CN1993617A - 用于生产dna芯片的方法和系统、用于检测杂交的方法和系统和用于基质处理的设备和方法 - Google Patents

用于生产dna芯片的方法和系统、用于检测杂交的方法和系统和用于基质处理的设备和方法 Download PDF

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Abstract

提供能够在短时间内有效地执行杂交并获得高精确检测结果的DNA芯片相关的技术。通过使用包含具有至少一个作为杂交区域的反应区域R检测单元(3)和配置来以便将电场施加到在反应区域R中积累或保持的媒质的相反电极(E1－E2等)的盘形基质(1)或DNA芯片(10)，并且通过施加由相反电极形成的电场，可以将检测核酸D固定在检测表面U，将检测核酸D与目标核酸T杂交，并且清除过剩物质B，由此在短时间内有效地执行杂交并获得高精度的检测结果。

Description

用于生产DNA芯片的方法和系统、用于检测杂交的方法和系统和用于基质处理的设备和方法
本发明涉及DNA芯片的技术，更具体地，本发明涉及用于生产DNA芯片的方法和系统、用于检测杂交的方法和系统和用于基质处理的设备和方法。
背景技术
在1970年代为检测杂交的分析而开发的技术大都采用诸如硝化纤维薄膜之类的多孔材料、放射性标记和放射自显影法(autoradiography)。
在该领域中的新近创新是用于微分析的所谓DNA芯片或DNA微阵列(下面统称为DNA芯片)。DNA芯片是通过使用微阵列技术在其上精密地布置特定DNA分子的集成基质。其用于基因突变分析、SNP(single nucleotidepolymorphism，单核苷多态)分析和基因表达频率分析。现在，它在药物开发、临床诊断、生药学、进化和合法药物研究中起很重要的作用。
DNA芯片具有集成在玻璃基质或硅基质上的多种大量的DNA寡链(oligochain)和cDNA(互补DNA)。因此，其允许对杂交进行综合分析。
以下面简要描述的方式完成由DNA芯片进行的分析。该过程从细胞或组织提取mRNA开始。由PCR扩增所提取的mRNA，在此期间其通过反向转录(reverse transcription)PCR反应参入荧光探针。将经扩增的mRNA与在玻璃基质或硅基质上保持的DNA探针杂交。通过荧光测量来检测产生的杂交。
当前，通过使用几种技术来生产DNA芯片，这些技术包括使用半导体暴光(exposure)技术的影印术、基于压电技术的喷墨术和机械微点术(microspotting)。虽然它们具有优点和缺点，但是它们需要具有平滑、均匀表面的非多孔玻璃或塑料基质，其允许使用很少量样本进行分析，而不会扩散或吸收样本。
DNA芯片被归为两个大类。第一类包括具有通过上述影印术(photolithography)直接在特定基质上合成的核苷酸的DNA芯片。可以从Affimetrix买到它。(见JP-A-Hei 4505763)。该类型DNA芯片具有高集成度，但是由于在基质上合成DNA的限制，其仅具有数十个碱基(base)(仅仅数十个)。
第二类包括被称为“斯坦福型”的DNA芯片。它们具有事先已经准备了通过开口销(split pin)分配到并固定在基质上的DNA。(见JP-A-Hei 10-503841)。该类型DNA芯片具有比上述DNA芯片低的集成度，但是具有1kb长的DNA片断。
正如在日本专利公开No.2000-60554(权利要求1和图1)中公开的那样，当前可用的DNA芯片大都已经在矩形基质上划分区(section)。每一区具有用于杂交和探针。附带地，该公开还提及每一区可以包括凝胶，通过其由电泳迁移多核苷酸的样本。
在一般实践中采用荧光扫描系统来检测或读取在DNA芯片上的特定反应区域中发生的杂交。设计该系统来从标记核酸分子的荧光物质中检测荧光。
该荧光检测系统使用特定激励光照射荧光物质，并且检测由荧光物质发出的荧光。由于其采用荧光物质代替常规辐射物质，因此这改善了检测的速度和精确度，并且有助于安全。
通过使用利用共焦扫描仪或CCD摄像机的成像技术来完成荧光的检测。检测装置将从DNA芯片散发的荧光转换为用于数据文件和分析的后续确定的数字输出。
已知电场作用在充电的物质上。具体讲，电场在液相中伸展或移动双股核酸分子(double strand nucleic acid molecule)。该现象是因为从负电荷(作为基干的磷酸盐离子)和正电荷(从周围的水中电离的氢原子)产生的粒子云造成的。这些负电荷和正电荷使得偶极(dipole)出现，并且一旦施加高频高压，则整体布置在一个方向上。结果，将所包含的那些分子伸展，并且在不均匀电场存在的情况下，其被移动到电场线集中的位置(见Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi，Shin-ichi Tazawa，Osamu Kurosawa and Masao Washizu；“Quantitative analysis on electrostatic orientation and DNA in stationary ACelectric field using fluorescence anisotropy”，IEEE Transaction on IndustrialApplications，Wol.34，No.1，p.75-83(1998)。)
已经报道，与在具有十到数百微米间隙的微电极间施加的高频电场(1MV/m，1MHz)直线平行地伸展在溶液中以随机盘绕形式存在的DNA分子。该电场致使感应极化，并且通过所谓“电泳”的电动效应将极化的DNA分子自然地吸引到电极边缘。最后，使DNA分子固定，而它们末端与电极边缘接触。(见Masao Washizu，“DNA handling under observation”VisualizedInformation，Vol.20，No.76(January，2000)。)
在用于检测生物聚合物的设备中实现利用电效应的另一DNA芯片技术，该设备设计来根据DNA分子是否已经形成互补股来分离DNA分子，或者通过施加到DNA探针的DC电压来伸展DNA分子(见日本专利公开No.2002-168864，第015段和图7)。此外，已经提出具有电针并且核苷固定在电针上的DNA芯片。(见日本专利公开No.2001-241315)。
设计迄今所提出的各种DNA芯片来分析诸如用于检测的探针DNA的核酸和其互补目标核酸之间的杂交，前者固定在之前形成于基质上的反应区域上。
然而，由于常规DNA芯片技术有限的杂交效率，因此它们不足以进行广泛使用。位阻现象(steric hindrance)和杂质(contaminant)引起该缺陷。由于核酸分子采取圆形或螺旋高阶结构(为随机盘绕形状)，因此杂交经历位阻现象，并且位阻现象阻止在碱基上的平滑互补连接。当基质在检测的核酸周围含有杂质时，也会抑制杂交。解决这些问题将很显著地降低使用DNA芯片进行分析所需要的时间。
此外，常规DNA芯片技术具有由于不可忽略的频繁误杂交而引起假阳性(false positive)和假阴性(false negative)的缺点。换句话说，它们需要改善检测精度。
精确检测需要用于精确杂交的足够条件和环境。在检测之前还需要用特定水溶液从反应区域中清除干扰检测的不需要的物质。必须在不会对检测精确度有不利影响的情况下，充分执行该清除步骤。
为了在未来更广泛地使用杂交进行综合分析，需要开发新技术来应对关于基质的日益增加的信息量、大量各种基因的同时分析、简化分析方法和设备和芯片基质的成本降低。
因此，本发明的目的是提供用于生产DNA芯片的方法和系统、用于检测杂交的方法和系统以及用于基质处理的设备和方法，这将有助于对关于基质的信息的有效操作和短时有效杂交，以及杂交的精确检测。
发明内容
本发明涵盖(1)用于生产DNA芯片的方法、(2)用于生产DNA芯片的系统、(3)用于检测杂交的方法、(4)用于检测杂交的系统、(5)用于基质处理的设备和(6)用于基质处理的方法。
(1)用于生产DNA芯片的方法
本发明的第一实施例涉及从具有检测元件的基质上“生产DNA芯片的方法”，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域以及布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极。
该方法包括：对基质执行表面处理的步骤；通过相反电极将电场施加到反应区域中保持的、包含之前准备的用于检测的核酸的媒质上，由此将用于检测的核酸固定到电极表面上的步骤；和从反应区域中清除过剩的用于检测的核酸。
