CN112326758A - 一种硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供了一种硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法，该硅纳米生物传感器由用于制备芯片的绝缘硅片制备，包括：硅纳米柱层；硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极；所述硅纳米柱上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子；所述桥连分子为活泼脂或Ni2+探针或马来酰亚胺；所述桥连分子上连接的生物大分子为：病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。由于本发明实施例提供的硅纳米生物传感器是由用于制备芯片的绝缘硅片制备的，使得检测性能更加稳定，更易推广使用。而且，该硅纳米生物传感器的桥连分子能够连接多种生物大分子，因此能够实现对不同病毒的检测。

Description

一种硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法。
背景技术
随着生物传感器技术的发展，出现了纳米生物电学传感器。目前，纳米生物电学传感器主要用于低浓度致病微生物的无标记实时检测，如离子、小分子、蛋白质、DNA、RNA和病毒。其基本原理是：将用于检测目标物的某种生物成分或生物体固定在纳米材料上，再将被检测样本与固定在纳米材料上的生物成分或生物体进行反应。当被检测样本中存在目标物，如被检测生物成分或生物体时，被检测生物成分或生物体与固定在纳米材料上的生物成分或生物体发生生物相互作用或者化学反应，引起纳米材料电流或者电压的变化，从而纳米生物电学传感器能够依据电学信号的变化来判断出检测结果。
纳米生物电学传感器具备高灵敏度和高选择性的优势，在环境检测、基因检测、细菌和病毒检测等方面非常有前景。然而，当前的纳米生物电学传感器技术发展还不够成熟，实际应用中，纳米生物电学传感器的检测性能不够稳定。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种具有高稳定性的硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法。
为了实现本发明实施例的目的，本发明实施例提供了一种硅纳米生物传感器，其由用于制备芯片的绝缘硅片制备，该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层和位于二氧化硅层上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱构成的硅纳米柱阵列；每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极；
所述硅纳米柱上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子；所述桥连分子为活泼脂或Ni2+探针或马来酰亚胺；
所述桥连分子上连接的生物大分子为：病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
其中，所述硅纳米生物传感器的硅纳米柱层，是由所述绝缘硅片的单晶硅层经减薄和刻蚀形成的；所述硅纳米柱阵列中的各个硅纳米柱之间相互平行；所述硅纳米柱的横截面设置为矩形，优选的高度为25-80nm，，宽度为50-300nm。
所述硅纳米柱阵列上可以设置有微流道微反应器。
所述的桥连分子可以为如下之一：
Figure BDA0002692845110000021
所述病毒抗原可以为新冠病毒SARS-CoV-2抗原，所述病毒抗体可以为SARS-CoV-2抗体，所述核酸探针可以为用于检测SARS-CoV-2病毒的核酸探针。
所述SARS-CoV-2抗原可以为：IgM和IgG抗原片段；
所述IgM和IgG抗原片段是由S蛋白和N蛋白1：1混合成的；
其中，S蛋白为：S1-RBD，其氨基酸排列顺序为：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF；
N蛋白的氨基酸排列顺序为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA；
所述SARS-CoV-2抗体为：IgM和IgG抗体片段；
所述用于检测新冠病毒的核酸探针，可以为下列单链DNA探针之一：
寡聚DNA探针：
5’-3’
ATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGAGTTGATCACAACTACAGCCATAAC
其中5’端修饰修饰氨基；或，
RdRp探针：
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基；或
N基因探针：
5’-3’
AGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCA。
本发明实施例还提供了一种上述硅纳米生物传感器的制备方法，包括：
A、对用于制备芯片的绝缘硅片最上层的单晶硅层进行减薄，减薄至所述硅纳米柱预设的高度；所述绝缘硅片包含：从下至上紧密排列的硅衬底层、二氧化硅层和单晶硅层；
B、对减薄后的绝缘硅片通过光刻曝光出图形后，进行刻蚀，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列；
C、利用热蒸镀沉积法，在各个硅纳米柱的两端蒸镀上金属电极，形成待修饰器件；
D、在待修饰器件的硅纳米柱上修饰上桥连分子；
E、在所述桥连分子上连接病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
其中，所述步骤A，可以包括：
A1、将绝缘硅片在干氧的条件下进行氧化，使得单晶硅层上部，有部分氧化为二氧化硅；反应温度为：900℃～1100℃；氧化时长：2～3小时；
A2、将绝缘硅片置于缓冲氧化物刻蚀液进行刻蚀，将单晶硅层减薄到25-80nm；所述缓冲氧化物刻蚀液由49％HF水溶液：40％NH4F水溶液＝1：6(体积比)的成分混合而成；反应时长10～20秒；
所述步骤B，包括：
B1、将器件通过紫外光刻曝光出图形后，将器件浸泡在40％四甲基氢氧化铵中刻蚀1～2分钟，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列。
上述的制备方法，还可以包括：
F、在修饰完成的器件上设置微流道微反应器。
本发明实施例还提供了一种病毒检测方法，使用上述任一硅纳米生物传感器进行检测，包括：
通过硅纳米生物传感器中每个硅纳米柱的两端的金属电极，检测硅纳米生物传感器在进行反应前和反应后的电流信号，基于电流信号的变化，判断待检测样品中是否有目标病毒。
本发明实施例有益效果：
本发明实施例提供的一种硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法，通过能够连接多种生物大分子的桥连分子，在硅纳米生物传感器上修饰了病毒抗原或病毒抗体或用于检测病毒的核酸探针。通过每个硅纳米柱的两端的金属电极，检测硅纳米生物传感器在进行反应前和反应后的电流信号，基于电流信号的变化，判断待检测样品中是否有目标病毒。由于本发明实施例提供的硅纳米生物传感器是由用于制备芯片的绝缘硅片制备的，使得检测性能更加稳定，更易推广使用。而且，该硅纳米生物传感器的桥连分子能够连接多种生物大分子，因此能够实现对不同病毒的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的一种结构示意图；
图1b为图1a所示实施例中硅纳米柱阵列结构示意图；
图1c为一种微流道微反应器的结构示例图；
图2为本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的第二种结构示意图；
图3为本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的第三种结构示意图；
图4a为本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的一种制备方法流程图；
图4b基于图4a所示的制备方法使得绝缘硅片变化的示意图；
图4c为基于图4a所示的制备方法得到的待修饰器件的俯视示意图；
图5为应用本发明实施例提供的硅纳米生物传感器进行新冠病毒核酸检测的灵敏度实验结果示意图；
图6为应用本发明实施例提供的硅纳米生物传感器进行新冠病毒核酸检测的特异性实验结果示意图；
图7为应用本发明实施例提供的硅纳米生物传感器进行新冠病毒免疫检测的灵敏度实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种具有高稳定性的硅纳米生物传感器及制备方法和病毒检测方法，以下分别进行详细说明。
本发明实施例提供的一种硅纳米生物传感器，其由用于制备芯片的绝缘硅片制备。该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层和位于二氧化硅层上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极；
所述硅纳米柱上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子；所述桥连分子为活泼脂或Ni2+探针或马来酰亚胺；
所述桥连分子上连接的生物大分子为：病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
在一种具体实施例中，所述硅纳米生物传感器的硅纳米柱层，是由所述绝缘硅片的单晶硅层经减薄和刻蚀形成的；所述硅纳米柱阵列中的各个硅纳米柱之间相互平行；所述硅纳米柱的横截面设置为矩形，优选的高度为25-80nm，宽度为50-300nm。由于工艺误差的原因，制备完成的硅纳米柱的横截面可能是梯形，高度为25-80nm，上底长为宽度50-300nm，下底长由于工艺误差会比宽度50-300nm稍宽。
