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Technisches
Gebiet
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Die Erfindung betrifft ein Substrat
zur kontrollierten Benetzung vorbestimmter Benetzungsstellen mit kleinen
Flüssigkeitsvolumina.
Die Erfindung betrifft ferner ein Herstellungsverfahren, eine Substratabdeckung für ein solches
Substrat, sowie eine Flusskammer mit einem Substrat und einer Substratabdeckung.
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Stand der
Technik
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Das kontrollierte Benetzen eines
Substrates mit einer Flüssigkeit
hat breite Anwendung in Industrie und Wissenschaft. Speziell im
Bereich der Biowissenschaften, der Medizintechnik und der Sensorik
wurde in den letzten Jahren das Herstellen von mikrostrukturierten
Substraten für
die Analytik vorangetrieben, um so genannte Lab-on-a-chip Produkte
zu erhalten. Diese Produkte sollen es im sogenannten High-throughput-screening
(HTS) ermöglichen,
in paralleler Weise eine Vielzahl von möglichen Reaktionen in kurzer
Zeit automatisiert zu untersuchen. Für diese Produkte ist es allerdings
notwendig, kleine Flüssigkeitsmengen
sowohl für
eine Funktionalisierung der Oberflächen als auch zum Aufbringen
der Testflüssigkeiten
bei einer Analyse in gezielter Weise an ausgezeichneten Stellen
des Substrates aufbringen zu können.
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Im Bereich der Sensorik werden zwei
verschiedene Ansätze
für die
Analytik von Flüssigkeiten
eingesetzt:
Die Reaktion zweier Komponenten kann durch das
Mischen zweier flüssiger,
die Komponenten enthaltenden Phasen in einem Reaktionsgefäß untersucht
werden. Durch diese Reaktion ändern
sich Eigenschaften der Flüssigkeiten
im Reaktionsgefäß in detektierbarer
Weise. Die Analytik in der Volumenphase hat auf der einen Seite
den Vorteil, dass speziell Proteine ihre spezifischen Funktionen
beibehalten, wobei auf der anderen Seite die oft benötigten großen Volumina
von Nachteil sind. Somit ist es nötig, Substrate zu schaffen,
die extrem kleine Reaktionsgefäße zur Verfügung stellen.
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Im einem anderen Ansatz benutzt man
Oberflächen,
die mit verschiedenen Kopplungsgruppen versehen sind und spezifisch
bestimmte Analyten binden können,
um unbekannte Flüssigkeiten
auf das Vorhandensein dieser Analyten zu untersuchen. Hierzu muss
die Sensoroberfläche
zunächst
mit den Kopplungsgruppen funktionalisiert, dann mit der unbekannten
Flüssigkeit
in Kontakt gebracht und anschließend das Anbinden des Analyten
detektiert werden. Auch hier muss also wieder mit kleinen Volumina
auf Substraten gearbeitet werden.
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Für
die Detektion solcher Bindungsereignisse an Oberflächen stehen
im Stand der Technik eine Vielzahl von Verfahren wie Fluoreszenzspektroskopie,
Radiometrie, Elektrochemie und eine Vielzahl Oberflächen-sensitive
Methoden wie AFM, SPR oder Schwingquarze zur Verfügung.
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Speziell im Bereich der DNA-Analytik
oder der Proteom-Forschung bestehen die unbekannten Analyt-Flüssigkeiten
meistens aus einer großen
Anzahl verschiedener Substanzen in extrem kleinen Mengen, so dass
ein potentieller Sensor zur Analyse dieser Flüssigkeiten mit Hinblick auf
die für
industrielle Anwendungen wichtigen Faktoren wie Kosten oder Zeit
einen hohen Grad an Parallelisierung aufweisen, mit sehr kleinen
Materialmengen auskommen und sehr sensitiv sein muss. Die Parallelisierung
einer solchen Analyse kann entweder durch eine laterale Strukturierung
der Sensoroberfläche
in Bereiche verschiedener Funktionalitäten bzw. im Falle eines Volumenansatzes
durch eine große
Anzahl an Reaktionsgefäßen erreicht
werden.
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Für
die Parallelisierung von Analysen in der Volumenphase stehen kommerziell
erhältliche
Mikrotitter-Platten zur Verfügung,
die mit Volumina von nur etwa 10 μl
pro Reaktionsgefäß betrieben
werden können. Um
aber das parallele Befüllen
der Platten mit solch kleinen Volumina in kurzer Zeit zu erreichen
sind meist teure Pipetier-Roboter nötig.
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Für
die Analyse einer unbekannten Flüssigkeit
mit Hilfe der oben beschriebenen Sensoroberflächen mit lateral begrenzten
Bereichen unterschiedlicher Funktionalitäten stehen im Weiteren zwei
Möglichkeiten
zur Verfügung:
das Benetzen des gesamten Substrates oder aber das gezielte Benetzen
nur der funktionalisierten Bereiche des Substrates mit der Analyt-Flüssigkeit.
Beide gerade erwähnten
Varianten der Analyse einer unbekannten Flüssigkeiten mit einer Sensoroberfläche weisen
jedoch entscheidende Nachteile auf. Das Benetzen der gesamten Sensoroberfläche führt zu einem
großen
Todvolumen, so dass dieses Verfahren sehr große Flüssigkeitsmengen benötigt. Durch
die gezielte Benetzung nur der funktionalisierten Bereiche der Substratoberfläche wird
zwar die zu verwendende Flüssigkeitsmenge
drastisch reduziert, auf der anderen Seite werden aber spezielle
Geräte
nötigt,
die dieses gezielte Aufbringen kleiner Volumina ermöglichen.
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Aus dem Stand der Technik sind für das gezielte
Aufbringen kleiner Volumina kommerziell erhältliche Spotter (z.B. der Firma
Cartesian Technologies) bekannt, die aber mit erheblichen Anschaffungskosten
verbunden sind und geschultes Personal erfordern. Ein weiteres Verfahren
zur partiellen Benetzung eines Substrates mit einer Flüssigkeit
ist das Mikrokontakt-Drucken μCP
(mico-contact-printing), das erstmals von Whitesides 1994 (A. Kumar,
G.M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60;
US-A-6 048 623 ) vorgestellt
wurde. Bei diesem Verfahren wird ein mikrostrukturierter Stempel
mit einer Flüssigkeit
benetzt, anschließend
in direktem Kontakt mit dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und
so der Oberfläche
eine laterale chemische Struktur aufgeprägt. Eine große Schwierigkeit
dieser Technik ist die Realisierung eines gleichförmigen Kontakts
zwischen Stempel und Substrat, der für das Gelingen bzw. die Qualität von entscheidender
Bedeutung ist.
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Somit sind alle bekannten Verfahren
für breite
Anwendungen, beispielsweise zur standardisierten Analytik in einer
Arztpraxis, nur bedingt geeignet.
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Darstellung
der Erfindung
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Hier setzt die Erfindung an. Der
Erfindung, wie sie in den Ansprüchen
gekennzeichnet ist, liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat und
ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, das die kontrollierte
Benetzung vorbestimmter Benetzungsstellen mit kleinen Flüssigkeitsvolumina
insbesondere zu Analysezwecken ermöglicht und die eingangs genannten
Nachteile des Stands der Technik vermeidet.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das Substrat nach Anspruch 1 oder Anspruch 28, die Substratabdeckung
nach Anspruch 45, die Flusskammer nach Anspruch 47 und das Herstellungsverfahren nach
Anspruch 50 oder Anspruch 51 gelöst.
Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der
Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
werden die folgenden Abkürzungen
und Begriffe benutzt: Allgemeines
Genetik
Chemikalien
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In einem ersten Aspekt umfasst ein
gattungsgemäßes Substrat
erfindungsgemäß eine Trägerplatte
mit einer horizontalen Hauptfläche
zur Benetzung mit einer Flüssigkeit
an vorbestimmten Benetzungsstellen, und eine auf die Trägerplatte
aufgebrachte flächige
Schutzschicht, die die Hauptfläche
von der Umgebung trennt. Die Schutzschicht weist sich zur Hauptfläche der
Trägerplatte
erstreckende vertikale Aussparungen auf, die die vorbestimmten Benetzungsstellen
auf der Trägerplatte
definieren, und enthält
einen oder mehrere zu den vertikalen Aussparungen führende Zuführungskanäle mit reduzierter
Dicke der flächigen
Schutzschicht, zum Zuführen
der Benetzungsflüssigkeit
zu den vorbestimmten Benetzungsstellen.
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Dabei fallen im Sinne der vorliegenden
Erfindung unter den Begriff Flüssigkeit
nicht nur reine flüssige Stoffe,
sondern auch Flüssigkeiten
mit Detergenz, jede Art von gelösten
organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen
und kolloidalen Lösungen.