基质的表面处理步骤意欲使基质与媒质相容(compatible)。反应区域保持滴入或注入其上的媒质。
可以在基质旋转的同时滴入或注入媒质。施加电场的步骤包括通过由施加电场引起的电泳移动用于检测的核酸的附加步骤。电场是具有不低于1MV/m电压和不低于1MHz的频率的高频电场。
(2)用于生产DNA芯片的系统
本发明的第二实施例涉及由具有检测元件的基质生产DNA芯片的系统，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域以及布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极。
该系统包括用于将包含之前准备的用于检测的核酸的媒质滴入或注入反应区域中的装置；和用于通过相反电极将电场施加到在反应区域中保持的媒质的装置。
该系统还包括用于将媒质滴入或注入反应区域中，并且允许在反应区域中保持媒质的装置，和用于从反应区域中清除过剩的用于检测的核酸。用于施加电场的装置是施加高频电场的装置。该系统还包括用于旋转基质的装置。用于滴入或注入以将媒质提供到反应区域的装置与基质的旋转同步工作。
(3)用于检测杂交的方法
本发明的第三实施例涉及用于检测具有检测元件的基质上的杂交的方法，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域、布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极和在反应区域中被固定的、用于检测的核酸。
该方法包括将包含之前准备的用于检测的核酸的媒质滴入或注入反应区域中的步骤；通过相反电极将电场施加到反应区域中保持的媒质的步骤；使用于检测的核酸和目标核酸之间进行杂交的步骤；将添加物(intercalator)滴入或注入反应区域的步骤；和使用特定波长的激励光照射反应区域，并且检测所得荧光的强度的步骤。附带地，可以同时在整个基质的表面上执行施加电场的步骤，或者顺序地在基质的分割区域上执行该步骤。
可以同时执行“将包含目标核酸的媒质滴入或注入反应区域”的步骤和“将添加物滴入或注入反应区域”的步骤。可以在存在电场或不存在电场的情况下执行杂交。
为了改善检测的精度，可以以如下方式执行该方法：在检测荧光的步骤之前进行从杂交区域中清除在反应区域存在的过剩目标核酸的步骤。可以通过施加将过剩的目标核酸吸引到杂交区域外部的电极表面的电场完成清除过剩目标核酸的附加步骤。
可以执行用于检测杂交的方法，使得将激励光引导到基质的下侧。还可以执行该方法，使得在旋转基质的同时执行将媒质(包含之前准备的目标核酸)滴入或注入反应区域的步骤、将添加剂滴入或注入反应区域的步骤和使用特定波长的激励光照射反应区域的步骤。
(4)用于检测杂交的系统
本发明的第四实施例涉及用于检测具有检测元件的基质上的杂交的系统，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域、布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极和在反应区域中被固定的、用于检测的核酸。
该系统至少包括将包含之前准备的目标核酸的媒质滴入或注入所述反应区域中的装置；用于通过相反电极将电场施加到反应区域中保持的媒质的装置；使用于检测的核酸和目标核酸之间进行杂交的装置；将添加物滴入或注入反应区域的装置；和使用特定波长的激励光照射反应区域，并且检测所得荧光的强度的装置。
可以修改用于检测杂交的系统，使得基质具有透射激励光的层，并且从与基质的反面相对的源发出激励光。该结构允许用于将媒质滴在或注射在基质上的装置的布置和用于检测基质下的杂交的光学装置的布置。以该方式进行布置使整个设备紧凑，并且简化设备的结构。
该系统还可以包括用于控制温度的装置和/或用于控制杂交的湿度的装置和用于向反应区域供水的装置。
该系统还可以包括用于旋转盘状基质的装置和用于将检测元件放置在基质上的伺服控制装置以及用于聚焦的伺服控制装置。
(5)用于基质处理的设备
本发明的第五实施例涉及用于处理在其上具有用于杂交的反应区域的基质的设备。该设备包括用于向已经固定了用于检测的核酸的反应区域供应目标核酸的装置；用于将已经被提供了目标核酸的基质加热到受控温度的装置；用于读取所述基质上的杂交状态的装置；和用于传输基质的装置。该设备还可以具有用于向基质施加电场的装置或用于光学读取的装置。
可以修改该设备，使得用于传输的装置连续地将基质通过用于供应的装置、用于加热的装置和用于读取的装置。可以修改该设备，使得连续地布置用于供应的装置、用于加热的装置和用于读取的装置。还可以修改该设备，使得用于供应的装置具有用于加湿的装置。
该设备还可以包括用于将基质引导到用于供应的装置的装置，和用于从用于读取的装置中卸下基质的装置。用于引导基质的装置和用于卸下基质的装置可以合并到一个单元中。该设备可以具有连续布置的用于供应的装置、用于加热的装置、用于读取的装置、基质的入口和基质的出口。
该设备可以额外地具有用于将溶剂供应到其中固定了用于检测的核酸的反应区域中的第二装置，或用于从血液中提取核酸的装置。
(6)用于基质处理的方法
本发明的第六实施例涉及用于处理在其上具有用于杂交的反应区域的基质的方法。该方法包括用于向已经固定了用于检测的核酸的反应区域供应目标核酸的步骤；用于将已经被提供了目标核酸的基质加热到受控温度的步骤；和用于读取所述基质上的杂交状态的步骤，其中连续地执行这些步骤。
该方法可以具有将电场施加到基质的附加步骤。在供应核酸的步骤中或在杂交期间施加的电场向核酸分子提供电泳效应，由此改善杂交的效率和杂交检测的精度。
可以修改该方法，使得用于温度控制的步骤提供在用于检测的核酸和目标核酸之间发生杂交的时段。
可以修改该方法，使得通过光学读取完成读取，通过供应核酸的步骤、控制温度的步骤和读取步骤传输基质。可以修改该方法，使得供应所述核酸的步骤包括加湿。
下面是用在本发明中的技术术语的定义。
“用于检测的核酸”是在反应区域中保持的媒质中自由或静止的核酸，并且用作检测具有用于与所述用于检测的核酸进行特异反应的互补碱基序列的核酸的探针。典型的例子是作为DNA探针的寡核苷酸或多核苷酸。“目标核酸”是具有与用于检测的所述核酸互补的碱基序列的核酸。
“核酸”是核苷的磷酸酯的聚合物(或核苷链)，其中嘌呤或嘧啶碱基通过配糖键(glycoside linkage)与糖组合在一起。其包含DNA(完整或片断)，包括通过从寡核苷酸、多核苷酸、嘌呤核苷(purinenucleotide)或嘧啶核苷(pyrimidinenucleotide)聚合的探针DNA。其还包含通过反向转录形成的cDNA(c探针DNA)、RNA和聚酰胺核苷衍生物(PNA)。
“杂交”是形成具有互补碱基序列的互补股(双股)的反应。“误杂交”是形成异常互补股的反应。在本说明书中可以将其称为“误杂交”。
“反应区域”是发生杂交和其它反应的区域。其包括保持液体或凝胶的形状良好的区域。只要反应与本发明的目的和效果一致，则不特别限制在反应区域中的反应。
“相反电极”表示其表面彼此面对的至少一对电极。“相反轴”是连接相反电极的表面的中心的直线。“交叉(crossing)”包括具有交叉点的二维交叉和不具有交叉点的三维交叉。只要其与本发明的目的和效果一致，则不特别限制交叉角。
“过剩物质”包括在反应区域中存在的诸如探针DNA之类的用于检测的过剩核酸、具有与用于检测的核酸互补的碱基序列的过剩目标核酸和插入到通过杂交获得的互补股中的“添加物”。
“添加物”是使用插入到双股核酸中的荧光标记的物质。其用于检测杂交。其包括POPO-1和TOTO-3。
“位阻”表示防止反应基团相互接近的分子中的大基团、或者被布置或分子的三维结构(高阶结构)妨碍所期望的反应(或在本发明中的杂交)的现象。
“电泳”是分子在不均匀电场存在的情况下移动的现象。当施加DC电压或AC电压时发生该现象。在后一情况下，反向电压极性使分子极化的方向反向。(见“Micromachine and Material technology”from CMC edited by TeruHayashi，P.37-46，Chapter 5，Manipulation of Cells and DNA。)
“DNA芯片”表示用于检测杂交的基质，在其上以非常小的间隔固定诸如DNA探针之类的核酸分子。其还包括DNA微阵列。
本发明允许基质上的基因信息的有效集成(固定)和有效杂交以及短时间内的精确检测。
附图说明
图1是显示适用于本发明的盘状基质的典型实例的透视图。
图2是显示基质1的基本分层结构的部分截面图。
图3是形成在反应区域R中的检测表面U的示意放大图。
