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Die Anmeldung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Dielektrizitätskonstante von Proben, insbesondere von Nukleinsäuren enthaltenden Proben und ein damit durchführbares Messverfahren.
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Die Messung der Konzentration bestimmter Nukleinsäuren ist für die Virendiagnostik essenziell. Hierfür finden typischerweise auch Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation wie etwa Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) oder PCR-Test Verfahren Anwendung. Gerade in Zeiten von Pandemien besteht ein noch größerer Bedarf für zeitsparende Verfahren mit geringem Materialaufwand, die es außerdem erlauben, große Mengen an Substraten gleichzeitig zu untersuchen. Darüber hinaus können im Anschluss an ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren mittels einer Schmelzkurvenanalyse (Melt Curve Analysis MCA) Sequenzabweichungen bzw. definierte pathogene Mutationen des amplifizierten DNA Materials detektiert werden.
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Bei der Schmelzkurvenanalyse wird das PCR-Produkt durch langsames Erwärmen um üblicherweise etwa 1 °C/s auf eine Temperatur von etwa 60°C bis etwa 100°C gebracht. Dadurch trennen sich die DNA Doppelstränge in Einzelstränge auf. Die Schmelzkurve weist regelmäßig einen sigmoiden Verlauf auf, wobei die Temperatur des Wendepunkts spezifisch für die untersuchte DNA ist. Aufgrund der unterschiedlichen Anzahl an Wasserstoffbrückenbindungen von Guanin (G) - Cytosin (C) Basenpaaren mit 3 Wasserstoffbrückenbindungen und Adenin (A) - Tryptophan (T) Basenpaaren mit nur 2 Wasserstoffbrückenbindungen ist eine Änderung der DNA-Sequenz (Mutation) anhand einer Verschiebung des Schmelzpunkts mittels MCA detektierbar. Das Auftrennen der DNA Doppelstränge in die Einzelstränge geht weiterhin mit einer detektierbaren Änderung der Absorption einher (Hyperchromieeffekt). Hierzu werden häufig Fluorophore in Form von sogenannten LightCycler-Sonden eingesetzt. Diese bestehen aus zwei verschiedenen, mit jeweils einem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Donor und FRET-Akzeptor markierten Oligonukleotiden, welche an vordefinierte Basensequenzen der DNA Einzelstränge „andocken“ können und durch den FRET zu einem detektierbaren Peak in der Absorptionskurve führen. Dissoziiert eines der beiden Oligonukleotide aufgrund eines Basenmismatches (z.B. Mutation in der DNA Sequenz) bei einer anderen Temperatur, erscheint auch der Absorptionspeak bei einer (von der Temperatur des Absorptionspeaks ohne Basenmismatch) abweichenden Temperatur. Lagern sich die DNA-Einzelstränge wieder zu einem DNA Doppelstrang zusammen oder trennen sich erst gar nicht auf, können die Sonden nicht an die Basensequenz andocken. Aufgrund der hohen Kosten für das Verfahren und die Sonden wird in herkömmlichen molekularbiologischen Analyselaboren jedoch häufig auf die MCA und den Einsatz von Fluorophoren verzichtet, wodurch sich jedoch die Aussagekraft der Analyse auf den eines einfachen Standard PCR Tests reduziert (positiv oder negativ). Derartige Verfahren haben also den generellen Nachteil, dass die Genauigkeit der Untersuchung im Hinblick auf die Detektion von Mutationen leidet
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Um den kostenintensiven Einsatz von Fluorophoren zu vermeiden, wird im Stand der Technik anstatt der Messung der Absorption teilweise auch auf andere Kenngrößen wie etwa der Impedanz oder den pH-Wert zurückgegriffen. Diese Verfahren leiden jedoch Ihrerseits unter dem Nachteil, dass die benötigten Elektroden vor jedem Test gewechselt oder aufwendig gereinigt werden müssen, da diese während der Untersuchung in direktem Kontakt mit der Testflüssigkeit stehen.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur kapazitiven Messung von Proben bereitzustellen, welche eine Verbesserung im Hinblick auf mindestens einen der genannten Nachteile des Stands der Technik darstellen. Vorzugsweise sollte dieses Verfahren und diese Vorrichtung geeignet sein, zusätzlich einen oder mehrere der nachfolgenden Vorteile zu erzielen: berührungsfreie Bestimmung des Fortschritts einer Nukleinsäureamplifikation, kostengünstige und schnelle Analyse einer Probe im Hinblick auf die erfolgreiche Amplifikationsreaktion, zeitgleiches Durchführen einer Schmelzkurvenanalyse während der Amplifikationsreaktion.
