DE19607546C1 - Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung und -Verfahren - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur elektrophoretischen Probentrennung unter Hochdruck.

Es ist bekannt, daß die Ausübung von Hochdruck ein wirksames thermodynamisches Mittel zur Dissoziierung komplexer biolo­ gischer Systeme und zur Störung der Konformation von Makromolekülen ist (siehe z. B. Silva, J.L. & Weber, G., Ann. Rev. Phys. Chem. 44, 89-113 (1993) und Gross, M. & Jaenicke, R., Eur. J. Biochem. 221, 617-630 (1994)). Die Elektrophorese, insbesondere auf der Basis von Trägergelen, hat sich als geeignetes Verfahren zur Identifizierung der unter Hochdruck dissoziierten Produkte erwiesen. Ein Beispiel einer Trägergel-Elekrophorese ist die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (abgekürzt: PAGE), mit der sich bevorzugt makromolekulare Komponenten nach ihrer Größe, Ladung und/oder Gestalt trennen lassen. Die Durchführung der Gel-Elektro­ phorese unter Hochdruck ist bekannt, erfolgt bislang jedoch unter erheblichem experimentellem Aufwand oder unter den folgenden technischen Schwierigkeiten.

Es ist bekannt, bei der Hochdruck-Gel-Elektrophorese sogenannte "slab"-Gele (oder: Schicht-Gele) zu verwenden (siehe z. B. Paladini, A.A., Silva, J.L. & Weber, G., Anal. Biochem. 161, 358-369 (1987), Paladini, A.A., Weber, G. & Erÿman, L., Anal. Biochem. 218, 364-369 (1994) und Erÿman, L., Paladini, A.A., Lorimer, G.H. & Weber, G., J. Biol. Chem. 268, 25914-25919 (1993)). Dabei handelt es sich um zweidimensionale, flache Gelanordnungen vorzugsweise zwischen Glasplatten. Diese Technik ist nachteilig, weil die "slab"-Gele verhältnismäßig große Hochdruckkammern erfordern. Soll die Hochdruck-PAGE bei bestimmten Temperaturbedingungen durch­ geführt werden, so ist diese große Hochdruckkammer in ein aufwendiges Temperierungsbad zu tauchen, das einen großen Material- und Energieaufwand erfordert und schnelle Tempe­ raturänderungen ausschließt.

Ferner ist z. B. aus Masson, P. & Reyboud, J., Eletrophoreses 9, 157-161 (1988) bekannt, die PAGE mit einem unter Druck stehenden, mit dem Trägergel gefüllten Rohr durchzuführen. Diese Technik ist jedoch nicht praktikabel, weil es schwierig ist, das Rohrgel z. B. zur Einfärbung aus dem Hochdruckrohr zerstörungslos zu entnehmen.

Aus der Publikation Masson, P., Arciero, D.M. Hopper, A.B. & Balny, C., Electrophoresis 11, 128-133 (1990) ist eine Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung bekannt, die unter Bezug auf die schematische Schnittdarstellung in Fig. 6 erläutert wird. Ein äußeres Glas-Zentrifugenrohr 607 mit einem Durchmesser von 20 mm bildet eine Anoden-Pufferkammer 601, in der die Anode an einem Träger 602 angebracht ist. Die Kathodenkammer 604 wird durch ein erstes inneres Rohr 608, das durch den Träger 602 innerhalb der Anodenkammer 601 gehalten wird, und durch ein zweites inneres Rohr 609 gebildet, das mittels einer Durch­ führungsscheibe 603 am oberen Ende des ersten inneren Rohres 608 angebracht ist. Eine Mehrzahl von mit Trägergel beladenen Kapillarröhren 605 wird durch den Träger 602 und die Durch­ führungsscheibe 603 derart gehalten, daß ihre Enden in die jeweiligen Pufferlösungen in der Anodenkammer 601 und der Kathodenkammer 604 ragen. Die Elektrophoresezelle wird an ihrer Oberseite durch ein Druckübertragungsmittel 606 (Silikonöl) verschlossen.

Die aus Fig. 6 bekannte Elektrophoresezelle ist wie die oben beschriebenen Hochdruckelektrodephorese-Vorrichtungen wegen ihres komplexen Aufbaus (Anordnung der Pufferlösungskammern ineinander bzw. nebeneinander) und ihrer Ausmaße schlecht handhabbar. Die ineinander eingreifenden Pufferkammern, in denen der für die Elektrophorese notwendige Ladungstransfer stattfindet, sind zur Vermeidung einer übermäßigen Wider­ standserwärmung mit einem großen Volumen ausgeführt. Die Elektrophoresevorrichtung gemäß Fig. 6 ist auf den Labor­ einsatz beschränkt und für die Durchführung von Routineunter­ suchungen wenig geeignet.