图4是具有布置在一个方向上的一对相反电极的检测元件3的截面图。
图5是具有布置在另一个方向上的一对相反电极的检测元件3的截面图。
图6是具有布置在又一个方向上的一对相反电极的检测元件3的截面图。
图7是具有布置成它们的相对轴彼此正交的两对相反电极的检测元件3的截面图。
图8是显示检测元件3中的扫描电极C的布置的示意图。
图9是显示检测表面U的模式的示意图。
图10是显示配有具有凸起(projection)的电极的检测元件3的一个实施例的示意图。
图11是显示用于向相反电极供电的布线7的一个实施例的示意图。
图12是显示生产DNA芯片10的步骤的流程图。
图13是显示生产DNA芯片10的步骤的另一流程图。
图14是显示属于本发明的系统的实施例的方框图。
图15是显示用于基质的处理的设备的实施例的示意图，其中该设备是图14中所示的系统的组成部分的组合。
图16是显示用于可用来生产DNA芯片和/或检测杂交的基质的处理的示意方框图。
图17是显示检测杂交的一种方式的流程图。
图18是显示检测杂交的另一种方式的流程图。
图19是显示用于施加高频电场W1并随后施加低频电场W2的波形的曲线图。
图20是显示用于施加低频电场W2并随后施加具有矩形波形的低频电场W3的波形的曲线图。
图21是显示用于施加低频电场W2并随后施加低频电场W3的波形的曲线图，其中在它们之间插入零电场周期。
图22是显示用于施加高频电场W1并随后施加低频电场W3的波形的曲线图，其中在它们之间插入DC电场周期W4。
图23是显示用于施加高频电场W1并随后施加低频电场W3的波形的曲线图，其中在W1之前放置DC电场周期W4。
图24是显示用于施加具有被叠加了DC分量的高频电场W5并随后施加低频电场W2的波形的曲线图。
图25是显示用于施加高频电场W1并随后施加具有被叠加了DC分量的低频电场W6的波形的曲线图。和
图26是显示用于施加具有被叠加了DC分量的高频电场W5并随后施加具有被叠加了DC分量的低频电场W6的波形的曲线图。
具体实施方式
将在下面参照附图描述用于实现本发明的最佳方式。所示的实施例是典型的实施例，它们不意欲限制本发明的范围。
<1.适用于本发明的实施例的“基质”>
(1)基质的基本结构
本发明可以采用以与用于诸如CD(紧凑盘)和DVD(数字多功能盘)之类的光信息记录介质相同的材料制成的任何基质。不具体限制属于本发明的基质的形状，然而，圆盘形是特别理想的。下面的描述主要涉及盘状基质。
图1显示适用于本发明的盘状基质的实例。从诸如硅树脂、聚碳酸酯和聚苯乙烯之类的光学透明石英玻璃或塑料，特别是那些能够喷射模塑的塑料中形成所示盘状基质1(下面简称为“基质1”)。与常规玻璃芯片相比，从便宜的塑料形成基质1有助于降低运行成本。
基质1在其中心可以具有规定尺寸的孔2(不必须是通孔)。该孔2允许由转轴(spindle)9或插入其中的下述卡盘(chuck)保持并旋转基质。
此外，可以构造孔2以便接受合适的夹具(jig)，该夹具向布置在基质1上以施加电场的相反电极(下面描述)的全部或部分供电。
图2是显示基质1的基本分层结构的部分截面图。基质1实质上包括反射层11和特定波长的发光层12。如图2所示，应该最好将反射层11放置在发光层12上。在通过基质1反面的向上照射的帮助下，该结构有助于检测操作等。
可以以如下方式将如上构造的基质1合并成用于实验的完整系统中：将用于滴或注射样本溶液的那些机械装置布置在基质上，并且将用于检测(或读取)的那些光学装置布置在基质下。
形成基质1使得反射层11具有几个到几十个纳米的厚度。该反射层11可以是对来自伺服机构(在图10中由符号V表示)的激光束具有5％到50％的单层金属材料或无机材料。
上述反射系数范围对于稳定伺服机构(聚焦和跟踪)来说是足够高的，并且对于激励光透射和用于测量荧光强度所需的荧光来说是足够低的。
使用上述的反射系数范围，甚至当基质的折射率与在其上存在的任何物质的折射率非常接近时，基质1也完全清除来自用于伺服机构(在图10中由符号V表示)的反射激光束的干扰。
反射层11可以是由多种无机材料形成的、具有波长选择性的多层结构的反射薄膜。这样的反射薄膜仅反射用于伺服机构(在图10中由符号V表示)的激光束，而不损失激励光和用于测量荧光强度的荧光。
上述反射薄膜用作反射层11，该反射层11具有高于50％(例如，90％或以上)的激光束反射系数，而不会对荧光强度的测量产生不利影响。
基质1具有形成在发光层12或反应区域形成层(未示出)中的大量检测元件3，其中反应区域形成层是放置在发光层12之上的光敏聚酰亚胺树脂层等等。每个检测元件3包括类似井(well)的反应区域和一对彼此面对的相反电极(或至少一个电极)。(在图1中，由于电极太小，所以不能显示它。)每个反应区域是DNA探针(用于检测的核酸)和目标核酸之间发生杂交的地方。可以通过任何已知的光盘控制技术形成反应区域。见图1。
发光层12可以是双层结构(未示出)，其上层具有比下层和媒质的折射率更高的折射率。该结构允许快速和精确聚焦和定位伺服控制。
每个检测元件3具有检测区域(对应于反应区域R的部分)和伺服区域。伺服区域具有用于径向位置(radial position)控制的伺服标记和用于基质1上的每个检测元件3的地址信息的地址标记。
可以以圆周或螺旋模式在基质1上布置检测元件3，使得检测区域和伺服区域交替出现。周期布置的伺服区域组成光盘技术领域中熟知的样本伺服系统。
可以通过常规光盘控制处理来形成伺服标记和地址标记。如果基质1与光盘类似，则用于样本滴入和检测的反应区域与用户数据区域类似。其它区域可以具有用于根据样本伺服系统跟踪的同步凹坑。紧随它们的地址给出关于基质1的位置信息。
地址部分从作为导入模式(leading pattern)的扇区标记开始。其包括显示基质1的旋转相位的VFO(可变频率振荡器)、显示地址数据的开始位置的地址标记和保存轨道和扇区号的ID(标识符)。
可以由从精细误差(fine error)信号获得的轨道位置信息和地址标记来定义基质1在其径向上的任何位置。前者是在径向上向外侧和内侧偏移四分之一轨道的两个跟踪标记的信号电平之间的差。
轨道位置信息允许在基质1在径向级(radial stage)上旋转的同时，定位用于媒质供应的放电头和用于检测的光头。
通过由光拾取器从在径向级上旋转的基质1的读取侧接收到的地址跟踪误差信号和聚焦误差信号控制该定位。
在本发明中使用的基质1具有为媒质亲和性(affinity)而预先进行表面处理的其表面。换句话说，基质表面划分为亲水性区和憎水性区。该规定节约了样本水溶液并将有机体平稳导入检测区域。
(2)“检测元件3”的结构
基质1具有布置在其上的大量小区域，其用作检测元件。每个检测元件3具有反应区域R(或类似井的小区域)，该反应区域R保持包含样本的水溶液和凝胶(诸如琼脂糖凝胶)，以便在其中发生杂交。每个反应区域R可以具有向它供水来防止媒质从其蒸发的装置。
应该以可以根据分析的目的来容易地分组检测元件3的方式来将这些检测元件3布置在基质1上。换句话说，可以以在圆周、径向或螺旋方向、以特定的隔将它们规则地布置在盘状基质1上。此外，可以根据样本的种类和基因在圆周方向上按角度来分组它们。
不具体限制检测元件3中的反应区域R的形状和大小。其长度、宽度和深度通常在几到几百微米的范围内。可以根据激励光的斑点直径和样本溶液(包含用于检测的核酸和目标核酸)的最小滴尺寸来恰当地确定它们。
(3)“检测表面U”的结构
检测元件3中的反应区域R具有用于固定DNA探针(用于检测的核酸)的经处理的表面。在下面将该经处理的表面称为“检测表面”。
图3是形成在反应区域R中的检测表面U的示意放大图。图3示意性显示检测表面U、固定在其上的用于检测的核酸D、与之杂交的目标核酸T和彼此连接双股的添加物I。
检测表面U可以是诸如黄金之类的金属、薄膜的表面或面对反应区域R的电极的表面。
可以使用包含硅烷耦合试剂(silane coupling agent)的氨基溶液或赖氨酸溶液预先处理检测表面U(或电极表面)，以容易地在其上固定DNA探针或用于检测的核酸D。
可以在对塑料基质进行上述表面处理之前使用深UV光或远红外线进行等离子处理和照射，然后进行使用包含硅烷耦合试剂的氨基溶液的处理。
替代地，可以通过使用铜、银、铝或金薄膜进行喷镀(sputter)来向塑料基质添加涂层，然后使用具有诸如氨基、硫醇和羧基团之类的官能团的物质或使用巯基乙胺或抗生蛋白链菌素(streptavidine)向其添加涂层。
使用抗生蛋白链菌素的表面处理合适于固定经生物素化的(biotinylated)DNA探针的末端的检测表面。类似地，使用硫醇(SH)基团的表面处理对于固定用于检测的核酸D的检测表面是合适的，其中该核酸D可以是具有通过二硫键的硫醇改变末端(thiol-modified terminal)的探针DNA。
