KR20070048713A - Ｄｎａ 칩의 제조 방법과 제조 시스템, 혼성화 검출 방법과검출 시스템, 및 기판 처리 장치와 기판 처리 방법 - Google Patents

Abstract

혼성화를 단시간에 효율적으로 진행시킬 수 있고, 또한 고정밀도의 검출 결과가 얻어지는 DNA 칩 관련 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 혼성화 장소가 되는 반응 영역 (R)과, 상기 반응 영역 (R)에 저류(貯留) 또는 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치된 대향 전극(E₁-E₂ 등)을 적어도 구비하는 검출부 (3)이 배치되어 이루어지는 원반형 기판 (1), 또는 DNA 칩 (10)을 사용하여, 상기 대향 전극을 사용한 전계 인가에 의해 상기 검출용 핵산 (D)를 검출 표면 (U)에 고정화하거나, 검출용 핵산 (D)와 표적 핵산 (T)를 혼성화하거나, 잉여 물질 (B)를 제거함으로써, 혼성화를 단시간에 효율적으로 진행시키고, 또한 고정밀도의 검출 결과를 얻는다.

DNA 칩, 혼성화, 대향 전극, 기판, 표적 핵산

Description

ＤＮＡ 칩의 제조 방법과 제조 시스템, 혼성화 검출 방법과 검출 시스템, 및 기판 처리 장치와 기판 처리 방법 {DNA CHIP MANUFACTURING METHOD, MANUFACTURING SYSTEM, HYBRIDIZATION DETECTION METHOD, DETECTION SYSTEM, SUBSTRATE TREATMENT DEVICE, AND SUBSTRATE TREATMENT METHOD}

본 발명은 DNA 칩에 관한 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, DNA 칩의 제조 방법과 제조 시스템, 혼성화 검출 방법과 검출 시스템, 및 기판 처리 장치와 기판 처리 방법에 관한 것이다.

1970년대경에 개발된 혼성화를 검출하기 위한 어세이 기술에서는, 니트로셀룰로오스막 등의 다공막 재료, 방사성 표지 기술, 오토라디오그래피 기술 등이 주로 사용되었다.

그러나, 최근에 마이크로어레이 기술에 의해 소정의 DNA가 미세 배열된, 소위 DNA 칩 또는 DNA 마이크로어레이(이하, 본원에서는 「DNA 칩」이라 총칭함)라 불리는 바이오어세사용 집적 기판이 유전자의 변이 해석, SNPs(일염기 다형) 분석, 유전자 발현 빈도 해석 등에 사용되게 되어 약의 개발, 임상 진단, 약리 제노믹스, 진화의 연구, 법의학 및 그 밖의 분야에서 광범위하게 활용되기 시작하였다.

이 「DNA 칩」은 유리 기판이나 실리콘 기판 상에 다종ㆍ다수의 DNA 올리고 쇄나 cDNA(complementary DNA) 등이 집적되어 있기 때문에, 혼성화의 망라적 해석이 가능해지는 점이 특징이다.

이 DNA 칩에 의한 해석 방법의 일례를 간결하게 설명하면, 유리 기판이나 실리콘 기판 상에 보유된 DNA 프로브에 대하여 세포, 조직 등으로부터 추출한 mRNA를 역전사 PCR 반응 등에 의해서 형광 프로브 dNTP를 조합하면서 PCR 증폭시키고, 상기 기판 상에서 혼성화를 행한 후에, 소정의 검출기에서 형광 측정을 행하는 방법이다.

이 DNA 칩을 제조하기 위한 기술은 현재, 반도체 노광 기술을 사용한 포토리소그래피(photolithogrphy), 압전 기술(piezoelectric technology) 등의 잉크 젯팅(ink-jetting)을 사용한 기술, 메카니컬 마이크로스포팅(mechanical microspotting) 등의 기술을 구사하여 행해졌고, 이들 기술에는 일장 일단이 있다고 되어 있다. 그러나, 어느 기술에서도 시료의 확산이나 흡수가 일어나지 않으면서 또한 시료가 미량으로 충분한 등의 이유 때문에, 표면이 평활하며 균일한 비다공성 유리제 또는 합성 수지제 기판 표면을 사용하는 것을 전제로 하고 있다.

이 「DNA 칩」은 대략 2개의 유형으로 크게 구별할 수 있다. 제1 유형은 상기 포토리소그래피 기술을 사용하여 소정의 기판 상에 직접 올리고뉴클레오티드를 합성해가는 것이며, 아피메트릭스사(Affymetrix사)에 의한 것이 대표적이다(예를 들면, 일본 특허 공표 (평)4-505763호 공보 참조). 이 종류의 칩은 집적도는 높지만, 기판 상에서의 DNA 합성에는 한계가 있으며 수십 염기 정도의 길이이다.

제2 유형은 「스탠포드 방식」이라고도 불리는 것으로, 앞이 분할된 핀 (split pin)을 사용하여 미리 준비된 DNA를 기판 상에 분주ㆍ고상화해감으로써 제조되는 것이다(예를 들면, 일본 특허 공표 (평)10-503841호 공보 참조). 이 종류의 칩은 집적도는 전자에 비해 낮지만, 1 kb 정도의 DNA 단편을 고상화할 수 있다는 이점이 있다.

다음에, 현재 이미 제안되어 있는 DNA 칩의 대부분은 대략 일본 특허 공개 제2000-60554호 공보(특히 청구항 1, 도 1 참조)에 개시되어 있는 형태의 DNA 칩과같이, 직사각형의 기판 상을 구획나눈 구성의 것이 대부분이고, 기판 상의 각 구획이 프로브를 보유하며, 거기서 혼성화가 진행된다. 이 일본 특허 공개 제2000-60554호 공보에는, 구획에 겔을 도입하여 전기 영동에 의해 시료 폴리뉴클레오티드를 이동시키는 기술도 개시되었다.

DNA 칩 상의 소정의 반응 영역에서 진행된 혼성화의 검출 또는 판독에 관련된 작업은, 현재 핵산 분자에 표지되는 형광 색소 물질로부터 얻어지는 형광을 검출(형광 스캐닝)하는 시스템 등을 사용하는 것이 일반적이다.

이 형광 검출 시스템은 상기 형광 물질에 소정의 여기광을 조사하여 얻어지는 형광을 검출하는 시스템이다. 이 시스템에 따르면, 이전의 방사성 물질 대신에 형광 물질을 사용하기 때문에 검출의 신속화, 정밀도 및 안전성의 향상을 달성할 수 있게 된다.

형광의 검출 작업에서는, 공촛점 스캐닝 장치(confocal scanner)나 CCD 카메라를 사용한 이미징 등의 기술이 사용되고 있다. DNA 칩에서 방출된 형광이 소정의 검출 장치에 의해서 디지탈 출력으로 변환된다. 또한, 이에 이어서 데이터 파 일의 정량과 해석이 행해진다.

다음에, 하전되어 존재하는 물질에 대한 전계의 작용에 관련된 기술이 알려져 있다. 구체적으로는, 이중가닥 핵산 분자는 액상 중에서 전계의 작용을 받으면 신장 또는 이동하는 것으로 알려져 있다. 그 원리는, 골격을 이루는 인산 이온(음전하)과 그의 주변에 있는 물이 이온화한 수소 원자(양전하)에 의해 이온 구름(曇)을 만들었다고 생각되고, 이들 음전하 및 양전하에 의해 생기는 분극 벡터(쌍극자)가 고주파 고전압의 인가에 의해 전체적으로 한 방향을 향하고, 그 결과로서 신장되며, 또한 불균일 전계가 인가된 경우, 전기력선이 집중되는 부위를 향해 이동한다(Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin-ichi Tazawa, Osamu Kurosawa and Masao Washizu: "Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy", IEEE Transaction on Industrial Applications, Vol.34, No.1, P75-83(1998) 참조).

또한, 수십 내지 수백 ㎛의 갭을 갖는 미세 전극 중에 DNA 용액을 놓고. 여기에 1 MV/m, 1 MHz 정도의 고주파 전계를 인가하면, 랜덤 코일형으로 존재하는 DNA에 유전 분극이 생기고, 그 결과 DNA 분자는 전계와 평행하게 직선형으로 늘어난다. 또한, 「유전 영동」이라 불리는 전기 역학적 효과에 의해서, 분극된 DNA는 자발적으로 전극단에 끌어당겨지고, 전극 엣지에 그의 일단(一端)을 접촉한 형태로 고정된다(와시즈 마사오, 「보면서 행하는 DNA 핸들링」, 가시화 정보 Vol.20 No.76(2000년 1월) 참조).

또한, 전기적 효과를 사용하는 DNA 칩 기술로서는, 예를 들면 DNA 프로브에 직류 전압을 인가함으로써, 상보쇄를 형성한 DNA와 상보쇄를 형성하지 않은 DNA를 분리하거나 늘어나게 하거나 하는 생체 고분자 검출 장치가 제안되었다(일본 특허 공개 제2002-168864호 공보(특히, 단락 0015, 도 7 참조) 참조). 또한, 전극 핀에 올리고뉴클레오티드가 고정된 구성을 구비하는 DNA 칩도 제안되었다(일본 특허 공개 제2001-241315호 공보 참조).

현재 제안되어 있는 다양한 DNA 칩 기술은, 단적으로 말하면 물질 사이의 상호 작용의 장, 즉, 혼성화 장소를 제공하는 반응 영역을 기판 상에 미리 설정해두고, 이 반응 영역 중에 프로브 DNA 등의 검출용 핵산을 고정해둠으로써, 이 검출용 핵산과 상보적인 표적 핵산 사이의 상호 작용인 혼성화를 해석하는 기술이라고 할 수 있다.

그러나, 종래의 DNA 칩 기술에 있어서는 그 정도의 차는 있으며, 혼성화의 효율이 상기 기술의 보급 확대에는 아직 불만족스러운 수준이라는 문제가 있다. 이는 주로, (1) 핵산의 고차 구조가 둥글게 되거나 꼬인 상태(랜덤 코일 상태)가 되기 쉽기 때문에, 혼성화시에 소위 입체 장해가 발생하여 염기 부분이 상보 결합하기 어렵다고 하는 점, (2) 검출용 핵산 주변이 기판 표면에 표적 핵산 등이나 검출 관련 물질이 부착되어 혼성화에 장애가 되는 점 등이 주원인으로 되어 있다. 이들 원인을 해결할 수 있다면, DNA 칩을 사용한 어세이 시간을 대폭 단축화할 수 있다.

또한, 종래의 DNA 칩 기술에서는 미스 혼성화(mishybridization)의 발생 등에 의해서 의양성(擬陽性; false positive)이나 위음성(僞陰性; false negative)의 발생이 무시할 수 없는 정도로 자주 발생한다는 문제를 안고 있다. 즉, 종래의 DNA 칩 기술에 있어서는 검출 정밀도의 향상이 필요하다.

이 검출 정밀도의 향상을 도모하기 위해서는, 우선 첫째로, 혼성화의 정밀도를 높일 수 있는 반응장의 조건이나 환경을 개발하는 것이 근본적으로 필요하다고 생각된다. 둘째로, 종래의 DNA 칩 기술에서는 검출시 장애가 되는 불필요한 물질(예를 들면, 혼성화되지 않은 유리 상태의 단일가닥 핵산 등)을 검출 작업 전에 소정의 수용액으로 반응장에서 세정 제거하는 작업이 필수이지만, 이 세정 제거 작업이 검출 정밀도에 바람직하지 않은 영향을 주는 경우가 있기 때문에, 이 문제를 해결해야만 한다.

또한, 이후에 혼성화의 망라적 해석의 필요성이 더욱 확대되어 가면, 기판 상의 정보 집적량의 증가, 다수 또는 다양한 유전자의 동시 해석, 해석 기술의 간이화, 해석 장치나 칩 기판 등의 저비용화에 기여할 수 있는 신규 기술이 더욱 요구될 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명은 기판 상에 유전자 정보를 효율적으로 집적(고정화)하는 기술이나, 혼성화를 단시간에 효율적으로 진행시킬 수 있으면서 또한 고정밀도의 검출 결과가 얻어지는 기술 등을 포함하는 DNA 칩의 제조 방법과 제조 시스템, 혼성화 검출 방법과 검출 시스템, 및 기판 처리 장치와 기판 처리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

<발명의 개시>

본 발명에서는 이하에 설명하는, (1) DNA 칩의 제조 방법, (2) DNA 칩의 제조 시스템, (3) 혼성화 검출 방법, (4) 혼성화 검출 시스템, (5) 기판 처리 장치, (6) 기판 처리 방법을 제공한다.

(1) DNA 칩의 제조 방법.

첫째로, 본 발명에서는 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 및 상기 반응 영역에 저류(貯留) 또한 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치되는 대향 전극을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 이루어지는 기판을 사용하여 행하는 「DNA 칩의 제조 방법」을 제공한다.

구체적으로는, 적어도 기판의 표면 처리를 행하는 공정, 상기 반응 영역에 저류 또는 보유되며 미리 제조된 검출용 핵산을 포함하는 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행함으로써, 상기 전극 표면에 상기 검출용 핵산을 고정하는 공정, 및 잉여의 상기 검출용 핵산을 상기 반응 영역으로부터 제거하는 공정을 행하는 DNA 칩의 제조 방법을 제공한다.

기판의 표면 처리를 행하는 공정은 예를 들면, 기판에 친매성 가공을 행하는 공정이다. 또한, 상기 매질은 상기 반응 영역에 적하 또는 주입함으로써 저류 또는 보유된다.

상기 기판을 회전시키면서 상기 매질의 적하 또는 주입을 행하도록 할 수도 있다. 전계 인가에서는, 이 전계 인가에 의한 유전 영동에 기초하여 검출용 핵산을 이동시키는 공정을 포함한다. 또한, 이 전계 인가는 고주파 전계이고, 또한 이 고주파 전계는 1 MV/m 이상 및 1 MHz 이상이 바람직하다.

(2) DNA 칩의 제조 시스템.

둘째로, 본 발명에서는 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 및 상기 반응 영역에 저류 또한 보유된 매질에 전계 인가 가능하게 배치되는 대향 전극을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 이루어지는 기판을 사용하는 DNA 칩의 제조 시스템을 제공한다.

