JP4094530B2 - 電気的信号を用いてｐｃｒ産物を検出する方法 - Google Patents

電気的信号を用いてｐｃｒ産物を検出する方法 Download PDF

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Description

本発明は、電気的信号を利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を検出する方法に関する。
代表的なバイオセンサとしては、酵素センサ及び免疫系の免疫反応を利用した免疫センサがある。しかしながら、ヒトのゲノムプロジェクトが完了したことによって膨大な量のＤＮＡ情報が得られ、ヒトの遺伝病を早期に発見し、治療できる可能性とそれによる期待とが大きくなっているため、バイオセンサの分野にさらに他のセンサとしてＤＮＡチップが急激に確立されている。現在、バイオセンサ開発の趨勢は、低価格性、迅速性、正確性、操作の簡便性そして小型化（携帯性）にあり、この点において、ＤＮＡ情報を用いてヒトの疾病を早期発見するためのＤＮＡセンサもまた、世界的な市場での競争力を強化するために、上記要求を満たすように開発が行なわれている。
基本的な遺伝アッセイの一つとしてＰＣＲ ＤＮＡアッセイがあり、これは、１９８０年代後半に発明されて以来、臨床、生物、及び遺伝子の実験室で広く使用されている。
既存のＰＣＲは、ＰＣＲ反応の終末点でゲル泳動によって増幅されたＤＮＡの定性的な結果を示すが、ＤＮＡの定量的な検出は不正確であるなどの多くの問題点を有している。このような問題を解決するために、光学的検出システムを利用して、増幅されたＤＮＡの濃度に比例する、蛍光の強さを検出することによって増幅されたＤＮＡの定量分析を可能にさせるリアルタイムＰＣＲが開発された。
ＤＮＡの定量分析は、疾病の治療とＤＮＡ発現の研究に必須である。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者の成功的な薬物治療を確率するために、定期的に血漿のＨＢＶの濃度をリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して検出することによって、投与される薬物に対するウイルスの耐性を検査しなければならない。
従来のリアルタイムＰＣＲは、レーザ源、微細鏡(micromirror)及び顕微鏡以外にフィルタのような色々な光学装置が必要であると同時に、高価の蛍光染料が使用されていた。また、ＤＮＡ定量分析のための多くのＰＣＲチップが開発されたが、従来のリアルタイムＰＣＲチップは蛍光検出の原理による方法であるので、小型化（チップ化）及び経済性において多くの短所を有している。
この問題を克服するために、毛細管電気泳動（ＣＥ：Capillary Electrophoresis）を利用して電気的にＤＮＡを検出しようとする努力がなされた（例えば、非特許文献１，非特許文献２，非特許文献３参照）。この方法は定性分析が可能であるが、定量分析をするには多くの問題がある。上記問題に加えて、ＰＣＲが終わった後にＰＣＲ産物をマイクロチャンネルを利用してＣＥ検出システムまで移さなければならない面倒さ及び高い電圧が必要である。ゆえに、経済効率及び機器の小型化が十分でないという問題がある。
ＰＣＲ過程中でＤＮＡの濃度が濃くなるにつれてインピーダンスが小さくなり、伝導性は増加するという概念に基づいて、特許出願がなされた（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、上記特許文献１に示されるＰＣＲ過程中でＤＮＡの濃度が濃くなるにつれてインピーダンスが小さくなるという主張は、本発明者らが確認した結果とは相異なる点がある。したがって、この特許文献１は、ＰＣＲ反応のメカニズムを理解していない可能性がある。
ＰＣＲ過程中、ｄＮＴＰは、ｄＮＭＰとジホスフェートとに分解されると同時に、ｄＮＭＰは、鋳型ＤＮＡに相補的なプライマーを用いて重合されてＤＮＡが合成される。この時、特許文献１では、副産物であるジホスフェートの電気的移動性だけを考慮しているがが、ＤＮＡの合成時に電荷を有しているｄＮＭＰ、プライマー及び鋳型によって減少される電気的移動性までを考慮すると、ＤＮＡの濃度が濃くなるにつれてＰＣＲのインピーダンスは電気的移動性の減少により高まる。また、前記特許文献１はリアルタイムＰＣＲチップでない終末点検出(end-point detection)用のＰＣＲチップに関するものであり、この点で、リアルタイムＰＣＲチップとは異なる。また、前記特許文献１は、増幅されたＰＣＲ産物を検出するためにイオンで標識されたプローブを使用しなければならないという問題点があった。
米国特許出願公開第２００２／００７２０５４号明細書 Christa L. Colyer et al, Journal of Chromatography A, Volume 781, Issues 1-2, 26 September 1997, pp. 271-276 F. Laugere et al, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 83, Issues 1-3, 15 March 2002, pp. 104-108 Pumera et al., Anal. Chem., 2002, 74(9), pp.1968-1971