检测表面U可以可选地具有连接到它的插入分子，诸如帮助固定用于检测的核酸D的联结子(linker)和间隔物(spacer)。这样的分子在检测表面U和用于检测的核酸D之间提供一定距离，以防止它们相互干扰。以这种方式可以防止除要被固定的特定部分之外的用于检测的核酸D附着在检测表面U。
此外，检测表面U还可以具有与以一定间隔交替连接到它的、分子长度不同的插入分子(联结子)，以便防止用于已经被固定到检测表面U上的用于检测的核酸D的分子之间的相互干扰。
用于上述目的的插入分子可以根据用于检测的核酸D或目标核酸T的长度(碱基的数量)或用于检测的核酸D的分子距离来具有足够的分子长度。在用于检测的核酸D(其为具有50-100个碱基的经伸展探针DNA)和具有大约1600个碱基的目标核酸T之间杂交的情况下，由于Brownian运动，额外碱基序列的一半(或不形成互补股的序列的一半)形成随机盘绕分子块。这样的块具有10到40nm的直径。
为了有效防止目标核酸T的分子块的位阻现象，插入分子(在其伸展状态下)应该具有10到40nm分子长度。此外，应该以大约10到40nm的间隔布置在检测表面U上的插入分子。
(4)“相反电极”的结构
检测元件3的反应区域R具有至少一对相反电极E1和E2，如图4所示，其面对反应区域R。可以由诸如金和铝之类的金属或诸如ITO(铟锡氧化物)之类的透明导体形成这些相反电极E1和E2。它们被布置成使得在反应区域R中在它们之间保持检测表面U。
图4显示如何布置一对相反电极E1和E2来将电场施加到反应区域R中保持的水溶液或诸如凝胶之类的媒质上。当需要时，可以由基质1上的一个电极和作为外部电极单元的其它电极(图4所示的E2)构造相反电极。
相反电极E1和E2施加诸如高频交替电场(将在下面描述)来产生电动效应或电泳，其伸展媒质中的核酸分子(用于检测的核酸D和目标核酸T)，将它们向电场线集中的电极边缘移动，在伸展它们的同时移动它们，或者吸引它们。附带地，图4的符号D示意性显示以其经伸展形式被固定的用于检测的核酸。相反电极E1和E2可以按要求用于电泳或电渗。
通常在螺旋或随机盘绕为球的两个单股分子之间发生杂交。因此，其经历位阻，这导致效率低的互补反应和误杂交。
通过经由相反电极E1和E2施加电场来避免上述情况，这以高阶结构伸展核酸分子或将其移动到用于核酸分子关联可能性高的区域。
在存在电场的情况下，由于降低的位阻缘故，而非常高效和精确地进行杂交。这导致由杂交进行的高速检测。附带地，在不存在电场的情况下，可以由自然Brownian运动进行杂交。
如图4所示，通过接通和断开电场的开关S将在反应区域R中的相反电极连接到外部电源V。
此外，它们具有用于调节场强、在AC和DC之间切换和在高频电场或低频电场之间切换的控制装置。
可以以下面三种方式中的任意一种方式布置反应区域R中的相反电极。
(1)如图4所示，将一个电极E1放置在反应区域R的底部4上，而其它电极E2放置在其上。
(2)如图5所示，将两个电极E3和E4放置在反应区域R的相对竖墙5。
(3)如图6所示，将两个电极E5和E6并排(具有分离的一定距离)放置在反应区域R的底部4上。
替代地，可以使用多对相反电极。例如，可以在反应区域R中布置两对相反电极，使得它们的相对轴彼此正交。如图7所示，反应区域R可以具有垂直布置的第一对相反电极E1和E2，和水平布置的第二对相反电极E3和E4。
在以上情况下，第一对相反电极E1和E2施加高频电场来调节用于检测的核酸D的高阶结构，并改善杂交的效率，而第二对相反电极E3和E4施加电场来清除阻碍检测杂交的、不需要的物质(诸如过剩的用于检测的核酸D、过剩的目标核酸T和过剩的添加物I)，并且将经杂交的核酸分子从检测表面移动到另一区域。使用电场进行清除是将替代使用水溶液的常规清除处理的新技术。
可以通过与低频电场组合来改善由电场进行的上述清除操作。换句话说，施加到反应区域R的低频电场向误杂交的核酸的分子提供足够的振动，由此将它们与用于检测的核酸D分离。用于该目的的低频电场应该具有足够低的强度，以便不会分离正常杂交的核酸的分子。
检测元件3的反应区域R可以具有通过毛细管作用供应包含用于分析的样本的媒质的设备。如图4和7所示，该设备可以包括与反应区域R相通的入口H1和开口到外部的通孔(vent hole)H2。此外，入口H1可以具有其周围表面是憎水性表面(与媒质的亲水性相反)的开口。
如图8所示，检测元件3的反应区域R可以额外地具有布置在其中的扫描电极C。图8简要显示检测元件3中的扫描电极C的布置。将扫描电极放置在相反电极E1和E2之间，使得它们的边缘d面对公共电极G。
图8所示的实施例具有分别连接到一系列开关(S1，S2…Sz)一系列扫描电极(C1，C2…Cz)。这些开关以一定时间间隔接通和断开，以将电场顺序施加到相邻扫描电极(即，C1-C2、C2-C3、…)。电场固定在相邻扫描电极的边缘d和d之间伸展的、用于检测的核酸的分子(由符号X指示)。附带地，图8中的符号L示意性显示在扫描电极(Cx和Cy)的边缘d集中的电场线。
如上所述，面对反应区域R的相反电极可以使它们的表面之一用作固定DNA探针或用于检测的核酸D的检测表面U(如图3所示)。
在这种情况下，用作检测表面U的电极表面最好应该小于其它电极表面。如图4和7所示，具有比其相反电极更小的表面区域的电极E1集中电场线来产生不均匀电场，这使得核酸分子通过电泳快速迁移到电极E1。
如图9所示，可以不规则地粗糙或者使用孤立物(island)规则模式化电极表面或用于固定的检测表面U，，使得其凸起集中电场线，由此产生不均匀电场。可以使用未图示的凸锥或凹锥或使用U形孔来形成规则模式。
可以通过诸如喷射沉积、取向附生沉积和蚀刻之类的任何公知方法来完成电极表面的粗糙。不具体限制该粗糙方法。
最好应该使用诸如SiO2、SiN、SiOC、SiC、SiOF和TiO2之类的绝缘材料来向电极表面添加涂层。结果所产生的绝缘层避免由保留在反应区域中的粒子溶液引起的电化学反应。
附带地，如图10所示，被布置来将电场施加到检测元件3的反应区域R中保持的媒质的相反电极E1和E2可以具有朝向反应区域R的凸起。
因此构造的相反电极使凸起的末端e1和e2集中电场线，由此快速产生不均匀电场。因此，它们合适地起作用来固定用于检测的核酸D。
(5)用于向“相反电极”供电的装置
可以以任何方式(没有具体限制)向安装在反应区域R中的相反电极供电。根据图11中所示的一个实施例，基质1在其孔2周围配有与外部导电夹具(未示出)接触的导电部分6，并且还配有从导电部分6延伸出的电源布线7，以覆盖基质的整个表面。
可以以圆形、环形、分割环形(如图11所示)之类的形式形成导电部分6。附带地，图11中的符号21表示用于定位导电夹具或卡盘的凹槽。
通过形成凸起或使孔2具有特定形状而不是采用凹槽21来达到定位的目的。不具体限制定位方法。
如图11所示，电源布线7的一个实施例包括第一到第三布线。第一布线(主布线)71从基质1的导电部分6沿半径延伸。第二布线72以圆周形方式从第一布线71中分出。第三布线73从第二布线72中分出并到达电极。第二布线72沿同心圆或螺旋曲线延伸。
可以在布线基质1a上以一层或多层形成这些布线71到73，其中该基质1a被精确地绑定到具有布置在其上的检测元件3的检测基质1b。因此，基质1包括两层1a和1b。
以上述方式构建的用于供电的布线7(布线71、72和73)可被用作用于信息读取的旋转同步信号(revolution synchronizing signal)或跟踪信号的参考(reference)。因此，它们清除了向基质1附加诸如凹坑和条形码之类的附属信号和标记的必要。这简化了基质1的结构。
<2.关于准备DNA芯片的方法>
从按上述方式构造它并使其经历表面处理的盘状基质1准备根据本发明的DNA芯片。
如上所述，基质1具有在其上形成的大量检测元件3，每个检测元件3包括发生杂交的至少一个反应区域R和将电场施加到反应区域R中保持的媒质的一对相反电极(即，E1和E2)。见图1。该基质用作所谓DNA芯片的基础，在其上固定了用于检测的特定核酸D。
通过包含图12和13(流程图)中所示的步骤的过程来准备DNA芯片如下。
整个过程包括五步。第一步P1是基质1的表面处理。第二步P2是将包含之前准备的用于检测的核酸D的媒质滴入或注入反应区域R。第三步P3是通过相反电极(即，E1和E2)将电场施加到反应区域R中保持的媒质。
在第三步P3中施加的电场产生将用于检测的核酸D伸展并将其固定在作用为检测表面U的电极(即，E1)的表面上的电动效应或电泳。第四步P4是从反应区域R中清除过剩的用于检测的核酸D。第五步P5是封装并交付到用户。将顺序描述以上步骤。