Aufgrund der genannten Probleme und wegen des bisherigen Fehlens von Meßstandards oder einfach handhabbaren Kalibrie­ rungsmöglichkeiten ist die Hochdruck-Gel-Elektrophorese bislang auf wenige Laboranwendungen beschränkt.

Insbesondere in biochemischen oder mikrobiologischen Labora­ torien und auch in entsprechenden Produktionsanlagen besteht ein großer Bedarf nach einem analytischen Trennverfahren, das zeitsparend ausführbar und schnell und zuverlässig auswertbar ist. Diese Anforderungen werden durch die oben erläuterten Hochdruck-Gel-Elektrophoreseverfahren nicht erfüllt.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zur Durchführung der Hochdruckelektrophorese anzugeben, mit der die Nachteile der bekannten Vorrichtungen überwunden werden und die insbesondere eine einfache Hand­ habung im Routinebetrieb, eine sichere Auswertung und gegebenenfalls eine unaufwendige Weiterverarbeitung der auf­ getrennten Proben erlaubt. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Hochdruckelektro­ phorese und deren Auswertung anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der Patent­ ansprüche 1 bzw. 10 oder 11 gelöst. Vorteilhafte Ausführungs­ formen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird in einem Hochdruckbehälter mindestens eine säulenförmige Elektrophoresezelle eingesetzt, in der die Kathoden- und Anoden-Pufferlösungskammern durch zwei benach­ barte, durch ein Halterungselement getrennte Zellenbereiche gebildet werden, wobei eine mit Trenngel beladbare Trägersäule von dem Halterungselement derart getragen wird, daß ihre Enden in die Pufferkammern ragen. Das Halterungselement bildet vorzugsweise eine im wesentlichen ebene Trennwand, durch die die Trägersäule hindurchtritt. Dieser im Vergleich zu den herkömmlichen Elektrophoresezellen stark vereinfachte und verkleinerbare Aufbau basiert auf der Idee, das obengenannte Problem der Wärmeentwicklung in den Pufferkammern nicht durch eine Vergrößerung sondern durch eine Verkleinerung der Kammern zu lösen. Überraschenderweise zeigte es sich, daß eine ver­ kleinerte und vereinfachte Kammergeometrie einerseits die gleichmäßige Wärmeabfuhr an die Umgebung fordert und anderer­ seits die Verwendung eines verhältnismäßig kleinen und somit leicht kühlbaren Hochdruckbehälters erlaubt. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hoch­ druckelektrophorese-Vorrichtung wird diese mit hochkonzen­ trierten Pufferlösungen betrieben, um eine ausreichende Pufferkapazität für die Elektrophorese bereitzustellen. Die Konzentrationserhöhung kann vorteilhafterweise z. B. einen Faktor 5 . . . 10 gegenüber den Pufferkonzentrationen bei her­ kömmlichen Elektrophoresevorrichtungen betragen.

Die Pufferlösungskammern sind erfindungsgemäß säulenförmig übereinander angeordnet. Ob die im Betriebszustand obere Kammer die Kathodenpufferlösung oder die Anodenpufferlösung und die untere Kammer jeweils die Lösung entgegengesetzter Pufferkapazität aufnimmt, hängt von den jeweils beabsichtigten Trennbedingungen (z. B. Molekülladung) ab.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung einer Hoch­ druckelektrophorese basiert auf der Verwendung der erfindungs­ gemäßen Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung.

Entgegen den oben erwähnten Problemen bei der Verwendung von Rohrgelen hat die Erfindung überraschenderweise gezeigt, daß die Anordnung des Trenngeles in einer Rohrform verringerten Durchmessers einerseits die Erzielung einer hohen Trennauflösung und andererseits eine einfache zerstörungs- oder verletzungsfreie Entfernung des Trenngels aus der Rohrform zur weiteren Verarbeitung nach der Hochdruckelektrophorese erlaubt.