本発明の目的は、前のような従来技術の問題点を解決するためのものであって、ＰＣＲ溶液中の電気的信号の変化を測定することによってＰＣＲ増幅産物をリアルタイムで検出できる方法を提供することである。
本発明の目的は、（ａ）ＰＣＲの反応に必要な成分からなる溶液を含む容器内に一対以上の電極を提供する段階と；（ｂ）イオンで標識されたプライマーを使用せずにＰＣＲを行う段階と；（ｃ）前記電極間に交流電場を発生させる段階と；（ｄ）前記溶液のインピーダンスサイズの増加度を測定する段階と、（ｅ）前記（ｄ）段階の測定時に生じる誤差値を修正する段階と、を含むＰＣＲ産物を検出する方法によって達成される。
本発明は、（ａ）ＰＣＲの反応に必要な成分からなる溶液を含む容器内に一対以上の電極を提供する段階と；（ｂ）イオンで標識されたプライマーを使用せずにＰＣＲを行う段階と；（ｃ）前記電極間に交流電場を発生させる段階と；（ｄ）前記溶液のインピーダンスサイズの増加度を測定する段階と、（ｅ）前記（ｄ）段階の測定時に生じる誤差値を修正する段階と、を含むＰＣＲ産物を検出する方法に関するものである。本発明の方法によれば、ＰＣＲ産物をＰＣＲ工程中にリアルタイムで測定できる。
また、本発明の方法によれば、電気的信号を検出することによって検出システムを小型化することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、（ａ）ＰＣＲの反応に必要な成分からなる溶液を含む容器内に一対以上の電極を提供する段階と；（ｂ）イオンで標識されたプライマーを使用せずにＰＣＲを行う段階と；（ｃ）前記電極間に交流電場を発生させる段階と；（ｄ）前記溶液のインピーダンスサイズの増加度を測定する段階と、（ｅ）前記（ｄ）段階の測定時に生じる誤差値を修正する段階と、を含むＰＣＲ産物を検出する方法を提供するものである。
本発明による（ａ）段階において、前記ＰＣＲ溶液を含む容器は、特に制限されず、通常、ＰＣＲに使用される容器が使用される。例えば、通常のバルクＰＣＲチューブ等のＰＣＲチューブまたは重合マイクロチャンバー(polymerization microchamber)等のチャンバーが含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明において、電極は、ＰＣＲ溶液を含む容器中に少なくとも１対設けられるが、この際、電極の配置は特に制限されないが、例えば、ＰＣＲ溶液を含む容器中に相互に対向するように配置される。バルクＰＣＲチューブの場合には、電極は、チューブの底から一定の高さに相互に対向するように設置できる。重合マイクロチャンバーの場合には、マイクロチャンバーの上下または左右の側面に、例えば、相互に対向するように、設置できる。この時、電極は、当該分野において既知の色々な方法、例えば、フォトリソグラフィ法を使用することによって形成されうる。また、前記電極は、当該分野において既知の様々な金属電極、例えば、Ｃｕ電極、Ｃｒ−Ａｕ電極またはシリコン上にＡｓをドーピングして作った電極などを使用できる。
上記段階（ａ）において、ＰＣＲ溶液を含む容器内に電極を提供する方法としては、特に制限されず公知の電極の形成方法が同様にして使用できるが、例えば、ＰＣＲチューブの場合には、ＰＣＲチューブに孔を開け、この孔を介してＰＣＲ溶液の適当な部分（例えば、中間部分）に電極がくるように電極をを挿入する方法がある。次に、適当な電線を孔に挿し込んで電極と連結する。この際、電極としてがは、特に制限されず、公知の電極が使用でき、例えば、銀がコーティングされており、テフロン（登録商標）被覆等の絶縁材で覆われたＣｕ電線などがある。また、電極は、高温エポキシ等の接着剤を用いて、電極間の距離が一定になるようにチューブの壁に固定することが好ましい。これにより、ＰＣＲ溶液が存在するチューブの下部の直径を一定に維持しつつ、チューブ内の壁面に小さな電極を設置できるので、電極の表面積を小さくすることができる。また、このように電極の表面積を狭くすることによって、電極表面で発生する酵素またはＰＣＲ成分の吸着量を減らし、それによる検出の感度及び産物収率を向上することが可能である。
また、重合マイクロチャンバーの場合にも、ＰＣＲ溶液を含む容器内に電極を提供する方法としては、特に制限されず公知の電極の形成方法が同様にして使用できるが、例えば、以下のような方法がある。まず、ＡｓがドーピングされたＮ型シリコンウェーハ等の適当なウェーハを熱酸化させて、適当な厚みの酸化膜層（例えば、ＳｉＯ２層）を、ウェーハの上下面に形成する。次に、ウェーハの上面に形成された酸化膜層に、フォトレジストを塗布し、フォトリソグラフィ法を利用して上部及び下部電極をパターニングした後、酸化膜層を適当なエッチング液でエッチングして、前記パターン形成された部分の酸化膜層を除去する。電子ビームまたはスパッタリング等の公知の蒸着方法を用いて、酸化膜層がエッチングされたウェーハの上面に、Ｃｒ及びＡｕ等の適当な金属薄膜を蒸着させ、下面には、Ａｌ等の適当な金属薄膜を同様にして蒸着させる。さらに、リフトオフ方式等の公知の方法用いて、上部電極として、Ａｕ等の電極を形成する。下面の金属薄膜にフォトレジストを塗布し、この薄膜上にフォトレジストパターンを形成し、エッチングする。