(1)用于基质的表面处理的第一步骤P1
按如下方式执行具有用于杂交的反应区域R的基质1上的表面处理。首先，使用憎水性物质处理基质表面，使得其呈现憎水性。其次憎水性基质表面部分呈现亲水性。
可以恰当地组合表面处理的两个步骤来在基质1上按期望产生憎水性区域和亲水性区域。例如，可以组合它们，使得组成反应区域R的墙呈现亲水性，而基质1的其它部分(非反应区域)呈现憎水性。
基质1的反应区域R通常通过滴入或注入来接受包含生物材料的水溶液。诸如用于诸如基因分析之类的生物分析的核酸之类的生物材料大都是亲水性的。
因此，执行表面处理，使得基质1的反应区域R呈现亲水性，而基质1的非反应区域呈现憎水性。以这种方式进行表面处理的效果在于：当包含生物材料的样本溶液被滴在基质1上时，它们被确定地导入或使其保留在反应区域R的亲水性区域中。
可以执行上述步骤P1，使得根据目的仅在基质1上的反应区域R中的特定部分上呈现憎水性或亲水性。例如，可以执行该步骤，使得仅在反应区域R的检测表面(或电极表面)上呈现亲水性，而仅在反应区域R的其它部分(或非检测表面)上呈现憎水性。
在反应区域R中这样形成的亲水性和憎水性区域允许在理想位置上保持亲水性或憎水性样本溶液和凝胶，或者允许将用于检测的核酸导入反应区域R中的理想位置以进行固定。
通过使用作为由R-Si-X1、X2、X3表示的憎水性物质的烷基硅烷处理基质表面来形成憎水性表面，其中R是烷基团(其可以包含步饱和基团)，并且Xn表示Cl或OR。
可以通过在憎水性表面上形成羟氢氧基团的反应来完成使憎水性表面部分呈现亲水性。将羟氢氧基团导入组成憎水性表面的烷基硅烷的一种方式是通过在氧存在的情况下使用UV光进行照射，这将羟氢氧基团添加到烷基硅烷的烷基团。
(2)用于滴入或注入用于检测的核酸的第二步骤P2
该步骤通过滴入或注入将之前准备的用于检测的核酸D添加到已经经历上述表面处理的基质1上的反应区域R。用于检测的核酸D可以是诸如DNA寡链(oligochain)和cDNA(互补DNA)之类的DNA探针，其包括作为cDNA片断的诸如EST(表达序列标签)和OFR(开读取框，open reading frame)之类的多核苷酸。
可以以任何方式(不具体限制)完成滴入或注入。一种方式是将包含DNA探针的样本溶液通过其位置被使用XYZ操作控制系统的压电装置精确控制的微型喷射到基质1上的反应区域R的喷墨打印技术。
另一种方式是在由XYZ操作控制系统的精确位置控制下，通过附属于打印头的微点笔、毛细管或镊子将之前准备的用于检测的核酸滴在基质1的反应区域R上的微点技术。
点技术使得可以将包含用于检测的核酸D的微小液滴和包含目标核酸T的微小液滴精确地添加到基质1的检测元件3上。
附带地，喷墨打印技术使用与安装在喷墨打印机中相同的喷嘴来向基质电喷射用于检测的核酸。
其包括压力喷墨方法、气泡喷射方法(注册商标)和超声波喷射方法。设计第一种方法来通过依据施加脉冲时由压电元件产生的压力喷射液滴。设计第二种方法来通过当由喷嘴内的加热器加热液体时出现的气泡产生的压力来喷射液滴。以规则的时间间隔激活嵌入在硅基质中的加热器，并且大约控制在300℃/秒来产生用于液体喷射的均匀气泡。然而，由于将液体加热到高温，因此该方法不适用于生物材料的样本。设计第三方法将超声波束引导到液体的自由表面，由此使液体在局部高压下释放微小液滴。其快速产生大于1μm直径的微小液滴，而不需要任何喷嘴。
在上述喷墨打印方法中，由于对媒质的热效应有限，所以压电喷墨方法适用于本发明。此外，其可以根据所施加的脉冲的形状来控制液滴的大小，这导致精确分析。当液表面的曲率半径很小时，可以将液滴大小控制为很小，反之亦然。还可以通过将脉冲向负值(negative)转换来向内拉伸液滴表面以降低液体表面的曲率半径。
设计微观点(micromechanical spotting)方法来通过带有微点笔、毛细管或镊子的打印头的装置将包含用于检测的核酸的每个微液滴添加到基质上的检测表面。
还可以采用通过导电音圈传送媒质的滴入装置，其中该导电音圈通过由电磁感应和外部磁场产生的感应电流的相互作用来振动。
可以在盘状基质1正在旋转并且伺服机构正在读取基质上的检测元件3的位置的同时完成第二步骤P2。附带地，可以与第三步骤P3同时处理第二步骤P2，使得将电场施加到已经滴入或注入反应区域R的媒质。见图13所示的步骤P21。
(3)用于施加电场的第三步骤P3(来固定用于检测的核酸)
分别如图12和13所示，在第二步骤P2之后或与之同时以下列方式处理第三步骤P3。该步骤意欲通过面对反应区域R的相反电极(即，E1和E2)将电场施加到基质1上的反应区域R中保持的媒质。
在没有电场的反应区域R中的媒质包含自由状态的DNA探针(其为用于检测的单股核酸D)。在其自由状态中，由于Brownian运动，核酸D具有随机盘绕的高阶结构。
在步骤P3(图12所示)或步骤P21(图13所示)中，通过连接到外部电源的相反电极(即，E1和E2)向反应区域R中的媒质提供高频AC电场。该高频电场最好具有等于或高于1MV/m的电压和等于或高于500KHz的频率，具体为大约1×106V/m和大约1MHz。见Masao Washizu and OsamuKurosawa：“Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26，No.26，P.1165 to 1172(1990)。
因此而施加的电场产生用于电泳的电动效应，其将随机盘绕的用于检测的核酸D伸展，并且使其向具有集中的电场线的电极表面迁移。因此，如图4所示，作为DNA探针的用于检测的核酸D具有通过耦合反应固定到电极表面的修改末端。换句话说，电极表面用作检测表面U。此外，电场使用于检测的核酸的移动加速，由此降低处理时间。
如上所述，使用抗生蛋白链菌素处理过的电极表面适用于生物素化的DNA探针，以使其末端固定。同样地，使用硫醇(SH)基团处理过的电极表面适用于经硫醇修改的DNA探针，以通过二硫(-S-S-)键固定其末端。
(4)用于清除(洗)的第四步骤P4
第四步骤P4意欲从反应区域R清除并回收过剩的用于检测的核酸D(没有被固定的仍然保持自由的)。
以两种方式之一来执行该步骤。第一种方式包括将之前准备的清洁缓冲溶液滴入或注入反应区域，并且从反应区域R中恢复清洁溶液与过剩的用于检测的核酸。
在以上过程中，可以通过与基质1的反应区域R相通的毛细管(未示出)的毛细管作用来有效地回收清洁溶液。此外，可以通过旋转盘状基质1产生的离心力来加速清洁。
附带地，清洁溶液可以是包含诸如SDS之类的表面活性剂的SSC(盐-柠檬酸钠)的缓冲溶液。
清洁步骤的第二种方式是通过与用于固定的相反电极分离地安装的、一对附加相反电极(即，图6中的E3和E4)施加电场。施加来用于清洁的电场足够弱，使得不移除被固定的用于检测的核酸，但是足够强到将其移动到不对检测表面产生影响的区域或电极E3和E4的表面的周围。因此而移动的过剩核酸被回收或捕捉(见图7)。
上述第二种方式不意欲从反应区域R中清除过剩的用于检测的核酸D，而是意欲将过剩的用于检测的核酸D移动到不损害反应区域R中的检测的任何区域。
因此，在用于执行固定的操作和杂交的操作的情况下，或者在用户通过使用已经在其上固定了用于检测的核酸D的DNA芯片10来执行杂交的操作的情况下，以第二种方式进行清洁是有效的。
附带地，图7示意性显示在电极E1的表面上的经杂交的双股核酸的分子，并且还显示被吸引到电极E3和E4的表面附近的过剩物质B。
通过上述步骤处理的基质1具有被固定在反应区域R的检测表面U上的用于检测的核酸D，以及从反应区域R中移除的过剩的用于检测的核酸D。因此，该基质1准备好封装并交付给用户。其将被称为具有集成基因信息的“DNA芯片”。在下面将由附图标记10指示DNA芯片。以上描述关注通过施加电场的探针固定。然而，由于通过化学反应固定探针，因此电场不是必须的。
<3.关于用于生产DNA芯片和用于杂交检测的系统>
下面涵盖用于从上述基质1生产DNA芯片的系统和用于检测属于本发明的DNA芯片的杂交的系统的典型实施例。图14是用于该实施例的方框图。
图14中显示的系统包括用于滴入或注入媒质的装置、伺服机构和荧光检测装置。头两个装置被用在用于固定用于检测的核酸D(或用于生产DNA芯片)的系统和用于检测杂交的系统。而最后一个装置也被用在用于检测杂交的系统中。
可以将图14中显示的系统分为两个单元——一个用于生产DNA芯片，而一个用于检测杂交。每个单元可以为特定目的设计。这对于在图15中所示的系统和图16中所示的系统都是对的显。