实际应用中，用于制备芯片的绝缘硅片(SOI)包含：从下至上紧密排列的硅衬底层、二氧化硅层和单晶硅层，上述硅纳米生物传感器的硅纳米柱层，可以是由单晶硅层经减薄和刻蚀形成的。具体的，单晶硅层可以被减薄到25-80nm。由于硅纳米柱是横向放置，因此硅纳米柱层中各个硅纳米柱的高度就可以是单晶硅层的厚度，也就是说，硅纳米柱层中各个硅纳米柱的高度，也可以是25-80nm。
另外，在所述硅纳米柱阵列上还可以设置有微流道微反应器。
其中，所述的桥连分子可以为如下之一：
Figure BDA0002692845110000071
本发明实施例提供的硅纳米生物传感器是由用于制备芯片的绝缘硅片制备的，使得检测性能更加稳定，更易推广使用。而且，由于本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的桥连分子能够连接多种生物大分子(病毒抗原或病毒抗体或核酸探针)，因此能够实现对不同病毒的检测。例如：本发明实施例提供的硅纳米生物传感器，可以对流感病毒、新冠病毒等多种病毒进行检测。
以下，以对新冠病毒进行检测为例，进行详细说明。
在对新冠病毒进行检测时，可以在硅纳米生物传感器的桥连分子上修饰新冠病毒(SARS-CoV-2)抗原，或SARS-CoV-2抗体，或用于检测SARS-CoV-2的核酸探针。
具体的，所述SARS-CoV-2抗原为：IgM和IgG抗原片段；
所述IgM和IgG抗原片段是由S蛋白和N蛋白1：1混合成的；
其中，S蛋白为：S1-RBD，其氨基酸排列顺序为：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF；
N蛋白的氨基酸排列顺序为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA；
所述SARS-CoV-2抗体为：IgM和IgG抗体片段；
所述用于检测新冠病毒核酸探针，可以是下列三种单链NDA探针之一：
寡聚DNA探针
5’-3’
ATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGAGTTGATCACAACTACAGCCATAAC
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6
或，
RdRp探针
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6
或，
N基因探针
5’-3’
AGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCA
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6。
具体的，用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器，根据桥连分子上连接的不同的生物大分子，可以有三种实现方式，以下分别举实施例进行说明：
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例一：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子为SARS-CoV-2抗原。如图1a所示，该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层110、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层120和位于二氧化硅层120上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱130构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极140。其中，硅纳米柱也可以称为硅纳米棒。
实际应用中，用于制备芯片的绝缘硅片包含：从下至上紧密排列的衬底层、二氧化硅层和单晶硅层。本实施例中的硅纳米生物传感器的硅纳米柱层，是由所述绝缘硅片的单晶硅层经减薄和刻蚀形成的；所述硅纳米柱阵列中的各个硅纳米柱之间相互平行；所述硅纳米柱的横截面设置为矩形，高度为60nm，宽度为100nm。由于工艺误差的原因，制备完成的硅纳米柱的横截面可能是梯形，高度为60nm，上底长为宽度100nm，下底长由于工艺误差比宽度100nm稍宽。
所述硅纳米柱130上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子150；所述桥连分子150为：
Figure BDA0002692845110000091
所述桥连分子150上连接有SARS-CoV-2抗原160。