続いて、酸化膜層及びシリコンウェーハをＩＣＰ−ＲＩＥなどの公知の方法を利用してドライエッチングする。エッチング後に残りのフォトレジストをアセトン等の適当な溶剤で溶かし、残りの下面の金属薄膜をエッチングして、下部電極を形成する。このようにして得られた上部及び下部電極が形成されたシリコンウェーハは、ガラスウェーハに正極接合法(anodic bonding process)等の公知の方法により接合し、これに、サンドブラスト工法等の公知の方法によってＰＣＲチップの反応チャンバー用孔を形成する。この接合されたウェーハをダイシングして、最終チップとする。前記正極接合法は、シリコンウェーハとガラスウェーハとを接合させるための方法であって、高い電場及び熱を加えて、ガラスウェーハ内に存在する正電荷を帯びたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）をシリコンウェーハの境界面から反対側に移動させて、シリコンウェーハとガラスウェーハとの間に水素結合を形成させて２つのウェーハを接合させる方法である。このようにして製造された電極は、公知の電極が従来平面的に一定領域に形成されるのとは異なり、電極を３次元的に相対するように、電極（上部、下部）が形成され、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡすべてがこのチャンバで検出できる。
または、上記方法において、上部及び下部電極を形成したシリコンウェーハを、シリコン直接接合法を用いて、直接結合して、２層構造のＰＣＲチップを製造してもよい。この方法によると、ガラスウェーハを使用しないので、生産コスト及びチャンバーの体積を容易に調節できる。また、この方法を利用する場合には、金属電極を利用せず、ＡｓドーピングされたＮ型シリコンウェーハ等のシリコンウェーハの上面及び下面上のＳｉＯ２層等の酸化膜層を狭い面積でエッチングした後、エッチングされたＳｉＯ２層を電極として使用することができる。これによって、金属表面に生体分子(biomolecule)の吸着を防止できて、ＰＣＲ産物収率と検出感度とを向上できる。
本発明による（ｂ）段階において、ＰＣＲは、公知の方法と同様にして行なわれ、その反応条件や試薬などは適宜選択される。なお、ＰＣＲを行うにおいて、ＰＣＲ反応に必要な反応物や溶液以外には、電気的信号を発生させ、溶液の誘電特性の変化を測定するため、特異的に標識されたプローブやプライマーを使用する必要は必ずしもない。したがって、本発明ではイオンで標識されたプライマーなどを使用する必要がない。ただし、本発明は、電気的信号を発生させるために特異的に標識されたプローブやプライマーを使用せずにもＰＣＲ産物を検出できるが、これに限定されるものではなく、このようなプローブやプライマーを使用してもよい。
本発明による（ｃ）段階において、電場は、公知の方法によって生じ、例えば、前記一対の電極に連結された公知の交流（ＡＣ）または直流（ＤＣ）供給器を通じて発生され、好ましくは交流を用いて発生する。前記電場を発生するのに使われる交流の周波数は、望ましくは１Ｈｚないし１００ＭＨｚである。また、電場を発生させる段階において、平均交流電圧［平均ＡＣ電圧（Ｖｒｍｓ）］は、望ましくは１ｍＶないし１０Ｖである。
本発明による（ｄ）段階において、ＰＣＲ溶液の誘電特性の変化を測定するが、この際誘電特性としては、特に制限されず、上記ＰＣＲ溶液の変化する特性であれば特に制限されないが、例えば、電場を通じて派生される、インピーダンス、誘電損失、誘電率またはアドミタンス等の電気的係数があるが、これに限定されるものではない。このような電気的係数は、特に制限されず、測定される誘電特性の種類によって公知の方法から適宜選択されて測定でき、前記電極に連結された前記誘電特性の測定手段を通じて測定できる。例えば、前記電極に作動可能に連結されたインピーダンスセンサを使用できる。
以下、本発明を、図面を参照した実施例を通じてさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：電極を備えたＰＣＲチューブの製作
公知のＰＣＲチューブに孔を開け、この孔を介してＰＣＲ溶液の中間部分に電極を挿し込んだ。次いで、この電極をＰＣＲ機器と連結した後、ＰＣＲを行いつつ、各ＰＣＲサイクル直後に電気的信号を検出した。本実施例では、増幅したＤＮＡをインピーダンスを測定した。
具体的には、０.２ｍｌのＰＣＲチューブの底部から５ｍｍ地点に、チューブの両壁面（相対する面）に直径０.３ｍｍの孔をあけた。次に、０.３２ｍｍ直径の電線を孔に挿し込んで電極として使用した。この際、電極として、銀がコーティングされており、テフロン（登録商標）被覆で覆われたＣｕ電線を使用した。電極は、チューブの壁に高温エポキシを利用して電極間の距離が１.５ｍｍに保持されるように固定した。これによって、図１に示されるように、ＰＣＲ溶液が存在するチューブの下部の直径は約１.５ｍｍに維持され、そのチューブ内の壁面に小さな電極を設置したので、電極の表面積を狭くできた。このように電極の表面積を狭くすることによって、電極表面で発生する酵素またはＰＣＲ成分の吸着を減らし、それによる検出の感度及び産物収率を向上させうる。
実施例２：チャンバーの上部及び下部に電極を備えた３層構造のＰＣＲチップの製作
図６ないし７に示したような過程を経て、チャンバーの上部及び下部に電極が具現されたＰＣＲチップを製作した。