如上所述地构造图14显示的基质1(或DNA芯片10)。在运行之前，将其固定到从配有旋转装置的盘托8向上突出的转轴9。转轴9穿过基质1(或DNA芯片10)的中心孔2(见图1)。
为了生产DNA芯片，通过滴入或注入向基质中的反应区域提供包含用于检测的核酸D的媒质M1。为了检测杂交，还滴入或注入向其提供包含目标核酸T的M2。
媒质M1和M2通常采用具有经恰当调整粘度的液体或凝胶的形式。基质1应该保持水平，同时滴入或注入液体媒质M，使得其留在规定的地方。
图14显示的系统具有布置在基质1(或DNA芯片10)的上表面1c上的多个喷头N1。构造喷头N1，使得在它运动到规定的位置时，以合适的时间间隔将媒质(即，M1到M3)滴入或注入检测元件3的每个反应区域R。
在图14中，示意性显示控制单元31，其响应于用于基质1(或DNA芯片10)的“聚焦信息”和来自基质1的“跟踪信息”控制来自喷头M1的滴入和注入。
在图14中，显示了激励光Q，其用于在杂交检测期间进行信息读取。其出现于激光二极管12，通过准直仪透镜(collimator len)L1(其产生平行光束)，并且在分色镜(dichoric mirror)13转动(90°)。
然后，激励光在放置在光路中的镜子14处在此转动(90°)，进入由传动装置15支持的聚光器透镜(condenser lens)L2，并且通过基质1的下侧1d撞击到检测元件3的(反应区域R)。附带地，附图标记16表示从控制单元31发送来控制激光二极管驱动器17的信号。
由聚光器透镜L2集中激励光Q，以便其在基质1(或DNA芯片10)的表面上变为很小的数微米。当通过设计来进行喷墨打印的喷头N1(其能够传送皮升级的极小溶液滴)将包含用于检测的核酸的媒质M1或包含目标核酸的媒质M2滴在或注射在基质1(或DNA芯片10)时，最有效地利用由此集中的激励光。
可以有与媒质一样多的喷头N1或喷墨喷嘴，或者可以仅有一个喷嘴，其在被清洁之后可以用于不同种类的媒质。
在滴入或注入包含用于检测的核酸的媒质M2的同时，或在杂交后的适当时间，喷头可以将包含添加物I(图3所示)的媒质M3滴在或注射在反应区域R。在固定步骤之后的适当时间，它们还可以滴入或注入清洁溶液。
通过使用读取预先记录在基质1(或DNA芯片10)上的地址标记信息的激光束V(下面描述)的伺服机构来实现将媒质滴入或注入基质1的所要的地址的目的。
DNA芯片10允许杂交来从之前已经被固定在反应区域R(的检测表面)上的用于检测的核酸D和目标核酸T(随后滴入或注入)形成双股核酸。在滴入或注入目标核酸T之后或同时，通过喷头N1将包含进入或与上述双股核酸组合的添加物I的媒质M3滴入或注入反应区域R。附带地，如果恰当地修改了媒质，则可以在滴入或注入目标核酸T之前将添加物I添加到反应区域R。
一旦使用激励光Q进行照射，添加物发出由符号F指示的荧光。荧光F通过基质1的下侧1d，在放置在DNA芯片10下的镜子14处转动90°，通过(放置在光路中的)分色镜13，并且最终在分色镜18处转动90°。
荧光F向上通过聚光器透镜L3并进入检测器19，分色镜18反射荧光F，但是具有用于伺服控制(下面描述)的激光束Z的透射特性。
荧光F具有比普通光盘RF信号弱得多的强度。因此，检测器19最好应该是任意高灵敏度检测器，诸如光电倍增器(光电池)和雪崩光电二极管(APD)。
由AD转换器20将由检测器19检测到的荧光转换为数字信号32(具有足够的位数)。例如，使用数字信号32来准备荧光强度对应于基质1上的地址的映射表。
根据本发明的系统和设备具有下面解释的伺服机构。
在基质1(或DNA芯片10)下布置了聚光器透镜L2，其中由用于光盘拾取的二轴音圈型传动装置15在聚焦方向(垂直方向)和跟踪方向(圆周方向)上移动它。
由于水平保持基质1，而在其下放置聚光器透镜L2，使得其光轴是垂直的，因此激励光Q和用于聚焦和跟踪伺服控制的激光束Z撞击到基质1(或DNA芯片10)的下侧1d。
以上结构允许用于伺服控制的激光束Z从基质1(或DNA芯片10)的下侧1d反射，而根本不会被放置在基质1(或DNA芯片10)的检测元件3中的、包含用于检测的核酸D和目标核酸T的媒质所影响。
换句话说，用于伺服控制的激光束Z反射，同时保持其反射方向和其强度不受基质1(或DNA芯片10)中的媒质的干扰。这有助于不受聚焦和跟踪误差干扰的稳定伺服控制。
如图14所示，伺服机构具有受到放置在其后的驱动器23的控制的激光二极管22，和放置在该二极管22之前的准直仪透镜L4。
准直仪透镜L4使用于伺服控制的激光束Z平行。在准直仪透镜L4之前是分色镜25，其具有用于伺服控制的激光束Z的透射特性。
在图14中所示的系统包括象散器L5，用于聚焦误差的散光校正。还可以应用刀口校正、菱形校正等等。
可以通过差分推-拉(dofferential push-pull)方法或三点(three spot)方法来校正跟踪误差。这两个方法都需要盘上的三个光点。
如图14所示，通过在用于伺服控制的激光系统中的准直仪透镜L4和分色镜25之间放置衍射光栅24来实现以上目的。零阶以及(±)一阶衍射光通过聚光器透镜L2并撞击到基质1(或DNA芯片10)上。
所反射的用于伺服控制的激光束进入图14所示的检测器26。附带地，由控制器31(图12所示)控制驱动器23和检测器26。
激励光Q、荧光F和激光束Z波长可以彼此不同。在这种情况下，基质1(图2所示)上的反射层11应该具有用于荧光F的一定透射率和用于激光束Z的一定反射率。
换句话说，反射层11可以根据波长变换反射率和透射率，或者可以具有类似低通滤波器的频率特性。如果反射层11仅响应一个波长，则对于荧光F和激光束Z来说它不应具有改善的透射率和反射率。可以使用波长依赖性改善荧光F的透射率和激光束Z的反射率。
<4.关于用于基质处理的设备和系统>
将上述组成部分组合为用于基质处理的设备。在图15中示意性显示该设备的实施例。其适用于生产DNA芯片和/或检测杂交。此外，可以以与所示不同的方式布置其组成部分。
在图15中，由附图标记100指示整个设备。其总体包括图14中所示的、生产DNA芯片10和检测杂交所需的所有组成部分。
该设备100包括用于向其装入或从其卸下基质1(或DNA芯片10)的装置101、用于基质1(或DNA芯片10)的贮存器102、作为控制其中固定了用于检测核酸D和发生杂交的环境的加热装置和控制湿度状态的湿度装置的装置104、用于向已经固定了用于检测的核酸的反应区域供应用于检测的核酸或供应目标核酸的装置N和用于读取杂交状态的装置103。
该设备100还具有用于将电场施加到反应区域R的装置(未示出)和用于清洁用于检测的核酸D的装置(未示出)。附带地，该设备可以分离地具有用于装入基质的装置和用于卸下基质的装置，来代替上述单一装置101。
该设备100可以额外地具有用于从自细胞和组织提取的mRNA自动扩增目标核酸T(cDNA)并将其导入供应装置N(喷头N1)的装置(101a)。该附加装置使用于杂交检测的处理自动化。
该设备100可以具有串联地布置的供应装置N、包括加热装置的环境控制装置14、读取装置、基质入口和基质出口。由于基质直线移动，因此以这种方式进行布置简化了设备的结构。
在基质1或DNA芯片10已经密封在装入贮存器102之后，设备100以合适的时间间隔自动执行一系列步骤，在其中由环境控制装置104建立适用于分析的温度和湿度。该一系列步骤包括滴入或注入用于检测的核酸D，将用于检测的核酸D固定，滴入或注入目标核酸T和添加物，施加电场、杂交、清洁或清除以及检测(或读取)。
设计该设备100来处理在其上具有用于杂交的反应区域的基质。
也就是说，该设备100顺序地和连续地作为用于增加杂交效率和改善检测精度的附加步骤执行下列步骤。这些步骤包括：将目标核酸T供应到已经固定了用于检测的核酸D的反应区域R(可以通过伴随湿度来完成该步骤)；控制被提供了目标核酸T的基质1(或DNA芯片10)的温度；(光学)读取反应区域R中的杂交的状态；将电场施加到基质的反应区域R。
在供应核酸的步骤中增加的湿度防止了媒质(或溶剂)变干。此外，温度控制允许已经以最佳温度被固定在反应区域R上的用于检测的核酸D与目标核酸T之间的反应。
在图16(示意方框图)中显示了用于可以用来生产DNA芯片和/或检测杂交的基质处理的系统。
在图16中显示的自动处理系统200适用于包含固定和杂交检测的大量工作。可以将自动系统的概念和结构应用到用于基质处理的上述设备100。
系统200配有储存规定数量的基质1(不具有固定的核酸)或DNA芯片10(具有固定的核酸)的第一存储机(stocker)201。第一储存机201具有气密空间和用于控制温度和湿度的装置。
第一存储机201自动识别所储存的基质1或DNA芯片10，并且将其发送到另一级(stage)。其还识别从另一级接收的基质1或DNA芯片10，并且将其储存在规定的位置。