Erfindungsgemäß kann eine weitere Gelverarbeitung nach einer Hochdruckelektrophorese z. B. eine Einfärbung oder eine erneute Trennung umfassen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Trägergel nach seiner Entfernung aus einer Trägersäule einer weiteren, bei Normaldruck durchgeführten "slab"-Gel-Elektrophorese unter­ zogen. Diese im Ergebnis sogenannte zweidimensionale Elektro­ phorese erlaubt eine wesentlich schärfere und zuverlässigere Trennung der in einer Probe enthaltenen Komponenten als dies mit herkömmlichen Hochdruckelektrophoreseverfahren möglich ist.

Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sowie die erfindungs­ gemäße Verfahrensweise werden im folgenden anhand einer Aus­ führungsform unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben. Bei diesem Beispiel ist die Kathode oben und die Anode unten in der Säulenanordnung vorgesehen. Diese Elektroden-Konfiguration ist nur beispielhaft und kann beim praktischen Einsatz umgekehrt werden (Anode oben, Kathode unten). Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Schnittansicht einer Hochdruck­ elektrophoresevorrichtung entsprechend einer Aus­ führungsform der Erfindung,

Fig. 2 eine schematische, vergrößerte Draufsicht der Elektrophoresezelle, die in Fig. 1 gezeigt ist;

Fig. 3 eine schematische, vergrößerte Draufsicht der Kathodenzuleitung der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung;

Fig. 4 das Ergebnis einer ein- und zweidimensionalen PAGE von Molekulargewicht-Markern;

Fig. 5A und 5B Ergebnisse von zweidimensionalen Trennungen von Untereinheiten der E. coli-RNA-Polymerase; und

Fig. 6 eine schematische Schnittansicht einer herkömmlichen Hochdruckelektrophoresezelle.

Fig. 1 zeigt eine schematische Schnittansicht der erfindungs­ gemäßen Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung 100 im Betriebs­ zustand.

Ein Hochdruckbehälter wird durch ein Metall-Hochdruckrohr 101 gebildet, das aus einem hochdruckbeständigen Material, z. B. aus Stahl oder aus Kunststoff mit elektrisch leitender Innen­ wandung, besteht. Die Enden des Hochdruckrohres 101 sind unter Verwendung von Hochdruckmuffen 104a und Buchsenmuttern 104b mit Hochdruckanschlüssen 102, 110 versehen. Der im Betriebs­ zustand der Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung obere Hoch­ druckanschluß 102 ist zur druckdichten Durchführung der Kathode 103 und deren Anschluß an eine Spannungsversorgung (nicht gezeigt) vorgesehen. Die Kathode 103 wird unten unter Bezug auf Fig. 3 näher beschrieben. Der entgegengesetzte, untere Hochdruckanschluß 110 enthält eine Druckleitung 111, die zu einem (nicht gezeigten) Hochdruckgenerator 112 führt.

Als Hochdruckrohr 101 kann ein beliebiges, kommerziell verfüg­ bares Hochdruckrohr verwendet werden. Die Maße des in Fig. 1 dargestellten Hochdruckrohres betragen z. B. 8 mm (Innendurch­ messer) und 14,3 mm (Außendurchmesser).

Der Hochdruckgenerator 112 kann z. B. durch einen Schnecken-Verdrängungsgenerator gebildet werden. Das Hochdruckrohr 101 ist mit einer elektrisch isolierenden Druckflüssigkeit 130 (z. B. Silikonöl, Zähigkeit: 200 cS) füllbar. Falls die Pumpe mit einer anderen Flüssigkeit als mit Silikonöl betrieben wird, ist es möglich, zwischen der Pumpe und dem Hochdruckrohr ein Trennmittel vorzusehen, wie es z. B. aus Spitzer, M. et al., Rev. Sci. Instrum. 59, 2092-2093 (1988) bekannt ist. Ersatzweise kann jedoch in der Druckleitung, die von der Pumpe 112 zu dem Hochdruckrohr 101 führt, ein Gummischieber vor­ gesehen sein, um beide Druckflüssigkeiten ohne nennenswerte Verunreinigung voneinander zu trennen.

Im Inneren des Hochdruckrohres 101 ist eine entnehmbare säulenförmige Elektrophoresezelle 120 angeordnet, die im einzelnen unter Bezug auf Fig. 2 beschrieben wird. Die Elektrophoresezelle 120 ist im Betriebszustand in dem Hoch­ druckrohr 101 unter der Klemmwirkung der Anode 125 in einer derartigen Position angeordnet, daß die von oben in das Hoch­ druckrohr 101 geführte Kathode 103 in den oberen Zellenbereich der Elektrophoresezelle 120, der eine Kathodenpufferkammer bildet, hineinragt.