구체적으로는, 미리 제조된 검출용 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 수단, 및 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 대해 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행하는 수단을 적어도 구비하는 DNA 칩의 제조 시스템을 제공한다.

또한, 동일한 시스템에서는, 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입으로써 저류 또는 보유하기 위한 스포팅 수단이나, 상기 반응 영역에 존재하는 잉여의 상기 검출용 핵산을 상기 반응 영역으로부터 제거하는 수단을 구비한다. 상기 전계 인가 수단은 고주파 전계 인가 수단을 바람직하게 채용할 수 있고, 상기 기판은 적합하게는, 예를 들면 원반형 기판이고, 이 원반형 기판을 회전시키는 수단을 구비하도록 할 수도 있다. 또한, 적하 또는 주입하는 수단은 기판의 회전과 동기(synchronism)로 상기 반응 영역에 매질을 공급하도록 할 수도 있다.

(3) 혼성화 검출 방법.

셋째로, 본 발명에서는 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 상기 반응 영역에 저류 또한 보유된 매질에 전계 인가 가능하게 배치되는 대향 전극, 및 상기 반응 영역 중에 고정된 검출용 핵산을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 이루어지는 기판을 사용하는 「혼성화 검출 방법」을 제공한다.

구체적으로는, 적어도 미리 제조된 표적 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 공정, 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행하는 공정, 상기 검출용 핵산과 상기 표적 핵산 간에 혼성화를 진행시키는 공정, 상기 반응 영역에 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 공정, 및 소정 파장의 여기광을 상기 반응 영역에 조사하여 얻어지는 형광 강도를 검출하는 공정을 행하는 「혼성화 검출 방법」을 제공한다. 또한, 상기 전계 인가를 행하는 공정에서 전계 인가는 상기 기판 전체에 대해 일괄적으로, 또는 블록 영역마다 행할 수도 있다.

이 방법에서는 「표적 핵산을 포함하는 매질을 반응 영역에 적하 또는 주입하는 공정」과 「이 반응 영역에 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 공정」을 동시에 행하도록 하여, 공정을 간략화할 수도 있다. 혼성화는 전계 인가 상태에서 행하도록 할 수도 있고, 경우에 따라서는 전계 오프 상태에서 행할 수도 있다.

또한, 적어도 검출 공정을 행하기 전의 단계에서, 반응 영역 중에 존재하는 잉여의 표적 핵산을 혼성화 영역으로부터 제거하는 공정을 행하도록 하여 검출 정밀도를 향상시킬 수도 있다. 이 제거 공정은 전계 인가에 의해 혼성화 영역 밖의 전극 표면으로 잉여의 표적 핵산을 끌어당기는 방법일 수도 있다.

검출 등에 사용되는 여기광은, 적합하게는 기판의 이면측에서 조사하도록 고안한다. 본 방법에서 사용되는 기판을 회전시키면서, 미리 제조된 표적 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 공정이나 반응 영역에 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 공정, 또는 소정 파장의 여기광을 상기 반응 영역에 조사하여 얻어지는 형광 강도를 검출하는 공정을 행한다.

(4) 혼성화 검출 시스템.

넷째로, 본 발명에서는 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 상기 반응 영역에 저류 또한 보유된 매질에 전계 인가 가능하게 배치되는 대향 전극, 및 상기 반응 영역 중에 고정화된 검출용 핵산을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 이루어지는 기판을 사용하는 「혼성화 검출 시스템」을 제공한다.

구체적으로는, 적어도 미리 제조된 표적 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 수단, 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행하는 수단, 상기 검출용 핵산과 상기 표적 핵산 간에 혼성화를 진행시키는 수단, 상기 반응 영역에 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 수단, 및 소정 파장의 여기광을 상기 반응 영역에 조사하여 얻어지는 형광 강도를 검출하는 수단을 구비하는 혼성화 검출 시스템을 제공한다.

상기 기판은 상기 여기광을 투과하는 층을 구비하도록 하고, 상기 여기광의 광원은 적합하게는 기판의 이면측에 배치한다. 이에 따라, 기판 상측 영역에는 매질의 적하 또는 주입 장치군을 배치하고, 동일한 하측 영역에는 혼성화 검출에 관련되는 광학적 장치군을 배치할 수 있다. 그 결과, 검출 장치 전체의 컴팩트화나 장치 구성의 간략화를 달성할 수 있다.

또한, 본 시스템에서는 상기 혼성화의 온도 제어 수단 및/또는 습도 제어 수단이나 상기 반응 영역에 수분 등의 용매를 보급하는 수단을 설치하여 매질의 건조를 방지할 수도 있다.

상기 기판의 원반형 기판의 회전 수단을 갖도록 연구하고, 또한 이 기판의 상기 검출부의 위치 결정용 서보 수단 및 포커스 서보 수단을 설치하도록 한다.

(5) 기판 처리 장치.

다섯째로, 본 발명에서는 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역을 표면에 갖는 기판을 처리하기 위한 장치로서, 검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 표적 핵산을 공급하는 공급 수단, 상기 표적 핵산이 공급된 상기 기판의 온도 제어를 행하기 위한 가열 수단, 상기 기판의 혼성화 상황을 판독하는 판독 수단, 및 상기 기판을 반송하는 반송 수단을 갖는, 기판 처리 장치를 제공한다. 본 장치에서는 또한, 상기 기판에 전계를 인가하는 수단을 구비하도록 고안하고, 상기 판독 수단으로서는 예를 들면, 광학적 판독 수단을 바람직하게 채용 가능하다.

또한, 본 장치에서는 기판이 상기 반송 수단에 의해서 상기 공급 수단과 상기 가열 수단과 상기 판독 수단 사이를 연속적으로 반송되도록 하거나, 상기 공급 수단과 상기 가열 수단과 상기 판독 수단을 직렬로 배치하거나, 상기 공급 수단에 가습 수단을 설치하도록 할 수도 있다.

다음에, 본 장치에서는 상기 공급 수단을 향해 상기 기판을 도입하기 위한 기판 도입 수단, 및 상기 판독 수단으로부터 상기 기판을 배출하기 위한 기판 배출 수단을 설치하고, 또한 기판 도입 수단과 기판 배출 수단을 공통의 수단으로 할 수도 있다. 또한, 상기 공급 수단, 상기 가열 수단, 상기 판독 수단, 상기 기판의 도입구, 및 상기 기판의 배출구를 직렬로 배치하도록 고안할 수도 있다.

또한, 본 장치에서는 검출용 핵산이 고정된 (기판의) 반응 영역에 대해 용매를 공급하는 제2 공급 수단이나, 혈액으로부터 핵산을 추출하는 추출 수단을 설치할 수도 있다.

(6) 기판 처리 방법.

여섯째로, 본 발명에서는 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역을 표면에 갖는 기판을 처리하기 위한 방법이며, 검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 표적 핵산을 공급하는 핵산 공급 공정, 상기 표적 핵산이 공급된 상기 기판의 온도를 제어하는 온도 제어 공정, 및 상기 반응 영역에서의 혼성화 상태를 판독하기 위한 판독 공정을 가지고, 상기 각 공정을 차례로 연속적으로 행하도록 고안한 기판 처리 방법을 제공한다.

또한, 본 방법에 있어서는 상기 기판에 전계를 인가하는 공정을 행하도록 할 수도 있다. 예를 들면, 핵산 공급 공정의 단계나 혼성화를 진행시키는 단계 등에서 전계 인가를 행함으로써, 혼성화 효율의 향상이나 혼성화 검출 정밀도의 향상에 도움이 되도록, 핵산 분자에 대하여 전기 역학적 효과를 부여할 수 있다.

상기한 온도 제어 공정에서는 예를 들면, 혼성화의 최적 온도를 설정하는 공정으로 사용하여 검출용 핵산과 표적 핵산 간의 혼성화를 진행시킬 수 있다.

또한, 본 방법에서는 판독 공정을 광학적 판독 공정으로 하거나, 핵산 공급 공정과 온도 제어 공정과 판독 공정의 각 공정 사이에서 기판이 반송되도록 하거나, 또는 핵산 공급 공정의 단계에서 가습을 행하거나 하도록 고안할 수 있다.

여기서, 본 발명에서 사용하는 주된 기술 용어를 정의한다.

「검출용 핵산」이란, 반응 영역에 저류 또는 보유된 매질 중에 고정 또는 유리 상태로 존재하고, 상기 핵산 분자와 특이적으로 상호 작용하는 상보적 염기 서열을 갖는 핵산 분자를 검출하기 위한 탐침(검출자)으로서 기능하는 핵산 분자이다. 대표예는 DNA 프로브 등의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 「표적 핵산」이란, 상기 검출용 핵산과 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산 분자이다.

「핵산」이란, 푸린 또는 피리미딘 염기와 당이 글리코시드 결합한 뉴클레오시드의 인산에스테르 중합체(뉴클레오티드쇄)를 의미하고, 프로브 DNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 푸린 뉴클레오티드와 피리미딘 뉴클레오티드가 중합된 DNA(전장 또는 그의 단편), 역전사에 의해 얻어지는 cDNA(c프로브 DNA), RNA, 폴리아미드 뉴클레오티드 유도체(PNA) 등을 널리 포함한다.

「혼성화」는 상보적인 염기 서열 구조를 구비하는 사슬 간의 상보쇄(이중가닥) 형성 반응을 의미한다. 「미스 혼성화」는 정규가 아닌 상기 상보쇄 형성 반응을 의미하고, 본 발명에서는 종종 「미스하이브리드」라고 약칭한다.

「반응 영역」은 혼성화, 그 밖의 상호 작용의 반응 장소를 제공할 수 있는 영역이고, 예를 들면 액상이나 겔 등을 저류할 수 있는 웰 형상을 갖는 반응 장소를 들 수 있다. 이 반응 영역에서 행해지는 상호 작용은 본 발명의 목적이나 효과에 부합되는 한, 좁게 한정되지 않는다.

「대향 전극」은 전극면이 마주 본 상태로 배치되는, 한쌍 이상의 전극을 의미한다. 「대향축」이란, 대향하는 2개의 전극면의 중심끼리를 연결하는 직선에 의해 형성되는 축을 의미한다. 「교차」란, 교점을 형성하는 동일 평면상에서의 교차의 경우나, 교점을 형성하지 않고 입체 교차하는 경우를 모두 포함하고, 교차하는 각도에 대해서는 직교하는 각도 이외에도, 본 발명의 목적이나 효과가 얻어지는 구성이라면 채용할 수 있다.

「잉여 물질」이란, 반응 영역 중에 존재하는 프로브 DNA 등의 검출용 핵산의 잉여의 것이나, 상기 검출용 핵산과 상보적인 염기 서열 부분을 구비하는 표적 핵산 중의 잉여의 것, 또는 혼성화 결과 얻어지는 상보쇄에 삽입 결합되는 특성을 구비하는 소위 「인터칼레이터」 중의 잉여의 것 등이 포함된다.

「인터칼레이터(intercalator)」는 이중가닥 핵산에 삽입 결합 가능한 형광 표지된 물질이고, 혼성화 검출에 사용되는 물질이다. 예를 들면, POPO-1이나 TOTO-3을 사용할 수 있다.

「입체 장해(steric hindrance)」는 분자내의 반응 중심 등의 근방에 부피가 큰 치환기의 존재나 반응 분자의 배위나 입체 구조(고차 구조)에 의해 반응 상대 분자의 접근이 곤란해짐에 따라서, 원하는 반응(본원에서는 혼성화)이 일어나기 어려워지는 현상을 의미한다.

「유전 영동」은 전계가 일정하지 않은 장에서 분자가 전계가 강한 쪽으로 구동하는 현상이고, 교류 전압을 건 경우에도 걸린 전압의 극성 반전에 따라서 분극 극성도 반전하기 때문에, 직류의 경우와 동일하게 구동 효과가 얻어진다(감수ㆍ하야시 아키라, 「마이크로머신과 재료 기술(씨엠씨 발행)」, P37 내지 P46ㆍ제5장ㆍ세포 및 DNA의 조작 참조).

「DNA 칩」은 DNA 프로브 등의 핵산이 고정화되어 미세 배열된 상태의 혼성화 검출용 기판을 널리 의미하고, DNA 마이크로어레이의 개념도 포함한다.

본 발명에 따르면, 기판에 유전자 정보를 효율적으로 집적(고정화)할 수 있고, 또한 혼성화를 단시간에 효율적으로 진행시켜 검출 정밀도를 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 채용할 수 있는 원반형 기판 (1)의 바람직한 실시 형태의 일례를 나타내는 외관도이다.

도 2는 동일한 기판 (1)의 기본적인 층 구조를 나타내는 부분 단면도이다.

도 3은 검출부 (3)의 반응 영역 (R)내에 형성된 검출 표면 (U) 부분의 확대도이다.

도 4는 한 조의 대향 전극의 일배치예를 나타내는 검출부 (3)의 단면도이다.

도 5는 한 조의 대향 전극의 다른 배치예를 나타내는 검출부 (3)의 단면도이다.

도 6은 한 조의 대향 전극의 또다른 배치예를 나타내는 검출부 (3)의 단면도이다.

도 7은 대향축이 직교하는 두 조의 대향 전극의 일배치예를 나타내는 검출부 (3)의 단면도이다.

도 8은 검출부 (3)내에 주사 전극 (C)군이 조작하는 전극 배치 구성을 간략하게 나타내는 도면이다.

도 9는 패터닝 형성된 검출 표면 (U)의 구성을 나타내는 도면이다.

도 10은 돌기형 전극이 배치된 검출부 (3)의 실시 형태를 나타내는 도면이다.

도 11은 대향 전극에 대한 전기공급용 배선 (7)의 실시 형태의 일례를 나타내는 도면이다.

도 12는 DNA 칩 (10)의 제조 방법의 일공정예의 플로우를 나타낸 도면이다.

도 13은 동일한 제조 방법의 다른 공정예의 플로우를 나타낸 도면이다.

도 14는 본 발명에 관한 시스템의 실시 형태예를 나타내는 블록도이다.

도 15는 동일한 시스템의 구성 요소를 일체화한 기판 처리 장치의 바람직한 실시 형태의 일례를 간략하게 나타내는 개념도이다.

도 16은 DNA 칩의 제조 및/또는 혼성화 검출을 행할 때에 채용 가능한 기판 처리 시스템의 개념도이다.