为了示意清楚，图1a中仅示出了硅纳米柱阵列中的两根硅纳米柱，硅纳米柱阵列中的各个硅纳米柱之间相互平行。实际硅纳米柱阵列包含很多的硅纳米柱，各个硅纳米柱之间也是不相交的，且每根硅纳米柱上的桥连分子150都修饰了很多SARS-CoV-2抗原160，图1a为了示意清楚，也仅在一根硅纳米柱上示出了两个SARS-CoV-2抗原160。
具体的，为了硅纳米生物传感器的硅纳米柱阵列中能够具有更多的硅纳米柱，可以用绝缘硅片制备成硅纳米生物传感器芯片。硅纳米生物传感器芯片中的硅纳米柱阵列可以如图1b所示进行排列，其中包含多个硅纳米柱130，每个硅纳米柱130的两端都镀有金属电极(8nm铬和80nm金)140。
具体的，所述桥连分子150上连接的SARS-CoV-2抗原160可以为：IgM和IgG抗原片段；
所述IgM和IgG抗原片段是由S蛋白和N蛋白1：1混合成的；
其中，S蛋白为：S1-RBD，其氨基酸排列顺序为：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF；
N蛋白的氨基酸排列顺序为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例二：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子也为SARS-CoV-2抗原。本实施例的硅纳米生物传感器是在图1a所示的硅纳米生物传感器的硅纳米柱阵列上设置微流道微反应器。微流道微反应器的结构如图1c所示，在微流道微反应器170中设置有贯穿微流道微反应器170上下的被测样品反应微腔171，使得硅纳米柱上修饰的桥连分子和SARS-CoV-2抗原位于被测样品反应微腔171中。被测样品以液态的形式滴入被测样品反应微腔171中进行反应，使得硅纳米柱两端的金属电极输电流信号，实时检测输出的电流信号，基于反应前和反应后电流信号的变化，判断待检测样品中是否有目标病毒。如果被测样品中，包含SARS-CoV-2抗体，则基于反应前和反应后电流信号的变化，能够待检测样品中有SARS-CoV-2抗体。
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例三：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子为SARS-CoV-2抗体。如图2所示，该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层110、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层120和位于二氧化硅层120上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱130构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极140。其中，硅纳米柱也可以称为硅纳米棒。本实施例中硅纳米柱的尺寸与图1a所示的实施例相同。
所述硅纳米柱130上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子150；所述桥连分子150为：
Figure BDA0002692845110000111
所述桥连分子150上连接有SARS-CoV-2抗体260。
所述SARS-CoV-2抗体为：IgM和IgG抗体片段。
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例四：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子为用于检测SARS-CoV-2的核酸探针。如图3所示，该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层110、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层120和位于二氧化硅层120上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱130构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极140。其中，硅纳米柱也可以称为硅纳米棒。本实施例中硅纳米柱的尺寸与图1a所示的实施例相同。
所述硅纳米柱130上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子150；所述桥连分子150为：
Figure BDA0002692845110000121
所述桥连分子150上连接有用于检测新冠病毒的核酸探针360，该核酸探针为：
寡聚DNA探针
5’-3’
ATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGAGTTGATCACAACTACAGCCATAAC
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6。