Das Hochdruckrohr 101 wird von außen durch ein Temperierungs­ mittel umgeben. Dies kann z. B. durch eine mit einem Thermo­ statenbad verbundene Kühlschlange 115 oder ein anderes geeignetes Kühlelement gebildet werden. Die Dimension der Kathode 103 und die Position der Elektrophoresezelle 120 sind vorzugsweise so ausgewählt, daß sich die Elektrophoresezelle 120 im Betriebszustand im Inneren des Hochdruckrohres 101 im wesentlichen im Bereich des äußeren Kühlelementes befindet.

Die Geometrie und Größe der Elektrophoresezelle 120, die in Fig. 2 vergrößert dargestellt ist, sind in vorteilhafter Weise an die Maße und Form des Hochdruckrohres 101 angepaßt. Bei der beispielhaften Ausführungsform besitzt die Elektrophoresezelle einen Außendurchmesser von rd. 5-7 mm und eine Länge von rd. 80-90 mm. Die Elektrophoresezelle 120 wird durch drei voneinander trennbare Komponenten aufgebaut, die die Kathodenpufferkammer 121, das Halterungs- oder Verbin­ dungselement 122 und die Anodenpufferkammer 123 umfassen. Diese Komponenten bestehen aus einem elektrisch nicht leitenden Material, vorzugsweise aus einem Kunststoff wie z. B. Poly­ chlortrifluorethylen (Marke: Kel-F) oder aus Glas. Die säulen­ förmige Kathodenpufferkammer 121 besitzt die Form eines Zylinders, der an seinem im Betriebszustand oberen Ende mit einer Öffnung 128 versehen und mit seinem unteren, offenen Ende an dem Halterungselement 122 angebracht ist.

Das Halterungselement 122 besteht aus einem zylindrischen Bauteil, das die Form eines doppelseitigen Verschlußstopfens aufweist. Das Halterungselement besitzt eine axiale Ausnehmung 122a, deren Durchmesser an den Außendurchmesser der Träger­ säule 124 derart angepaßt ist, daß diese formschlüssig und pufferlösungsdicht in dem Halterungselement 122 aufgenommen werden kann.

Die im Betriebszustand unten angeordnete Anodenpufferkammer 123 wird durch einen Zylinder gebildet, der an seinem unteren Ende 129 verschlossen und mit seinem offenen, oberen Ende an dem Halterungselement 122 angebracht ist. Die Wandung der Kammer 123 besitzt ferner eine Öffnung 126 zur Ausbildung des hydrostatischen Druckes im Inneren der Anodenkammer 123 und ggf. eine weitere Öffnung 127 zur Durchführung der Anode 125. Die Öffnungen 126, 127 sind derart dimensioniert und in einer derartigen Höhe angeordnet, daß während der Durchführung der Elektrophorese keine störende Verunreinigung des Anodenkammer­ innenraumes auftreten kann.

Die Anode 125 besteht aus einem Platindraht, der parallel zur Innenwandung der Anodenkammer 123 verläuft und an seinem oberen Ende an den Öffnungen 126, 127 eine Schleife bildend umgebogen und befestigt ist. Die Anode 125 besitzt somit eine Doppelfunktion. Erstens stellt sie den Kontakt mit der Wand des Hochdruckrohres 101 her, das mit der Anode der Spannungs­ versorgung (nicht gezeigt) verbunden ist. Zweitens ermöglicht die Drahtschleife im Betriebszustand eine einfache Halterung der Elektrophoresezelle 120 im Inneren des Hochdruckrohres 101, in dem die Elektrophoresezelle 120 gegen die Innenwand des Hochdruckrohres 101 verklemmt wird (Federwirkung). Aus Übersichtlichkeitsgründen ist in Fig. 1 lediglich der Kontakt der Anode 125 mit der Innenseite des Hochdruckrohres 101, nicht jedoch die gegebenenfalls eintretende Schrägstellung der Elektrophoresezelle 120 bei der Halterung und das Anliegen an der gegenüberliegenden Rohrwand gezeigt.

Die in Fig. 2 neben der Elektrophoresezelle 120 dargestellte, mit einem Trenngel beladbare Trägersäule 124 wird im Betriebs­ zustand der Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung in dem Halte­ rungselement 122 derart aufgenommen, daß ihre Enden in die Anoden- bzw. Kathodenpufferkammern 121, 123 ragen.