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Durch die Struktur aus Zuführungskanälen, die
zu den Benetzungsstellen führen,
wird die für
eine Analyse benötigte
Analytflüssigkeit
im Vergleich zur Benetzung des gesamten Substrates deutlich verringert.
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Nach einer bevorzugten Ausgestaltung
sind die vertikalen Aussparungen in dem Zuführungskanal oder den Zuführungskanälen angeordnet.
Insbesondere kann jede vertikale Aussparung in genau einem Zuführungskanal
liegen und kann somit über
diesen mit der Benetzungsflüssigkeit
versorgt werden. Nach einer anderen bevorzugten Variante liegt jede
vertikale Aussparung im Schnittpunkt von mehreren Zuführungskanälen. Während erfindungsgemäß bevorzugt
ist, dass jede vertikale Aussparung im Schnittpunkt von genau zwei Zuführungskanälen liegt,
sind auch solche Varianten Teil der Erfindung, bei denen jede vertikale
Aussparung im Schnittpunkt von beispielsweise drei oder vier Zuführungskanälen liegt.
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In diesem Zusammenhang kann mit Vorteil
auch vorgesehen sein, dass in einem Schnittpunkt von zwei oder mehreren
Zuführungskanälen jeweils
eine Gruppe von mehreren vertikalen Aussparungen liegt. Eine solche
Gruppe kann je nach beabsichtiger Anwendung beispielsweise vier
oder sechzehn einzelne Aussparungen umfassen und dient insbesondere
der Verbesserung der Messstatistik.
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Die vertikalen Aussparungen oder
Aussparungsgruppen sind mit Vorteil in Form einer n × m Matrix
mit n Zeilen und m Spalten angeordnet, wobei n und m größer oder
gleich 2 sind, und wobei bevorzugt n und m jeweils unabhängig voneinander
zwischen 10 und 1000 liegen. Bevorzugt ist dabei, dass die Anzahl
n der Zeilen und die Anzahl m der Spalten gleich ist, und/oder dass
die lateralen Abstände
benachbarter Aussparungen oder Aussparungsgruppen in den Zeilen
und Spalten gleich sind.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung
sind die m Aussparungen oder Aussparungsgruppen einer Zeile jeweils
in einem von n parallelen Zeilen-Zuführungskanälen angeordnet.
Auch die n Aussparungen oder Aussparungsgruppen einer Spalte können mit
Vorteil jeweils in einem von m parallelen Spalten-Zuführungskanälen angeordnet
sein, so dass jede Aussparung oder Aussparungsgruppen im Schnittpunkt
eines Zeilen- und eines Spalten-Zuführungskanals
liegt. Vorteilhaft weisen die Zeilen-Zuführungskanäle und die Spalten-Zuführungskanäle gleiche
Querschnittsform auf.
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In einer anderen besonders bevorzugten
Ausgestaltung ist jeweils eine n' × m' Teilmatrix von Aussparungen
oder Aussparungsgruppen in einem mäanderförmigen Zuleitungskanal angeordnet,
wobei n = kn · n' und m = km · m' ist, mit ganzen
Zahlen kn und km größer oder
gleich 1. Beispielsweise können
kn und km beide gleich
1 sein, so dass n' =
n und m' = m ist,
also alle Benetzungsstellen der n × m Aussparungsmatrix in einem einzigen
mäanderförmigen Zuführungskanal
angeordnet sind und von diesem mit der Benetzungsflüssigkeit versorgt
werden. Ist nach einen anderen Beispiel kn =
n/2 und km = 1 gewählt, so dass n' = 2 und m' = m ist, so sind
jeweils zwei Zeilenkanäle
zu einem U-förmigen Kanal
zusammengefasst. In diesem Fall können der Einlass und Auslass
der Kanäle
auf derselben Seite des Substrats liegen.
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Die Dicke der Schutzschicht in den
Zuführungskanälen ist
gegenüber
der Dicke der Schutzschicht außerhalb
der Aussparungen und Zuführungskanäle zweckmäßig um 10%
bis 99%, bevorzugt um 20% bis 95%, besonders bevorzugt um 50% bis
95% reduziert.
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Dabei weist die Schutzschicht in
einer vorteilhaften Ausgestaltung außerhalb der Aussparungen und Zuführungskanäle eine
Dicke dS zwischen 50 μm und 200 μm, bevorzugt zwischen 100 μm und 150
um auf. In den Zuführungskanälen weist
die Schutzschicht eine reduzierte Dicke dK zwischen
5 μm und
150 μm,
bevorzugt zwischen etwa 10 μm
und etwa 50 μm
auf.
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Die Zuführungskanäle verlaufen bevorzugt im Wesentlichen
parallel zur Hauptfläche
der Trägerplatte. Sie
können
allerdings auch eine leichte Steigung oder ein leichtes Gefälle aufweisen.
Der Querschnitt der Zuführungskanäle ist mit
Vorteil rechteckig oder trapezförmig.
Dies ermöglicht
eine unproblematische Herstellung und sichert einen guten Verschluss
der Kanäle
bei Verwendung der weiter unten beschriebenen Substratabdeckung.
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Die Zuführungskanäle weisen mit Vorteil eine
charakteristische Breite bK zwischen 5 μm und 250 μm, bevorzugt
von etwa 10 μm
bis etwa 150 μm
auf. Dabei ist die charakteristische Breite bK bei
rechteckigem Querschnitt einfach durch die konstante Breite der
Kanäle
gegeben. Bei Zuführungskanälen mit
trapezförmigen
Querschnitt ist die charakteristische Breite bK durch
das arithmetische Mittel der Breite des Kanals am Boden und an der
oberen Kanalbegrenzung gegeben. Analog ergibt sich eine charakteristische
Breite bK für andere Querschnittsformen
durch die Bedingung, dass das Produkt aus der charakteristische
Breite und der Kanaltiefe gleich der Querschnittsfläche ist.
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Die Benetzungsstellen weisen nach
der Erfindung bevorzugt eine charakteristische Ausdehnung von etwa
5 μm bis
etwa 200 μm,
bevorzugt von etwa 10 μm
bis etwa 100 μm
auf.
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Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung
des erfindungsgemäßen Substrats
weisen die vertikalen Aussparungen einen im Wesentlichen rechteckigen,
elliptischen oder kreisförmigen
Querschnitt auf. In letzterem Fall ist die angesprochene charakteristische
Ausdehnung durch den Kreisradius gegeben, in den anderen Fällen durch
das aritmethische Mittel der Seitenlängen bzw. der großen und
kleinen Ellipsenachse gegeben.
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Zur Ausbildung von Flusskammern kann
das Substrat mit einer Deckplatte bedeckt sein, die die Zuführungskanäle nach
oben verschließt.
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In einem zweiten Aspekt umfasst die
Erfindung ein gattungsgemäßes Substrat
mit einer Trägerplatte mit
einer horizontalen Hauptfläche
zur Benetzung mit einer Flüssigkeit
an vorbestimmten Benetzungsstellen, und einer auf die Trägerplatte
aufgebrachten flächigen
Schutzschicht, die die Hauptfläche
von der Umgebung trennt, wobei die Schutzschicht eine oder mehrere
Einsenkungen mit reduzierter Dicke der flächigen Schutzschicht zur Aufnahme
eines Vorratsvolumens von Benetzungsflüssigkeiten enthält, und
in den Einsenkungen angeordnete, sich zur Hauptfläche der
Trägerplatte
erstreckende vertikale Aussparungen aufweist, die die vorbestimmten
Benetzungsstellen auf der Trägerplatte
definieren, und die die Benetzungsflüssigkeit aus der jeweiligen
Einsenkung aufnehmen. Diese Ausführungsform
der Erfindung stellt eine einfache Variante dar, um Gruppen von
Benetzungsstellen mit jeweils einer Art von Flüssigkeit zu benetzen.
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Die vertikalen Aussparungen sind
vorzugsweise jeweils in Form einer n × m Matrix mit n Zeilen und
m Spalten in den Einsenkungen angeordnet, wobei n und m größer oder
gleich 2 sind, und wobei bevorzugt n und m jeweils zwischen 4 und
20 liegen. Bevorzugt ist dabei, wenn die Anzahl n der Zeilen und die
Anzahl m der Spalten gleich ist, und/oder wenn die lateralen Abstände benachbarter
Aussparungen in den Zeilen und Spalten gleich sind.