系统200还配有将基质1(或DNA芯片10)在系统和第一储存机201之间向前或向后移动的定点级(spotting stage)202。定点级202包含喷头N1、媒质贮存器和用于控制媒质的滴入和注入的装置(如图14所示)。
系统200还配有杂交级203，其包括用于施加电场的装置、用于控制电场的装置和用于控制温度和湿度的装置。
杂交级203将基质1(或DNA芯片10)在第一储存机201和定点级202之间向前和向后移动。
可以有定点级202的多个单元。在这种情况下，它们接收不同种用于检测的核酸D。
在图16中显示的系统200配有检测(读取)级204，其具有用于检测和伺服控制的光学系统(图14中所示)的装置、用于旋转DNA芯片10的装置和伺服机构。
检测级204意欲检测已经在DNA芯片10的检测元件3中发生的杂交。其连接到分析单元和显示单元(都未示出)。其将DNA芯片10移动到杂交级203或第一储存机201，或者从它们中移动DNA芯片10。
图16中显示的系统200配有第二储存机205，在其中在由检测级204在检测步骤之后回收并储存DNA芯片10。可以构造第二储存机205，以便从定点级202或杂交级203接收并回收基质1或DNA芯片10。
如上所述，可以有效地使用系统200来对大量样本执行快速分析。
<5.关于用于检测杂交的方法>
根据本发明，由将在下面参照图14、17和18描述的方法来检测杂交。图17是显示检测杂交的一种方式的流程图，而图18是显示检测杂交的另一种方式的流程图。
杂交检测从将DNA芯片10水平地安装在盘托8(图14中所示)上开始。DNA芯片具有在其上已经固定了的用于检测的核酸D。利用伺服控制和跟踪伺服控制工作，转动DNA芯片10。通过滴入或注入从喷头N1向根据地址信息选择的检测元件3提供包含用于检测的核酸的媒质M2。(由图17的P6指示该步骤)。
通过相反电极(诸如图4所示的E1和E2)向反应区域R中保持的媒质施加电场。电场产生电泳效应，该效应将处于反应区域中的、经固定的用于检测的核酸(D)伸展，还将处于自由状态的目标核酸(T)伸展，并且将其移动到检测表面U。在图17由P7指示该步骤。
在保持电场或电场关闭的情况下，允许由Brownian运动在用于检测的核酸D和目标核酸T之间进行杂交。(由图17的P8指示该步骤)。
根据本发明，由于电场的施加消除了位阻和其他问题，因此在非常短的时间完成杂交。可以分别或同时执行步骤P7和P8。
可以修改上述过程，以便通过使每个检测元件3处于足够的温度来加速用于检测的核酸D和目标核酸T之间的杂交。通过向每个检测元件3提供用于加热媒质的装置和用于检测媒质的温度的装置来实现该目的。这些装置帮助建立在检测的核酸D和目标核酸T之间反应的最佳温度状态。
在下一步中，向反应区域R提供从喷头N1滴入或注入的经荧光标记的添加物。该添加物与已经从上述杂交中产生的双股核酸组合(由图17的P9指示该步骤)。当然，可以在步骤P7和P8之间执行该步骤。这应用到图18所示的流程图。
随后从杂交区域(或检测表面区域)清除过剩物质B(诸如图7所示的过剩目标核酸和过剩添加物)以及通过将电场施加到反应区域R中保持的媒质而引起的电泳所导致的误杂交产生的任何物质(由图17的P10指示该步骤)。
在步骤P9和P10之后，使用特定波长的激励光Q照射反应区域R，并且由图14所示的光拾取装置检测因此产生的荧光(由图17的P11指示该步骤)。
在该步骤中，检测从添加物出现的荧光强度来确定用于检测的核酸和目标核酸之间的杂交的状态。由AD转换器20(见图12)将来自检测器的输出转换为具有特定位数的数字信号32。
以上步骤使得可以准备显示DNA芯片10上的地址和荧光强度的对应关系的映射表。该映射表允许通过与显示每个反应区域上固定的碱基的排列的映射表进行比较来分析目标核酸(由图17的P12指示该步骤)。
如图18所示，可以修改上述步骤，使得同时执行用于滴入或注入用于检测的核酸T的步骤P6和用于滴入或注入添加物的步骤P9。两个步骤P6和P9的组合改善过程的效率。
<6.关于用于施加电场的方法>
根据本法明的该方法包括以下列方式施加电场。
当从基质1生产DNA芯片10时，可以将下面描述的“施加电场”用在固定用于检测的核酸的步骤中，或者可以将其用在包括在DNA芯片10上进行杂交之前或之后步骤的步骤中。可根据电场施加的效果来采用电场的施加。
可以执行电场的施加而无需对场强、频率和施加持续时段进行具体限制。应该根据核酸的种类和长度来恰当地选择这些变量。可以使用具有包括正弦以及三角形的任何波形的电源。
图19显示电场的波形的实例。符号W1和W2分别表示高频电场和随后的低频电场。图20显示电场的波形的另一实例。符号W1和W3分别表示高频电场和随后的具有矩形波形的低频电场。
如图21所示，可以修改图19所示的电场的施加顺序。在修改的顺序中，将零电场周期(由图21的W0指示)插入在施加高频电场W1和施加低频电场W2之间。零场强允许已经通过电泳聚积到电极周围的目标核酸通过Brovnian运动自然地经历杂交。
正如刚才在上面描述的情况那样，可以通过插入零电场周期W0来修改图20所示的电场施加顺序。
如图22所示，也可以通过在施加高频电场W1和施加低频电场W2之间插入(DC)电场W4来修改电场的施加。被插入的DC电场增强通过电泳向电极吸引目标核酸的效果。
如图23所示，也可以通过在高频电场W1和随后的低频电场W2之前放置DC电场W4来修改电池的施加。DC电场预先通过电泳向电极吸引目标核酸。
如图24所示，也可以通过将DC分量叠加在高频电场(由W5指示)来修改电场的施加。所叠加的DC分量增强通过电泳向电极吸引目标核酸的效果。
如图25所示，也可以通过将DC分量叠加在低频电场(由W6指示)来修改电场的施加。所叠加的DC分量增强通过电泳从电极排斥(repel)不必要的核酸的效果。不必要的核酸包括过剩的非互补目标核酸、误杂交核酸和由于位阻而不完全杂交的互补目标核酸。
如图26所示，也可以通过将DC分量叠加在高频电场(由W5指示)和低频电场(由W6指示)来修改电场的施加。所叠加的DC分量增强通过电泳向电极吸引目标核酸的效果和通过电泳从电极排斥不必要的核酸的效果。不必要的核酸包括过剩的非互补目标核酸、误杂交核酸和由于位阻而不完全杂交的互补目标核酸。
可以通过将低频AC电场W3替代W2来修改图19到26所示的电场的施加。也可以通过在低频AC电场W2或低频AC电场W3之前放置零电场W0周期来修改电场的施加。附加的周期允许已经通过电泳聚集在电极周围的目标核酸通过Brownian运动自然地经历杂交。
[工业适用性]
根据本发明的方法允许基质上的非常小的反应区域中的有效杂交，由此显著地节约杂交时间。此外，其创建适用于精确杂交的条件和环境，由此抑制假阳性和假阴性，并且明显改善检测的精度。
根据本发明的设备、系统和方法将用于杂交的快速和精确检测。

Claims (49)

1.一种由具有检测元件的基质生产DNA芯片的方法，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域以及布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极，所述方法包括步骤：
(1)对所述基质执行表面处理；
(2)通过所述相反电极将电场施加到所述反应区域中保持的、包含之前准备的核酸探针的媒质上，由此将所述核酸探针固定到所述电极表面上；和
(3)从所述反应区域中清除过剩的核酸探针。
2.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中步骤(1)意欲使所述基质与所述媒质相容。
3.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中所述反应区域保持滴入或注入其上的所述媒质。
4.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中所述基质是盘状基质。
5.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中在所述盘状基质旋转的同时滴入或注入所述媒质。
6.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中步骤(2)包括通过由施加电场引起的电泳移动所述核酸探针的附加步骤。
7.如权利要求1所述的生产DNA芯片的方法，其中所述电场是高频电场。
8.如权利要求7所述的生产DNA芯片的方法，其中
所述高频电场具有不低于1MV/m电压和不低于1MHz的频率。