Die stopfenartige Steck-Verbindung der Pufferkammern 121, 123 mit dem Halterungselement 122 ermöglicht dessen leichten Austausch mit Halterungselementen, deren axiale Durchführung einen veränderten Innendurchmesser besitzt, so daß die Elektrophoresezelle 120 einfach an Trägersäulen 124 verschie­ dener Durchmesser angepaßt werden kann.

Einzelheiten der in Fig. 1 gezeigten oberen Elektrode (Kathode) sind in Fig. 3 dargestellt. Die Kathode 103 besteht aus einem Platindraht 105, der an die Grundseite eines Stahl­ konus 106 gelötet ist. An die Spitze des Stahlkonus 106 ist ein Stahlstab 108 angelötet, der die Verbindung mit der Kathode der Spannungsversorgung herstellt. Der Stahlkonus 106 und der Stahlstab 108 sind mit einer elektrischen Isolation versehen, die durch eine teilweise konisch verlaufende Teflon-Muffe 107 gebildet wird. Der Stahlkonus 106 kann beispiels­ weise einen Konuswinkel von 9° aufweisen. Die Teflon-Isolation kann beispielsweise eine Dicke von 0,25 bis 1 mm besitzen.

Der in Fig. 1 gezeigte Hochdruckanschluß 102 weist eine axiale Bohrung auf, die an der dem Hochdruckrohr 101 zugewandten Seite in einen konisch ausgearbeiteten Bereich 102a übergeht, der mit dem konischen Bereich der Teflon-Isolation 107 in einfacher Weise eine wirksame Druckdichtung der elektrischen Verbindung von der Spannungsversorgung in die Hochdruckkammer bildet.

Im folgenden wird der Betrieb der erfindungsgemäßen Hochdruck­ elektrophorese-Vorrichtung unter Bezug auf die Fig. 1 bis 3 beschrieben. Zunächst wird eine kapillarförmige Trägersäule geeigneten Innendurchmessers von ungefähr 0,5 mm bis 2 mm entsprechend einem bekannten Verfahren mit dem Trenngel beladen. Als Trennsäule kann nach geeignetem Zuschnitt eine kommerziell verfügbare Kapillarpipette (z. B. 5-50 µl-Pipette) verwendet werden. Die Trägersäule wird auf eine Säule von rd. 45 mm Länge geschnitten. Acrylamidlösungen werden in 5-ml-Behältern polymerisiert, die Lösungen entgast und unter der Wirkung von Kapillarkräften in die Trennsäule gefüllt, so daß rund 4 mm an deren einen Ende zur Aufnahme der Probe frei bleiben. Die Gelbildung erfolgt unter der Wirkung von wasser­ gesättigtem Isopropanol und wird rund 1 Stunde vor Gebrauch der Trennsäule ausgelöst. Der Gebrauch von diskontinuierlichen Gelsystemen bestehend aus einem Lädegel und einem Trenngel ist möglich.

Die Zusammensetzung des Kathodenpuffers in der Kathodenpuffer­ kammer 121 wird durch Tris (24mM)-Glycin (192mM) mit einem pH = 8.2 gebildet. Demgegenüber ist der Tris-Glycin-Puffer in der Anodenpufferkammer 123 rund 5-fach stärker konzentriert. Wie bei herkömmlichen Elektrophoresevorrichtungen können die Pufferbedingungen und die Art des Puffers variiert werden.

Die Proben werden beispielsweise mit einer 0,2-2 µl-Mikro­ pipette in den oberen gelfreien Aufnahmeraum der Trägersäule 124 geladen. Die Elektrophoresezelle 120 mit der beladenen Trägersäule 124 und den Pufferlösungen wird in das mit Silikonöl gefüllte Hochdruckrohr 101 getaucht, wobei ggf. ein (nicht dargestelltes) Betätigungsmittel (Manipulator, Pinzette o. dgl.) verwendet wird. Nach dem Verschließen wird das Innere des Hochdruckrohres 101 einem vorbestimmten Druck und einer vorbestimmten Temperatur ausgesetzt. Nach einer Zeit von rund 15 bis 20 Minuten zur Ausbildung eines Gleichgewichtszustandes werden die Elektroden zur Ausführung des Elektrophorese-Trenn­ vorganges für rund 60 Minuten an eine Spannung von rund 100 V angeschlossen.

