance magnitude)为频率的函数的变化曲线；
图10为在实际PCR循环中阻抗实部为频率的函数的变化曲线；
图11为在实际PCR循环中阻抗幅值为频率的函数的变化曲线；
图12为在对照PCR循环中阻抗幅值的变化曲线；
图13为在实际PCR循环中阻抗幅值的变化曲线；以及
图14为经过误差校正的实际PCR循环中阻抗幅值变化曲线。
                            发明详述
依据本发明，在步骤(a)中，含PCR反应溶液的容器包括，但不限于，常规的大体积(bulk)PCR管以及聚合微型室(polymerization microchamber)。电极以彼此相对的方式安装在PCR反应容器中。在大体积PCR管的情况下，电极安装在从管底算起的预定高度位置，彼此相对。同时，在聚合微型室的情况下，电极安装在微型室的上侧和下侧或左侧和右侧，这样成彼此相对的方式。电极常规方法加工例如光刻方法。多种金属电极例如铜(Cu)电极，铬(Cr)-金(Au)电极，以及砷(As)-搀杂硅电极可用做上述的电极。
在步骤(b)的PCR反应中，除了PCR反应物和溶液，不需要产生电信号的特异标记的探针或引物。因此，与Miles的专利不同，不需要使用离子化标记的引物。依据本发明，PCR产物可不用产生电信号的特异标记的探针或引物进行检测，但不限于这些。
在步骤(c)中，用常规交流(AC)或直流(DC)发生器产生电场，其连接到电极对上。优选地，AC频率范围为1Hz～100MHz并且平均AC电压(Vrms)范围为1mV～10V。
在步骤(d)中，电介质特性(dielectric property)包括，但不限于，阻抗，介质损耗，介电常数，以及导纳(admittance)，这些都源自电场。这些电(场)相关系数可以用连接到电极的电介质特性测量装置测量出来，例如，可以使用可操作性地连接到电极的阻抗传感器。
在下文中，本发明通过实施例将进行更明确的描述。但是，下列实施例只是用于例举说明，因此，本发明不限于或不被其所限制。
实施例
实施例1：装配电极PCR管的制造
在常规PCR管上打孔，将电极通过孔插入到PCR溶液的中央部位。然后，将电极连接到PCR设备然后进行PCR的同时，每一轮PCR循环后就立即检测电信号。在实施例1中，测量扩增的DNA的阻抗。
详细地，在0.2ml PCR管的两侧打孔，孔径0.3mm，孔距离管底5mm。然后，将直径为0.32mm的导线插入到孔中，作为电极。电极是Teflon绝缘的、镀银铜导线。电极固定在管壁上，使用热环氧树脂使电极间保持1.5mm的距离。为了降低电极的表面积，存在PCR溶液的管下部分的直径保持到约1.5mm，并且将小号电极安装在管壁表面(图1)。因此，可以减少可能发生在电极表面的对酶或PCR组分的吸附，从而增加了检测灵敏度和产物产率。
实施例2：在室中具有上位和下位电极的三层结构的PCR芯片的制造
依据图6和7显示的方法进行制备在室中具有上位和下位电极的PCR芯片。
首先，用热氧化在搀杂As的n-型硅片(silicon wafer)1的上和下表面上形成约5,000或更厚的SiO2层3(步骤A)。在片1的上表面的SiO2层3用光刻胶(AZ5214)5包被(步骤B)。在光刻胶上用光刻方法对上位和下位电极(区域)图案化(patterning)后，片放入蚀刻溶液(HF)中从而去除图案化的SiO2层。用e-束(e-beam)或喷射(sputtering)将由Cr和Au组成的膜(film)7沉积在暴露片和光刻胶的上表面，将Al膜9沉积在片的下表面(步骤C)。在上位电极上通过lift-off方法形成Au-电极(步骤D)。用光刻胶包被Al膜9以及光刻胶在Al膜9上图案化(步骤E)后，对Al膜9进行蚀刻，将SiO2层3和硅片1用ICP-RIE依次进行干蚀刻(步骤F，G，H，和I)。蚀刻后，残留的光刻胶用丙酮溶解，残留的Al膜进行蚀刻(步骤J和K)。
形成了上位和下位电极的硅片1阳极结合到玻璃片11，后者通过喷砂处理方法形成孔以作为PCR芯片中的反应室。结合片切割产生最终的芯片。阳极结合是一种硅片与玻璃片(glass wafer)结合的方法。在阳极结合过程中，高电场和热使玻璃片上阳离子(例如，Na+离子)发生迁离离开这些片界面，从而在硅片和玻璃片间造成氢键结合。
依据本实施例以相对电极图案制备的上位(upper)和下位(lower)电极在三维样式上彼此相对，与常规电极不一样，其在二维平面一定的位置形成。因此，PCR扩增的所有DNA可在室(chamber)中进行检测。
依据本实施例制备的PCR芯片显示在图2到5中。图2是PCR芯片的透视图。图3为PCR芯片的平面图并显示出入口13和出口15。图4为PCR芯片的纵向剖面图并显示出聚合室17和下位电极19。图5为PCR芯片的横向剖面图并显示出入口13，出口15，上位电极21，下位电极19，聚合室17，以及玻璃片11。
实施例3：用硅直接结合方法制造二层结构的PCR芯片
二层结构的PCR芯片按照实施例2同样的方式制造，除了两块硅片直接相互结合。