まず、ＡｓがドーピングされたＮ型シリコンウェーハ１を熱酸化させて、約５,０００Å以上の厚みを有するＳｉＯ２層３を、ウェーハ１の上下面に形成した（Ａ段階）。次に、ウェーハ１の上面に形成された前記ＳｉＯ２層（酸化膜層）３に、フォトレジスト（ＡＺ ５２１４）５を塗布した（Ｂ段階）。前記フォトレジスト５についてフォトリソグラフィ法を利用して上部及び下部電極をパターニングした後、前記パターンされた部分のＳｉＯ２層を除去するために、エッチング液（ＨＦ）にウェーハ１を入れてＳｉＯ２をエッチングした。ＳｉＯ２がエッチングされたウェーハ１に電子ビームまたはスパッタリングを利用してＣｒ及びＡｕ薄膜７をウェーハ１の上面に蒸着させ、下面にはＡｌ薄膜９を同様にして蒸着させた（Ｃ段階）。その次に、リフトオフ方式を利用して上部電極にＡｕ電極を形成した（Ｄ段階）。Ａｌ薄膜９にフォトレジストを塗布し、Ａｌ薄膜９上にフォトレジストパターンを形成した（Ｅ段階）後、Ａｌ薄膜９をエッチングし、さらに、ＳｉＯ２層３及びシリコンウェーハ１をＩＣＰ−ＲＩＥを利用してドライエッチングした（Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩ段階）。エッチング後に残りのフォトレジストをアセトンを利用して溶かし、残りのＡｌ薄膜をエッチングした（Ｊ、Ｋ段階）。
得られた上部及び下部電極が形成されたシリコンウェーハ１をガラスウェーハ１１を正極接合法(anodic bonding process)を利用して接合し、これに、サンドブラスト工法によってＰＣＲチップの反応チャンバー用孔を設置形成した。この接合されたウェーハをダイシングして、最終チップを製造した。前記正極接合法は、シリコンウェーハとガラスウェーハとを接合させるための方法であって、高い電場及び熱を加えて、ガラスウェーハ内に存在する正電荷を帯びたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）をシリコンウェーハの境界面から反対側に移動させて、シリコンウェーハとガラスウェーハとの間に水素結合を形成させて２つのウェーハを接合させる方法である。
本実施例の製造工程は、公知の電極が従来平面的に一定領域に形成されるのと異なり、電極を３次元的に相対するように、電極（上部、下部）を形成するものであって、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡすべてがチャンバで検出できる。
本実施例によって製作されたＰＣＲチップを、図２ないし５に示した。図２は、前記ＰＣＲチップの斜視図である。図３は、前記ＰＣＲチップの平面図であって、入口１３と出口１５とが示されている。図４は、前記ＰＣＲチップの平面断面図であって、重合マイクロチャンバー１７と下部電極１９とが示されている。図５は、前記ＰＣＲチップの側面断面図であって、入口１３、出口１５、上部電極２１、下部電極１９、重合マイクロチャンバー１７及びガラスウェーハ１１が示されている。
実施例３：シリコン直接結合を通した２層構造のＰＣＲチップの製作
前記実施例２において、上部及び下部電極を形成したシリコンウェーハを、シリコン直接接合法を用いて、直接結合した以外は、実施例２と同様にして、２層構造のＰＣＲチップを製造した。
本実施例では、ガラスウェーハを使用しなかったので、生産コスト及びチャンバーの体積を容易に調節（減少）できる。この方法を利用する場合には、金属電極を利用せず、ＡｓドーピングされたＮ型シリコンウェーハの上面及び下面上のＳｉＯ２層を狭い面積でエッチングした後、エッチングされたＳｉＯ２層を電極として使用する。これによって、金属表面に生体分子(biomolecule)の吸着を防止できて、ＰＣＲ産物収率と検出感度とを向上させうる。
実施例４：ＰＣＲ反応産物のリアルタイム検出
本実施例では、実施例１と同様にして製造された電極を備えたＰＣＲチューブ及び前記電極に作動的に連結されたインピーダンス測定装置（インピーダンスセンサ）を含むＰＣＲ機器を利用して、ＰＣＲ産物をリアルタイムで検出した。
ＰＣＲ反応は、プラスミドＤＮＡ（３２３ｂｐ）を鋳型とし、およびＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを利用してＰＣＲを行った。総３５サイクルのＰＣＲのうち、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、及び３５サイクル目で、それぞれ、１分間の延長反応が終わった後にインピーダンス（抵抗）値を測定した。この時、測定温度は、延長反応時の温度と同じであり、電圧は１００ｍＶの交流電圧を印加して、５００〜５,０００Ｈｚの周波数範囲で測定する。比較群として、ＤＮＡ鋳型なしで同じようにＰＣＲを行った後、インピーダンスを測定した。
その結果を図８ないし１１に示した。図８は、比較用ＰＣＲのサイクルの増加による周波数に対するインピーダンス実数の変化を示すグラフである。図８に示したように、ＰＣＲサイクル数の増加によって、インピーダンス実数は増加する。また、周波数が増加するほど、１サイクル目から３５サイクル目までのインピーダンス実数の差が小さくなることが分かる。