Nach Beendigung des Trennvorganges wird die Trägersäule 124 aus dem Hochdruckrohr 101 bzw. der Elektrophoresezelle 120 entnommen und das Gel aus der Trägersäule 124 herausgelöst. Dies erfolgt vorzugsweise unter Ausübung eines Wasserdruckes z. B. durch eine Spritze, die über ein Kunststoffrohr mit der Trägersäule verbunden wird, oder mechanisch mit einem dünnen Stempel, der in die Kapillare einführbar ist. Die weitere Verarbeitung umfaßt die Einführung in eine Färbungslösung oder gegebenenfalls die Durchführung eines zweiten Elektrophorese­ schrittes unter atmosphärischem Druck.

Für diese nachfolgende PAGE, die vorzugsweise diskontinuierlich durchgeführt wird, wird das extrudierte Gel in einem Lädegel-Puffer mit einer Lösung von erwärmter 1%-iger Agarose angebracht. Von dem Ladegel-Puffer aus wird der zweite Elektrophoreseschritt unter Verwendung eines slab-Gels durchgeführt, das gegebenenfalls für Kalibrierungszwecke gleichzeitig mit separaten Kontrollösungen beladen wird.

Diese sogenannte zweidimensionale Trennung erlaubt eine genauere Interpretation der bei der Kapillargelelektrophorese erhaltenen Banden, die ggf. relativ unscharf sein können. Diese Unschärfe ist nicht geräte- oder verfahrensbedingt, sondern eine thermodynamische Folge der Verteilung der freien Enthalpie in dem System der zu trennenden Komponenten. Dies ermöglicht erstmalig die Identifizierung bisher nicht separierbarer Untereinheiten von aggregierten Systemen.

Vorzugsweise wird die zweite Trennung mit einem Natrium-dodecyl-sulfat-slab-Gel (sog. SDS-PAGE) durchgeführt, um die im Hochdruck-Gel entstandenen Banden weiter aufzulösen.

Die zweidimensionale Trennung kann auch mit Hochdruckgelen aus herkömmlichen Säulenanordnungen durchgeführt werden. Im folgenden wird unter Bezug auf die Fig. 4, 5A und 5B die elektrophoretische Trennung von zwei Probenbeispielen beschrieben.

(a) Probe 1

Fig. 4 zeigt das Ergebnis der ein- und zweidimensionalen PAGE-Auftrennungen von vorgefärbten Molekulargewichts-Markern. Der obere Teil der Figur zeigt das Ergebnis der ersten Trennung mittels der oben beschriebenen Hochdruckelektrophorese-Vor­ richtung (Verfahrensparameter: Innendurchmesser der Trenn­ säule: 1 mm, Druck 150 MPa, Spannung 100 V, Dauer 60 Minuten).

Die im Ergebnis der zweiten Trennung mit dem slab-Gel auf der Trennfläche gebildeten Banden sind scharf abgegrenzt und zeigen keine Verbreiterung oder Profilierung. Durch dieses Ergebnis wird gezeigt, daß die Hochdruckelektrophorese vor­ teilhafterweise grundsätzlich dieselbe Auflösung wie die folgende slab-Gel-Elekrophorese unter Normaldruck aufweist. Das Ergebnis zeigt ferner, daß die Elektrophorese bei 150 MPa zu keiner Deformation oder anderweitigen Beeinflussung des Geles führt.

(b) Probe 2

Die Auftrennung des aus einer Vielzahl von Untereinheiten bestehenden Enzyms E. coli RNA-Polymerase (im folgenden: RNAP) unter Normaldruck und unter Drücken oberhalb von 120 MPa ist jeweils in den Fig. 5A und 5B gezeigt. Die Figuren zeigen aus drucktechnischen Gründen die Lage der Banden nur schematisch und ohne Graustufen. Verhältnismäßig schwache Banden sind schraffiert. Zur Erfassung detaillierterer Informationen über die Konformation und Integrität des polygomeren Komplexes unter hohem Druck wurden die in der engen, kapillarförmigen Trägersäule erhaltenen Gele in einer zweiten Dimension unter Verwendung eines slab-Geles weiter aufgetrennt. Dazu wurde das Gel aus der Trennsäule auf ein Standard-Mini-slab-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (sog. SDS-PAGE) geladen. Die zweite Trennung mit nachfolgender Einfärbung erlaubt eine Identifizierung von den Untereinheiten durch Vergleich von deren Beweglichkeiten mit einer Standardprobe, die nicht unter Druck gestanden hat und auf dasselbe Gel geladen worden ist. Der Vergleich der Bänder in dem Natriumdodecylsulfat-slab-Gel (aus dem extrudierten Hochdruckgel) mit einem Kontroll­ experiment, bei dem die erste Dimension unter Normaldruck aufgenommen wurde, zeigt die Auftrennung des RNAP-Holoenzyms in seine Untereinheiten bei 180 MPa. Wie erwartet zeigt das Kontrollexperiment keine Auftrennung von RNAP unter Normal­ druck (Fig. 5A). Dagegen besitzen unter erhöhtem Druck nach der Trennung die Proteinmaterialien von den verschiedenen Bändern von dem Hochdruckgel entsprechend den einzelnen Unter­ einheiten von der RNAP verschiedene Beweglichkeiten in dem slab-Gel (s. Fig. 5B). Dies zeigt, daß die Untereinheiten bei der Hochdruckelektrophorese ohne Denaturierungsmittel getrennt werden und sich entsprechend ihrer Größe und Ladung bewegen. Dabei bezeichnet β′ die Grund-Untereinheit von RNAP (s. Zillig, W. et al., RNA Polymerase, Cold Spring Harbor Laboratory, 1976).