도 17은 혼성화 검출 방법의 공정 플로우의 일례를 나타내는 도면이다.

도 18은 동일한 방법의 다른 공정 플로우를 나타내는 도면이다.

도 19는 고주파 전계 (W₁)을 인가한 직후에, 저주파 전계 (W₂)를 인가한 경우의 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

도 20은 도 19에 있어서의 저주파 전계 (W₂) 인가 부분을 저주파의 직사각형 교류 전계 (W₃)으로 한 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

도 21은 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 전계를 0으로 한 전계 인가예를 나 타내는 파형도이다.

도 22는 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 직류(DC) 전계 (W₄)를 인가한 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

도 23은 고주파 전계 (W₁)을 인가하기 전에 직류 전계 (W₄)를 인가한 전계 인가예의 파형도를 나타낸다.

도 24는 직류 성분도 동시에 인가하도록 한 고주파 전계 (W₅)를 인가한 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

도 25는 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 직류 성분도 동시에 인가된 저주파 전계 (W₆)을 인가하도록 한 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

도 26은 직류 성분을 동시에 인가한 고주파 전계 (W₅)를 인가한 후에, 직류 성분을 동시에 인가한 저주파 전계 (W₆)을 인가한 전계 인가예를 나타내는 파형도이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대하여 첨부 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 첨부 도면에 나타내어진 각 실시 형태는 본 발명에 따른 물질이나 방법의 대표적인 실시 형태의 일례를 나타낸 것이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되지 않는다.

<1. 본 발명을 실시할 때에 사용하는 바람직한 「기판」에 대하여>

(1) 기판의 기본 구성.

본 발명에서 채용할 수 있는 기판은 CD(Compact Disc), DVD(Digital Versatile Disc), MD(Mini Disc) 등의 광정보 기록 매체와 동일한 기재로 형성할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기판의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 원반형을 이루는 기판(디스크)이 특히 바람직하다. 이하의 설명에서는, 원반형 기판을 채용한 경우를 대표예로서 설명한다.

도 1에는 본 발명에서 바람직하게 채용할 수 있는 기판의 1 실시 형태인 원반형 기판의 바람직한 실시 형태가 예시되어 있다. 이 도 1에 나타내어진 원반형 기판 (1)(이하, 간단하게 「기판 (1)」이라 함)은 광투과성의 석영 유리나 실리콘, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 등의 합성 수지, 바람직하게는 사출 성형 가능한 합성 수지로 원반형으로 성형한다. 기판 (1)을 저가인 합성 수지를 사용하여 성형함으로써, 종래 사용되었던 유리 칩에 비해 낮은 운전 비용을 실현할 수 있다.

또한, 기판 (1)의 중심 부분에는, 도 1 중에 부호 2로 나타내어진 소정 직경의 구멍(또는 관통되지 않은 구멍일 수도 있음)을 형성해둘 수도 있다. 이 구멍 (2)에 후술하는 스핀들(부호 9) 등의 처킹(chucking) 지그(jig)를 삽입함으로써, 상기 기판 (1)을 유지하거나 회전시키거나 할 수 있다.

또한, 상기 구멍 (2)에 대해서는, 전기공급용 통전 지그(도시하지 않음)를 삽착함으로써, 기판 (1)에 배치된 대향 전극군(후술)의 전부나 또는 선택된 일부에 대하여 전계를 인가하는 구성으로 할 수도 있다.

도 2에는 기판 (1)의 기본적인 층 구조를 나타내는 부분 단면도가 나타나 있 다. 기판 (1)은 반사층 (11) 및 소정 파장 영역의 빛을 투과하는 광투과층 (12)를 기본적으로 구비하고 있다. 보다 바람직하게는 도 2에 나타내어진 예와 같이, 하층측에 광투과층 (12), 상층측에 반사층 (11)을 갖도록 고안한다. 이 고안에 의해, 기판 (1)의 하측(이면측)으로부터의 광 조사에 의해서 검출 작업 등을 실시할 수 있다.

또한, 상기 층 구성에 의해 기판 (1) 주변에 필요한 장치군의 배치 설계를 행하는 경우에 있어서는, 기판 (1)의 상측에는 시료 용액 등의 적하 또는 주입에 관련된 장치를 배치하고, 기판 (1)의 하측에는 검출(판독)용 광학적 장치군을 통합하여 배치할 수 있다.

기판 (1)의 반사층 (11)은 수 nm 내지 수십 nm 정도 범위의 막 두께로 형성한다. 이 반사층 (11)이 단층의 금속 재료 또는 단층의 무기 재료로 이루어지는 경우에는, 후술하는 서보 동작용 레이저 광(도 10의 부호 V 참조)에 대한 반사율을 5 ％ 이상, 50 ％ 이하의 범위로 하는 것이 바람직하다.

이것은, 기판 (1)에 대하여 보다 안정한 서보 동작(포커스 서보 및 트랙킹 서보)을 행하기 위해서 요구되는, 보다 높은 레이저 광 반사율과 형광 강도 측정을 위해 필요한 여기광 및 형광에 대한 투광성을 양립시킬 수 있는 바람직한 범위이기 때문이다.

또한, 상기한 반사율의 범위를 채용함으로써, 기판 (1)의 표면에 존재하는 물질의 굴절률이 기판 (1)의 굴절률과 매우 가까운 경우에도, 기판 (1) 상에서 반사된 서보용 레이저 광(도 10의 부호 V 참조)에 대한 방해를 완전히 제거할 수 있 다.

반사층 (11)은 복수개의 무기 재료를 적층하며, 파장 선택성이 있는 반사막일 수도 있다. 이 경우에서는, 서보 동작용 레이저 광(도 10의 부호 V 참조)만을 반사시키는 것이 가능해지기 때문에, 형광 강도 측정용 여기광이나 형광의 손실을 우려할 필요가 없어진다.

즉, 상기 반사막을 채용하면, 형광 강도 측정에 대한 영향을 우려하지 않아도 되고, 레이저 광 반사율이 50 ％를 넘는(예를 들면, 반사율 90 ％ 이상의) 반사층 (11)을 형성할 수 있다.

다음에, 기판 (1)의 광투과층 (12), 또는 이 광투과층 (12)에 적층된 합성 수지(예를 들면, 감광성 폴리이미드 수지층) 등을 포함하는 반응 영역 형성층(도시하지 않음)에는, 공지된 광디스크 마스터링 기술에 의해서 DNA 프로브 등의 검출용 핵산과 표적 핵산 간의 혼성화 장소를 제공하는, 예를 들면 웰형의 반응 영역 (R)과, 상기 반응 영역 (R)을 향하도록 배치시킨 한쌍 이상의 대향 전극(미소하기 때문에 도 1에서는 도시 생략) 또는 하나 이상의 전극을 적어도 구비하는 검출부 (3)을 다수개 배치해둔다(도 1 참조).

또한, 광투과층 (12)는 2층 구조로 할 수도 있다(도시하지 않음). 상층측의 광투과층을, 매질의 굴절률 및 하층측의 광투과층의 굴절률보다 높은 굴절률을 갖 도록 하면, 후술하는 포커스 서보 제어 및 위치 결정 서보 제어를 정확하면서 또한 고속으로 행할 수 있다.

또한, 각 검출부 (3)에서는 검출 영역(반응 영역 (R)의 일부에 상당)과 서보 영역을 형성한다. 또한, 상기 서보 영역에는 반경 위치 제어용 서보 마크, 및 각 검출부 (3)의 기판 (1) 상의 번지 정보를 제공하는 어드레스 마크를 설치해 두도록 한다.

이 검출부 (3)을 기판 (1) 상에 주위(周) 방향 또는 스파이럴형으로 배치하면, 상기 검출 영역, 서보 영역의 순서로 잇달아 형성되고, 서보 영역은 불연속 상태가 되기 때문에, 광 디스크 기술 분야에서 말하는 샘플 서보 방식으로 할 수 있다.

또한, 서보 마크와 어드레스는 관용의 광디스크 마스터링 공정에 의해 형성할 수 있다. 즉, 기판 (1)을 광 디스크로서 생각한 경우, 적하 및 검출 위치인 반응 영역 (R)을 사용자 데이터 영역이라고 생각할 수 있다. 다른 영역은 샘플 서보 방식 등에 의해 동기 피트를 배열하고, 또한 트랙킹 서보로서도 사용할 수 있으며, 또한 직후에 어드레스부(기판 (1) 상의 지리적인 번지)를 삽입함으로써 위치 정보를 제공할 수 있다.

어드레스부는 선두 패턴인 섹터 마크로부터 시작하여, 실제로 회전하고 있는 기판 (1)의 회전 위상을 제공하는 VFO(Variable Frequency Oscillator)와 어드레스 데이터의 개시 위치를 제공하는 어드레스 마크와 트랙과 섹터의 번호가 포함된 ID(Identifer) 등을 조합할 수 있다.

기판 (1)의 반경 방향의 정보는, 각각 반경 방향으로 1/4 트랙+와 -방향에 위치하는 트랙킹 마크로부터의 신호 수준의 편차분에 의한 파인 에러 신호와 어드레스 마크로부터 얻어지는 트랙 위치 정보에 기초한다.

이 트랙 위치 정보를 사용하여, 기판 (1) 전체를 반경 스테이지에 장착하여 회전 구동함으로써, 매질 공급용 토출 헤드나 검출용 광 픽업을 행하는 광학 헤드의 위치 결정을 행할 수 있다.

토출 헤드나 광학 헤드의 위치 결정 동작에 따른 제어는, 반경 스테이지에 장착되어 회전하는 기판 (1)의 판독측에서 광 픽업에 의해 얻어진 재생 신호로부터의 어드레스ㆍ트랙킹 에러 신호 및 포커스 에러 신호에 기초하여 행할 수 있다.

다음에, 본 발명에서 사용되는 기판 (1)의 표면은 미리 친매성 가공에 기초하는 표면 처리를 실시하도록 한다. 기판 (1)의 표면 상에 있어서, 소수성인 표면 부분과 친수성인 표면 부분을 목적에 따라서 구별하여 형성함으로써 시료 수용액의 손실을 방지할 수 있고, 또한 원하는 생체 물질을 검출 표면 영역으로 원활하게 유도할 수 있는 등의 효과를 얻을 수 있다.

(2) 「검출부 (3)」의 구성.

검출부 (3)은 기판 (1) 상에 다수 배열된 미소한 영역이다. 검출부 (3)에는 시료가 함유된 수용액을 저류하거나, 겔(예를 들면, 아가로스 겔)을 보유하거나 하여, 혼성화 장소를 제공하게 되는 반응 영역 (R)(예를 들면 웰 형상의 미소 영역)이 설치되어 있다. 또한, 이 반응 영역 (R)의 매질의 증발을 방지하기 위해서, 반응 영역 (R)의 주변에서 수분의 보급을 행할 수 있는 구성으로 할 수도 있다.

이 검출부 (3)은 어세이의 목적에 따라서 그룹을 나누기 쉽도록 기판 (1) 상에 배열할 수 있다. 예를 들면, 원반형을 이루는 기판 (1)에서는 주위 방향, 스파이럴형 또는 방사형으로 검출부를 소정 간격으로 정연하게 배열시켜 두는 것이 가 능해진다. 예를 들면, 사용되는 시료 물질의 종류나 유전자의 차이에 의해서, 검출부 (3)군을 원주 방향으로 소정 각도의 영역마다 그룹을 나누는 것도 자유롭게 할 수 있된다.

검출부 (3)에 설치된 반응 영역 (R)의 형상이나 크기는 특별히 한정되지 않지만, 그의 길이, 폭, 깊이는 각각 수 ㎛ 내지 수백 ㎛이며, 이 크기의 값은 여기광의 스폿 직경이나 샘플 용액(검출용 핵산 함유 용액, 표적 핵산 함유 용액)의 최소 적하 가능량에 기초하여 결정할 수 있다.

(3) 「검출 표면 (U)」의 구성.

검출부 (3)을 구성하는 반응 영역 (R) 내에는, DNA 프로브 등의 검출용 핵산을 고정화할 수 있도록 표면 처리 가공된 표면(이하, 「검출 표면」이라 함)을 형성해둔다.

도 3에는, 반응 영역 (R)내의 검출 표면 (U) 부분의 확대도가 모식적으로 나타나 있다. 도 3에서는 이 검출 표면 (U) 부분에 검출용 핵산 (D)의 말단이 고정화되어 있고, 이 검출용 핵산 (D)에 혼성화된 표적 핵산 (T), 또한 이중가닥 부분에 삽입 결합된 인터칼레이터 (I)가 모식적으로 나타나 있다.

이 검출 표면 (U)로서는 예를 들면, 금 등의 금속 박막 표면이나, 반응 영역 (R) 내를 향하도록 설치된 전극의 표면을 활용할 수 있다.

DNA 프로브 등의 원하는 검출용 핵산 (D)를 고정하기 위한 검출 표면 (U)(예를 들면, 전극 표면)의 표면 처리법에 대해서는, 예를 들면 아미노기 함유의 실란 커플링제 용액이나 폴리리신 용액으로 미리 표면 처리해두는 방법을 채용할 수 있 다.

예를 들면, 아미노기 함유의 실란 커플링제 용액이나 폴리리신 용액으로 표면 처리한다. 합성 수지제 기판이면, 그 표면을 플라즈마 처리 및 DUV(Deep UV, 원적외) 조사 처리 후, 아미노기 함유 실란 커플링제 용액으로 처리한다.

또한, 표면에 구리, 은, 알루미늄 또는 금을 스퍼터링하여 막 형성하고, 그의 표층에 아미노기, 티올기, 카르복실기 등의 관능기(활성기)를 갖는 물질이나 시스테아민, 스트렙토아비딘 등을 코팅할 수도 있다.

스트렙토아비딘에 의해서 표면 처리된 검출 표면의 경우에는, 비오틴화된 DNA 프로브 말단의 고정에 적합하다. 또는, 티올(SH)기에 의해 표면 처리된 검출 표면의 경우에는, 티올기가 말단에 수식된 프로브 DNA 등의 검출용 핵산 (D)를 디술피드 결합(-S-S- 결합)에 의해 고정하는 것에 적합하다.