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur kapazitiven Messung der Dielektrizitätszahl, insbesondere einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine wässrige Lösung von zumindest: Nukleinsäuren, sowie passend auf die zu testenden Nukleinsäuren ausgesuchten Primer-Sequenzen und entsprechende Polymerase Enzyme. Je nach gesuchter Nukleinsäure können entsprechende Primer-Sequenzen hergestellt oder erworben werden, welche spezifisch an die Einzelstränge der gesuchten Nukleinsäure anbinden. Dort docken die Polymerase Enzyme an und vervielfältigen daraufhin die Nukleinsäure. Die Vorrichtung umfasst zumindest zwei elektrisch leitfähige Körper, welche zusammen den Messraum bilden. Der Messraum kann dabei vollständig oder auch nur teilweise von den zumindest zwei elektrisch leitfähigen Körpern umschlossen sein. Die leitfähigen Körper fungieren hierbei außerdem als Plattenkondensator zur Ausbildung eines elektrischen Feldes im Messraum. Plattenkondensator im Sinne dieser Erfindung ist jedes passive elektrische Bauelement, welches aus zumindest zwei, aus einem elektrisch leitfähigen Material bestehenden, durch ein Dielektrikum voneinander getrennten, Elektrodenkörpern besteht und welches die Fähigkeit besitzt, elektrische Ladung durch Ausbildung eines elektrischen Feldes im Dielektrikum zu speichern. Anmeldungsgemäß ist das Dielektrikum der von den leitfähigen Körpern umschlossene Messraum. Durch den beschriebenen erfindungsgemäßen Aufbau wird eine schnellere, fortlaufende Analyse von Proben ermöglicht.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst weiter ein Mittel zur Messung der Kapazität der Probe. Gemäß einer Ausführungsform kann das Mittel zur Messung der Kapazität ein handelsübliches Impedanzmessgerät sein.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Impedanzmessgerät mit einem Kapazitäts-zu-Digital Wandler verbunden sein, welcher die gemessene Kapazität zur weiteren Auswertung in ein digitales Signal umwandelt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform sind die elektrisch leitfähigen Körper aus einem metallischen Werkstoff ausgebildet und umfasst insbesondere ein Metall oder eine Legierung oder bestehen daraus, beispielsweise kann das Metall Kupfer, Eisen oder Aluminium sein oder die Legierung eines dieser Elemente enthalten.
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Um den Inhalt mehrerer Proben, beispielsweise PCR-Tubes, PCR-Tube Strips oder PCR-Wells gleichzeitig analysieren zu können, kann die Vorrichtung auch aus mehreren leitfähigen Körpern, die mehrere Messräume umschließen bestehen.
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In einer weiteren Ausführungsform kann zumindest einer der leitfähigen Körper, oder beide leitfähigen Körper beweglich ausgestaltet sein. Typischerweise im Wesentlichen horizontal, gegebenenfalls aber auch vertikal oder sowohl als auch. Auf diese Weise kann der Durchmesser des umschlossenen Messraumes an das Fassungsvermögen, mithin die Dimensionen der Probengefäße, angepasst werden.
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Die bewegliche Ausgestaltung kann bei einigen Varianten durch eine Führungseinrichtung oder gummielastische Lagerung bewerkstelligt werden, die eingerichtet ist, zumindest einen der leitfähigen Körper entlang einer Ebene beweglich zu lagern.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung zusätzlich ein Heizmittel zur Erwärmung des Probengefäßes aufweisen. Damit kann eine Anpassung der Probe an die Messbedingungen erfolgen und zusätzlich kann - sofern erforderlich - auch eine vor der Messung durchzuführende chemische Reaktion beschleunigt oder in Gang gesetzt werden. Insbesondere ist hierbei die Nukleinsäureamplifikation zu nennen.
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Wenn ein Heizmittel vorhanden ist, dann kann dieses in vorteilhafter Weise auch noch zur Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse (MCA) zeitgleich oder im zeitlichen Nachgang zur chemischen Reaktion, beispielsweise der Nukleinsäureamplifikation eingesetzt werden. Die Schmelzkurvenanalyse erlaubt beispielsweise eine tiefergehende Analyse des amplifizierten biologischen Materials etwa im Hinblick auf Mutationen der DNA. Da sich bei Änderungen der Basenpaare auch die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen ändert, geht eine Mutation der DNA regelmäßig mit einer Verschiebung des erwarteten Schmelzpunktes einher.