Die in Fig. 5B sichtbaren breiten Bänder werden der statistisch verteilten freien Energie der Vereinigung von Untereinheiten bei dem Druck zugeschrieben, bei dem das Gel verwendet wird. Falls die Protein-Untereinheiten bei erhöhten Drucken differentiell in Wechselwirkung treten, werden keine scharfen Punkte (wie bei Fig. 4), sondern verbreitete Bänder erwartet, deren Größe von dem Trennungsgrad bzw. dem zugeführten Druck abhängt.

Die Vorrichtung und die Verfahrensweise gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Vorteile auf.

Die einfache Handhabbarkeit der Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung erlaubt es, mit geringem Aufwand eine Vielzahl von Probentrennungen unter Variation der Parameter Druck, Temperatur, pH-Wert, Gelkonzentration usw. durchzuführen.

Die Messungen können unter nur geringfügiger Modifizierung von verfügbaren kostengünstigen und kommerziell erhältlichen Instrumenten realisiert werden. Es werden erheblich Kosten und Platz gespart, um die Probentrennungen routinemäßig durch­ führen zu können. Da als Hochdruckrohr ein beliebiges Standard-Hochdruckverbindungsstück verwendet werden kann, das in der Regel vom Hersteller mit Sicherheitsprüfung (z. B. TÜV) angeboten wird, besteht bei niedrigen Kosten eine hohe Betriebssicherheit.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt es, große Wärmemengen wirksam durch Eintauchen der gesamten Elektrophoresezelle geringen Durchmessers in das umgebende Silikonöl, das eine große Wärmekapazität besitzt, abzuleiten. Gleichzeitig ist es möglich, bestimmte Temperaturen für bestimmte Dissoziations­ bedingungen einzustellen und die Temperaturen ggf. schnell zu variieren. Die Säulenform der Elektrophoresezelle und des Hochdruckrohres erlaubt es ferner, die Gesamtmenge der erforderlichen Hochdruckflüssigkeit zu reduzieren. Somit sind verhältnismäßig kleine Hochdruckpumpen einsetzbar.

Da die Hochdruck-Gele leicht aus der Trennsäule extrudiert werden können, wird erfindungsgemäß eine zweidimensionale Auf­ trennung ermöglicht. Die Anordnung des extrudierten Geles entlang einer Kante von einem elektrophoretischen Natrium­ dodecylsulfat-slab-Gel erlaubt es, die unter erhöhtem Druck getrennten Untereinheiten bei der zweiten, unter Normaldruck durchgeführten Elektrophorese zu identifizieren und weiter zu analysieren. Damit wird ein erheblicher Informationsgewinn zur Durchführung quantitativer thermodynamischer Analysen von komplexen Enzymen wie dem genannten RNAP-System erzielt. Ferner ist es möglich, einen Abschnitt des Hochdruck-Gels auszuschneiden und einer weiteren Hochdruckelektrophorese zu unterziehen. Damit kann die Bildung weiterer Sub-Banden untersucht werden.

Die Vorrichtung und Verfahrensweise gemäß der Erfindung sind in den folgenden Bereichen anwendbar: Untersuchung der Anordnung von Enzymen mit mehreren Untereinheiten, von hetero­ genen Molekülaggregaten, Membranen und Membrankomplexen, Viren und Zellen. Es ist möglich, Proteinkomplexe, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, ohne Lösungs- oder Denaturierungs­ mittel in die Komponenten zu trennen und nach einer Behandlung der einzelnen Untereinheiten (z. B. Anbringung von Fluoreszenz­ markern) wieder zusammenzusetzen. Aufgrund des unter hohem Druck erniedrigten Gefrierpunktes des Wassers wird eine elektrophoretische Analyse der Proteinentfaltung bei Tempe­ raturen unter 0° (sogenannte kalte Denaturierung) ermöglicht. Ferner ist die Trennung von Epitopen (z. B. unter Verwendung ganzer Viren) unter Vermeidung des Gebrauches organischer Lösungsmittel denkbar.