또한, 검출 표면 (U)에는 필요에 따라서, 검출용 핵산 (D)를 고정화하기 위한 링커나 스페이서 등을 포함하는 삽입 분자를 결합시켜 둠으로써, 검출 표면 (U)와 검출용 핵산 (D)의 거리를 확보하여 서로의 간섭을 막도록 고안할 수도 있다. 즉, 검출용 핵산 (D)의 고정화 부위 이외가 검출 표면 (U)에 부착되는 것을 방지하도록 할 수도 있다.

삽입 분자의 분자 길이를 선택함으로써, 예를 들면 분자 길이가 다른 링커를 소정 간격으로 검출 표면 (U)에 교대로 결합시켜 둠으로써, 상기 검출 표면 (U)에 고정화된 검출용 핵산 (D)끼리가 서로 간섭하지 않도록 고안할 수도 있다.

또한, 사용되는 삽입 분자의 분자 길이는 검출용 핵산 (D)나 표적 핵산 (T) 의 길이(염기수), 검출용 핵산 (D)끼리의 거리 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 50 내지 100 염기의 프로브 DNA를 신장된 검출용 핵산 (D)에 대하여 1,600 염기 정도의 표적 핵산 (T)를 혼성화시키는 경우를 상정하면, 표적 핵산 (T)의 잉여 염기 서열 부분(상보쇄를 만들지 않는 배열 부분)이 브라운 운동에 의해서 랜덤 코일형의 분자 덩어리가 되었을 때의 직경은 10 내지 40 nm로 계산할 수 있다.

이 경우, 표적 핵산 (T)의 상기 분자 덩어리 부분에 의한 입체 장해를 효과적으로 막기 위해서는, 삽입 분자(또는 신장된 상태의 삽입 분자)의 분자 길이는 10 내지 40 nm 확보하는 것이 바람직하고, 또한 검출 표면 (U) 상에 배열되는 삽입 분자 사이의 거리에 대해서도 10 내지 40 nm 정도가 바람직하다.

(4) 「대향 전극」의 구성.

검출부 (3)의 반응 영역 (R)에는, 상기 반응 영역 (R)을 향하도록 한쌍 이상의 대향 전극 (E₁), (E₂)가 설치되어 있다(예를 들면, 도 4 참조). 이 대향 전극 (E₁), (E₂)는 알루미늄이나 금 등의 금속, 또는 ITO(인듐-주석-옥시드) 등의 투명한 도체로 형성할 수 있다. 이 대향 전극 (E₁), (E₂)는 반응 영역 (R) 내의 검출 표면 (U) 영역을 사이에 두는 것과 같은 배치 관계로 설치한다.

도 4에는, 1조의 대향 전극 (E₁), (E₂)의 일배치예가 나타나 있다. 이 대향 전극 (E₁), (E₂)는 반응 영역 (R)에 저류된 수용액이나 보유된 겔 등의 매질에 전계 를 인가하기 위해서 설치된, 서로 대향하는 배치 관계에 있는 전극쌍이다. 또한, 한쪽 전극(예를 들면, 도 4 중의 E₂)을 외부 전극 유닛으로 하고, 필요에 따라서 기판 (1) 측의 전극과 대향 전극을 형성할 수 있도록 할 수도 있다.

이 대향 전극 (E₁), (E₂)는 예를 들면, 고주파 교류 전계 등의 전계 인가(후술)에 의해 얻어지는 유전 영동의 전기 역학적 효과에 의해, 상기 매질 중에 존재하는 핵산 분자(검출용 핵산 (D), 표적 핵산 (T))를 직쇄형으로 신장시키거나, 전기력선이 집중되는 전극 엣지 등의 소정 부분을 향해 이동시키거나, 신장시키면서 이동시키거나, 또는 끌어당기거나 하기 위한 수단으로서 기능한다. 또한, 도 4에 나타내어진 부호 (D)는, 신장된 상태로 고정화되어 있는 검출용 핵산이 모식적으로 나타나 있다. 또한, 대향 전극 (E₁), (E₂)를 전기 영동이나 전기 침투류 등의 전기 역학적 효과를 사용하는 경우에 사용하는 것은 자유롭다.

혼성화는 통상적으로 랜덤 코일형으로 둥글게 되거나, 꼬인 상태의 단일가닥 핵산 분자끼리의 사이에서 진행되기 때문에, 입체 장해의 영향 등을 받아 상보 결합의 효율이 저하되고, 미스 혼성화도 일어나기 쉬워진다.

그러나, 대향 전극 (E₁), (E₂)를 통해 전계 인가를 행함으로써, 핵산 분자의 고차 구조를 신장 상태로 조정하거나, 또는 핵산 분자의 회합 확률(즉, 농도)이 높아지도록 소정 영역으로 이동시키거나 할 수 있다.

전계 인가가 이루어진 상태에서 혼성화를 행하면 입체 장해의 영향을 감소시킬 수 있기 때문에, 상기 혼성화의 효율과 정밀도를 비약적으로 높일 수 있다. 그 결과, 고속의 혼성화 검출을 실현할 수 있다. 또한, 혼성화시에는 전계 오프 상태(시간대)를 형성하고, 자연스러운 브라운 운동에 의해 혼성화를 진행시킬 수도 있다.

또한, 반응 영역 (R)에 설치되는 모든 대향 전극도 외부 전원 (V)에 통전 가능하게 구성되고, 스위치 (S)의 조작에 의해 전계 인가의 온/오프가 자유자재로 되는 통전 구성으로 되어 있다(예를 들면, 도 4 참조).

또한, 반응 영역 (R)에 설치되는 모든 대향 전극도 전계 강도의 선택, 교류와 직류의 선택, 또는 고주파 전계나 저주파 전계의 선택을 자유롭게 행할 수 있 도록 전계 제어되어 있다.

여기서, 반응 영역 (R)에서의 대향 전극의 주된 배치 구성예를 열거하면, (1) 반응 영역 (R)의 저면 (4) 부분에 하나의 전극 (E₁)을 형성해두고, 이 전극 (E₁)과 대향하는 상측 위치에 다른 하나의 전극 (E₂)를 배치하는 구성(도 4 참조), (2) 반응 영역 (R)을 형성하는 벽면의 대향하는 세로 벽면 (5), (5) 부분에 서로 마주 보도록 전극 (E₃), (E₄)를 배치하는 구성(도 5 참조), (3) 서로의 전극 엣지 부분이 대향하는 두개의 전극 (E₅), (E₆)이 저면 (4) 부분에 소정 간격을 두고 나란히 배치된 구성(도 6 참조) 등을 예시할 수 있다.

또는, 이들 대향 전극을 적절하게 자유롭게 조합하여 복수개의 대향 전극을 설치하도록 할 수도 있다. 예를 들면, 2쌍의 대향 전극을, 그의 대향축이 교차하도록 반응 영역 (R)에 배치할 수도 있다. 구체적으로는 도 7에 나타낸 바와 같이, 수직 방향으로 배치된 대향 전극 (E₁)-(E₂)와 수평 방향으로 배치된 대향 전극 (E₃)-(E₄)를 각 반응 영역 (R)에 형성할 수도 있다.

이 경우, 한쪽 대향 전극 (E₁)-(E₂)를 검출용 핵산 (D)의 고차 구조 조정이나 혼성화 효율 향상을 목적으로 하는 고주파 전계 인가 수단으로 사용하고, 다른쪽 대향 전극 (E₃)-(E₄)는 혼성화 검출시의 장해가 되는 잉여 물질(예를 들면, 잉여의 검출용 핵산 (D), 잉여의 표적 핵산 (T), 잉여의 인터칼레이터 (I) 등)이나 미스 혼성화된 핵산 분자를 검출 표면 부위로부터 다른 영역으로 강제적으로 제거하기 위한 전계 인가 수단으로 사용할 수 있다. 이러한 전계를 사용한 제거 작업은, 현재 일반적으로 실시되는 수용액을 사용한 세정 제거 작업을 대신할 수 있는 신규 기술이다.

전계 인가에 의한 상기 제거 작업시에는, 저주파 전계를 적극적으로 사용하도록 고안할 수도 있다. 반응 영역 (R) 중의 매질에 저주파 전계를 인가함으로써 미스 혼성화된 핵산 분자에 적당한 진동을 주어, 상기 핵산 분자를 검출용 핵산 (D)로부터 해리시킬 수 있다. 또한, 저주파 전계의 전계 강도는 정규 혼성화를 해리시키지 않을 정도로 한다.

또한, 어세이에서 사용되는 시료 물질을 포함하는 매질을 검출부 (3)의 반응 영역 (R)로 확실하게 보내기 위해, 모세관 현상을 이용할 수도 있다. 이를 위해, 예를 들면 도 4나 도 7에 나타낸 바와 같이, 반응 영역 (R)에 연통하는 흡입 구멍 (H₁)과 외기 연통 구멍 (H₂)를 설치하도록 고안하고, 또한 상기 흡입 구멍 (H₁)의 상측 개구부의 주변 표면 영역을 매질과 반대인 친매성인 소수성으로 할 수도 있다.

반응 영역 (R)에는, 대향 전극뿐 아니라 주사 전극 (C) 군을 배치할 수도 있다. 그의 일실시 형태를 도 8에 나타낸다. 도 8에는 검출부 (3)내의 전극 배치 구성이 간략하게 나타나 있다. 우선, 대향 전극 (E₁)-(E₂)가 설치되어 있고, 이 대향 전극 (E₁)-(E₂) 사이에 공통 전극 (G)와, 이에 각각의 엣지 (d)가 대향하는 배치 관계에 있는 주사 전극 (C) 군이 설치된다.

도 8의 실시 형태에서는, 도시된 스위치(S₁ 내지 Sz)의 전환 조작을 소정의 타이밍에 차례로 행함으로써, 인접하는 주사 전극(예를 들면, C₁-C₂, C₂-C₃) 사이에 순서대로 전계 인가를 행하여, 서로 인접하는 주사 전극의 각 엣지 (d), (d)의 사이를 신장 상태의 검출용 핵산(부호 (X))이 가교하도록 고정시킬 수 있다. 또한, 도 8 중의 부호 (L)은 주사 전극(Cx, Cy)의 엣지 (d) 부분에 집중하는 전기력선을 모식적으로 나타낸 것이다.

여기서, 이미 상술한 바와 같이, 반응 영역 (R)을 향하는 대향 전극을 구성하는 전극 표면은 DNA 프로브 등의 검출용 핵산 (D)를 고정하기 위한 검출 표면 (U)(도 3 재참조)로서 사용할 수 있다.

이 경우, 검출 표면 (U)로서 기능시키는 측의 전극 표면의 면적은, 그의 대 향하는 다른쪽 전극의 표면 면적보다 협소한 면적으로 형성하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들면, 도 4, 도 7에 나타낸 바와 같이, 면적이 협소한 측의 전극 (E₁)에는 전계(전기력선)가 보다 집중되어 불균일 전계가 형성되기 때문에, 유전 영동에 의해 전극 (E₁)측으로 핵산 분자가 이동하기 쉬워진다.

또한, 고정화용으로 사용하는 전극의 표면, 즉 검출 표면 (U)는 예를 들어 도 9에 나타낸 바와 같이, 요철 형상으로 조면 가공을 실시하거나, 섬 형상이 되 도록 패터닝 형성하거나 할 수도 있다. 이러한 구성을 채용하면, 전기력선이 상기 전극 표면의 볼록 부위 (u)(산 형상 부위)에 집중되기 쉬워지므로, 불균일 전계가 형성되기 쉬워져 바람직하다. 또한, 도시하지 않았지만, 검출 표면 (U)에 역원추형이나 단면 U자형의 오목부나 원추형 등의 볼록부를 규칙적으로 형성해둘 수도 있다.

또한, 전극 표면을 조면 가공하는 방법은, 예를 들면 공지된 스퍼터링 증착 기술, 에피택시 증착 기술이나 에칭 기술을 사용하여 실시할 수 있지만, 상기 방법은 특별히 한정되지 않는다.

또한, 각 전극 표면은 SiO₂, SiN, SiOC, SiC, SiOF, TiO₂ 등의 재료에 의해서 형성한 절연층으로 덮는 것이 보다 바람직하다. 반응 영역 중에 저류되는 경우가 있는 이온 용액에 의한 전기 화학적인 반응을 방지할 수 있기 때문이다.

또한, 도 10에 나타내는 실시 형태와 같이, 검출부 (3)의 반응 영역 (R) 중에 수용된 매질에 대하여 전계 인가가 가능하게 대향 배치되는 대향 전극 (E₁), (E₂)를 구성하는 각 전극이, 상기 반응 영역 (R)을 향해 돌기된 형태를 갖도록 할 수도 있다.

이러한 돌기형 대향 전극의 선단 부위 (e1), (e2)에는 전기력선이 집중되고, 불균일 전계가 형성되기 쉬워지기 때문에, 검출용 핵산 (D)의 고정 부위로서 바람직하게 사용할 수 있다.

(5) 「대향 전극」에의 전기공급 수단.

반응 영역 (R)에 설치된 각 대향 전극으로의 전기공급은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 도 11에 도시되어 있는 바와 같이, 기판 (1)의 중심부에 외부 통전 지그(conducting jig)(도시하지 않음)와 접촉 가능한 통전부 (6)을 구멍 (2)의 주변 벽면에 노출되도록 형성해두고, 이 통전부 (6)으로부터 도출되어 기판 전체를 망라하도록 연설(延設)된 전기공급용 배선 (7) 군을 개재하여 행할 수 있다.

또한, 상기 통전부 (6)은 원형, 링형, 분할된 링형(도 11 참조) 등의 형상을 목적에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 도 11 중의 부호 (21)은, 도시하지 않은 통전 지그나 처킹 지그의 위치를 결정하기 위해 형성된 절취부이다.

또한, 절취부 (21) 이외에도, 볼록부를 형성하거나 구멍 (2)의 형상 그 자체를 고안하거나 함으로써, 통전 지그나 처킹 지그의 위치 결정을 행하도록 할 수도 있으며, 위치 결정의 구체적 방법은 특별히 한정되지 않는다.