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Gemäß einer Ausführungsform ist das Heizmittel zur Erwärmung des Probengefäßes in der Art eines Heizblocks oder Heizmantels ausgebildet.
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In einer weiteren Ausführungsform werden die im wesentlichen vertikalen Flächen der leitfähigen Körper und der von diesen umschlossene Messraum zur besseren Homogenisierung der Probentemperatur im Probengefäß vollständig vom Heizmittel umschlossen, um eine möglichst homogene Erwärmung der Probe zu gewährleisten und so Messungenauigkeiten zu reduzieren. Somit kann auf diese Weise ohne zusätzlichen Aufwand, bzw. zusätzliche Verfahrensschritte, insbesondere das Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation mit einer Schmelzkurvenanalyse verbunden werden. Wodurch genauere Rückschlüsse auf die Beschaffenheit des amplifizierten Materials, etwa im Hinblick auf Mutationen ermöglicht werden.
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Zur Bestimmung des Reaktionsfortschritts der Nukleinsäureamplifikation umfasst die Vorrichtung außerdem ein Mittel zur Messung der Kapazität im Messraum, mithin in der Probe. In einer Ausführungsform erfolgt die Kapazitätsmessung durch einen handelsüblichen, in unmittelbarer Nähe zur Probe angebrachten Kapazitätssensor, welcher mit einem Kapazität-zu-Digital Wandler verbunden ist. Um Störeinflüsse auf das empfangene Signal und damit Messfehler zu vermeiden, wird der Kapazitätssensor so nah wie möglich an die Probenflüssigkeit heran befestigt. Das mit dem Kapazitätssensor ermittelte Messsignal wird vom Kapazität-zu-Digital Wandler in ein digitales Messsignal umgewandelt. Dieses kann dann mit einer digitalen Datenverarbeitungseinheit angezeigt, ausgewertet und/oder verarbeitet werden. Um eine Verunreinigung von Kapazitätssensor und Wandler zu vermeiden, werden diese aber nicht direkt in die Probenflüssigkeit eingebracht. Dadurch wird eine aufwendige Reinigung des Messinstruments nach jeder Messung vermieden.
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In einer Ausführungsform kann der Kapazitätssensor gemeinsam mit zumindest einem der leitfähigen Körper die den Plattenkondensator bilden, auf zumindest einer gemeinsamen Platine sitzen.
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Der handelsübliche Kapazitäts-zu-Digital Wandler erfasst die vom Sensor gemessene elektrische Kapazität der Probe und wandelt die Information in ein digitales Signal zur Auswertung an einem Rechner um. Die Messung der Kapazität erfolgte bei den anmeldungsgemäßen Beispielen bei 400kHz und lag bei Werten um 1 pF. Aus der Kapazität kann bei bekannter Geometrie die Dielektrizitätszahl des Substrats bestimmt werden. Erfindungsgemäß wurde insbesondere festgestellt, dass die Kapazität und damit die Dielektrizitätszahl abhängig vom Reaktionsfortschritt, insbesondere vom Reaktionsfortschritt der Nukleinsäureamplifikation, also von der Konzentration und Beschaffenheit der Nukleinsäure in der Probe ist. Beschaffenheit der Nukleinsäure bezeichnet in diesem Zusammenhang insbesondere das Vorliegen der Nukleinsäure in einsträngiger, oder doppelsträngiger Form. Findet eine Amplifizierung statt, steigt durch die Vermehrung doppelsträngiger DNA die Dielektrizitätszahl und somit die Kapazität. Findet hingegen keine Amplifizierung statt oder denaturiert die DNA, liegt mehr DNA im einsträngigen Zustand vor. Die Dielektrizitätszahl und damit die Kapazität sinkt.
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Um das Verfahren unter gleichbleibenden Bedingungen durchführen zu können, sind gemäß einer Ausführungsform die leitfähigen Körper der erfindungsgemäßen Vorrichtung derart geformt, dass der von diesen umschlossene Raum geometrisch zur formschlüssigen Aufnahme von handelsüblichen Probengefäßen geeignet ist. Beispielsweise handelt es sich bei den leitfähigen Körpern um Platten welche kreisbogenförmig mit Radius entsprechend des halben Durchmessers der aufzunehmenden Probengefäße verformt sind.