由于玻璃片没有用于本实施例，制造成本和室容积可很易调整。依据本方法，不使用金属电极，在搀杂As的n型硅片的上和下表面蚀刻小面积的SiO2层后，蚀刻的SiO2层可用作电极。因此，可以防止生物分子在金属表面的吸附，从而提高了PCR产物的产率以及检测灵敏度。
实施例4：PCR产物的实时检测
PCR产物实时检测用PCR设备进行，该设备包括实施例1中装配电极的PCR管以及可操作性连接到电极的阻抗传感器。
PCR反应用质粒DNA(323bp)作为模板并用Tag DNA聚合酶进行。在总数35个PCR循环中，在1st，5th，10th，15th，20th，25th，30th，以及35th循环的每个1分钟延伸反应后分别检测阻抗(电阻)。然后，在检测过程中的温度与延伸反应中一致，在检测过程中AC电压为100mV，频率为500～5，000Hz。作为对照，进行没有DNA模板的PCR反应然后检测阻抗。
结果见图8-11。图8显示对照PCR循环增加中阻抗实部作为频率的函数的变化曲线。如图8中所示，随着PcR循环数的增加，阻抗实部增加。同样，随着频率增加，1st循环和35th循环中的阻抗实部的差值下降。
图9显示在对照PCR循环中阻抗幅值为频率的函数时的变化曲线。如图9中所示，阻抗虚部(impedance imaginary part)的变化随PCR循环数的增加显著下降，当与(如图8中所示的)阻抗实部、阻抗虚部、tangent delta等的变化相比较的时候。在约1,000Hz区，阻抗幅值随PCR循环数的增加几乎没有发生变化。尽管没有DNA扩增，在1,077Hz时1st循环和35th循环的阻抗幅值的差值约为45Ω。这可以由电极上dNTPs，引物、以及酶的吸附以及检测体系的内在干扰得到解释。这种差异在确定PCR扩增的DNA检测值时必须考虑。
图10显示在实际PCR循环中阻抗实部作为频率的函数的变化曲线。如图10中所示，随PCR循环数的增加，DNA浓度增加，因此在阻抗实部中存在显著的差异。这符合当PCR循环数为n、被扩增DNA的数为2n倍的理论。
图11显示在实际PCR循环中阻抗幅值作为频率的函数时随频率的变化曲线。如图11中所示，随着PCR循环数目的增加，阻抗幅值显著地增加。1st到5th循环中的阻抗幅值变化较小可以用DNA扩增发生指数形式的变化的理论得到解释。同时，在30th到35th循环阻抗幅值变化较小的原因是因为由于PCR组分的耗尽PCR到达平台期。
从图8-11的结果可以看出，阻抗幅值最适合进行DNA产物的定量分析，依据PCR循环数目的增加，而不是测量数值例如阻抗实部和虚部。这是因为系统干扰相对与其他测量值而言对阻抗幅值的影响最小，如图8和9中所示。
实施例5：在特定频率下阻抗幅值随PCR循环的变化
PCR产物的实时检测按照实施例4中相同的方式进行，除了在特定频率下测定阻抗幅值随PCR循环的变化。依据实施例4，最符合PCR理论的结果在约1,000Hz的频率。基于该结果，在1,077Hz频率时，测量扩增的DNA和未扩增的DNA随PCR循环的阻抗幅值。结果显示在图12和13中。
图12显示在实时的基础上在对照PCR反应溶液中阻抗幅值的变化曲线，图13显示在实际PCR循环中阻抗幅值的变化曲线。在1,077Hz时候，1st循环与35th循环的阻抗幅值差值为约45Ω，如图12中所示，与实施例4中类似。该数值是由检测系统内在干扰引起的误差。如图13中所示，阻抗幅值随PCR循环数的增加的变化形成S曲线，该形状表现出PCR产物的指数增加。基于上述结果，在实际PCR循环中，经过45Ω误差-校正的(error-corrected)阻抗幅值见图14。
从上述描述可以明显看出，依据本发明，PCR产物可以在PCR过程中进行实时测量。
此外，检测体系可通过检测电信号而缩微化。
尽管本发明已经进行了详细的说明并参考典型的技术方案进行了描述，本领域的普通技术人员应该理解可以有很多不偏离如下述权利要求所限定的本发明实质和范围的形式和细节上的改变。

Claims (6)

1.一种检测聚合酶链式反应(PCR)产物的方法，包括：
(a)在含PCR溶液容器中装配至少一对电极；
(b)进行PCR；
(c)在电极间产生电场；以及
(d)检测PCR溶液中的电介质特性变化。
2.依据权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，PCR在无离子化标记的引物存在的条件下进行。
3.依据权利要求1的方法，其中含PCR溶液的容器为PCR管或聚合微型室。
4.依据权利要求1的方法，其中电介质特性为阻抗、介质损耗、介电常数、或导纳。
5.依据权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，电场用1Hz～100MHz频率的交流电产生。
6.依据权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，电场用1mV～10V的平均AC电压产生。
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