図９は、比較用ＰＣＲのサイクルの周波数に対するインピーダンスサイズの変化を示す図面である。図９に示したように、インピーダンス虚数部(impedance imaginary part)の変化は、図８に示されるのと同様、インピーダンス実数、虚数部の変化、タンジェントデルタの値と比較すると、ＰＣＲサイクル数の増加に伴って顕著に減少する。約１,０００Ｈｚ領域では、ＰＣＲサイクル数の増加に対するインピーダンスサイズの変化は、ほとんどないことが分かる。周波数が１０７７Ｈｚである時の１サイクル目及び３５サイクル目でのインピーダンスサイズの差が約４５Ωである。ＤＮＡの増幅があまりないあるいはあるにも拘わらずインピーダンス値の変化が発生するのは、ｄＮＴＰ、プライマー及び酵素が電極に吸着される現象とこの検出システムが含んでいる測定時の干渉とのためであると考えられる。この誤差値はＰＣＲによって増幅されるＤＮＡの検出値で考慮されなければならない。
図１０は、本発明によるＰＣＲサイクルの周波数に対するインピーダンス実数の変化を示すグラフである。図１０に示したように、ＰＣＲサイクル数の増加に従って、ＤＮＡ濃度が増加することを示す、インピーダンス実数は顕著な差を示す。この結果は、ＰＣＲサイクルの数がｎになった時、ＤＮＡの数は２ｎ倍に増幅するという理論と符合するものである。
図１１は、本発明によるＰＣＲサイクルの周波数に対するインピーダンスサイズの変化を示すグラフである。図１１に示したように、ＰＣＲサイクル数の増加に従って、インピーダンスサイズが顕著に増加することが分かる。１ないし５サイクル目ではインピーダンスサイズの変化が少なく、それ以降インピーダンスサイズの変化が大きくなっていることは、ＤＮＡの増幅が指数的に生じるという理論によって説明される。また、３０ないし３５サイクル目ではインピーダンスサイズ値の変化が少ない理由はＰＣＲ成分の枯渇によりプラトーになったためであると考えられる。
以上のように図８ないし１１に示した結果から、ＰＣＲサイクル数の増加によるＤＮＡ産物の濃度を定量的に分析するためには、インピーダンス実数、虚数部、タンジェントデルタのような測定値よりは、インピーダンスサイズが最適であることが判明した。その理由は、図８及び９の結果に示したように、システムの干渉のサイズが、他の測定値と比較して、インピーダンスサイズで最も小さいためである。
実施例５：特定な周波数でのＰＣＲサイクルに対するインピーダンスサイズの変化
一定の周波数でのＰＣＲサイクルに対するインピーダンスサイズの変化を測定することを除いては、実施例４と同じ方法で、ＰＣＲ産物のリアルタイム検出を行なった。実施例４では、約１,０００Ｈｚの周波数でＰＣＲ理論に最適の結果を示すことが示されたので、この近くの周波数である１,０７７ＨｚでのＰＣＲサイクルによるＤＮＡ増幅時及び増幅が起らない時のインピーダンスサイズ（電気的抵抗）を測定した。その結果を図１２及び１３に示した。
図１２は、比較用ＰＣＲ反応溶液のリアルタイムでのインピーダンスサイズを測定した結果を示すグラフであり、図１３は、本発明によるＰＣＲが進行されるにつれて増幅されたＤＮＡをリアルタイムで検出した結果を示すグラフである。図１２では、実施例４で説明したように、周波数が１０７７Ｈｚである時の１サイクル目及び３５サイクル目でのインピーダンスサイズの差が４５Ωである。これは検出システムの干渉によって発生する誤差値である。図１３に示したように、ＰＣＲサイクル数の増加によるインピーダンスの変化はＳ字型曲線を形成しており、これは代数的に増加するＰＣＲ産物の濃度をよく反映している。以上のような結果を基に、本発明によるＰＣＲサイクルの４５Ωの干渉による誤差を修正したインピーダンスサイズの結果を図１４に示した。
本発明のＰＣＲ増幅産物を検出する方法は、ＰＣＲから増幅産物をリアルタイムで検出するのに使用されうる。本発明の方法は、電気的信号を利用してＰＣＲ増幅産物を測定することによって検出機器を小型化できる。
電極を備えたＰＣＲチューブを示す図面である。 電極を備えたＰＣＲチップを有するＰＣＲチャンバーの一実施態様を示す図面である。 は、図２のＰＣＲチップの平面図である。 は、図２のＰＣＲチップの平面断面図である。 は、図２のＰＣＲチップの側面断面図である。 及び は、図２のＰＣＲチップの重合反応チャンバー及び電極を製造する過程を示す図面である。 は、比較用ＰＣＲサイクルで周波数に対するインピーダンス実数の変化を示すグラフである。 は、比較用ＰＣＲサイクルで周波数に対するインピーダンスサイズ(impedance magnitude)の変化を示すグラフである。 は、本発明によるＰＣＲサイクルで周波数に対するインピーダンス実数の変化を示すグラフである。 は、本発明によるＰＣＲサイクルで周波数に対するインピーダンスサイズの変化を示すグラフである。 は、比較用ＰＣＲサイクル数に対するインピーダンスサイズの変化を示すグラフ図面である。 は、本発明によるＰＣＲサイクル数に対するインピーダンスサイズの変化を示すグラフである。 は、誤差を修正した本発明によるＰＣＲサイクル数に対するインピーダンスサイズの変化を示すグラフである。
符号の説明
入口…１３、出口…１５、上部電極…２１、下部電極…１９、重合マイクロチャンバー…１７、ガラスウェーハ…１１。

Claims (5)

  1. （ａ）ＰＣＲの反応に必要な成分からなる溶液を含む容器内に一対以上の電極を提供する段階と、
    （ｂ）イオンで標識されたプライマーを使用せずにＰＣＲを行う段階と、