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Wie beim ersten Aspekt der Erfindung
ist die Dicke der Schutzschicht in den Einsenkungen gegenüber der
Dicke der Schutzschicht außerhalb
der Aussparungen und den Einsenkungen um 10% bis 99%, bevorzugt um
20% bis 95%, besonders bevorzugt um 50% bis 95% reduziert. Die Schutzschicht
weist außerhalb
der Aussparungen und den Einsenkungen mit Vorteil eine Dicke dS zwischen 50 μm und 200 μm, bevorzugt zwischen 100 μm und 150 μm auf. In
den Einsenkungen weist die Schutzschicht eine reduzierte Dicke dK auf, die vorteilhaft zwischen 5 μm und 150 μm, bevorzugt
zwischen etwa 10 μm
und etwa 50 μm
liegt.
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Die Einsenkungen können beispielsweise
einen rechteckigen oder trapezförmigen
Querschnitt aufweisen. Ihre charakteristische Abmessung liegt typischerweise
zwischen 100 μm
und 2000 μm,
bevorzugt zwischen etwa 300 μm
und etwa 1000 μm.
Die charakteristische Abmessung ist beispielsweise bei kreisförmigem Querschnitt
durch den Kreisradius oder bei rechteckigem Querschnitt durch das
aritmethische Mittel der Seitenlängen
gegeben.
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Die in den Einsenkungen angeordneten
Benetzungsstellen weisen mit Vorteil eine charakteristische Ausdehnung
von etwa 5 μm
bis etwa 200 μm,
bevorzugt von etwa 10 μm
bis etwa 100 μm
auf, und sie haben, wie beim ersten Aspekt, vorzugsweise einen im
Wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Querschnitt.
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In beiden Aspekten besteht die auf
die Trägerplatte
aufgebrachte Schutzschicht zweckmäßig aus einem Material, das
an die zu benetzende Hauptfläche
der Trägerplatte
physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung
bindet. Sie kann insbesondere durch einen positiven oder negativen
Photolack, einen Lötstopplack,
ein organisches Polymer, insbesondere Cellulose, Dextran oder Collagen gebildet
sein. Die Schutz schicht wird vor der Benetzung mit einer beliebigen,
dem Schutzschichtmaterial angepassten Technik aufgebracht.
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Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung
weist die Trägerplatte
einen Grundkörper
aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, einem porösem Material
oder einer Kombination dieser Materialien auf. Im Falle eines nichtleitfähigen Grundkörpers ist
die Trägerplatte
bevorzugt mit einer leitfähigen
Schicht, beispielsweise aus Silizium, Platin oder Gold versehen,
welche dann die zu benetzende Hauptfläche der Trägerplatte bildet.
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In einer bevorzugten Weiterbildung
der Erfindung sind bei beiden Aspekten die vorbestimmten Benetzungsstellen
mit spezifischen Sondenmolekülen
funktionalisiert. Insbesondere sind dabei Sondenmoleküle an den
vorbestimmten Benetzungsstellen an die Hauptfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert
oder kovalent, koordinativ oder über
Komplexbildung gebunden.
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Die vorbestimmten Benetzungsstellen
sind in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung mit Nukleinsäure-Oligomeren
funktionalisiert, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen
bzw. Markern modifiziert sind. Insbesondere können die Nukleinsäure-Oligomere
zur Visualisierung mit einem Fluorophor modifiziert sein.
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In einer vorteilhaften Variante ist
die zu benetzende Hauptfläche
der Trägerplatte
durch eine Goldschicht gebildet und die vorbestimmten Benetzungsstellen
sind mit Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert.
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Die Erfindung umfasst auch eine Substratabdeckung
für ein
Substrat nach dem ersten Aspekt der Erfindung mit einer Abdeckungsträgerplatte
mit einer Mehrzahl vorspringender Barriereelemente, deren Form und
Größe auf die
Form und Größe der Zuführungskanäle des Substrats
abgestimmt sind, um die Zuführungskanäle in Teilbereichen
zu verschließen.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung
sind die Barriereelemente auf der Abdeckungsträgerplatte so angeordnet, dass
sie nach dem Verbinden der Substratabdeckung mit dem Substrat nur
eine oder eine bestimmte Anzahl an Kanalrichtungen offen lassen.
Die Benetzungsstellen der unverschlossenen Kanäle können dann gezielt mit verschiedenen
spezifischen Sondenmolekülen
funktionalisiert bzw. mit einer Analytflüssigkeit versorgt werden. Durch
die verschlossenen Zeilen-Zuführungskanäle bzw.
Spalten-Zuführungskanäle wird
eine Beeinflussung benachbarter Kanäle ausgeschlossen.
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Die Barriereelemente können beispielsweise
durch Laser-Ablation aus einer vollflächigen Lackschicht auf der
Abdeckungsträgerplatte
erzeugt werden. Je nach Anwendung ist es möglich, diese Substratabdeckung permanent
mit dem Substrat zu verkleben, oder aber die Abdeckung mobil zu
montieren, um später
weitere Benetzungsschritte mit anderen oder derselben Abdeckung
in anderen Stellungen zu ermöglichen.
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Die Erfindung umfasst ferner eine
Flusskammer mit einem Substrat nach dem ersten Aspekt der Erfindung
und einer beschriebenen Substratabdeckung. Die Substratabdeckung
kann dabei mit dem Substrat permanent oder lösbar verbunden sein.
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Gemäß einer bevorzugten Weiterentwicklung
weist die Anordnung der Aussparungen und der Zuführungskanäle des Substrats eine mehrzählige Symmetrie
auf. Die Barriereelemente der Substratabdeckung sind dabei so auf
der Abdeckungsträgerplatte
angeordnet, dass die Substratabdeckung in verschiedenen Orientierungen
auf dem Substrat platzierbar ist und dabei jeweils verschiedene
Teile der Zuführungskanäle verschließt. Mit
einer einzigen Substratabdeckung können so verschiedene Benetzungsmuster
auf dem Substrat erzeugt werden.
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Insbesondere kann die Flusskammer
ein Substrat mit einer n × n
Aussparungsmatrix umfassen, bei dem jede Aussparung im Schnittpunkt
zweier Zuführungskanäle liegt
und die Zeilen- und Spalten-Zuführungskanäle gleiche
Querschnittsform aufweisen. Die Barriereelemente der Substratabdeckung
verschließen
dann in einer ersten Orientierung die Zeilen-Zuführungskanäle und in einer zweiten, um
90° gegen
die erste Orientierung gedrehten Orientierung die Spalten-Zuführungskanäle.
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Ein Verfahren zum Herstellen eines
Substrats nach dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst die Verfahrensschritte:
- a) Bereitstellen einer Trägerplatte mit einer horizontalen
Hauptfläche,
- b) Aufbringen einer flächigen
Schutzschicht auf die Trägerplatte,
die die Hauptfläche
von der Umgebung trennt,
- c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung eines oder
mehrerer Zuführungskanäle mit reduzierter Schutzschichtdicke,
und
- d) Erzeugen vertikaler Aussparungen in dem Zuführungskanal
oder den Zuführungskanälen, welche
sich zur Hauptfläche
der Trägerplatte
erstrecken und die vorbestimmten Benetzungsstellen auf der Hauptfläche der
Trägerplatte
definieren.
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Ebenfalls Teil der Erfindung ist
ein Verfahren zum Herstellen eines Substrats nach dem zweiten Aspekt der
Erfindung, welches die Verfahrensschritte
- a)
Bereitstellen einer Trägerplatte
mit einer horizontalen Hauptfläche,
- b) Aufbringen einer flächigen
Schutzschicht auf die Trägerplatte,
die die Hauptfläche
von der Umgebung trennt,
- c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung einer oder
mehrerer Einsenkungen mit reduzierter Schutzschichtdicke, und
- d) Erzeugen vertikaler Aussparungen in den Einsenkungen, welche
sich zur Hauptfläche
der Trägerplatte erstrecken
und die vorbestimmten Benetzungsstellen auf der Hauptfläche der
Trägerplatte
definieren,
umfasst.
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In einer vorteilhaften Verfahrensvariante
wird mit einem Vorhanggießverfahren
ein Lötstopplack
als Schutzschicht aufgebracht.
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Die Aussparungen und/oder die Zuführungskanäle bzw.
die Einsenkungen werden vorzugsweise mittels Laserablation, insbesondere
durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder
gepulster Laserstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge, bevorzugt
im ultravioletten Spektralbereich erzeugt. Die Laserstrahlung kann
direkt oder über
eine Optik bzw. eine Maske auf die abzutragende Schutzschicht gerichtet
werden.