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例五：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子为用于检测SARS-CoV-2的核酸探针。本实施例与实施例四相似，区别仅在于采用了不同的核酸探针。本实施例采用的核酸探针为：
RdRp探针
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6
用于检测新冠病毒的硅纳米生物传感器实施例六：
本实施例中，桥连分子上连接的生物大分子为用于检测SARS-CoV-2的核酸探针。本实施例与实施例四相似，区别仅在于采用了不同的核酸探针。本实施例采用的核酸探针为：
N基因探针：
5’-3’
AGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCA
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6。
以下对本发明实施例提供的硅纳米生物传感器的制备方法进行详细说明。如图4a所示，本发明实施例提供的硅纳米生物传感器制备方法，包括如下步骤：
A、对用于制备芯片的绝缘硅片最上层的单晶硅层进行减薄，减薄至所述硅纳米柱预设的高度；所述绝缘硅片包含：从下至上紧密排列的硅衬底层、二氧化硅层和单晶硅层。
具体的，本步骤可以包括如下2个步骤：
A1、将绝缘硅片在干氧的条件下进行氧化，使得单晶硅层上部，有部分氧化为二氧化硅；反应温度为：900℃～1100℃；氧化时长：2～3小时；
A2、将绝缘硅片置于缓冲氧化物刻蚀液进行刻蚀，将单晶硅层减薄到25-80nm；所述缓冲氧化物刻蚀液由49％HF水溶液：40％NH4F水溶液＝1：6(体积比)的成分混合而成；反应时长10～20秒。
B、对减薄后的绝缘硅片通过光刻曝光出图形后，进行刻蚀，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列；
具体的，本步骤可以将器件通过紫外光刻曝光出图形后，将器件浸泡在40％四甲基氢氧化铵中刻蚀1～2分钟，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列。
C、利用热蒸镀沉积法，在各个硅纳米柱的两端蒸镀上金属电极，形成待修饰器件；
D、在待修饰器件的硅纳米柱上修饰上桥连分子；
E、在所述桥连分子上连接病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
其中，所述病毒抗原可以为新冠病毒SARS-CoV-2抗原或流感病毒抗原，所述病毒抗体可以为SARS-CoV-2抗体或流感抗体，所述核酸探针可以为用于检测SARS-CoV-2的核酸探针或用于检测流感的核酸探针。
硅纳米生物传感器的制备方法实施例：
本发明实施例提供的硅纳米生物传感器，是由用于制备芯片的绝缘硅片制备的。如图4b所示，绝缘硅片(SOI)包含：从下至上紧密排列的衬底层、二氧化硅层和单晶硅层。具体的制备过程，包括：
步骤1、将绝缘硅片(SOI)在干氧的条件下1000℃热氧化2小时，单晶硅部分氧化为二氧化硅。
如图4b所示，经过了步骤1后，在单晶硅部分的最上层，有部分单晶硅被氧化为二氧化硅。
步骤2、再将绝缘硅片置于6：1缓冲氧化物刻蚀液(49％HF水溶液：40％NH4F水溶液＝1：6(体积比)的成分混合而成)中反应15秒，将单晶硅层由200纳米(nm)减薄到25-80nm。
如图4b所示，经过了步骤2后，单晶硅层被减薄了。
步骤3、对减薄后的绝缘硅片通过紫外光刻曝光出图形后，将器件浸泡在40％四甲基氢氧化铵(TMAH)中刻蚀1分钟，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱(棒)阵列。并利用热蒸镀沉积金属电极(8nm铬和80nm金)，最后剥离形成待修饰器件。待修饰器件有如图4c所示的器件结构，待修饰器件400的单晶硅层被刻蚀成具有硅纳米柱阵列的硅纳米柱层，其中各个硅纳米柱401之间相互平行，每个硅纳米柱401的两端分别镀有金属电极402。
本实施例中，所述硅纳米柱401的横截面设置为矩形，高度为50nm，宽度为150nm.由于工艺误差的原因，制备完成的硅纳米柱的横截面是梯形，高度为50nm，上底长为宽度150nm，下底长由于工艺误差比宽度稍宽。
如图4b所示，经过了步骤3后，单晶硅层刻蚀成硅纳米柱(棒)阵列。
在其他的实施例中，可以是形成图1b所示的硅纳米柱阵列结构，制备成硅纳米生物传感器芯片。
步骤4、在待修饰器件的硅纳米柱上修饰上桥连分子，并在所述桥连分子上连接病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
如图4b所示，经过了步骤4后，硅纳米柱上修饰上桥连分子，并在所述桥连分子上连接了病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