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Bei den Probengefäßen kann es sich insbesondere aus ökonomischen Gründen um handelsübliche PCR-Tubes, PCR-Tube Strips oder PCR-Wells. Handeln. Für handelsübliche PCR-Tubes mit 0,2 ml Fassungsvermögen beispielsweise 6,3 mm Durchmesser und 20,8 mm Höhe. Für handelsübliche PCR-Tubes mit 0,5 ml Fassungsvermögen 7,2 mm Durchmesser und 30,5 mm Höhe, jeweils mit zylindrischer Grundform konisch zulaufend. Probengefäße ermöglichen generell ein schnelles, fortlaufendes Wechseln der zu untersuchenden Flüssigkeit und verhindern außerdem eine Kontamination des Plattenkondensators und des Kapazitätssensors mit Probenflüssigkeit. Dadurch ist eine aufwendige Reinigung nach jeder Messung nicht mehr nötig und es wird eine fortlaufende Untersuchung von Proben ermöglicht. Dies ermöglicht einen gesteigerten Durchsatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und senkt außerdem die Kosten.
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Im Ausnahmefall kann die Probenflüssigkeit, wie in herkömmlichen Verfahren, auch direkt, also ohne Probengefäß in den Messraum eingebracht werden. In diesem Fall ist eine zumindest teilweise Beschichtung der leitfähigen Körper mit einer inerten Schicht aus einem Polymer, insbesondere einem Polyimid vorteilhaft. Zumindest teilweise bedeutet hierbei, dass zumindest im Bereich des direkten Kontakts zwischen der Probenflüssigkeit und den leitfähigen Körpern eine vollständig abdeckende Beschichtung ausgebildet ist.
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Die Beschichtung der leitfähigen Körper stellt eine Möglichkeit dar, das Auswechseln oder Reinigen der Elektroden nach jeder Messung zu vermeiden. Jedoch besteht darin noch keine vollständige räumliche Trennung zwischen Elektroden und Probenflüssigkeit, so dass eine Verunreinigung der Elektroden zwar verringert, aber nicht ganz ausgeschlossen wird.
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In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der mit dem Kapazität-zu-Digital Wandler verbundene Kapazitätssensor in unmittelbarer Nähe zum unteren, konischen Teil des Probengefäßes angebracht. Dadurch wird eine erfolgreiche Untersuchung auch dann ermöglicht, wenn nur wenig Probenflüssigkeit vorhanden ist.
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Das mit der anmeldungsgemäßen Vorrichtung durchführbare Verfahren, insbesondere zur berührungsfreien, kapazitiven Messung des Amplifikationsfortschritts einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion umfasst zumindest folgende Schritte:
- a) Bereitstellen der Probe,
- b) Verbringen der Probe enthaltend Nukleinsäuren in die vorstehend näher erläuterte Vorrichtung,
- c) Erwärmen der Probe auf eine Temperatur im Bereich von 0°C bis 100°C, bevorzugt 25°C bis 100°C, weiter bevorzugt 60°C bis 90°C,
- d) Messen der Kapazität der Probe enthaltend Nukleinsäuren,
- e) Korrelieren der gemessenen Kapazität mit der Temperatur der Probe,
- f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte c) bis e).
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Mit dem anmeldungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen oder aufwendig zu reinigenden, oder nach jeder Analyse zu wechselnden Elektroden, im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden nicht mehr notwendig. Die Bestimmung des Amplifikationsfortschritts über die Kapazität und Dielektrizitätszahl erfolgt in der anmeldungsgemäßen Vorrichtung ohne Kontakt zwischen Probenflüssigkeit und Messelektrode, da die den Plattenkondensator bildenden Körper lediglich mit dem Probengefäß in Kontakt kommen. Dies ermöglicht bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Lehre dieser Anmeldung ein unmittelbar aufeinander folgendes Durchführen mehrerer Analysen, ohne durch Reinigung oder Auswechseln der Elektroden bedingte Wartezeiten.
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Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird die Erfindung nachfolgend noch näher anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen erläutert, die insbesondere für den Ausführungsfall der Amplifizierung von Nukleinsäuren beschrieben sind, gleichermaßen aber auch in verallgemeinerter Form gelten.