여기서, 도 11에 기초하여 전기공급용 배선 (7)의 실시 형태의 일례를 설명하면, 전기공급용 배선 (7)은 기판 (1)의 통전부 (6)으로부터 기판 외주측을 향해 방사형으로 연장되는 제1 배선(기간 배선; main wiring)(71), 이 제1 배선 (71)로부터 원주 방향으로 분지되는 제2 배선 (72), 또한 이 제2 배선 (72)로부터 분지되어 전극에 접속하는 제3 배선 (73) 등이다. 또한, 상기 제2 배선 (72)는 상측에서 보았을 때에, 동심원형 또는 스파이럴형을 나타내도록 연설한다.

이들 배선 (71) 내지 (73)을 단일층내에 형성하거나 또는 복수층으로 나누거나, 걸치거나 하여 형성하고, 배선용 기판(층) (1a)에 연설해둔다. 이 배선용 기판(배선층) (1a)를, 검출부 (3)이 배열된 검출용 기판 (1b)에 정확하게 위치 결정하고, 접합 등을 행함으로써 일체화하여 기판 (1)을 형성할 수 있다.

상기한 바와 같은 전기공급용 배선 (7)(71, 72, 73)의 구성을 채용하면, 기록 정보 판독시에 사용되는 회전 동기 신호(synchronizing signal)의 기준으로서, 또는 트랙킹 신호의 기준으로서 사용할 수 있다. 이 결과, 이들 신호를 얻기 위한 피트(pit)군이나 바코드군 등의 전용 신호나 마크를 기판 (1)에 일부러 설치하지 않아도 되기 때문에, 기판 (1)의 구성을 보다 간소화할 수 있는 이점이 있다.

<2. DNA 칩의 제조 방법에 대하여>

본 발명에서는 이미 상술한 구성 또는 구조를 구비하는, 원반형 형태로 성형되고 또한, 표면 처리를 실시한 기판 (1)을 사용하여 DNA 칩을 제조한다.

이 기판 (1)은 이미 상술한 바와 같이, 혼성화 장소가 되는 반응 영역 (R), 및 상기 반응 영역 (R)에 저류 또한 보유된 매질에 전계 인가 가능하게 배치되는 대향 전극(예를 들면, (E₁)-(E₂))을 적어도 구비하는 검출부 (3)이 다수 배치되어 있다(도 1 참조). 이 기판 (1)을 사용하여 소정의 검출용 핵산 (D)가 고정(집적)된, 소위 「DNA 칩」을 제조한다.

본 제조 방법을 동일한 방법의 공정예의 플로우가 나타내어진 도 12, 도 13을 참조하여 설명한다.

기판 (1)에 대하여 표면 처리를 행하는 공정 (P₁), 미리 제조된 검출용 핵산 (D)를 포함하는 매질을 상기 반응 영역 (R)에 적하 또는 주입하는 공정 (P₂), 상기 반응 영역 (R)에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극(예를 들면, (E₁)-(E₂))을 통해 전계 인가를 행하는 공정 (P₃)을 행한다.

전계 인가에 의해 얻어지는 전기 역학적 효과인 「유전 영동」에 의해, 상기 검출용 핵산 (D)를 신장시키면서, 검출 표면 (U)로 기능하는 전극 표면(예를 들면, (E₁) 표면)에 고정한다. 또한, 잉여의 상기 검출용 핵산 (D)를 반응 영역 (R)로부터 제거하는 공정 (P₄)를 행하고, 계속하여 포장 공정 (P₅)를 경유하여 DNA 칩 (10)을 사용자에게 출하한다. 이하, 이 DNA 칩 (10)의 제조 공정을 공정별로 차례로 설명한다.

(1) (기판의) 표면 처리 공정 (P₁).

우선, 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역 (R)이 형성된 기판 (1)을 사용하여, 이 기판 표면을 소수성 물질로 처리하여 소수면을 형성하는 소수화 공정을 행하고, 이에 이어서 소수면의 일부를 친수면으로 변환시키는 친수화 공정을 행한 다.

이들 공정을 적당하게 조합함으로써, 기판 (1) 상의 소정의 영역 또는 부분 영역을 목적에 따라서 친수면으로 하거나, 소수면으로 하거나 할 수 있다. 예를 들면, 반응 영역 (R)을 구성하는 벽면만을 친수면으로 변환시키고, 기판 (1) 상의 그 이외의 부분(비반응 영역)을 소수면으로 할 수 있다.

유전자 해석 등의 바이오어세이에 사용되는 핵산 등의 생체 물질은 친수성인 경우가 대부분이기 때문에, 이들 생체 물질은 수용액 등에 함유된 상태에서 기판 (1)의 반응 영역 (R)에 적하, 주입 또는 송액된다.

따라서, 기판 (1) 상의 반응 영역 (R)이 친수면이 되도록, 비반응 영역(반응에 직접 관련되지 않는 영역)이 소수면이 되도록 기판 (1)을 표면 처리함으로써, 생체 물질이 용해된 시료 용액 등을 기판 (1) 상에 적하하거나 할 때에, 이 시료 용액 등을 반응 영역 (R) 내의 친수 표면 영역에 정확하게 보내거나, 상기 친수 표면 영역에 확실하게 머물게 할 수 있다.

또한, 상기 공정 (P₁)에서는, 기판 (1) 상의 반응 영역 (R) 내의 소정 부분만을 목적에 따라서 적절하게 친수면 또는 소수면으로 하는 것도 가능하다. 예를 들면, 상기 친수화 공정에 의해 반응 영역 (R) 내에 배치된 검출 표면 부분(예를 들면, 전극 표면 부분)만을 친수면으로 변환시키거나, 역으로 반응 영역 (R) 중의 상기 검출 표면 이외의 부분(비검출용 표면)만을 친수면으로 변환시킬 수도 있다.

이와 같이, 반응 영역 (R) 내에 친수면과 소수면을 목적에 따라서 설치함으 로써, DNA 칩 제조 단계에서 사용되는 친수성 또는 소수성 시료 용액이나 시료 겔 등을 목적하는 장소에 보유시키거나, 반응 영역 (R) 내의 목적하는 장소에 검출용 핵산을 보내 고정화시키거나 하는 것 등을 자유롭게 행할 수 있게 된다.

상기 소수화 공정은 예를 들면, 소수성 물질인 알킬실란(R-Si-X₁, X₂, X₃, R:알킬기(불포화기를 포함할 수도 있음), Xn:Cl, OR)을 기판의 표면에 고정화함으로써 행할 수 있다.

상기 소수면의 일부를 친수면으로 변환시키는 친수화 공정은, 소수면에 수산기를 형성하는 반응에 기초하여 간편하게 행할 수 있다. 예를 들면, 소수면이 상기한 알킬실란으로 형성되어 있는 경우, 알킬실란에 산소 존재하에서 자외선을 조사함으로써 알킬실란의 알킬기에 수산기를 부가할 수 있다.

(2) 검출용 핵산의 적하 또는 주입 공정 (P₂).

이 공정 (P₂)에서는, 상기 표면 처리 공정을 거쳐 얻어진 기판 (1) 상의 반응 영역 (R)에, 미리 제조된 검출용 핵산 (D)를 적하 또는 주입한다. 검출용 핵산 (D)로서는, DNA 올리고쇄나 cDNA(complementary DNA) 등(cDNA 단편인 EST(Expression sequence tag나 ORF(Open reading frame) 등의 폴리뉴클레오티드를 포함함)의 DNA 프로브를 예시할 수 있다.

이 적하 또는 주입에 관한 구체적인 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 잉크젯 프린팅 기술을 사용한 압전 기술에 의해, XYZ 작동 제어 시스템에 의해 위치 제어된 작은 젯 노즐을 통해 상기 DNA 프로브를 포함하는 시료 용액을 기 판 (1) 상의 반응 영역 (R)에 정확하게 분사할 수 있다.

또는, 마이크로스포팅 기술을 사용하여 XYZ 작동 제어 시스템에 의해서 위치 제어된 마이크로스포팅 펜, 모세관, 또는 핀셋을 장착한 프린트 헤드로, 미리 제조된 검출용 핵산을 기판 (1) 상의 반응 영역 (R)에 스포팅할 수 있다.

이들 적하(스포팅) 방법은, 기판 (1) 상의 검출부 (3) 위치를 정확하게 찾아 검출용 핵산 (D)를 포함하는 미소액적 및 표적 핵산 (T)를 포함하는 미소액적 등을 정확하게 적하할 수 있다.

또한, 「잉크젯 프린팅법」은 잉크젯 프린터에서 사용되는 노즐을 응용하는 방법이며, 전기를 사용하여 잉크젯 프린터와 같이 프린터 헤드로부터 기판에 검출용 핵산을 분사하여 고정하는 방법이다.

이 방법에는 압전식 잉크젯법, 버블젯(등록 상표)법, 초음파 젯법이 있다. 압전식 잉크젯법은 압전체에 펄스를 인가함으로써 생기는 변위의 압력에 의해서 액적을 비산시키는 방법이다. 통상적인 버블젯(등록 상표)법은 열 방식이며, 노즐 중의 히터를 가열하여 발생시킨 기포의 압력에 의해서 액적을 비산하는 방식이다. 노즐내에 히터가 되는 실리콘 기판을 매립하고, 약 300 ℃/s로 제어하여 일정한 기포를 만들어 액적을 압출한다. 그러나, 액체가 고온에 노출되므로 생체 물질 시료에는 적합하지 않다고 생각된다. 초음파 젯법은 초음파 빔을 액체의 자유면에 쏘여 국소적으로 높은 압력을 가함으로써, 그 부분에서 소액적을 방출시키는 방식이다. 노즐을 필요로 하지 않고, 고속이며, 직경 약1 ㎛의 소액적을 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서는 「잉크젯 프린팅법」으로서 「압전식 잉크젯법」과 같이, 매질에 대한 열의 영향이 적은 방법을 바람직하게 채용할 수 있다. 인가하는 펄스의 형상을 변화시킴으로써 액적(미소액적)의 크기를 제어할 수 있기 때문에, 해석 정밀도 향상에 바람직하다. 액적 표면의 곡률 반경이 작을 때에는 액적을 작게 하고, 액적의 곡률 반경이 클 때에는 액적을 크게 할 수 있다. 또한, 펄스를 급격히 부(負) 방향으로 변화시켜 액적 표면을 내측으로 인장(引張)함으로써, 곡률 반경을 작게 하는 것도 가능하다.

「마이크로 메카니컬 스포팅법」은 마이크로스포팅 펜, 모세관(세관) 또는 핀셋을 장착시킨 프린트 헤드를 사용하여, 검출용 핵산을 포함하는 미소액적을 기판 상의 검출 표면 부위에 스포팅해가는 방법이다.

또한, 본 발명에서는 전자 유도에 의해 생긴 유도 전류와 외부 자장과의 상호 작용에 의해 진동하는 도전성 보이스 코일에 의해 구동하여, 토출구로부터 매질을 토출하는 장치를 적하 수단으로서 채용할 수도 있다.

이 공정 (P₂)는 기판 (1) 상의 소정의 검출부 (3)(또는 검출부 (3)군)의 위치를 서보 기구로 판독하고, 이 원반형을 이루는 기판 (1)을 회전시키면서 행할 수 있다. 또한, 이 공정 (P₂)를 개시함과 동시에 다음 공정 (P₃)을 개시해 두고, 반응 영역 (R) 중에 적하 또는 주입된 매질에 전계 인가를 행하도록 할 수도 있다(도 13의 공정 (P₂₁) 참조).

(3) 전계 인가 공정(검출용 핵산의 고정 공정)(P₃).

상기 공정 (P₂)에 이어서(도 12 참조), 또는 상기 공정 (P₂)와 동시에(도 13참조), 기판 (1) 상의 반응 영역 (R)에 저류 또는 보유된 매질에 대하여, 상기 반응 영역 (R)의 대향 전극(예를 들면, (E₁)-(E₂))을 통해 전계 인가를 행한다. 이하, 구체적으로 설명한다.

상기 매질에 전계 인가가 되지 않은 단계(전계 오프의 단계)에서는, 단일가닥의 검출용 핵산 (D)(예를 들면, DNA 프로브)는 반응 영역 (R)의 매질 중에 유리 상태로 존재한다. 이 때, 검출용 핵산 (D)는 브라운 운동의 작용을 받아 랜덤 코일형으로 둥글게 된 고차 구조로 존재한다.

전계 인가를 실시하는 본 공정 (P₃)(도 12) 또는 (P₂₁)(도 13)에서는, 외부 전원에 접속된 대향 전극(예를 들면, (E₁)-(E₂))을 사용하여, 반응 영역 (R)내의 매질에 고주파 교류 전계를 인가한다. 이 때의 인가 전계의 바람직한 조건으로서, 고주파 전계는 1 MV/m 이상 및 500 kHz 이상인 것이 바람직하고, 예를 들면 약 1×10⁶ V/m, 약 1 MHz를 바람직하게 선택할 수 있다(Masao Washizu and Osamu Kurosawa: "Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures", IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26, No.26, p.1165-1172(1990) 참조).

이 전계 인가에 의해 얻어지는 유전 영동의 전기 역학적 효과에 의해서, 랜덤 코일형 검출용 핵산 (D)를 신장시키면서 전기력선이 집중되는 전극 표면을 향해 이동시키고, DNA 프로브 등의 검출용 핵산 (D)의 수식된 말단 부위를 커플링 반응 등을 통해 전극 표면에 고정할 수 있다(예를 들면, 도 4의 상태를 참조). 즉, 전극 표면을 검출 표면 (U)로서 기능시킨다. 특히, 전계 인가에 의해 검출용 핵산의 이동을 빠르게 할 수 있기 때문에, 공정 시간의 단축에 효과적이다.

이미 상술한 바와 같이, 예를 들면 스트렙토아비딘에 의해서 표면 처리된 전극 표면에는, 비오틴화된 DNA 프로브 말단의 고정이 적합하다. 또는, 티올(SH)기에 의해 표면 처리된 전극 표면의 경우에는, 티올기가 말단에 수식된 DNA 프로브를 디술피드 결합(-S-S- 결합)으로 고정하는데 적합하다.

(4) 제거(세정) 공정 (P₄).

이 공정 (P₄)는 반응 영역 (R) 중에 고정되지 않은 채로 유리 상태로 존재하는 잉여의 검출용 핵산 (D)를, 반응 영역 (R) 중에서 제거하여 회수하는 것을 목적으로 하는 공정이다.