下面对制备的硅纳米生物传感器芯片进行修饰的实施例进行详细说明。
对制备的硅纳米生物传感器芯片进行修饰的实施例：
本实施例中，是在硅纳米生物传感器芯片上，修饰的是SARS-CoV-2核酸探针。具体的是单链DNA探针：RdRp探针。修饰的过程具体包括：
步骤1、将硅纳米生物传感器芯片浸泡在氟化铵缓冲溶液(氢氟酸(40％):氟化铵(40％)＝1:7)7秒钟，在硅纳米柱(棒)表面形成Si-H键。在其他实施例中，反应时长可以在5～10秒选择。
步骤2、将硅纳米生物传感器芯片浸泡在十一碳炔酸溶液中，90℃氩气氛围下反应10小时。再将其浸泡在二氯甲烷中并超声30秒，去除器件表面未反应的残留物，并用氮气气流吹干。
步骤3、将硅纳米生物传感器芯片浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(20mM)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(10mM)的混合水溶液中，并在室温下反应1h(pH＝6.5)。反应完成后，芯片用去离子水润洗，并用氮气气流吹干。
步骤4、把芯片浸润在1mM的SARS-CoV-2核酸探针缓冲液中，反应12小时，然后缓冲液润洗，氮气吹干。
本实施例中，使用的SARS-CoV-2核酸探针为RdRp探针：
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基：NH2-C6。
本发明实施例还提供了一种病毒检测方法，该方法可以使用上述任一硅纳米生物传感器进行检测，包括：
通过硅纳米生物传感器中每个硅纳米柱两端的金属电极，检测硅纳米生物传感器在进行反应前和反应后的电流信号，基于电流信号的变化，判断待检测样品中是否有目标病毒。
具体实施时，可以搭建简单的电流检测电路，通过硅纳米生物传感器每个硅纳米柱的两端的金属电极，对硅纳米生物传感器施加电压，检测硅纳米生物传感器在进行反应前和反应后的电流值，基于电流值变化是否大于预设差值阈值，来判断待检测样品中是否有目标病毒。
以下，以对新冠病毒的检测为例，对病毒检测方法进行详细说明。
病毒检测实施例一
本实施例中，采用图3所示的硅纳米生物传感器，该传感器的桥连分子150上连接的用于检测新冠病毒的核酸探针360，为：
RdRp探针：
5’-CATGACCATTTCACTCAATACTTGAGCACACTCATTAGCTAATCTATAGAAACGGTGTGACAAGCTACAACACGTTGTATGTTTGCGAGCAAGAACAAGT-3’，其中，5’端修饰氨基。
先通过每个硅纳米柱的两端的金属电极140，为未滴加待检测样品溶液的硅纳米生物传感器加电，检测硅纳米生物传感器输出的电流值。然后，在硅纳米生物传感器上滴加待检测样品溶液，检测硅纳米生物传感器输出的电流信号，基于反应前后电流值差值对反应前电流值的占比是否大于预设阈值，判断待检测样品中是否有新冠病毒。
具体的，对于制备出的硅纳米生物传感器芯片，可以先检测出该芯片在未反应之前的电流值。再将25μL的待检测样品，本实施例中待检测样品为目标RNA的缓冲溶液，滴加到芯片中心，在85℃条件下加热9分钟后与硅纳米柱上的核酸探针发生互补配对反应。检测反应后的电流值，基于反应前后电流值差值对反应前电流值的占比是否大于预设阈值，判断待检测样品中是否有新冠病毒。
病毒检测实施例二
采用上述硅纳米生物传感器实施例二的硅纳米生物传感器，该硅纳米生物传感器的硅纳米阵列上设置了微流道微反应器。病毒检测方法为：将被测样品以液态的形式滴入被测样品反应微腔171中进行反应，使得硅纳米柱两端的金属电极输电流信号，实时检测输出的电流信号，基于反应前后电流值差值对反应前电流值的占比是否大于预设阈值，判断待检测样品中是否有新冠病毒。
以下，通过实验数据，对本发明实施例的有益效果进行说明。
一、采用应用本发明实施例提供的硅纳米生物传感器进行新冠病毒核酸检测的实验。
1、灵敏度和特异性实验
采用的硅纳米生物传感器，为：基于图3所示的硅纳米生物传感器构成的硅纳米生物传感器芯片。
该传感器芯片的桥连分子150上连接的用于检测新冠病毒的核酸探针360，为：
单链DNA核酸探针：RdRp探针：
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基。
实验包括：
11、采用新冠病毒RNA的一段保守序列(RdRp)，检测灵敏度。
该RdRp序列为与RdRp探针互补的序列：
5’-3’
CATGACCATTTCACTCAATACTTGAGCACACTCATTAGCTAATCTATAGAAACGGTGTGACAAGCTACAACACGTTGTATGTTTGCGAGCAAGAACAAGT
实验的过程为：
通过每个硅纳米柱的两端的金属电极，为硅纳米生物传感器芯片加电压，先检测出该芯片在未反应之前的电流值I0。
制备待检测样品，本实施例中为包含RdRp序列的缓冲溶液。
将待检测样品滴加到芯片中心，在85℃条件下加热9分钟后与硅纳米柱上的核酸探针发生互补配对反应。