    （ｃ）前記電極間に交流電場を発生させる段階と、
    （ｄ）前記溶液のインピーダンスサイズの増加度を測定する段階と、
    （ｅ）前記（ｄ）段階の測定時に生じる誤差値を修正する段階と、
    を含むＰＣＲ産物を検出する方法。
  2. 前記溶液を含む容器は、ＰＣＲチューブまたは重合マイクロチャンバーである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（ｃ）段階において、前記交流電場を発生させる段階は、周波数１Ｈｚ〜１００ＭＨｚの交流を使用する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記（ｃ）段階において、前記交流電場を発生させる段階は、１ｍＶ〜１０Ｖの平均交流電圧［平均ＡＣ電圧（Ｖｒｍｓ）］を使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記（ｅ）段階は、周波数をパラメーターとして、ＰＣＲのサイクルの増加による周波数に対するインピーダンスの変化を測定し、１サイクル目及び３５サイクル目でのインピーダンスの誤差値を求めることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7157232B2 (en) * 2000-12-13 2007-01-02 The Regents Of The University Of California Method to detect the end-point for PCR DNA amplification using an ionically labeled probe and measuring impedance change
US7250775B1 (en) * 2003-11-12 2007-07-31 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices and methods based on measurements of electrical admittance
US8697433B2 (en) * 2003-12-10 2014-04-15 Samsung Electronics Co., Ltd. Polymerase chain reaction (PCR) module and multiple PCR system using the same
US7767439B2 (en) * 2003-12-10 2010-08-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Real-time PCR monitoring apparatus and method
US7799557B2 (en) * 2003-12-10 2010-09-21 Samsung Electronics Co., Ltd. Polymerase chain reaction (PCR) module and multiple PCR system using the same
US7553625B2 (en) * 2003-12-22 2009-06-30 John Wayne Cancer Institute Method and apparatus for in vivo collection of circulating biological components
US20050153309A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 David Hoon Method and apparatus for in vivo surveillance of circulating biological components
KR100590569B1 (ko) * 2004-02-14 2006-06-15 삼성전자주식회사 실시간 중합효소연쇄반응 검사 방법
CN101506380A (zh) * 2006-08-11 2009-08-12 香港科技大学 用电导或电化学活跃标签实时定量分析与监察核酸扩增的方法与系统
TW200905198A (en) * 2007-07-27 2009-02-01 Univ Nat Taiwan Miniature eddy generator
KR100969667B1 (ko) 2008-03-24 2010-07-14 디지탈 지노믹스(주) 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한바이오칩
KR100969671B1 (ko) * 2008-03-28 2010-07-14 디지탈 지노믹스(주) 고감도 바이오 센서 및 이를 포함하는 바이오 칩 그리고이를 제조하는 방법
WO2010037085A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Dna sequencing and amplification systems using nanoscale field effect sensor arrays
GB0905325D0 (en) 2009-03-30 2009-05-13 Selex Sensors & Airborne Sys Detection system