첫째로 예시할 수 있는 공정은, 미리 세정용으로 제조된 버퍼 용액을 반응 영역에 적하 또는 주입하고, 이 세정 용액을 회수할 때에 잉여의 검출용 핵산을 동시에 반응 영역 (R) 중에서 제거하는 방법이다.

이 방법에 있어서의 세정액의 회수 작업에서는, 기판 (1)의 반응 영역 (R)에 연통하도록 모세관(도시하지 않음)을 형성해둠으로써, 모세관 현상을 효과적으로 사용할 수 있다. 또는, 원반형을 이루는 기판 (1)의 형태적 특성을 적극적으로 활용하여, 상기 기판 (1)을 회전시킴으로써 얻어지는 원심력을 효과적으로 사용할 수 도 있다.

또한, 세정액으로서는 예를 들면, 계면활성제 SDS를 포함하는 SSC(Saline-Sodium Citrate) 버퍼 용액 등을 사용할 수 있다.

둘째로 예시할 수 있는 방법은, 고정용으로서 사용한 대향 전극과는 별조의 대향 전극(예를 들면, 도 6 중의 대향 전극 (E₃)-(E₄))을 반응 영역 (R)에 미리 설치해두고, 이 대향 전극에, 고정화된 검출용 핵산이 떨어지지 않을 정도의 강도로 전계를 인가함으로써, 상기 전극 (E₃), (E₄)의 표면 근방의 영역에, 즉, 검출 표면 영역에 영향이 없는 영역에 잉여의 검출용 핵산을 회수 또는 트랩핑하는 방법이다(도 7 참조).

또한, 이 제2 방법은 반응 영역 (R)에서 잉여의 검출용 핵산 (D) 등을 제거하는 방법이 아니라, 상기 반응 영역 (R)의 검출에 장해가 되지 않는 영역으로 잉여의 검출용 핵산 등의 잉여 물질을 이동시키는 방법이다.

따라서, 이 방법은 사용자 자신이 검출용 핵산 (D)의 고정 작업과 혼성화의 일련의 작업을 행하는 경우나, 검출용 핵산 (D)가 고정된 DNA 칩 (10)을 사용하여 혼성화 작업을 행하는 경우 등에 특히 효과적인 방법이라고 생각된다.

또한, 상기 설명에서 사용한 도 7에는, 전극 (E₁) 표면에 혼성화된 이중가닥 핵산이 존재하고, 전극 (E₃)이나 (E₄) 표면 근방에는 잉여 물질 (B)가 끌어당겨진 모습이 모식적으로 나타내어져 있다.

상기 공정을 거쳐, 검출용 핵산 (D)가 반응 영역 (R)의 검출 표면 (U)에 고 정화되고, 또한 잉여의 검출용 핵산 (D)가 반응 영역 (R)로부터 제거된 상태가 된 기판 (1)은, 패키징되어 유전자 정보가 집적된 「DNA 칩」으로서 사용자에게 출하된다. 이하, DNA 칩은 부호 (10)으로 나타낸다. 이상, 전계 인가를 사용한 프로브 고정에 대하여 설명하였지만, 프로브 고정은 화학 반응으로 일어나기 때문에 반드시 전계 인가가 필요한 것은 아니다.

<3. DNA 칩의 제조 시스템/혼성화 검출 시스템에 대하여>

이하, 상기 기판 (1)로부터 얻어진 DNA 칩 (10)의 제조 시스템, 및 본 발명에 따른 DNA 칩 (10)을 사용한 혼성화 검출 시스템의 바람직한 실시 형태에 대하여 설명한다. 도 14는 동일한 시스템의 바람직한 실시 형태의 일례를 나타내는 블록도이다.

또한, 이 도 14에 나타나 있는 시스템 구성 중에서, 매질을 적하 또는 주입하기 위한 수단이나 서보 기구에 대해서는, 검출용 핵산 (D)의 고정 시스템(즉, DNA 칩의 제조 시스템)과 혼성화 검출 시스템 양자 모두에 사용할 수 있는 구성이고, 형광 검출 수단은 혼성화 검출에 관한 수단이다.

또한, 도 14에 나타낸 것과 같은 시스템을, DNA 칩의 제조 시스템에만 필요한 장치 구성 부분과 혼성화 검출 시스템에만 필요한 장치 구성 부분으로 분리하여, 각각의 목적으로 특화된 다른 시스템으로서 설계하는 것은 자유롭게 행할 수 있고, 또한 이 점은 도 15의 장치, 도 16의 시스템에서도 동일하다.

우선, 도 14에 나타내어진 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))은 이미 상술한 바와 같은 형태나 구성을 구비한다. 이 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))을, 회전 수단을 구 비하는 디스크 지지대 (8)의 상측에 돌출 설치된 스핀들(지그) (9)에 고정한다. 이 스핀들 (9)는 기판 (1)(또는 (10)) 중심의 구멍 (2)(도 1 참조)에 위치 결정되어 삽착되어 있다.

또한, 기판의 반응 영역 (R)에는, DNA 칩 (10)의 제조 단계에서는 검출용 핵산 (D)를 포함하는 매질 (M₁)이 적하 또는 주입되고, 혼성화 검출 단계에서는 표적 핵산 (T)를 포함하는 매질 (M₂)가 적하 또는 주입된다.

이들 매질 (M₁), (M₂)는 용액형이나 점도 제조된 겔형을 이루는 것이 일반적이다. 특히, 용액형 매질의 경우에는 액 흐름 등의 다양한 문제를 피하기 위해, 상기 매질 (M)이 적하 또는 주입되는 기판 (1)은 수평으로 유지하는 것이 바람직하다.

도 14에 나타낸 시스템 구성에 있어서는, 노즐 헤드 (N₁)이 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 상면 (1c)측(상측)에 복수개 배치되어 있다. 이 노즐 헤드 (N₁)은, 소정 위치에 배열된 검출부 (3)의 반응 영역 (R)을 정확하게 찾아 소정의 매질 (M)(예를 들면, (M₁) 내지 (M₃))을 소정의 타이밍에 적하 또는 주입할 수 있는 구성으로 되어 있다.

도 14 중의 부호 (31)은 「제어부」를 블록도로 간략하게 나타낸다. 이 제어부 (31)은 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))에 대한 「포커스 정보」와 기판 (1)로부터 얻어지는 「트랙킹 정보」에 기초하여, 노즐 헤드 (N₁)의 적하 또는 주입의 동작 전체를 제어하고 있다.

여기서, 도 14에 부호 (Q)로 나타내지는 여기광은 혼성화 검출 단계에서 사용하는 정보 판독용 광이다. 이 여기광 (Q)는 레이저 다이오드 (12)로부터 출사되고, 콜리메이터 렌즈 (L₁)에서 평행광이 된 후, 이색성 미러(dichroic mirror)(13)에서 90° 굴절된다.

그 후, 여기광 (Q)는 광의 진행 방향 전방에 배치된 미러 (14)에서 90° 굴절된 후, 작동기(actuator)(15)로 지지된 집광 렌즈 (L₂)에 입사되고, 기판 (1)의 이면 (1d) 측에서 검출부 (3)(의 반응 영역 (R))으로 조사된다. 또한, 부호 (16)은 제어부 (31)로부터 송신되는 레이저 다이오드 드라이버 (17)을 제어하기 위한 신호이다.

여기광 (Q)는 상기 집광 렌즈 (L₂)에 의해서 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 표면(이면)에서 수 ㎛ 정도의 크기까지 집광된다. 이 미소한 여기광 스폿 직경을 활용하기 위해서는, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10)) 상에 검출용 핵산을 포함하는 매질 (M₁), 표적 핵산을 포함하는 매질 (M₂) 등을 적하 또는 주입하는 노즐 헤드 (N₁)으로서, 피코리터 차수의 미소량의 용액을 적하 가능한 잉크젯 프린팅 노즐이 바람직하다.

노즐 헤드 (N₁)의 일례인 잉크젯 프린팅 노즐의 수는 사용하는 매질의 수나 종류만큼 준비할 수도 있고, 1종류의 매질을 적하 후 일단 노즐을 세정하고, 다른 종류의 용액을 적하함으로써, 적은 노즐수로 다종의 매질을 취급하도록 할 수도 있다.

또한, 이 잉크젯 프린팅 노즐을 사용하여, 인터칼레이터 (I)(도 3 참조)을 포함하는 매질 (M₃)을 표적 핵산을 포함하는 매질 (M₂)와 동시에 적하 또는 주입할 수 있고, 혼성화 후의 소정 타이밍에, 반응 영역 (R)로 적하 또는 주입할 수도 있으며, 소정의 세정 용액을 고정화 공정 후의 소정 타이밍에 반응 영역 (R)에 적하 또는 주입할 수도 있다.

기판 (1)(또는 DNA 칩 (10)) 상에 매질 적하 또는 주입할 때에는, 서보용 레이저 광 (V)(후술)를 사용하여 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10)) 상에 미리 기록되어 있는 어드레스 마크 정보를 판독하면서, 원하는 어드레스(번지)에 매질을 적하 또는 주입한다.

DNA 칩 (10)의 경우에는, 반응 영역 (R)(의 검출 표면)에 미리 고정된 검출용 핵산 (D)와, 이후에 적하 또는 주입되는 표적 핵산 (T)가 혼성화되고, 상보적인 이중가닥 핵산을 형성한 후, 또는 표적 핵산 (T)의 적하 또는 주입과 동시에 소정의 노즐 헤드 (N₁)을 통해 상기 이중가닥 핵산에 삽입 결합 가능한 인터칼레이터 (I)를 포함하는 매질 (M₃)을 반응 영역 (R)에 적하 또는 주입할 수 있다. 또한, 매질 등을 고안함으로써, 표적 핵산 (T)의 적하 또는 주입 전 단계에서 인터칼레이터 (I)를 반응 영역 (R)에 첨가해둘 수도 있다.

여기광 (Q)가 조사되면, 부호 (F)로 표시되는 형광이 인터칼레이터로부터 발 생하여, 기판 (1)의 이면 (1d) 측에 상기 형광 (F)가 되돌아온다. 이 형광 (F)는 DNA 칩 (10)의 아래쪽에 배치된 상기 미러 (14)에서 90° 굴절된 후, 광 진행 방향으로 배치된 상기 이색성 미러 (13)을 투과하여 직진하고, 또한 전방에 배치된 이색성 미러 (18)에서 90° 굴절된다.

계속해서, 이 형광 (F)는 상측의 렌즈 (L₃)에 입사하여 집광되고, 검출기 (19)로 유도된다. 이와 같이, 이색성 미러 (18)은 형광 (F)를 반사하는 성질을 가짐과 동시에, 후술하는 서보용 레이저 광 (Z)에 대하여 투광성을 갖는 성질을 구비한다.

여기서, 형광 강도는 일반적인 광 디스크 RF 신호 등과 비교하여 매우 약할 것으로 예상된다. 따라서, 형광 검출용 검출기 (19)에는, 일반적인 포토다이오드와 비하여 매우 감도가 높은 광증폭관(photomultiplier; 광전관)나 애벌런치 포토다이오드(avalanche photodiode; APD)를 채용하는 것이 바람직하다.

상기 검출기 (19)에서 검출된 형광 (F)는, AD 변환기 (20)에 의해 소정 비트수의 디지탈 신호 (32)로 변환된다. 이 디지탈 신호 (32)는 예를 들면, 기판 (1) 상의 어드레스와 발생한 형광 강도를 대응시킨 맵 작성 등의 해석에 사용된다.

다음에, 본 발명에 따른 시스템이나 장치를 구성하는 「서보 기구」에 대하여 구체적으로 설명한다.

우선, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 아래쪽에 배치된 상기 집광 렌즈 (L₂)는 상기 작동기 (15)에 의해 포커스 방향(상하 방향) 및 트랙킹 방향(원주 방향)으 로 구동되는 구성으로 되어 있다. 이 작동기 (15)로서는, 광 디스크의 픽업에 사용되는 것과 동일한 유형의 2축 보이스 코일형의 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))은 수평으로 유지되고, 또한 상기 집광 렌즈 (L₂)는 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))에서 볼 때 연직 방향 하측 위치에 설치되어 있기 때문에, 여기광 (Q) 및 포커스 서보 및 트랙킹 서보에 사용되는 서보용 레이저 광 (Z)는 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 이면측 (1d)에서 조사된다.

기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 이면 (1d)측에서 서보용 레이저 광 (Z)를 조사하는 구성을 채용함으로써, 서보용 레이저 광 (Z)는 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 검출부 (3)의 매질 중에 존재하는 검출용 핵산 (D)나 표적 핵산 (T)의 영향을 전혀 받지 않고, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 이면 (1d)에서 반사되어 되돌아온다.

이 때문에, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))이 회전하더라도, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10)) 중의 매질에 의해 반사광의 방향 및 강도가 흐트러지지 않기 때문에 매우 바람직하다. 즉, 포커스 에러 및 트랙킹 에러도 방해를 받지 않고, 서보가 안정적으로 동작할 수 있게 된다.

구체적으로 설명하면, 우선 도 14 중의 부호 (22)는 서보용 레이저 다이오드를 나타내고, 그의 뒷쪽에는 상기 다이오드 (22)를 제어하기 위한 드라이버 (23)이 배치되어 있다. 서보용 레이저 다이오드 (22)의 광 출사 방향에는 콜리메이터 렌즈 (L₄)가 배치되어 있다.

이 콜리메이터 렌즈 (L₄)에 의해, 서보용 레이저 광 (Z)는 평행광으로 변환되어 직진한다. 또한, 콜리메이터 렌즈 (L₄)의 전방에 배치된 이색성 미러 (25)는 서보용 레이저 광 (Z)에 대하여 투광성을 갖는 성질을 구비한다.

여기서, 포커스 에러의 발생에는 비점 수차법, 나이프 엣지법, 스큐법 등 몇 가지 방법을 생각할 수 있지만, 도 14의 구성의 경우에는 비점 수차 발생 렌즈 (L₅)를 사용한 비점 수차법을 채용한다.

또한, 트랙킹 에러의 발생에는, 디퍼렌셜 푸쉬풀법(differential push-pull method)과 3스폿법이 적합하다고 생각된다. 두 방법 모두 디스크 상에서 3개의 광 스폿을 얻을 필요가 있다.