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Dabei wird beim Erzeugen der Aussparungen
in Schritt d) zweckmäßig eine
Oberflächenregion
der Trägerplatte
im Bereich der Benetzungsstellen aufgeschmolzen. Durch das Aufschmelzen
der Oberfläche
ergibt sich eine reduzierte Oberflächenrauhigkeit und eine verbesserten
Homogenität
der Oberfläche
der Trägerplatte.
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Nach einer bevorzugten Weiterbildung
werden die vorbestimmten Benetzungsstellen dann in einem Schritt
e) mit spezifischen Sondenmolekülen
funktionalisiert. Insbesondere können
die vorbestimmten Benetzungsstellen in Schritt e) mit einem Spotting-Verfahren
mit Nukleinsäure-Oligomeren
funktionalisiert werden.
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Alternativ können die vorbestimmten Benetzungsstellen
bei einem Substrat nach dem ersten Aspekt der Erfindung in Schritt
e) durch Einspülen
einer Lösung
mit Nukleinsäure-Oligomeren
in die Zuführungskanäle funktionalisiert
werden. Bei einem Substrat nach dem zweiten Aspekt der Erfindung
können
die vorbestimmten Benetzungsstellen durch Befüllen der Einsenkungen mit einer
Lösung
mit Nukleinsäure-Oligomeren
funktionalisiert werden.
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Weitere Ausgestaltungen und Vorteile
der Erfindung werden nachfolgend im Detail beschrieben:
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Aufbringen
einer Schutzschicht auf das Substrat
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Erfindungsgemäß sind die Substrate nach dem
ersten oder zweiten Aspekt mit einer Schutzschicht versehen. Diese
Schutzschicht kann den kritischen Zeitraum zwischen der Herstellung
der Trägerplatte
und der Benetzung ihrer Oberfläche überbrücken, da
die Schutzschicht das Adsorbieren von Verunreinigungen verhindert.
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Für
die Schutzschicht kann jedes beliebige Material verwendet werden,
das an einer Oberfläche
eine geschlossene Schicht bildet und somit die Substratoberfläche von
der Umgebung trennt und zu einem späterem Zeitpunkt etwa durch
Laser-Ablation an gewünschten
Stellen entweder in seiner gesamten Dicke rückstandsfrei entfernt oder
aber auf Bruchteile der ursprünglichen
Dicke reduziert werden kann. Es versteht sich, dass mit Vorteil
für eine
gegebene Trägerplatte
eine angepasste Schutzschicht gewählt wird, die in Bezug auf die
Haftung zwischen Trägerplatte
und Schutzschicht optimiert ist. Ebenso lässt sich die Schutzschicht
im Hinblick auf die zu verwendende Flüssigkeit optimieren. Im Falle
von wässrigen
Lösungen
bietet sich ein hydrophiles Schichtmaterial an, so dass die Flüssigkeiten
die Zuleitungskanäle
der Erfindung benetzen und Luftblasen vermieden werden. Bei öligen Flüssigkeiten
ist hingegen hydrophobes Material zu bevorzugen.
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Durch die Zugabe von Detergenzien
zu den verwendeten Flüssigkeiten
lassen sich unabhängig
vom Schichtmaterial verbesserte Benetzungen der Kanalstrukturen
und damit gute Flusseigenschaften erreichen. Neben üblichen
bekannten Lacken aus der Lithographie (positive und negative Photolacke)
und der Leiterplatten-Technologie (Lötstopplacke) eignen sich auch
organische Polymere wie Cellulose, Dextran oder Collagen. Auch ist
es denkbar, Lacke zu verwenden, deren spezielle Bestandteile beim
Trocknen des Materials an der Oberfläche vorteilhafte Funktionalisierungen
für besondere
Anwendungen ausbilden.
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Die Schutzschicht kann beispielsweise
durch Sprühen
im Falle der Photolacke, durch Spincoating oder Physisorption im
Falle der organischer Polymere oder durch Siebdruck bzw. Vorhanggießen im Falle
der Lötstopplacke
auf die Trägerplatte
aufgebracht werden. Bei den bevorzugten, aus von der Leiterplattentechnologie
bekannten Lötstopplacken,
eignen sich sowohl 2-Komponenten
als auch 1-Komponenten Lötstopplacke,
die über
Vorhanggießverfahren,
Siebdruck oder Sprayverfahren aufgebracht werden und anschließend an
der Luft oder durch UV-Bestrahlung aushärten können. Ein Vorteil dieser Verfahrensvariante
besteht darin, dass die Dicke der Lötstopplackschicht z.B. im Vorhanggießverfahren
durch die Geschwindigkeit der Trägerplatte
unter dem Lackvorhang in einem großen Bereich frei wählbar eingestellt
werden kann.
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Laser-Ablation
der Schutzschicht in beliebiger Geometrie
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Unter dem Begriff "Laser-Ablation" versteht man nicht
nur das partielle oder vollständige
Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, sondern
auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einer Trägerplatte
durch Einstrahlung von Laserlicht. Im Rahmen der Erfindung wird
die Laser-Ablation
mit Vorteil zur Entfernung oder Strukturierung der aufgebrachten
Schutzschicht an gewünschten
Stellen des Substrates in beliebiger Geometrie eingesetzt. Somit
ist es möglich,
verschiedene, genau definierte freie Substratflächen oder Bereiche mit verjüngter Schutzschicht
in unterschiedlicher Größe auf ein
und demselben Substrat-Design nur durch Veränderung der Laser-Belichtung zu realisieren.
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Ein weiterer Gesichtspunkt ist das
Aufschmelzen der Trägerplattenoberfläche bei
vollständigem
Entfernen der Schutzschicht mittels Laser-Ablation, das durch Einstellung
der Laserintensität
oder der Bestrahldauer auf die Gegebenheiten der Trägerplatte
und der Schutzschicht erreicht werden kann. Dieses kurzfristige, oberflächennahe
Aufschmelzen der Trägerplattenoberfläche schließt neben
der Reduktion der Oberflächenrauhigkeit
auch vorhandene Poren im Material und verbessert somit die Homogenität der freien
Trägerplattenoberfläche. Außerdem werden
durch die Ablation weniger Goldlagen von der Oberfläche Verunreinigungen
entfernt.
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Die Laser-Ablation kann durch direkte
Einstrahlung des Lichts oder aber durch Einstrahlung des Lichts über eine
Optik bzw. eine Maske erfolgen. Die Größe oder die Form der einzelnen
freizulegenden oder strukturierten Benetzungsstellen und ihr lateraler
Abstand sind hierbei beliebig und nur von der jeweiligen Anwendung
abhängig.
Die Wellenlänge
des verwendeten Laserlichts, sowie Einstrahldauer bzw. Anzahl und
Dauer der Pulse hängen
von der Kombination aus Schutzschicht und des Materials der Trägerplattenoberfläche ab und
werden vorzugsweise für
jedes Paar optimiert.
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In einer bevorzugten Variante der
Erfindung werden mit einem Excimer-Laser über mehrere Masken in mehreren
Prozessschritten Strukturen aus Kanälen bzw. Einsenkungen und sich
zur Trägerplatte
erstreckende Aussparungen in einen Lötstopplack geschrieben, welche
das gezielte Benetzen der freien oder funktionalisierten Benetzungsstellen
mit einer oder mehreren verschiedenen die Analyten enthaltenden
Flüssigkeiten
ermöglichen.
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Beispielsweise werden in Lötstopplackschichten
von typischerweise 100 – 150 μm Dicke mit
einer bestimmten Anzahl an Laser-Pulsen verschiedene Kanäle der Tiefe
80 – 100 μm und der
Breite 10 – 150 μm geschnitten
und dann innerhalb der Kanäle
das Substrat an ein oder mehreren Stellen mit Durchmessern von etwa
d = 10 – 100 μm durch weitere
Laser-Pulse freigelegt, um die Benetzungsstellen zu definieren.
Hierbei sind die lateralen Ausdehnungen der freigelegten Benetzungsstellen
kleiner oder gleich der Breite der Zuleitungskanäle.
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Funktionalisierung der
freigelegten Substratstellen
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Im Rahmen der Erfindung wird unter
der Funktionalisierung der Substratoberfläche das Aufbringen von Molekülen auf
die Benetzungsstellen des Substrats verstanden, die spezifisch andere
Moleküle
aus einer Probensubstanz binden können. Diese Moleküle werden
für die
Funktionalisierung in beliebigen organischen und anorganischen Lösungsmittel
oder Mischungen von Flüssigkeiten
gelöst
mit der Hauptfläche
der Trägerplatte
in Kontakt gebracht. Nach einer gewissen Inkubationszeit liegen
die Sondenmoleküle
(Ligaten) mit dem Substrat physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent,
koordinativ bzw. über
Komplexbildung gebunden vor.