检测反应后的电流值，基于反应前后电流值的比值是否大于预设阈值，判断待检测样品中是否有新冠病毒。
实验结果如图5所示，其中，图5的左图表明了5种不同浓度(10-1fg/mL～103fg/mL)下的RdRp序列的缓冲溶液，分别滴加到硅纳米生物传感器芯片后，硅纳米生物传感器芯片的电流ID随施加电压VD的变化情况。图5右图表明了5种不同浓度(10-1fg/mL～103fg/mL)下的RdRp序列的缓冲溶液检测后，反应前电流I0与反应后电流ID的电流差值ΔID与反应前电流I0之间的占比关系。
由图5的右图可见，用浓度为10-1fg/mL的RdRp序列的缓冲溶液进行检测，反应前后电流值差值ΔID对反应前电流值I0的占比大于预设阈值2。因此，灵敏度实验结果表明该硅纳米生物传感器核酸检测的最低检测限可以达到0.1fg/mL(约为1,800copies/mL)。
12、采用新冠病毒RNA的错配RNA序列，检测特异性。
该错配RNA序列可以为：
5’-3’
TGAAGCGCTGGGGGCAAATTGTGCAATTTGCGGCCAATGTTTGTAATCAGTTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTCCCCAAAATTTCCTTGGGTTTGTTCT。
该错配RNA序列是新冠病毒RNA中选取的，不能与硅纳米生物传感器上的RdRp探针发生互补配对的一段序列。
实验的过程为：
通过每个硅纳米柱的两端的金属电极，为硅纳米生物传感器芯片加电压，先检测出该芯片在未反应之前的电流值I0。
制备待检测样品，本实施例中为包含错配RNA序列的缓冲溶液。
将5种不同浓度(10-1fg/mL～103fg/mL)下的错配RNA的缓冲溶液，分别作为待检测样品滴加到芯片中心，在85℃条件下加热9分钟后与硅纳米柱上的核酸探针进行反应。
实验结果如图6所示，反应前后电流值差值ΔID对反应前电流值I0的占比很小，均小于预设阈值2。因此，特异性实验结果表明该硅纳米生物传感器能够特异性识别目标RNA片段。
2、新冠病毒病人的临床实验
21.阳性组：采用临床检测中7例光学法核酸检测(RT-qPCR检测)测得的阳性患者；
22.对照组：采用7例RT-qPCR检测法均呈阴性健康人。
检测特异性：在14例现场检测中，有7例新冠病毒2019-nCoV阳性患者，7例阴性对照者。与RT-qPCR检测方法比较，该方法检测结果显示：对7例2019-nCoV阳性患者全部检出，阳性准确率100％；对7例2019-nCoV阴性健康人也全部检出，阴性准确率100％。总体结果与RT-qPCR检测法结果完全吻合，但是核酸检测时间由24小时大大缩减为10分钟，具备明显的优势。具体测试结果和对照如下表：
Figure BDA0002692845110000201
Figure BDA0002692845110000211
二、应用本发明实施例提供的硅纳米生物传感器进行新冠病毒免疫检测的灵敏度实验。
1、灵敏度实验
采用的硅纳米生物传感器，为基于图1所示的硅纳米生物传感器构成的硅纳米生物传感器芯片。
该硅纳米生物传感器芯片的桥连分子150上连接的是SARS-CoV-2抗原：IgM和IgG抗原片段。
实验的过程为：
通过每个硅纳米柱的两端的金属电极，为硅纳米生物传感器芯片加电压，先检测出该芯片在未反应之前的电流值I0。
制备待检测样品，待检测样品为包含25μL抗体的缓冲溶液。
具体的，本实施例采用SARS-CoV-2IgG抗体作为目标抗体来检测芯片的灵敏度。
将待检测样品滴加到芯片中心，室温条件下反应4min与硅纳米柱上的SARS-CoV-2抗原特异性结合。
实验结果如图7所示，其中，图7的左图表明了5种不同浓度(100fg/mL～104fg/mL)下的抗体的缓冲溶液，分别滴加到硅纳米生物传感器芯片后，硅纳米生物传感器芯片的电流ID随施加电压VD的变化情况。图7右图表明了5种不同浓度(100fg/mL～104fg/mL)下的抗体缓冲溶液检测后，反应前电流I0与反应后电流ID的电流差值ΔID与反应前电流I0之间的占比关系。
由图7的右图可见，用浓度为100fg/mL抗体的缓冲溶液进行检测，反应前后电流值差值ΔID对反应前电流值I0的占比大于预设阈值3。因此，灵敏度实验结果表明传感器免疫检测的最底检测限可以达到1fg/mL。
2、新冠病毒病人的临床实验
21.阳性组：采用临床检测中6例胶体金法测得的阳性患者；
22.对照组：采用6例胶体金法均呈阴性健康人。
检测特异性：在12例现场检测中，有6例2019-nCoV阳性患者，6例阴性对照者。与胶体金试纸检测方法比较，该方法检测结果显示：对6例2019-nCoV阳性患者全部检出，阳性准确率100％；对6例2019-nCoV阴性健康人也全部检出，阴性准确率100％。总体结果与胶体金试纸结果完全吻合，但是免疫检测时间由24小时大大缩减为5分钟，具备明显的优势。
具体测试结果和对照如下表：
编号 胶体金检测结果 硅纳米生物传感器结果 一致性
1 阳性 阳性 是
2 阳性 阳性 是
3 阳性 阳性 是
4 阳性 阳性 是
5 阳性 阳性 是
6 阳性 阳性 是