따라서, 광 디스크 픽업에서 일반적인 것과 같이, 도 14 중에 나타내어진 회절 격자 (24)를, 서보용 레이저 광학계의 콜리메이터 렌즈 (L₄)와 이색성 미러 (25) 사이에 배치하고, 회절된 0차 및 ±1차 광을 집광 렌즈 (L₂)를 통해 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))에 조사한다.

도 14에 있어서의 부호 (26)은 서보용 레이저 반사광의 검출기를 나타낸다. 또한, 드라이버 (23) 및 검출기 (26)은 제어부 (31)에 의해서 제어된다(도 12 참조).

상기한 여기광 (Q)의 파장, 형광 (F)의 파장, 레이저 광 (Z)의 파장은 각각 다를 수도 있다. 이들 광 Q, F, Z의 파장을 다르게 한 구성을 채용하는 경우에는, 기판 (1)에 설치된 반사층 (11)(도 2 참조)이 형광 (F)의 파장에 대해 소정 정도의 투광성(투과율)을 가지면서, 또한 서보 동작이 가능한 레이저 광 반사율을 구비하는 물성이 요구된다.

즉, 반사율ㆍ투과율에 파장 의존성이 있어도 상관없고, 바람직하게는 로우 패스(low-pass) 필터적인 주파수 특성이 있을 수 있다. 단일 파장의 경우에는, 형광 (F)의 투과율과 레이저 광 (Z)의 반사율 모두를 향상시키는 것은 곤란하지만, 파장 의존성을 갖게 함으로써, 형광 (F)의 투과율 및 레이저 광 (Z)의 반사율을 향상시킬 수 있다.

<4. 기판 처리 장치 및 시스템에 대하여>

다음에, 도 15는 상기 시스템의 구성 요소를 일체화한 기판 처리 장치의 바람직한 실시 형태의 일례를 간략하게 나타내는 개념도이다. 이 기판 처리 장치는 DNA 칩의 제조 장치나 혼성화 검출 장치, 또는 DNA 칩의 제조와 혼성화 검출을 모두 담당하는 장치로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기판 처리 장치를 구성하는 각 수단의 배치 구성은, 도 15에 나타내어진 실시 형태로 좁게 한정되지 않는다.

우선, 도 15에 나타내어진 부호 (100)은 DNA 칩 (10)의 제조나 혼성화의 검출에 필요한 수단이 전부 일체화된 장치를 예시한다. 즉, 이 장치 (100)은 도 14에 나타나 있는 모든 수단이 소정 부분에 일체로 배치되어 있다.

부가적으로, 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))을 장치 (100)내에 도입하는 수단과 장치밖으로 배출하는 수단의 두가지 모두를 담당하는 수단 (101), 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 수납부 (102), 검출용 핵산 (D)의 고정이나 혼성화 등의 어세이의 온도 환경을 제어할 수 있는 가열 수단이나 습도 조건을 제어할 수 있는 가습 수단으로서 기능하는 환경 설정 수단 (104), 검출용 핵산이나 상기 검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 표적 핵산을 공급하는 공급 수단 (N), 및 혼성화 상황을 판독하는 판독 수단 (103)을 구비한다.

또한, 반응 영역 (R)로의 전계 인가 수단이나 잉여의 검출용 핵산 (D) 등을 세정 제거하기 위한 수단(도시하지 않음)을 구비한다. 또한, 기판 도입 수단과 상기 기판 배출 수단은 도 15과 같이 공통적인 수단 (101)일 수도 있지만, 분리된 수단일 수도 있다.

본 장치 (100)에서는 상기 수단에 더하여, 세포, 조직 등으로부터 추출한 mRNA 등으로부터 표적 핵산 (T)(cDNA)를 자동적으로 증폭 제조하여 공급 수단 (N)(노즐 헤드 (N₁))에 도입하는 수단 (101a)를 일체화함으로써, 혼성화 검출 어세이를 보다 자동화하도록 할 수도 있다.

또한, 본 장치 (100)에서는 공급 수단 (N), 가열 수단을 포함하는 환경 설정 수단 (104), 상기 판독 수단, 상기 기판의 도입구, 및 상기 기판의 배출구를 직렬로 배치하도록 할 수도 있다. 기판의 반송 경로가 직선적으로 되기 때문에, 장치 구성을 간략화할 수 있기 때문이다.

이 장치 (100)은 기판 (1) 또는 DNA 칩 (10)을 수납부 (102) 내부에 넣어 밀폐시키고, 환경 설정 수단 (104)에 의해 온도나 습도를 상기 어세이에 적합한 범위 로 설정한 후에, 검출용 핵산 (D)의 적하 또는 주입, 고정, 표적 핵산 (T)나 인터칼레이터의 적하 또는 주입, 전계 인가, 혼성화, 세정 또는 제거 작업, 검출(판독)등의 작업을 소정의 타이밍에 자동적으로 실시할 수 있도록 한 장치로서 기능한다.

즉, 이 장치 (100)은 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역을 표면에 갖는 기판을 처리하기 위한 방법을 실시할 수 있다.

예를 들면, 검출용 핵산 (D)가 고정된 반응 영역 (R)에 표적 핵산 (T)를 공급하는 핵산 공급 공정(가습을 행할 수도 있음), 상기 표적 핵산 (T)가 공급된 상기 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 온도를 제어하는 온도 제어 공정, 및 상기 반응 영역 (R)에서의 혼성화 상태를 판독하기 위한 판독 공정(예를 들면 광학적인 판독 공정)을 차례로 연속적으로 행하는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 기판의 반응 영역 (R)에 전계를 인가하는 공정을 실시하여 혼성화 효율이나 검출 정밀도를 향상시킬 수도 있다.

핵산 공급 공정에서 가습을 행함으로써 매질(예를 들면, 용액)의 건조를 방지할 수 있다. 또한, 온도 제어를 행하는 공정에서는 최적 온도 조건을 설정하여, 반응 영역 (R)에 고정된 검출용 핵산 (D)와 표적 핵산 (T) 간의 혼성화를 행할 수 있다.

여기서, 도 16은 DNA 칩의 제조 및/또는 혼성화 검출시에 채용 가능한 기판 처리 시스템의 개념 블록도이다.

이 도 16에 나타내어진 자동 처리 시스템 (200)은, 고정 작업이나 혼성화 검출 작업을 대량으로 행하는 경우에 특히 바람직한 자동화 시스템으로서 사용할 수 있다. 또한, 이 자동화 시스템의 개념이나 구성을 상기 기판 처리 장치 (100)에 응용할 수도 있다.

우선, 시스템 (200)은 (미고정 상태의) 기판 (1)이나 (고정된) DNA 칩 (10)을 소정 매수로 저장가능한 제1 스토커(stocker)(201)을 구비한다. 이 제1 스토커 (201)은 밀폐 가능한 공간을 구비하며 온도나 습도의 조건을 제어할 수 있는 수단을 구비한다.

또한, 제1 스토커 (201)은 스톡된 기판 (1)이나 DNA 칩 (10)을 자동 식별하여 다른 스테이지를 향해 배출하거나, 다른 스테이지에서 보내온 기판 (1)이나 DNA 칩 (10)을 식별하여 지정된 부분에 수용하거나 하는 기능을 갖는다.

또한, 본 시스템 (200)은 이 제1 스토커 (201) 사이에서 쌍방향으로 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 반송이 가능하게 구성되고, 노즐 헤드 (N₁), 매질 저류부, 매질의 적하 또는 주입을 제어하는 제어부 등(도 14 참조)이 배치된 스포팅ㆍ스테이지 (202)를 구비한다.

또한, 전계 인가를 위한 통전 수단이나 전계 인가를 제어하는 수단, 또한 온도나 습도를 제어하는 수단을 갖는 혼성화ㆍ스테이지 (203)을 구비한다.

이 혼성화ㆍ스테이지 (203)은 상기 제1 스토커 (201)나 상기 스포팅ㆍ스테이지 (202)의 사이에서 쌍방향으로 기판 (1)(또는 DNA 칩 (10))의 반송이 가능하게 구성되어 있다.

또한, 스포팅ㆍ스테이지 (202)는 복수개 부분에 설치될 수도 있고, 이 경우 각 스포팅ㆍ스테이지 (202)에 있어서 각각 다른 검출용 핵산 (D)가 적하 또는 주입되도록 한다.

도 16의 부호 (204)는 검출(판독) 스테이지를 나타낸다. 이 검출 스테이지 (204)에는 검출용 또는 서보용 광학계 수단(도 14 참조), DNA 칩 (10)의 회전 수단, 서보 기구 등이 설치되어 있다.

이 검출 스테이지 (204)는 혼성화가 완료된 DNA 칩 (10)의 각 검출부 (3)에 있어서의 혼성화 상태를 검출하는 장소이고, 도시하지 않는 해석부나 표시부와 연결되어 있다. 이 검출 스테이지 (204)는 혼성화ㆍ스테이지 (203), 또는 제1 스토커 (201)의 사이에서 쌍방향으로 DNA 칩 (10)의 이동이 가능하게 구성되어 있다.

부호 (205)는 제2 스토커이고, 검출 스테이지 (204)에서 검출 작업을 끝낸 DNA 칩 (10)을 회수하여 저장하는 장소이다. 또한, 이 제2 스토커 (205)는 스포팅ㆍ스테이지 (202)나 혼성화ㆍ스테이지 (203)으로부터의 기판 (1)이나 DNA 칩 (10)을 받아 회수하도록 할 수도 있다.

이상 설명한 바와 같은 시스템 (200)을 효과적으로 사용하면, 필요할 때에 원하는 어세이 작업을 신속하면서 또한 대량으로 실시할 수 있다.

<5. 혼성화 검출 방법에 대하여>

다음에, 본 발명에 따른 「혼성화 검출 방법」을 도 14에 부가적으로 도 17, 도 18을 주로 참조하여 구체적으로 설명한다. 또한, 도 17은 혼성화 검출 방법의 공정 플로우의 일례를 나타낸 도면, 도 18은 동일한 방법의 다른 공정 플로우를 나타내는 도면이다.

우선, 검출용 핵산 (D)가 이미 정렬 고정화되어 있는 DNA 칩 (10)을 수평으로 디스크 지지대 (8)(도 14 참조)에 고정한다. 또한, 포커스 서보 및 트랙킹 서보를 동작시키면서 DNA 칩 (10)을 회전시키고, 어드레스 정보를 검출하면서, 선택된 검출부 (3)에 표적 핵산을 함유하는 매질 (M₂)를, 노즐 헤드 (N₁)을 통해 적하 또는 주입한다(도 17의 부호 (P₆)으로 나타내는 공정).

다음에, 상기 반응 영역 (R)에 저류 또는 보유된 매질에, 대향 전극(예를 들면 (E₁)-(E₂), 도 4 참조)을 통해 「전계 인가」를 행함으로써 얻어지는 유전 영동에 의하여, 적어도 고정화되어 있는 검출용 핵산(D)의 신장과, 반응 영역 (R) 중에 유리 상태로 존재하는 표적 핵산 (T)의 신장 및 검출 표면 (U)로의 이동을 행한다(도 17의 부호 (P₇)로 나타내는 공정).

계속해서, 전계 오프 상태를 형성하거나 또는 전계 인가 상태를 계속하거나 하여, 검출용 핵산 (D)와 표적 핵산 (T) 간의 혼성화를 자연스러운 브라운 운동의 지배하에 진행시킨다(도 17의 부호 (P₈)로 나타내는 공정).

본 발명에서는 상기 전계 인가에 의해 입체 장해 등의 문제가 해소될 수 있기 때문에, 혼성화 반응을 매우 단시간에 완료할 수 있다. 또한, 상기 설명에서는, 공정 (P₇)과 (P₈)을 각각 분리하여 행하였지만, 동시에 행할 수도 있다.

또한, 본 방법에서는 검출부 (3) 단위에 반응 온도 조건을 선택할 수 있는 가온 수단, 및 검출부 (3)의 매질 온도를 검출하는 온도 검출 수단을 구비하도록 고안하여, 상기 검출용 핵산 (D)와 표적 핵산 (T) 사이의 최적 반응 조건에 기초하여 상기 가온 수단을 제어하여 작동시킴으로써, 상기 검출부 (3) 단위에 최적 온도조건을 설정하여 상기 검출용 핵산 (D)와 표적 핵산 (T) 간에 혼성화가 진행되도록 고안할 수도 있다.

다음에, 노즐 헤드 (N₁)을 통해 형광 표지된 인터칼레이터 (I)를 반응 영역 (R)에 적하 또는 주입하고, 이 인터칼레이터 (I)을 상기 혼성화에 의해 얻어진 이중가닥 핵산에 삽입 결합시킨다(도 17의 부호 (P₉)로 나타내는 공정). 또한, 이 공정 (P₉)는 상기 공정 (P₇)과 (P₈)을 동시에 행할 수도 있는 것은 물론이다. 또한, 후술하는 도 18에 나타내는 경우도 동일하다.

그 후에, 상기 반응 영역 (R)에 저류 또는 보유되어 있는 매질에 다시 「전계 인가」를 행함으로써 얻어지는 유전 영동에 의해, 미스 혼성화를 나타낸 물질이나 잉여 물질 (B)(예를 들면, 잉여 표적 핵산이나 잉여의 인터칼레이터, 도 7 참조)를 혼성화 영역(검출 표면 영역)으로부터 제거할 수도 있다(도 17의 부호 (P₁₀)으로 나타내는 공정).

상기 공정 (P₉) 또는 상기 공정 (P₁₀)에 이어서, 소정 파장의 여기광 (Q)를 반응 영역 (R)에 조사하여 얻어지는 형광 강도를, 상기한 시스템의 광 픽업 수단(도 14 참조)을 사용하여 검출한다(도 17의 부호 (P₁₁)로 나타내는 공정).

즉, 인터칼레이터로부터 발생한 형광 (F)의 강도를 검출하여, 검출용 핵산 물질과 표적 핵산의 혼성화 상황을 판단한다. 검출기 출력은 AD 변환기 (20)에 의해 특정 비트수의 디지탈 신호 (32)로 변환된다(도 12 참조).