9.一种由具有检测元件的基质生产DNA芯片的系统，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域以及布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极，所述系统包括：
用于将包含之前准备的核酸探针的媒质滴入或注入所述反应区域中的装置；和
用于通过所述相反电极将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的装置。
10.如权利要求9所述的用于生产DNA芯片的系统，还包括用于将所述媒质滴入或注入所述反应区域中，并且允许在所述反应区域中保持所述媒质的装置。
11.如权利要求9所述的用于生产DNA芯片的系统，还包括用于从所述反应区域中清除过剩的所述核酸探针的装置。
12.如权利要求9所述的用于生产DNA芯片的系统，其中用于施加电场的所述装置是施加高频电场的装置。
13.如权利要求9所述的用于生产DNA芯片的系统，还包括用于旋转所述基质的装置。
14.如权利要求13所述的用于生产DNA芯片的系统，其中用于滴入或注入的所述装置与所述基质旋转同步地将所述媒质提供到所述反应区域。
15.一种用于检测具有检测元件的基质上的杂交的方法，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域、布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极和在所述反应区域中被固定的核酸探针，所述方法包括步骤：
(1)将包含之前准备的目标核酸的媒质滴入或注入所述反应区域中；
(2)通过所述相反电极将电场施加到所述反应区域中保持的所述媒质；
(3)使所述核酸探针和所述目标核酸之间进行杂交；
(4)将添加物滴入或注入所述反应区域；和
(5)使用特定波长的激励光照射所述反应区域，并且检测所得荧光的强度。
16.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中同时执行步骤(1)和(4)。
17.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中在存在电场的情况下执行步骤(3)。
18.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中在不存在电场的情况下执行步骤(3)。
19.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中在步骤(5)之前进行从杂交区域中清除在所述反应区域存在的过剩目标核酸的步骤。
20.如权利要求19所述的用于检测杂交的方法，其中通过施加将过剩目标核酸吸引到杂交区域外部的电极表面的电场来完成清除过剩目标核酸。
21.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中所述基质具有透射所述激励光的层。
22.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中所述激励光被引导到基质的下侧。
23.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中在基质上一次全部或者在每个区域块上执行用于施加电场的步骤(2)。
24.如权利要求15所述的用于检测杂交的方法，其中在所述基质旋转的同时执行步骤(1)和/或步骤(4)。
25.如权利要求23所述的用于检测杂交的方法，其中在所述基质旋转的同时执行步骤(5)。
26.一种用于检测具有检测元件的基质上的杂交的系统，其中在每个检测元件上配有用于杂交的至少一个反应区域、布置来以便将电场施加到在所述反应区域中保持的媒质的相反电极和在所述反应区域中被固定的核酸探针，所述系统包括：
(1)将包含之前准备的目标核酸的媒质滴入或注入所述反应区域中的装置；
(2)用于通过所述相反电极将电场施加到所述反应区域中保持的所述媒质的装置；
(3)使所述核酸探针和所述目标核酸之间进行杂交的装置；
(4)将添加物滴入或注入所述反应区域的装置；和
(5)使用特定波长的激励光照射所述反应区域，并且检测所得荧光的强度的装置。
27.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，其中所述基质具有透射所述激励光的层。
28.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，其中从与所述基质的反面相对的源发出所述激励光。
29.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，还包括用于控制温度的装置和/或用于控制所述杂交的湿度的装置。
30.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，还包括用于向所述反应区域供水的装置。
31.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，还包括用于旋转所述基质的装置。
32.如权利要求26所述的用于检测杂交的系统，还包括用于在所述基质上定位所述检测元件的伺服控制装置以及用于聚焦的伺服控制装置。
33.一种用于处理在其上具有用于杂交的反应区域的基质的设备，所述设备包括：
(1)用于向已经固定了核酸探针的所述反应区域供应目标核酸的装置；
(2)用于将已经被提供了所述目标核酸的所述基质加热到受控温度的装置；
(3)用于读取所述基质上的杂交状态的装置；和
(4)用于传输所述基质的装置。
34.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，还包括用于向所述基质施加电场的装置。
35.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，其中所述用于读取的装置是用于光学读取的装置。
36.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，其中所述用于传输的装置通过所述用于供应的装置、所述用于加热的装置和所述用于读取的装置连续地传输所述基质。
37.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，其中串联地布置所述用于供应的装置、所述用于加热的装置和所述用于读取的装置。
38.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，其中所述用于供应的装置具有用于加湿的装置。
39.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，还包括：
用于将所述基质引导到所述用于供应的装置的装置；和
用于从所述用于读取的装置中卸下所述基质的装置。
40.如权利要求39所述的用于处理基质的设备，其中所述用于引导所述基质的装置和所述用于卸下所述基质的装置合并到一个单元中。
41.如权利要求39所述的用于处理基质的设备，其中串联地布置所述用于供应的装置、所述用于加热的装置、所述用于读取的装置、所述基质的入口和所述基质的出口。
42.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，还包括用于将溶剂供应到其中固定了核酸探针的所述反应区域中的第二装置。
43.如权利要求33所述的用于处理基质的设备，还包括用于从血液中提取核酸的装置。
44.一种用于处理在其上具有用于杂交的反应区域的基质的方法，所述方法包括步骤：
向已经固定了核酸探针的所述反应区域供应目标核酸；
将已经被提供了所述目标核酸的所述基质加热到受控温度；和
读取所述反应区域中的杂交状态，
其中连续地执行所述步骤。
45.如权利要求44所述的用于处理基质的方法，还包括将电场施加到所述基质的步骤。
46.如权利要求44所述的用于处理基质的方法，其中所述用于温度控制的步骤提供在所述核酸探针和所述目标核酸之间发生杂交的时间段。
47.如权利要求44所述的用于处理基质的方法，其中所述用于读取的步骤是用于光学读取的步骤。
48.如权利要求44所述的用于处理基质的方法，其中通过供应所述核酸的步骤、控制温度的步骤和读取步骤传输所述基质。
49.如权利要求44所述的用于处理基质的方法，其中供应所述核酸的步骤包括加湿。
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