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Auf dem Gebiet der Sensorik lassen
sich mit der vorliegenden Erfindung alle Arten von Ligaten, die
an den Benetzungsstellen auf die Trägerplatte aufgebracht sind,
kontrolliert mit verschiedenen Analytflüssigkeiten in Kontakt bringen
und diese auf das Vorhandensein ihrer spezifischen Liganden untersuchen.
Als Ligaten werden Moleküle
bezeichnet, die spezifisch mit einem Liganden unter Ausbildung eines
Komplexes wechselwirken. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden
Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner
eines Proteins (Enzyms), Antikörper
(als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner
eines Antikörpers),
Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als
Komplexbindungspartner eines Rezeptors), Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner
des komplementären
Nukleinsäure-Oligomers) oder Metallkomplexe.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
der Erfindung werden die freien Benetzungsstellen mit modifizierten
Nukleinsäure-Oligomeren
in wässriger
Lösung
benetzt. Das Nukleinsäure-Oligomer,
das auf die freie Oberfläche
aufgebracht werden soll, ist über
einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und
Kettenlänge
mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei sich
diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers
befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich bevorzugt um
Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren
können.
Beispiele hierfür
sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere
der allgemeinen Formel (n × HS-Spacer)-oligo, (n × R-S-S-Spacer)-oligo
oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter
Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren, (ii) Amine, die
sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern
und (iii) Silane, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung
eingehen.
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An der anderen Seite des Nukleinsäure-Oligomers
ist das Molekül über einen
weiteren Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge mit
einem Fluorophor modifiziert, um die Funktionalisierung der freien
Substratstellen zu visualisieren. Für die Funktionalisierung der
freigelegten Stellen kommen sowohl Einspülen über geeignete Zuleitungskanäle als auch
Spotting-Techniken in Frage.
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Herstellung
von Substrat-Abdeckungen zur Realisierung von Flusskammern und für das Einführen von
variablen Fiüssigkeits-Barrieren
in die Kanalstrukturen
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Mit Hilfe der Laser-Ablation lassen
sich im Rahmen der Erfindung auch Abdeckungen für die jeweiligen Substrate
mit unterschiedlichen Kanalstrukturen herstellen. Diese Abdeckungen
stellen nicht nur einen Verschluss der Kanalstrukturen zur Realisierung
von Flusskammern dar, sondern können
auch an gewünschten Stellen
Barrieren für
die Analytflüssigkeiten
in die Kanäle
einführen.
Durch diese Barrieren kann man im Falle von Kanalanordnungen mit
sich kreuzenden Kanälen
das Fließen
der Flüssigkeiten
von einem Kanal in die anliegenden Kanäle verhindern und somit Kreuzreaktionen
ausschließen.
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Zur Herstellung der oben beschriebenen
Abdeckung kann eine beliebige Abdeckungsträgerplatte mit Lötstopplack
beschichtet werden, dessen Dicke der Tiefe der Kanäle der zugehörigen Kanalstruktur
entspricht. Anschließend
wird der Lack durch Laser-Ablation so entfernt, dass nur noch die
gewünschten Barrieren
stehen bleiben. Die Länge
dieser Barrieren ist zweckmäßig durch
die Breite der Zuführungskanäle und die
Breite der Barrieren durch den lateralen Abstand der Kanäle gegeben.
Dadurch wird eine besonders gute Abschirmung benachbarter Zuführungskanäle erreicht.
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Realisiert man beim Design der Kanalstrukturen
der Substrate eine mehrzählige
Symmetrie, so kann eine einzelne Abdeckung durch Drehen um den Symmetriewinkel
sukzessive als Barriere für
verschiedene Teilgruppen der Zuführungskanäle fungieren.
Dabei sind Substratabdeckungen möglich,
die entweder nur eine oder aber mehrere der verschiedenen Kanalrichtungen
offen lassen.
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Durch die Verwendung eines Substrates
mit freigelegten, funktionalisierten Benetzungsstellen in den Schnittpunkten
von Kanalstrukturen mit k-zähliger
Symmetrie und einer geeigneten, beweglichen Abdeckung, lassen sich
alle Benetzungsstellen der Matrix sukzessive und kontrolliert mit
bis zu k/2 verschiedenen Analytflüssigkeiten benetzen, ohne dass
Kreuzreaktionen erfolgen. Im Falle einer Anordnung von zueinander
senkrechten Gruppen von Kanälen
mit Reaktionsgefäßen im Kreuzungspunkt
je zweier Kanäle
(4-zählige
Symmetrie), lassen sich im Falle einer n × n-Matrix von Benetzungsstellen
n2 Kombinationen potentieller Bindungspartner
analysieren.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
der Erfindung werden die oben beschriebenen Abdeckungen aus mit
Lötstopplack
beschichteten Glassubstraten hergestellt.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Nachfolgend soll die Erfindung anhand
von Ausführungsbeispielen
im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Dabei sind nur
die für
das Verständnis
der Erfindung wesentlichen Elemente dargestellt. Es zeigt
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1 eine
schematische Darstellung der Anordnung von Zuführungskanälen und Benetzungsstellen in
einem Substrat nach einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung;
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2 einen
Querschnitt durch das Substrat von 1 entlang
der Linie II-II, teilweise mit funktionalisierten Benetzungsstellen;
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3 in (a) und (b) SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation
freigelegten Benetzungsstellen in einer Stopplack-Schutzschicht;
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4 in (a) ein AFM-Bild einer gelaserten
und aufgeschmolzenen Gold-Oberfläche und
in (b) ein Querschnitts-Höhenprofil
entlang der Linie B-B
aus 4(a);
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5 eine
Fluoreszenzaufnahme von mit Fluorophor modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren,
die an freigelegten Benetzungsstellen eines Substrates immobilisiert
sind;
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6 eine
schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignisen
bei hohem Salzgehalt durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an
Quench-Oberflächen.
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7 in (a) bis (d) schematische Darstellungen der Anordnung
von Zuführungskanälen nach
weiteren Ausführungsbeispielen
der Erfindung;
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8 in (a) einen Ausschnitt einer
möglichen
Kanalstruktur und in (b) den Ausschnitt einer zugehöriger Substratabdeckung,
am Beispiel einer freigelegten, quadratischen Stelle im Kreuzungspunkt
zweier Kanäle
mit einer Abdeckung, die je nach Stellung einen der Kanäle blockieren
kann. In 8(a) ist ein
Teil der Lackschicht transparent dargestellt, um das Innere der
Struktur zu zeigen.
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9 in (a) das Substrat von 7(c), bei dem jede Benetzungsstelle
im Schnittpunkt zweier zueinander senkrechter Zuleitungskanäle liegt,
in (b) eine zugehörige in
mehreren Orientierungen auf dem Substrat platzierbare Substratabdeckung,
in (c) das Substrat mit
verschlossenen Spalten-Zuleitungskanälen und in (d) das Substrat mit verschlossenen Zeilen-Zuleitungskanälen;
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10 eine
schematische Darstellung eines Substrats mit einer Einsenkung nach
einem anderen Ausführungsbeispiel
der Erfindung; und
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11 einen
Querschnitt durch das Substrat von 10 entlang
der Linie XI-XI,
teilweise mit funktionalisierten Benetzungsstellen.
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Wege zur Ausführung der
Endung
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Ein Substrat 10 zur kontrollierten
Benetzung vorbestimmter Benetzungsstellen nach einem ersten Ausführungsbeispiel
der Erfindung und ein Verfahren zu seiner Herstellung wird nunmehr
mit Bezug auf die 1 und 2 näher erläutert. Dabei zeigt 1 das Substrat 10 in
Aufsicht und 2 stellt
einen Querschnitt durch das Substrat 10 entlang der Linie
II-II von 1 dar. Der Übersichtlichkeit
halber ist in 1 und 2 und in einigen der nachfolgenden
Figuren ein Substrat mit einer lediglich 4 × 4 großen Matrix an Benetzungsstellen dargestellt.
Es versteht sich, dass größere Matrizen
im Rahmen der Erfindung liegen und für die parallele Analyse einer
Vielzahl möglicher
Reaktionen bevorzugt sind.
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Das Substrat 10 umfasst
eine Trägerplatte 12,
die im Ausführungsbeispiel
durch ein Glas-Slide 14 mit einer aufgedampften Goldschicht 16 gebildet
ist. Dazu wird auf das Glas-Slide 14 zunächst eine
in den Figuren nicht dargestellte, 5 nm dicke CrNi-Kontaktschicht
und auf diese dann eine 200 nm dicke Goldschicht 16 aufgedampft.