US9376713B2 (en) * 2009-09-23 2016-06-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Label free detection of nucleic acid amplification
JP5753581B2 (ja) * 2010-07-23 2015-07-22 バイオニア コーポレーション 試料内蔵マイクロチャンバープレート及び分析用マイクロチャンバープレートの製造方法、分析用マイクロチャンバープレート及び試料内蔵マイクロチャンバープレートの製造装置セット
JP2013541698A (ja) * 2010-09-02 2013-11-14 ヘード ダイアグノスティックス エイピーエス 被検体の電気化学的検出
KR101726238B1 (ko) * 2010-10-15 2017-04-12 (주) 하임바이오텍 표적 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 비특이적으로 연장하는 방법, 이를 위한 프라이머 조성물 및 표적 폴리뉴클레오티드 검출감도 향상용 키트
KR20120045909A (ko) * 2010-11-01 2012-05-09 엘지전자 주식회사 복수 종의 표적 핵산을 실시간으로 검출하는 장치 및 방법
KR101892292B1 (ko) * 2011-04-04 2018-08-27 엘지전자 주식회사 복수 종의 표적 핵산을 실시간으로 검출하는 장치 및 방법
CN102604827B (zh) * 2012-03-31 2014-01-29 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 非接触式电导法实现pcr反应过程的实时检测系统和方法
WO2013150454A2 (en) * 2012-04-04 2013-10-10 Shama Bhat System and method for detecting and analyzing amplified deoxyribonucleic acid
KR101950210B1 (ko) * 2012-07-24 2019-02-22 주식회사 미코바이오메드 히터 유닛이 반복 배치된 열 블록을 포함하는 전기화학적 신호를 검출하기 위한 실시간 ｐｃｒ 장치, 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법
KR101983580B1 (ko) * 2012-08-29 2019-05-29 주식회사 미코바이오메드 히터 유닛이 반복 배치된 열 블록을 포함하는 전기화학적 신호를 검출하기 위한 ｐｃｒ 칩, 이를 포함하는 ｐｃｒ 장치, 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법
KR101946339B1 (ko) * 2012-08-29 2019-04-25 주식회사 미코바이오메드 히터 유닛이 반복 배치된 열 블록을 포함하는 전기화학적 신호를 검출하기 위한 실시간 ｐｃｒ 장치, 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법
KR101983593B1 (ko) * 2012-08-29 2019-05-29 주식회사 미코바이오메드 히터 유닛이 반복 배치된 열 블록을 포함하는 전기화학적 신호를 검출하기 위한 ｐｃｒ 칩, 이를 포함하는 ｐｃｒ 장치, 및 이를 이용한 실시간 ｐｃｒ 방법
US9506908B2 (en) 2014-10-06 2016-11-29 Alveo Technologies, Inc. System for detection of analytes
US9921182B2 (en) 2014-10-06 2018-03-20 ALVEO Technologies Inc. System and method for detection of mercury
US10196678B2 (en) 2014-10-06 2019-02-05 ALVEO Technologies Inc. System and method for detection of nucleic acids
US10627358B2 (en) 2014-10-06 2020-04-21 Alveo Technologies, Inc. Method for detection of analytes
US10352899B2 (en) 2014-10-06 2019-07-16 ALVEO Technologies Inc. System and method for detection of silver
CN105606673A (zh) * 2016-02-03 2016-05-25 北京大学 一种可用于电化学实时pcr的芯片及其制备方法
CN109561890A (zh) 2016-06-09 2019-04-02 海马切克公司 用于检测和可逆地捕获活体内体液中的细胞的收集器