- 1 zeigt beispielhaft zwei Plattenkondensatoren 5, 6 zwischen denen ein PCR Tube 2 passgenau eingebracht wird. Die beiden Plattenkondensatoren 5, 6 bilden ein elektrisches Feld aus. Mittels eines Kapazitätssensors kann die elektrische Kapazität gemessen und mit einem damit verbundenen Kapazitäts-zu-Digital Wandler in ein digitales Signal zur Auswertung an einem Rechner umgewandelt werden. Durch eine Mehrzahl entsprechender Plattenkondensatoren und Wandler kann die Messung für mehrere PCR Tubes gleichzeitig, also etwa auch PCR Tube Strips oder PCR Wells durchgeführt werden. Dieser Aufbau hat den Vorteil, dass der Reaktionsfortschritt nicht wie im Stand der Technik über eine Messung der Impedanz durch Elektroden/Sensoren in direktem Kontakt zur Testflüssigkeit gemessen wird, sondern berührungsfrei über die Messung der Dielektrizitätszahl im elektrischen Feld über die Kapazität. Weiterhin werden auch keine teuren Fluorophore oder Laservorrichtungen benötigt wie für die Absorptionsmessung bei herkömmlichen real-time PCR Verfahren. Eine Immobilisierung der DNA-Einzelstränge, etwa auf den Impedanzsensoren zur Verringerung des Signal-Rausch Verhältnisses, wie nach dem Stand der Technik ist ebenfalls nicht erforderlich. Die in dieser Erfindung beschriebene Vorrichtung kann mit Standardverbrauchsmaterialen durchgeführt werden, die in großer Zahl kostengünstig erhältlich sind. Die Plattenkondensatoren umschließen das PCR Tube bzw. die PCR Tube Strips oder die PCR Wells von außen und sind durch die Wand der Tubes von der Probe bzw. der Probenflüssigkeit getrennt. Sie werden bei bestimmungsgemäßer Nutzung der Vorrichtung dieser Erfindung nicht kontaminiert und können ohne Reinigung immer wieder verwendet werden.
- 2 zeigt einen schematischen Querschnitt einer Messeinheit der anmeldungsgemäßen Vorrichtung. Der oder die Behälter für das DNA Substrat 4, etwa ein PCR Tube 2 oder ein PCR Tube Strip oder ein PCR Well, werden mit einem Verschluss 1 abgeschlossen und in den Raum zwischen den passgenau geformten Kondensatorplatten 5, 6 eingesetzt. An den Kondensatorplatten 5, 6 ist wiederum das Mittel zur Messung der Kapazität 7 angeschlossen und bevorzugt mit einem Kapazität-zu-Digital Wandler verbunden. Zur Durchführung einer simultanen oder nachgeschalteten Schmelzkurvenanalyse (MCA) kann das System außerdem von einem Heizblock oder Heizmantel 3 umgeben sein.
- 3 zeigt den Verlauf der Kapazität eines DNA Substrats aus dem Grapevine Leafroll Virus Type 2 (GLRV2) bei Erwärmung im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse gemessen mit einem Impedanzmessgerät. Die Kapazitätsmessung mit dem Impedanzmessgerät erfolgte bei 400kHz und 300mV Amplitude. Die Temperaturänderung betrug 0,25 °C/s. Deutlich zu sehen ist der Abfall der Kapazität, der ab 82 °C einsetzt und auf eine zunehmende Aufspaltung der DNA Doppelstränge in Einzelstränge zurückzuführen ist.
- 4 zeigt für das DNA Substrats aus 3 den Verlauf der Ableitung der Kapazität nach der Temperatur im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse. Deutlich ist das Maximum der Kapazitätsänderung bei ca. 88 °C gemessen mit einem Temperatursensor von IDT zu erkennen. Diese stimmt sehr gut mit der theoretischen, vom Simulationsprogramm uMeltSM vorhergesagten Schmelztemperatur des DNA Substrats (zu erkennen in der im Wesentlichen im Temperaturbereich zwischen 65°C und 85°C horizontal verlaufenden Linie) überein. Die Temperatur bei welcher das DNA Substrat schmilzt, hiermit ist das Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Einzelsträngen gemeint, ist spezifisch für die amplifizierte Ausgangs DNA. In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass nach einem Erwärmungszyklus der Reaktionsfortschritt noch nicht ausreicht, um einen sichtbaren Peak zu erhalten. Dies kann insbesondere der Fall sein, wenn in der Probe bereits von Anfang an nur sehr wenig des zu amplifizierenden DNA Materials vorhanden war. In solchen Fällen ist es mit der anmeldungsgemäßen Vorrichtung und dem anmeldungsgemäßen Verfahren möglich, die Erwärmung mehrfach durchzuführen um auch bei anfänglich nur geringen Mengen DNA eine erfolgreiche Analyse zu erhalten.