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Auf das Substrat wird ein 2-Komponenten
Lötstopplack
(Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) in einem aus der Leiterplatten-Technologie
bekannten Vorhanggieß-Verfahren
auf die Trägerplatte 12 aufgebracht, um
eine Schutzschicht 20 für
die Oberfläche 18 der
Trägerplatte 12 zu
bilden. Durch die Variation der Transportgeschwindigkeit der Trägerplatte 12 unter
dem Lack-Vorhang
lassen sich die bevorzugten Dicken der Schutzschicht 20 im
Bereich von etwa 10 – 150 μm erreichen.
Im Ausführungsbeispiel
der 1 und 2 weist die Schutzschicht 20 eine
Dicke dS von etwa 150 μm auf.
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Nach dem Trocknen des Lacks wird
die Schutzschicht 20 mit einem Excimer-Laser der Firma Lambda-Physics durch
Laserablation strukturiert. Der Laser kann über verschiedene Masken verkleinert
auf das Substrat 10 abgebildet werden, wobei die Flächenintensität der Bestrahlung über die
Abbildungsvorrichtung eingestellt wird. Je nach Maske lassen sich
so verschiedene Geometrien der ablatierten Regionen realisieren.
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Mit Hilfe der Laser-Ablation werden
zwei Strukturen in die Lötstopplack-Schutzschicht 20 geschrieben. In
einem ersten Strukturierungsschritt werden über eine erste Maske Zuführungskanäle 22 in
den Lack geschnitten, wobei sich die Tiefe dieser Kanäle 22 durch
die Anzahl der Laserpulse einstellen lässt. Eine Kanaltiefe von etwa
80 – 120 μm wird beispielsweise
mit etwa 540 – 900
Pulsen (á 20
ns) des Lasers mit einer Flächenleistung
von 600 – 1200
mJ/cm2 erreicht. Die Breite der Kanäle ist je
nach Anwendung und gewünschtem lateralen
Abstand (typisch im Bereich von 50 – 200 μm) beliebig einstell bar und
bewegt sich typischerweise im Bereich von 10 – 150 μm. Im Ausführungsbeispiel enthält das Substrat 10 vier
parallele Zeilen-Zuführungskanäle 22 mit
rechteckigem Querschnitt, die eine Tiefe von etwa 100 μm und eine
Breite von etwa 70 μm
aufweisen. Innerhalb der Kanäle
ist die Dicke der Schutzschicht 20 somit von ihrem Ausgangswert
dS auf einen Wert dK von
etwa 50 μm
reduziert.
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Anschließend werden in einem zweiten
Strukturierungsschritt über
eine zweite Maske in den Zeilenkanälen 22 vertikale Aussparungen 24 (2) erzeugt, die sich bis
zur Gold-Oberfläche 18 der
Trägerplatte 12 erstrecken.
Die vertikalen Aussparungen 24 definieren damit die Benetzungsstellen 26 auf
der Trägerplatte 12. Dies
ist in der linken Bildhälfte
der 2 dargestellt.
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Anzahl und Intensität der Laserpulse
wird bei der Strukturierung so eingestellt, dass die Oberfläche 18 der
Trägerplatte 12 in
einer Oberflächenregion 28 aufgeschmolzen
wird. Dadurch wird eine reduzierte Oberflächenrauhigkeit und eine verbesserte
Homogenität
der Oberfläche
erreicht. Außerdem
werden durch die Ablation weniger Goldlagen von der Oberfläche Verunreinigungen
entfernt. Die freigelegten Benetzungsgebiete haben typischerweise
eine charakteristische Abmessung von etwa 10 bis 100 μm. Im Ausführungsbeispiel
sind die Aussparungen 24 und die Benetzungsstellen 26 kreisförmig und
haben einen Durchmesser von etwa 40 μm.
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Wie weiter unten im Detail beschrieben,
können
die Benetzungsstellen 26 über die Zuführungskanäle 22 mit einer Flüssigkeit
benetzt, und dadurch beispielsweise mit spezifischen Sondenmolekülen 30 funktionalisiert
werden. Ein Substrat mit funktionalisierten Benetzungsstellen 26 ist
in der rechten Bildhälfte
der 2 dargestellt.
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3 zeigt
SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation freigelegten Benetzungsstellen 26 in
einer Stopplack-Schutzschicht 20. Dabei sind sowohl rechteckige
bzw. quadratische Querschnitte wie in 3(a) gezeigt,
als auch runde Querschnitte, wie in 3(b) dargestellt,
möglich.
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Die mit dem Aufschmelzen der Gold-Oberfläche der
Trägerplatte 12 verbundene
Verbessung der Oberflächenstruktur
ist in 4 illustriert. 4 zeigt in (a) eine AFM-Aufnahme
einer Gold-Oberfläche,
die in einem kreisförmigen
Teilbereich durch Laserbeschuss aufgeschmolzen wurde, und in 4(b) ein Höhenprofil 40 entlang
der Linie B-B von 4(a).
Es ist deutlich zu erkennen, dass durch das Aufschmelzen die Rauhigkeit
der Oberfläche
verringert und die Homogenität
der bestrahlten Fläche
erhöht
wird. Dies erleichtert die spätere
Anbindung spezifischer Sondenmoleküle an die Benetzungsstellen 26.
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Funktionalisierung
der Benetzungsstellen des Substrats mit Nukleinsäure-Oligomeren
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Die Benetzungsstellen 26 des
Substrats 10 können
beispielsweise über
ein Spotting-Verfahren mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert
werden. Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt dabei in einem
automatischen Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384
DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom
Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen
mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger
(Glen Research 20–2933)
werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 molaren Iodlösung durchgeführt, um
eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen
an der 5'-Position
der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten
Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10–1037) wird
in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die
Kopplungseffizienzen werden während
der Synthese online über
die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch
bestimmt.
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Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem
Ammoniak (30%) bei 37 °C
16 h entschützt.
Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie
nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 molarer Triethylammoniumacetat-Puffer,
Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten
Oligonukleotide werden an die entsprechenden aktivierten Fluorophore
(z. B. Fluoresceinisothiocyanat) entsprechend der dem Fachmann bekannten
Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach
der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
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Auf ein Substrat 10 nach 1 wird doppelt modifiziertem
20 by Einzelstrang-Oligonukleotid
der Sequenz 5'-AGC
GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation
eins: die Phosphatgruppe des 3' Endes
ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert
ist, Modifikation zwei: an das 5' Ende
ist der Flourescein-Modifier
Fluorescein-Phosphoramidite (Proglio Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen
Standardprotokoll eingebaut) als 5×10–5 molare
Lösung
in Puffer (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7 mit 0.05 vol% SDS)
mit Zusatz von ca. 10–5 bis 10–1 molarem
Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) mit
Hilfe eines Spotters (Carthesian) aufgebracht und für 2 min – 24 h inkubiert.
Während
dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei
bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung
aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids
und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der
Inkubationslösung
gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung
einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des
Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem
Komplementärstrang
hybridisiert sein.
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Für
die Belegung mit dem Spotter der Firma Cartesian Technologies (Micro-Sys PA) werden Split-Pin Nadeln
(Arraylt Chipmarker Pins der Firma Tele-Chem) verwendet, die ein Ladevolumen
von 0.2 bis 0.6 μL haben
und Volumina von etwa 1 μL
pro Benetzungsvorgang abgeben. Die Kontaktfläche dieser Nadeln hat einen
Durchmesser von etwa 130 μm
und ist damit deutlich größer als
die bei der Laser-Ablation freigelegten Bereiche des Substrates.
Die Positionierung der Nadel über
dem Substrat erfolgt mit einer Genauigkeit von 10 μm bei einer
Luftfeuchtigkeit von etwa 70–80
%. Der Tropfen wird beim Kontakt der Spitze mit der Schutzschicht
abgegeben und es kommt zu keiner direkten Berührung mit dem Substrat („Pseudo-Kontakt-Drucken").
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Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners
der Firma Lavision Biotech kann die Belegung der freien Substratstellen
mit fluoreszenz-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren visualisiert werden. 5 zeigt eine Fluoreszenzaufnahme
von vier Benetzungsstellen, die mit derart modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren
funktionalisiert sind.
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Das Nachweisprinzip ist mit Bezug
auf 6 kurz dargestellt.
Die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen
erfolgt bei hohem Salzgehalt durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen. Vor
der Hybridisierung in Teilbild i) liegt das einzelsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in
einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 205 von
Fluorophor 203 und quenchender Metalloberfläche 204,
beispielsweise Gold, charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung
(Bezugszeichen 202) mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang,
dem Target, vergrößert sich
der Abstand 206 des Fluorophors 203 von der quenchenden
Metalloberfläche 204,
wie in Teilbild ii) dargestellt und die Fluoreszenzintensität steigt
signifikant.