이에 의해, DNA 칩 (10) 상의 어드레스와 형광 강도를 대응시킨 맵을 작성할 수 있다. 또한, 이 맵과 각 반응 영역 (R)에 대하여 어떠한 염기 서열이 검출용 핵산에 고정화되어 있는가를 나타내는 배치 맵에 기초하여, 표적 핵산을 해석한다(도 17의 부호 (P₁₂)로 나타내는 공정).

또한, 도 18에는 표적 핵산 (T)를 적하 또는 주입하는 공정 (P₆), 및 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 공정 (P₉)를 동시에 행하도록 고안한 변형예인 공정이 나타나 있다. 이 공정에서는, 공정 (P₆)과 공정 (P₉)를 병합함으로써 1 공정을 생략할 수 있는 결과, 작업 효율면에서는 유리해진다.

<6. 전계 인가의 방법에 대하여>

이하, 본 발명에 따른 방법에서 채용 가능한 「전계 인가」의 방법을 구체적인 예를 들어 설명한다.

이하에 설명하는 「전계 인가」는 기판 (1)로부터 DNA 칩 (10)을 제조할 때의 검출용 핵산의 고정화 공정, 또는 DNA 칩 (10)을 사용한 혼성화 검출시의 혼성화 공정, 및 그 전후의 공정에서, 각각의 전계 인가예의 작용 효과에 따라서 적절하게 채용 가능하다.

또한, 전계 강도, 주파수, 인가 시간은 한정되지 않고, 핵산의 종류, 길이 등에 의해 적정한 전계 강도, 주파수, 인가 시간을 선택하는 것이 바람직하다. 파 형에 대해서도 사인파로 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 삼각파 등일 수도 있다.

우선, 도 19는 부호 (W₁)로 나타내는 고주파 전계를 인가한 직후에, 부호 (W₂)로 나타내는 저주파 전계를 인가한 경우의 전계 인가예를 나타낸다. 계속해서, 도 20은 도 19에 있어서의 저주파 전계 (W₂) 인가 부분을, 부호 (W₃)으로 나타내는 저주파의 직사각형 교류 전계로 한 전계 인가예를 나타낸다.

다음에, 도 21은 도 19의 변형예이며, 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 전계를 0으로 하고(도면 중의 W₀ 부분 참조), 전극 주변에 유전 영동 효과로 모인 표적 핵산의 브라운 운동에 의한 자연스러운 혼성화를 일으키는 시간을 둔 후에, 저주파 전계 (W₂)를 인가한 방법예이다.

또한, 도 20의 전계 인가예에 있어서도, 저주파의 교류 전계 (W₃)을 인가하기 전에, 동일한 전계 0의 시간 (W₀)을 둘 수도 있다.

도 22는 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 부호 (W₄)로 나타내는 직류(DC) 전계를 인가하여, 전기 영동에 의해 표적 핵산을 전극에 가까이 끌어당기는 효과를 상승시키도록 고안하고, 그 후에 저주파 전계 (W₂)를 인가한 전계 인가예를 나타낸다.

도 23은 고주파 전계 (W₁)을 인가하기 전에 직류 전계 (W₄)를 인가해두고, 미리 전기 영동에 의해 표적 핵산을 전극에 가까이 당기고, 그에 이어서 고주파 전 계 (W₁)을 인가한 후에, 저주파 전계 (W₂)를 인가한 전계 인가예를 나타낸다.

도 24는 직류 성분도 동시에 인가하도록 한 고주파 전계 (W₅)를 인가해둠으로써, 전기 영동에 의해 표적 핵산을 전극에 가까이 끌어당기는 효과를 상승시키도록 하고, 그 후에 저주파 전계 (W₂)를 인가한 전계 인가예를 나타낸다.

도 25는 고주파 전계 (W₁)을 인가한 후에 직류 성분도 동시에 인가된 저주파 전계 (W₆)을 인가하도록 하여, 전기 영동에 의해 잉여의 상보적이지 않은 표적 핵산이나 미스 혼성화를 일으킨 핵산, 입체 장해가 원인이 되어 혼성화가 완전히 되지 않은 상보적인 표적 핵산을 전극 근방으로부터 떼어놓는 효과를 상승시키도록 한 전계 인가예를 나타낸다.

도 26은 직류 성분을 동시에 인가한 고주파 전계 (W₅)로 전기 영동에 의해 표적 핵산을 전극에 가까이 당기는 효과를 상승시키고, 그 후에 직류 성분을 동시에 인가한 저주파 전계 (W₆)을 인가해둠으로써, 전기 영동에 의해 잉여의 상보적이지 않은 핵산이나 미스 혼성화를 일으킨 표적 핵산, 입체 장해가 원인이 되어 혼성화가 완전히 되지 않은 상보적인 표적 핵산을 전극 근방에서 떼어놓는 효과를 상승시킨 전계 인가예를 나타낸다.

또한, 도시되지 않지만, 도 19 내지 도 26에 있어서 저주파 전계 (W₂) 부분을 저주파의 교류 전계 (W₃)으로 할 수도 있다. 또한, 저주파 전계 (W₂) 또는 저주 파의 교류 전계 (W₃)을 인가하기 전에 전계 0의 시간 (W₀)을 두고, 전극 주변에 유전 영동 효과로 모인 표적 핵산의 브라운 운동에 의한 자연스러운 혼성화를 일으키게 하는 시간을 둘 수도 있다.

본 발명은 기판에 설치된 미소한 반응 영역내에서 혼성화를 효율적으로 진행시킬 수 있기 때문에, 상기 혼성화의 시간을 대폭 단축시킬 수 있다. 또한, 정확한 혼성화가 진행되기 쉬운 조건이나 환경을 제공할 수 있기 때문에, 의양성이나 위음성의 발생을 적게 억제하여 검출 정밀도를 비약적으로 향상시킬 수 있다.

본 발명은 혼성화 검출에 따른 작업을 단시간에 효율적으로 실시할 수 있고, 또한 검출 정밀도가 높은 혼성화 검출을 실시할 수 있는 장치, 시스템 및 방법으로 사용할 수 있다.

Claims (49)

1. 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 및 상기 반응 영역에 저류(貯留) 또는 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치된 대향 전극을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 있는 기판을 사용하여, 적어도

   (1) 상기 기판의 표면 처리를 행하는 공정,

   (2) 상기 반응 영역에 저류 또는 보유되며 미리 제조된 검출용 핵산을 포함하는 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행함으로써, 상기 전극 표면에 상기 검출용 핵산을 고정하는 공정, 및

   (3) 잉여의 상기 검출용 핵산을 상기 반응 영역으로부터 제거하는 공정

   을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (1)의 공정이 상기 기판을 친매성 가공하는 공정인 DNA 칩의 제조 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 매질이 상기 반응 영역에 적하 또는 주입되어 상기 반응 영역에 저류 또는 보유되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 기판이 원반형 기판인 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 원반형 기판을 회전시키면서 상기 매질의 적하 또는 주입을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (2)의 공정이 전계 인가에 의한 유전 영동에 기초하여 상기 검출용 핵산을 이동시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 전계 인가가 고주파 전계 인가인 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 고주파 전계가 1 MV/m 이상 및 1 MHz 이상인 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 방법.
9. 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 및 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치된 대향 전극을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 있는 기판을 사용하며, 적어도

   미리 제조된 검출용 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 수단, 및

   상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극을 통해 전 계 인가를 행하는 수단

   을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 시스템.
10. 제9항에 있어서, 상기 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하고, 상기 반응 영역에 상기 매질을 저류 또는 보유시키기 위한 스포팅 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 시스템.
11. 제9항에 있어서, 상기 반응 영역에 존재하는 잉여의 상기 검출용 핵산을 상기 반응 영역으로부터 제거하는 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 시스템.
12. 제9항에 있어서, 상기 전계 인가를 행하는 수단이 고주파 전계 인가를 행하는 수단인 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 시스템.
13. 제9항에 있어서, 상기 기판을 회전시키는 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조 시스템.
14. 제13항에 있어서, 상기 적하 또는 주입하는 수단이 상기 기판의 회전과 동기(synchronism)로 상기 반응 영역에 매질을 공급하는 것인, DNA 칩의 제조 시스템.
15. 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치된 대향 전극, 및 상기 반응 영역 중에 고정된 검출용 핵산을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 있는 기판을 사용하여, 적어도

    (1) 미리 제조된 표적 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 공정,

    (2) 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행하는 공정,

    (3) 상기 검출용 핵산과 상기 표적 핵산 간에 혼성화를 진행시키는 공정,

    (4) 상기 반응 영역에 인터칼레이터(intercalator)를 적하 또는 주입하는 공정, 및

    (5) 소정 파장의 여기광을 상기 반응 영역에 조사하여 얻어지는 형광 강도를 검출하는 공정

    을 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 (1) 공정과 (4) 공정을 동시에 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 (3)의 공정을 전계 인가 상태에서 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 (3)의 공정을 전계 오프 상태에서 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
19. 제15항에 있어서, 적어도 상기 (5)의 공정을 행하기 전에, 상기 반응 영역 중에 존재하는 잉여의 표적 핵산을 혼성화 영역으로부터 제거하는 공정을 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
20. 제19항에 있어서, 전계 인가에 의해 혼성화 영역 밖의 전극 표면으로 잉여의 표적 핵산을 끌어당기는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
21. 제15항에 있어서, 상기 기판이 상기 여기광을 투과하는 층을 구비하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
22. 제15항에 있어서, 상기 여기광을 기판의 이면측에서 조사하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
23. 제15항에 있어서, 상기 (2) 공정의 전계 인가를 상기 기판 전체에, 또는 블록 영역마다 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
24. 제15항에 있어서, 상기 기판을 회전시키면서 상기 (1) 공정 및/또는 (4) 공 정을 행하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 (5) 공정에서 상기 기판을 회전시키는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 방법.
26. 혼성화 장소가 되는 반응 영역, 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 매질에 전계 인가가 가능하게 배치된 대향 전극, 및 상기 반응 영역 중에 고정화된 검출용 핵산을 적어도 구비하는 검출부가 배치되어 있는 기판을 사용하여, 적어도

    (1) 미리 제조된 표적 핵산을 포함하는 매질을 상기 반응 영역에 적하 또는 주입하는 수단,

    (2) 상기 반응 영역에 저류 또는 보유된 상기 매질에 상기 대향 전극을 통해 전계 인가를 행하는 수단,

    (3) 상기 검출용 핵산과 상기 표적 핵산 간에 혼성화를 진행시키는 수단,

    (4) 상기 반응 영역에 인터칼레이터를 적하 또는 주입하는 수단, 및

    (5) 소정 파장의 여기광을 상기 반응 영역에 조사하여 얻어지는 형광 강도를 검출하는 수단

    을 구비하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
27. 제26항에 있어서, 상기 기판이 상기 여기광을 투과하는 층을 구비하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
28. 제26항에 있어서, 상기 여기광의 광원이 기판의 이면측에 배치된 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
29. 제26항에 있어서, 상기 혼성화의 온도 제어 수단 및/또는 습도 제어 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
30. 제26항에 있어서, 상기 반응 영역에 수분을 보급하는 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
31. 제26항에 있어서, 상기 기판의 회전 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
32. 제26항에 있어서, 상기 기판의 상기 검출부의 위치 결정용 서보(servo) 수단 및 포커스 서보 수단을 갖는 것을 특징으로 하는 혼성화 검출 시스템.
33. 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역을 표면에 갖는 기판을 처리하기 위한 장치로서,

    (1) 검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 표적 핵산을 공급하는 공급 수단,

    (2) 상기 표적 핵산이 공급된 상기 기판의 온도 제어를 행하기 위한 가열 수단,

    (3) 상기 기판의 혼성화 상황을 판독하는 판독 수단, 및

    (4) 상기 기판을 반송하는 반송 수단

    을 갖는 기판 처리 장치.
34. 제33항에 있어서, 상기 기판에 전계를 인가하는 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
35. 제33항에 있어서, 상기 판독 수단이 광학적 판독 수단인 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
36. 제33항에 있어서, 상기 기판이 상기 반송 수단에 의해 상기 공급 수단과 상기 가열 수단과 상기 판독 수단 사이에서 연속적으로 반송되는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
37. 제33항에 있어서, 상기 공급 수단과 상기 가열 수단과 상기 판독 수단이 직렬로 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
38. 제33항에 있어서, 상기 공급 수단이 가습 수단을 구비하는 것을 특징으로 하 는 기판 처리 장치.
39. 제33항에 있어서,

    상기 공급 수단을 향해 상기 기판을 도입하기 위한 기판 도입 수단, 및

    상기 판독 수단으로부터 상기 기판을 배출하기 위한 기판 배출 수단

    을 구비하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
40. 제39항에 있어서, 상기 기판 도입 수단과 상기 기판 배출 수단이 공통의 수단인 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
41. 제39항에 있어서, 상기 공급 수단, 상기 가열 수단, 상기 판독 수단, 상기 기판의 도입구, 및 상기 기판의 배출구가 직렬로 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
42. 제33항에 있어서, 검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 용매를 공급하는 제2 공급 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
43. 제33항에 있어서, 혈액으로부터 핵산을 추출하는 추출 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 장치.
44. 혼성화 장소를 제공할 수 있는 반응 영역을 표면에 갖는 기판을 처리하기 위한 방법으로서,

    검출용 핵산이 고정된 상기 반응 영역에 표적 핵산을 공급하는 핵산 공급 공정,

    상기 표적 핵산이 공급된 상기 기판의 온도를 제어하는 온도 제어 공정, 및

    상기 반응 영역에서의 혼성화 상태를 판독하기 위한 판독 공정

    을 갖고, 상기 각 공정이 차례로 연속적으로 행해지는 기판 처리 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 기판에 전계를 인가하는 공정을 행하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 방법.
46. 제44항에 있어서, 상기 온도 제어를 행하는 공정에서 상기 검출용 핵산과 상기 표적 핵산 간의 혼성화를 행하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 방법.
47. 제44항에 있어서, 상기 판독 공정이 광학적 판독 공정인 것을 특징으로 하는 기판 처리 방법.
48. 제44항에 있어서, 상기 핵산 공급 공정과 상기 온도 제어 공정과 상기 판독 공정의 각 공정 사이에서 상기 기판이 반송되는 것을 특징으로 하는 기판 처리 방법.
49. 제44항에 있어서, 상기 핵산 공급 공정의 단계에서 가습을 행하는 것을 특징으로 하는 기판 처리 방법.

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