Aufgrund der geringen Größe der Elektrophoresezelle können eine Vielzahl von Hochdruckelektrophoresen gleichzeitig unter Verwendung mehrerer Zellen in einer Hochdruckkammer oder mehrerer Hochdruckkammern durchgeführt werden. Falls nur ein Druckgenerator verfügbar ist, können sogar eine Vielzahl von Messungen unter verschiedenen Drucken unter Verwendung von Hochdruckventilen in verschiedenen Hochdruckkammern durch­ geführt werden. Unter Anwendung geeigneter Hochdruckbau­ elemente kann die Vorrichtung auch bei höheren Drucken oberhalb der hier getesteten 200 MPa angewendet werden.

Durch den Einsatz von Hochdruckrohren verschiedener Längen kann auch die Länge der Trägersäule einfach modifiziert werden. Damit läßt sich eine Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung beliebiger Länge aufbauen, ohne daß dabei der Aufwand oder die Kosten erheblich steigen.

Claims (12)

1. Hochdruckelektrophorese-Vorrichtung (100) mit:

• - einem Hochdruckbehälter (101), in dem mindestens zwei Pufferlösungskammern (121, 123) gebildet sind, und
• - mindestens einer kapillarförmigen, mit einem Trenngel beladbaren Trägersäule (124), deren Enden jeweils in die beiden Pufferlösungskammern (121, 123) ragen,

gekennzeichnet durch

• - mindestens eine säulenförmige Elektrophoresezelle (120) mit zwei im Betriebszustand übereinander angeordneten Zellen­ bereichen, die die Pufferlösungskammern (121, 123) bilden und die durch ein Halterungselement (122) getrennt sind, das die Trägersäule (124) haltert.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die im Betriebs­ zustand obere Pufferlösungskammer (121) durch einen Kunst­ stoffzylinder gebildet wird, dessen unteres Ende an dem Halterungselement (122) angebracht und dessen oberes Ende offen ist.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die im Betriebszustand untere Pufferlösungskammer (123) durch einen Kunststoffzylinder gebildet wird, dessen oberes Ende an dem Halterungselement (122) angebracht und dessen unteres Ende geschlossen ist.

4. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Halterungselement (122) die Form eines zweiseitigen Stopfens mit einer axialen Ausnehmung zur Aufnahme der Träger­ säule (124) besitzt und jeweils in den unteren bzw. oberen Enden der Pufferlösungskammern steckt.

5. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Hochdruckbehälter (101) durch ein metallisches Hoch­ druckrohr gebildet wird.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, bei der eine Elektrode von einer isolierten Durchführung in einem im Betriebszustand oberen Hochdruckanschluß (102) des Hochdruckrohres in die obere Pufferlösungskammer (121) ragt.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 5 oder 6, bei der eine Gegen­ elektrode (125) durch ein im Inneren der unteren Puffer­ lösungskammer verlaufendes metallisches Element gebildet wird, das unter Bildung einer federartigen Schleife durch mindestens eine Öffnung (126) aus der unteren Pufferlösungskammer (123) derart herausragt, daß im Betriebszustand ein elektrischer Kontakt mit der Innenwand des Hochdruckrohres gebildet wird.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, bei der die Gegenelektrode (125) derart weit aus der unteren Pufferlösungskammer (123) herausragt, daß sich im Betriebszustand die Elektrophorese­ zelle (120) im Hochdruckrohr gegen dessen Innenwand verklemmt.

9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der die Elektrode (105) eine Kathode oder eine Anode ist und die Gegenelektrode eine jeweils entgegengesetzte Polarität aufweist.

10. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung.

11. Elektrophoreseverfahren, bei dem unter Verwendung eines Trenngels in einer kapillarförmigen Trägersäule (124) eine Hochdruckelektrophorese durchgeführt wird, gekennzeichnet durch die weiteren Schritte:

• - Extrusion des Trenngels aus der Trägersäule (124), und
• - Durchführung einer Elektrophorese unter Normaldruck, bei der das extrudierte Trenngel einer Trennung auf einer Schicht­ gelanordnung unterzogen wird.