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Funktionalisierung
der freien Benetzungsstellen des Substrates durch Einspülen von
Nukleinsäure-Oligomeren
in die Zuführungskanäle
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Nach der Erfindung werden die Benetzungsstellen
des Substrats 10 bevorzugt durch Einspülen von Nukleinsäure-Oligomeren
in die Zuführungskanäle 22 funktionalisiert.
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Dazu wird beispielsweise ein Substrat 10 wie
in 1 und 2 gezeigt mit einer 4 × 4 Matrix
freigelegter Benetzungsstellen 26 verwendet. Das Substrat
wird mit einem Glassubstrat, das mit einer homogene 50 μm dicken
Lötstopplackschicht
beschichtet ist bedeckt und anschließend eine Lösung mit den oben beschriebenen
Nukleinsäure-Oligomeren
in die Kanalstruktur eingespült.
Nach einer Inkubationszeit von 2 min – 24 h wird der Glasdeckel
entfernt, das Substrat gespült
und die Funktionalisierung der freien Stellen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners
visualisiert. Man erhält
ein Substrat mit funktionalisierten Benetzungsstellen 26,
wie im rechten Teilbild der 2 illustriert.
Da vier unabhängige
Zeilenkanäle
vorgesehen sind, können
die Benetzungsstellen in einfacher Weise mit vier verschiedenen
Nukleinsäure-Oligomeren
funktionalisiert werden.
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Alternative
Gestaltungen der Zuführungskanäle
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7 zeigt
in (a) bis (d) schematische Darstellungen
der Anordnung von Zuführungskanälen nach weiteren
Ausführungsbeispielen
der Erfindung.
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Bei dem Ausführungsbeispiel der 7(a) sind jeweils zwei Zeilenkanäle 50 und 52 auf
einer Substratseite verbunden, so dass U-förmige Kanäle 54 entstehen, deren
Einlass und Auslass sich auf derselben Seite des Substrats 10 befinden.
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In 7(b) ist
ein Ausführungsbeispiel
dargestellt, bei dem nur ein einziger Zuführungskanal 60 vorgesehen
ist, der sich mäanderartig über das
gesamte Substrat erstreckt und dabei alle Benetzungsstellen 26 erfasst.
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Zur Funktionalisierung der Substrate
nach 7(a) und 7(b) werden diese jeweils
mit einem beschichteten Glassubstrat bedeckt, und eine oben beschriebene
Nukleinsäure-Oligomer-Lösung in
die Kanalstruktur eingespült.
Nach einer Inkubationszeit von 2 min – 24 h wird der Glasdeckel
entfernt, die Substrate gespült
und die Funktionalisierung der freien Stellen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners
visualisiert.
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Kanalstrukturen, bei denen die Benetzungsstellen
im Schnittpunkt von zwei oder mehr Zuführungskanälen liegen, sind in den 7(c) und 7(d) dargestellt. 7(c) zeigt eine quadratische Matrix aus
Zeilen-Zuführungskanälen 70 und
Spalten-Zuführungskanälen 72,
in deren Schnittpunkte jeweils eine Benetzungsstelle 26 angeordnet
ist. Jede Benetzungsstelle 26 kann somit sowohl über einen
Zeilen-Zuführungskanal 70 als auch über einen
Spalten-Zuführungskanal 72 mit
einer Flüssigkeit
benetzt werden. Eine bevorzugte Anwendung eines solchen Substrats
ist weiter unten ausführlich
beschrieben.
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In Erweiterung diese Konzepts können die
Benetzungsstellen 26 auch im Schnittpunkt von mehr als zwei
Kanälen
liegen. Einen Ausschnitt aus einer solchen Kanalstruktur zeigt 7(d), wo jede Benetzungsstelle 26 im
Schnittpunkt von vier Zuführungskanälen 74 liegt.
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Substratabdeckungen
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Substrate, bei denen die Benetzungsstellen
im Schnittpunkt mehrerer Zuführungskanäle 22 liegen, werden
bevorzugt zusammen mit Substratabdeckungen eingesetzt, die zum einen
die Zuführungskanäle 22 zur
Ausbildung von Flusskammern nach oben verschließen und die zum anderen geeignet
angeordnete Barriereelemente für
die Analytflüssigkeiten
aufweisen, die einen Teil der Zuführungskanäle blockieren. Durch diese
Barriereelemente kann man bei sich kreuzenden Kanälen das
Fließen
der Flüssigkeiten
von einem Kanal in die benachbarten Kanäle verhindern und somit Kreuzreaktionen
vermeiden.
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Beispielsweise kann eine erste Substratabdeckung
für das
Versperren der Spalten-Zuführungskanäle und eine
zweite Substratabdeckung für
das Versperren der Zeilen-Zuführungskanäle vorgesehen
sein. Bevorzugt ist aller dings im Rahmen der Erfindung, dass eine
einzige Substratabdeckung sowohl für das Versperren der Zeilen-Zuführungskanäle, als
auch nach entsprechender Neuorientierung der Abdeckung, für das Versperren
der Spalten-Zuführungskanäle eingesetzt
wird.
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Solche Substratabdeckungen lassen
sich mit Hilfe der Laser-Ablation für Substrate mit unterschiedlichen
Kanalstrukturen herstellen. Das Prinzip ist mit Bezug auf 8 illustriert. 8(a) zeigt einen Ausschnitt einer
Kanalstruktur, bei der eine quadratische vertikale Aussparung 26
im Schnittpunkt eines Zeilen-Zuführungskanals 70 und
eines Spalten-Zuführungskanals 72 angeordnet
ist. Der Zeilen-Zuführungskanal 70 und der
Spalten-Zuführungskanal 72 haben
beide denselben rechteckigen Querschnitt. Ein Teil der Lackschicht
ist in der Figur transparent dargestellt, um das Innere der Struktur
zu zeigen.
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8(b) stellt
den entsprechenden Ausschnitt einer Substratabdeckung 80 dar,
die je nach Orientierung den Zeilen-Zuführungskanal 70 oder
den Spalten-Zuführungskanals 72 blockieren
kann. Die beiden, auf einer Abdeckungsträgerplatte 82 angeordneten
Barriereelemente 84 sind in Form und Größe auf die Form und Größe der Zuführungskanäle 70 und 72 des
Substrats abgestimmt und verschließen aufgrund der Symmetrie der
Anordnung in einer ersten Orientierung den Zeilen-Zuführungskanal 70 und
in einer dazu um 90° gedrehten
zweiten Orientierung den Spalten-Zuführungskanal 72.
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Zur Herstellung einer solchen Substratabdeckung 80 wird
eine beliebige Abdeckungsträgerplatte 82, beispielsweise
ein Glas-Slide, mit Lötstopplack
beschichtet, dessen Dicke mindestens der Tiefe der Kanäle des Substrats 10 entspricht
und beispielsweise 80 bis 120 μm
beträgt.
Anschließend
wird der Lack durch Laser-Ablation soweit entfernt, dass nur noch
die gewünschten
Barriereelemente 84 stehen bleiben. Die Substratabdeckung
kann beispielsweise durch Bestrahlen des Gebiets außerhalb
der Barrieren mit etwa 540 – 900 Pulsen
(a 20 ns) des obengenannten Excimer-Lasers mit einer Flächenleistung
von 600 – 1200
mJ/cm2 erreicht werden.
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Sukzessives
Einspülen
von Nukleinsäure-Oligomeren
in die Zuführungskanäle eines
Substrates unter Verwendung einer Substratabdeckung
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Der Einsatz eines Substrats mit einer
beschriebenen Substratabdeckung wird nunmehr im Zusammenhang mit 9 erläutert. 9 zeigt in (a) ein
Substrat mit 4 × 4
Benetzungsstellen 26 und einer Anordnung von parallelen
Zeilen-Zuführungskanälen 70 und
Spalten-Zuführungskanälen 72,
wie bei 7(c) beschrieben.
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9(b) zeigt
die zugehörige
Substratabdeckung 80 mit den auf die Kanalanordnung abgestimmten Barriereelementen 84.
Die Abmessungen der Barriereelemente 84 sind zweckmäßig durch
die Breite bK der Zuführungskanäle 70, 72 und
den lateralen Abstand ΔK der Kanäle
gegeben. Dadurch wird eine besonders gute Abschirmung benachbarter
Zuführungskanäle erreicht,
da der Zwischenraum zwischen den benachbarter Zuführungskanälen durch
die Barriereelemente 84 vollständig ausgefüllt wird. Die Höhe der Barriereelemente 84 entspricht
der Kanaltiefe im Substrat 10.