MX2019003273A (es) 2016-09-23 2019-09-13 Alveo Tech Inc Metodos y composiciones para detectar analitos.
GR1009763B (el) 2018-03-13 2020-06-12 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων (Εκεφε) " Δημοκριτος" Ολοκληρωμενη μικροδιαταξη σε υποστρωμα τυπωμενου κυκλωματος για την ανιχνευση νουκλεϊκων οξεων με μεγαλη ευαισθησια και μεθοδος κατασκευης αυτης
DE102022124960A1 (de) 2022-09-28 2024-03-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein DNA/-RNA Sensorsystem mittels kapazitiver berührungsfreier Messung

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4023096A (en) * 1976-02-17 1977-05-10 Shell Oil Company Method and apparatus for determining physical characteristics of emulsions
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5587128A (en) * 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
JP4912517B2 (ja) * 1996-04-03 2012-04-11 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー 複数の分析物の検出のためのデバイスおよび方法
GB9717932D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Hybaid Ltd Estimation of nucleic acid
US6686150B1 (en) * 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
WO2000009651A1 (en) * 1998-08-12 2000-02-24 University Of Utah Research Foundation Dna amplification using electrolyte conductance heating and temperature monitoring
US6169394B1 (en) * 1998-09-18 2001-01-02 University Of The Utah Research Foundation Electrical detector for micro-analysis systems
WO2001042508A2 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Motorola, Inc. Methods and compositions relating to electrical detection of nucleic acid reactions
GB0002859D0 (en) * 2000-02-08 2000-03-29 Molecular Sensing Plc Process for characterising nucleic acids in solution
US20010034062A1 (en) * 2000-02-09 2001-10-25 Scott Koenig Antibody gene therapy with adeno-associated viral vectors
JP2001306359A (ja) 2000-04-20 2001-11-02 Seiko Epson Corp 自動評価システム
WO2001081619A2 (de) * 2000-04-22 2001-11-01 Borros Arneth Konduktivitäts-pcr (leitfähigkeits-pcr)
US20030027169A1 (en) * 2000-10-27 2003-02-06 Sheng Zhang One-well assay for high throughput detection of single nucleotide polymorphisms
US20020072054A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-13 The Regents Of The University Of California Sensor using impedance change to detect the end-point for PCR DNA amplification

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