7 阴性 阴性 是
8 阴性 阴性 是
9 阴性 阴性 是
10 阴性 阴性 是
11 阴性 阴性 是
12 阴性 阴性 是
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种硅纳米生物传感器，其特征在于，由用于制备芯片的绝缘硅片制备，该硅纳米生物传感器包括：硅衬底层、位于所述硅衬底层上的二氧化硅层和位于二氧化硅层上的硅纳米柱层；其中，硅纳米柱层包含：由多个横向放置的硅纳米柱构成的硅纳米柱阵列；且每个硅纳米柱的两端分别镀有金属电极；
所述硅纳米柱上修饰有用于连接生物大分子的桥连分子；所述桥连分子为活泼脂或Ni2 +探针或马来酰亚胺；
所述桥连分子上连接的生物大分子为：病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
2.根据权利要求1所述的硅纳米生物传感器，其特征在于，所述硅纳米生物传感器的硅纳米柱层，是由所述绝缘硅片的单晶硅层经减薄和刻蚀形成的；所述硅纳米柱阵列中的各个硅纳米柱之间相互平行；所述硅纳米柱的横截面设置为矩形，优选的高度为25-80nm，宽度为50-300nm。
3.根据权利要求1所述的硅纳米生物传感器，其特征在于，所述硅纳米柱阵列上设置有微流道微反应器。
4.根据权利要求1所述的硅纳米生物传感器，其特征在于，
所述的桥连分子为如下之一：
Figure FDA0002692845100000011
5.根据权利要求1所述的硅纳米生物传感器，其特征在于，
所述病毒抗原为新冠病毒SARS-CoV-2抗原，所述病毒抗体为SARS-CoV-2抗体，所述核酸探针为用于检测SARS-CoV-2病毒的核酸探针。
6.根据权利要求4所述的硅纳米生物传感器，其特征在于，
所述SARS-CoV-2抗原为：IgM和IgG抗原片段；
所述IgM和IgG抗原片段是由S蛋白和N蛋白1：1混合成的；
其中，S蛋白为：S1-RBD，其氨基酸排列顺序为：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF；
N蛋白的氨基酸排列顺序为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA；
所述SARS-CoV-2抗体为：IgM和IgG抗体片段；
所述用于检测新冠病毒的核酸探针，为下列单链DNA探针之一：
寡聚DNA探针：
5’-3’
ATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGAGTTGATCACAACTACAGCCATAAC
其中5’端修饰修饰氨基；或，
RdRp探针：
5’-3’
ACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATG
其中，5’端修饰氨基；或
N基因探针：
5’-3’
AGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCA。
7.一种权利要求1所述硅纳米生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：
A、对用于制备芯片的绝缘硅片最上层的单晶硅层进行减薄，减薄至所述硅纳米柱预设的高度；所述绝缘硅片包含：从下至上紧密排列的硅衬底层、二氧化硅层和单晶硅层；
B、对减薄后的绝缘硅片通过光刻曝光出图形后，进行刻蚀，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列；
C、利用热蒸镀沉积法，在各个硅纳米柱的两端蒸镀上金属电极，形成待修饰器件；
D、在待修饰器件的硅纳米柱上修饰上桥连分子；
E、在所述桥连分子上连接病毒抗原或病毒抗体或核酸探针。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤A，包括：
A1、将绝缘硅片在干氧的条件下进行氧化，使得单晶硅层上部，有部分氧化为二氧化硅；反应温度为：900℃～1100℃；氧化时长：2～3小时；
A2、将绝缘硅片置于缓冲氧化物刻蚀液进行刻蚀，将单晶硅层减薄到25-80nm；所述缓冲氧化物刻蚀液由49％HF水溶液：40％NH4F水溶液＝1：6(体积比)的成分混合而成；反应时长10～20秒；
所述步骤B，包括：
B1、将器件通过紫外光刻曝光出图形后，将器件浸泡在40％四甲基氢氧化铵中刻蚀1～2分钟，将单晶硅层刻蚀成硅纳米柱阵列。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括：
F、在修饰完成的器件上设置微流道微反应器。
10.一种病毒检测方法，其特征在于，使用权利要求1～6任一硅纳米生物传感器进行检测，包括：
通过硅纳米生物传感器中每个硅纳米柱的两端的金属电极，检测硅纳米生物传感器在进行反应前和反应后的电流信号，基于电流信号的变化，判断待检测样品中是否有目标病毒。
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