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Platziert man die Substratabdeckung 80 in
einer ersten Orientierung auf dem Substrat 10, so blockieren
die Barriereelemente 84 gerade die Spalten-Zuführungskanäle 72 und
lassen die Zeilen-Zuführungskanäle 70 offen
( 9(c)). In dieser Stellung
wird in die vier offenen Zeilen-Zuführungskanäle 70 des Substrates
je eine Lösung
mit doppelt modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren nach dem oben beschriebenen
Beispiel mit unterschiedlichen Sequenzen eingespült, die dann die entsprechenden
Benetzungsstellen 26 des Kanals 70 funktionalisieren.
Nach einer Inkubationszeit von 2 – 24 h werden die Zeilen-Zuführungskanäle 70 gespült, die Abdeckung 80 angehoben
und die Fluoreszenz der Spots mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners
der Firma Lavision Biotech als Referenz-Signal der Funktionalisierung
bestimmt.
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Nun wird die Substratabdeckung 80
um 90° gedreht
und erneut auf das Substrat 10 aufgebracht (9(d)). Dann werden die Spalten-Zuführungskanäle 72 mit
je einer unmodifizierte Nukleinsäure-Oligomere verschiedener
Sequenzen enthaltenden Analytflüssigkeit
(0,500 molar Phosphat-Puffer, pH 7, mit 1 molarer NaCl und 0.05
vol% SDS) gefüllt.
Die Synthese dieser Oligonukleotide erfolgt ebenfalls in einem automatischen
Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer)
gemäß der vom
Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese.
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Nach einer geeigneten Inkubationszeit
unter hybridisierenden Bedingungen werden die offenen Kanäle gespült, die
Substratabdeckung 80 abgenommen und eine zweite Fluorezenzmessung
der funktionalisierten Benetzungsstellen 26 des Substrates
mit dem Fluoreszenz-Scanner durchgeführt. Enthält eine bestimmte Analytflüssigkeit
keine zu den Nukleinsäure-Oligomeren
einer bestimmten Benetzungsstelle 26 komplementäre Oligonukleotide,
so entspricht die Fluoreszenzintensität der zweiten Messung im Wesentlichen
der der Referenzmessung. Im Falle der Hybridisierung von immobilisierter
Oligonukleotide einer Benetzungsstelle mit Molekülen der jeweiligen Analytflüssigkeit,
so ergibt sich eine im Vergleich zur Referenzmessung deutlich höhere Fluoreszenzintensität, wie oben
in Zusammenhang mit 6 erläutert.
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Für
die 4 × 4
Matrix an Benetzungsstellen 26 lassen sich so 42 = 16 Kombinationen potentieller Bindungspartner
analysieren. Bei Verwendung größerer Matrizen
lassen sich so rasch eine Vielzahl möglicher Reaktionen in kurzer
Zeit automatisiert und parallel untersuchen.
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Eine weitere Anwendungsmöglichkeit
für ein
beschriebenes Substrat mit einer n × n-Matrix an Benetzungsstellen
in den Schnittpunkten von je einem Zeilen-Zuführungskanal
und einem Spalten-Zuführungskanal mit
zugehöriger
Substratabdeckung ist die "on-chip" Synthese von Nukleinsäure-Oligomeren.
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Hierbei werden zu Beginn an Stelle
der Nukleinsäure-Oligomere
Nukleinsäure- Monomere für die Funktionalisierung
der Benetzungsstellen eingespült.
Anschließend
werden sukzessive weitere Nukleinsäure-Monomere über die
Kanalstrukturen mit Hilfe von Substratabdeckungen an die gewünschten
Benetzungsstellen transportiert, wo sie mit aus dem Stand der Technik
bekannter Phosphoramidit-Chemie an die dort vorhandenen Nukleinsäure-Oligomere
koppeln. Somit lassen sich an allen Benetzungsstellen des Substrats
Nukleinsäure-Oligomere
mit verschiedenen Sequenzen synthetisieren, also z.B. alle 65536
Nukleinsäure-Oktamere
auf einer 256 × 256-Matrix
von Benetzungsstellen.
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Antikörper-Assay
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In einem weitern Ausführungsbeispiel
der Erfindung wird ein Substrat mit einer gleichmäßigen Matrix von
3 x 3 freigelegten Benetzungsstellen in den Kreuzungspunkten von
je zwei Zuführungskanälen analog
zu 7(c) nebst einer
zugehöriger
Abdeckung hergestellt.
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Nach Anbringen der Abdeckung in der
ersten Orientierung werden in die 3 offenen Zeilen-Zuführungskanäle des Substrates 3 verschiedene
Antikörper
eingespült
(Ak1, Ak2, Ak3), die jeweils nach Standartverfahren mit
Thiol-Ankern für
die Anbindung an die Goldoberfläche
versehen werden. Nachdem die Zeilen-Zuführungskanäle gespült wurden, wird die um 90° gedrehte
Abdeckung erneut aufgebracht und die nun offenen Spalten-Zuführungskanäle mit 3
verschiedenen flüssigen
Proben gefüllt,
die unterschiedliche Zusammensetzungen an Proteinen bzw. Antigenen
beinhalten. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird das Substrat
erneut gespült.
Spezifische Antikörper-Protein
Komplexe haben sich nur an jenen Benetzungsstellen ausgebildet,
die mit Proben in Kontakt waren, in denen die jeweils passenden
Proteine bzw. Antigene enthalten waren.
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Zur Visualisierung der Komplexe auf
den Benetzungsstellen werden in einem weiteren Schritt 3 Mischungen
von Antikörpern
verwendet, wobei die Antikörper
nach Standartverfahren mit einem Fluoreszenz-Label (z.B. Fluorescein)
modifiziert wurden. Diese Antikörper-Mischungen
werden mit der erneut um 90° gedrehten
Abdeckung in die Zeilen-Zuführungskanäle der mit
gleichen Antikörpern
Aki funktionalisierten Spots eingespült. Die
Antikörper
einer Mischung sind hierbei jeweils auf die möglichen Antikörper-Protein
Komplexe der Spot-Reihe abgestimmt, so dass an jedem vorhandenen
Komplex ein Antikörper
binden kann. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden die Kanäle gespült und der
Chip mit Hilfe eines Fluoreszenz-Readers (Lavision Biotech) ausgelesen.
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Funktionalisierung
der freien Benetzungsstellen eines Substrates durch Einspülen von
Nukleinsäure-Oligomeren
in eine Substrateinsenkung
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Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung
ist in den 10 und 11 dargestellt. 10 zeigt ein Substrat 100 zur
kontrollierten Benetzung vorbestimmter Benetzungsstellen in Aufsicht, 11 stellt einen Querschnitt
durch das Substrat 100 entlang der Linie XI-XI von 10 dar.
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Das Substrat 100 umfasst
wie das Substrat 10 des ersten Ausführungsbeispiels eine Trägerplatte 102 aus
einem Glas-Slide 104 mit einer aufgedampften CrNi-Kontaktschicht
und einer darauf aufgedampften Goldschicht 106.
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Auf die Trägerplatte 102 wird
ein 2-Komponenten Lötstopplack
aufgebracht, um eine Schutzschicht 120 einer Dicke von
etwa 10 bis etwa 150 μm,
im Ausführungsbeispiel
von etwa 120 μm,
zu erzeugen. Nach dem Trocknen wird die Schutzschicht 120 mit
einem Excimer-Lasers durch Laserablation strukturiert.
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Dabei wird in einem ersten Strukturierungsschritt
eine Einsenkung 122 in den Lack geschnitten, die eine laterale
Abmessung von 600 μm × 600 μm und eine
Tiefe von etwa 100 μm
aufweist. Die Einsenkung 122 ist von einem umlaufenden
Rand 110 umgeben, so dass ein Vorratsvolumen zur Aufnahme
der Be netzungsflüssigkeit
entsteht.
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Am Boden der Einsenkung 122 werden
in einem zweiten Strukturierungsschritt vertikale Aussparungen 124 mit
einem Durchmesser von etwa 30 μm
erzeugt, die sich bis zur Gold-Oberfläche der Trägerplatte 102 erstrecken
und die vorbestimmten Benetzungsstellen 126 auf der Trägerplatte
definieren (linke Bildhälfte der 11).
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Zur Funktionalisierung der Besetzungsstellen 126 wird
die Einsenkung mit den Nukleinsäure-Oligomeren 130 des
oben beschriebenen Beispiels befällt,
nach einer Inkubationszeit von 2 – 24 h gespült und die in der rechten Bildhälfte der 11 dargestellte Funktionalisierung
der freien Stellen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners der Firma
Lavision Biotech visualisiert.
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