CN103201626B - 蛋白质原位检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质和/或氨基酸的稳定的检测组合物，该组合物可用于作为一种原位检测试剂，例如，在表面原位检测。本发明还涉及用于使用上述组合物和包含此组合物的试剂盒来检测表面上的蛋白质和/或氨基酸的方法。

Description

蛋白质原位检测试剂
技术领域
本发明涉及稳定的蛋白质和/或氨基酸检测组合物，该组合物可用作一种原位检测试剂，例如，在表面原位检测。本发明还涉及用于使用上述组合物和包含此组合物的试剂盒来检测表面上的蛋白质和/或氨基酸的方法。
背景技术
蛋白质的检测，比如，对自然完整的蛋白质和/或它们的亚组氨基酸和肽的检测，尤其是微量检测，是在实验室、临床、和法医环境中重要的分析和生物技术的标准过程。通常，蛋白质和/或氨基酸的检测是使用现有试剂、结合已经验证过的不同技术以及仪器而完成的。现有方法倾向于依赖试剂和肽的自由氨基酸、末端氨基酸残基反应，或者和溶液中蛋白的末端氨基酸残基、侧链官能团反应，通过产生可见的颜色、或者可探测的荧光产物，以定性和定量方式辅助确定分析物的存在。
研究表明，在医院灭菌与消毒装置（Hospital Sterilisation&Disinfection Units）（也称为Sterile Service Departments（SSD）（消毒服务部门））中，标准灭菌程序在对可回收利用的医疗器械进行净化时，是没有效率的（Baxter R.L et al J Hospital Infection.2006,63,439-44）。这些研究显示，医疗器械上的残留蛋白可以通过外科手术、尤其是神经手术过程，直接导致潜在疾病的威胁，包括vCJD（变异型库贾氏症）的转移。因此，检测医疗仪器表面的非常低数量（纳克或者皮克）的残留蛋白很重要，而且亟待解决。
茚三酮（2，2-二羟基-1，3-茚二酮）是用于检测一级和二级胺的化合物。茚三酮和氨基酸的alpha氨基残基反应。在茚三酮和胺反应的时候，在合适的温度环境下，会产生颜色深的蓝/紫色发色团，即罗曼紫（2-[(3-羟基-l–氧茚-2-基)亚氨]-l,3-茚二酮）。茚三酮的显色性质可以视觉检测和定量分析氨基酸。在生物化学分析上，茚三酮被用于在各种分离技术、如色谱法、高效液相色谱（HPLC）或者固体多肽合成完成时，确定存在的氨基酸的浓度。
无菌服务部门(SSD department)使用市场上可以购买到的试剂盒的茚三酮，用于定性检测可回收使用的外科和/或牙医设备的净化和/或灭菌程序的效率。高压蒸汽处理、加热和清洗过的仪器的表面，用棉签擦拭，然后用试剂盒里面的茚三酮湿润。一旦在棉签上有颜色产生（通过和胺的反应），通过视觉对比标准精氨酸棉签评估，判断是否有残余蛋白质。茚三酮依赖于自由可得的氨基酸来优选产生有色产物。在自由氨基酸存在的条件下，如氨基酸残基自由暴露，试剂是最有效的。但是，在仪器被洗涤或者高压蒸汽处理时，自由氨基酸，或蛋白质降解的氨基酸都被洗去。茚三酮可以检测精氨酸的阈值大约是5微克/毫升，而牛血清蛋白的检测阈值是实际很高的检测阈值，只有500微克/毫升。也因为擦拭技术在将蛋白质从它们结合的位置吸收下来的效率很低，因此造成检测灵敏度降低。由于对残留蛋白质不敏感，而且产生假阴性的风险高，因此，茚三酮的灵敏度和特异性都很低。总的来说，作为试剂的茚三酮和茚三酮的试剂盒不能为净化程序的蛋白质检测提供足够的灵敏度。
邻苯二甲醛（OPA）也是一种在化学和生物研究中用于氨基酸检测的试剂。因为其高的灵敏度而被用于氨基酸检测。邻苯二甲醛/硫醇的溶液，在氨基酸分析中是茚三酮的替代试剂（Stobaugh et al.（1983）分析生物化学135，页495-504）。邻苯二甲醛和一级胺在硫醇（如巯基乙醇，乙硫醇，或者（2R）-2-乙酰胺基-3-磺酰基丙酸、即通常所说的乙酰半胱氨酸(NAC)）存在下反应，产生具有明亮荧光的异吲哚衍生物（Garcia Alvarez-Coque et al.（1989），分析生物化学180，页172-176），在Ex/Em=350/450纳米下监测该衍生物。
合成式1：邻苯二甲醛和一级胺在硫醇存在下反应，产生荧光团1-烷基硫醇-2-烷基-取代异吲哚。
邻苯二甲醛/硫醇的试剂对比其他检测方法有数个优点。该试剂是非荧光的且可溶于水。邻苯二甲醛/硫醇的试剂和除了半胱氨酸和亚氨基酸的普通氨基酸反应，产生可被检测的荧光衍生物。在室温下，邻苯二甲醛/硫醇的试剂可快速反应生成各种可被检测的荧光团产物（Garcia Alvarez-Coque et al1989,supra）。邻苯二甲醛/硫醇的试剂可方便、快速和高度灵敏地检测溶液中的自由氨基酸和蛋白质，而且能准确定量测量可溶解的蛋白（Verjat et al.（1999），Int J Pharmaceutics179.页267-271）。
邻苯二甲醛/硫醇的试剂形成的荧光团和茚三酮不同，它们的结构依赖于试剂反应的氨基酸。然而，由于异吲哚荧光团衍生物的不稳定性，造成苯二甲醛/硫醇的试剂缺点。因此，在使用邻苯二甲醛/硫醇的试剂时，为了达到精准的分析，必须要小心注意（Garcia Alvarez-Coqueet al1989,supra）。额外地，苯二甲醛/硫醇的试剂需要在使用前24小时内制备好，以降低背景荧光干扰，试剂在溶剂中的稳定性会相对于不稳定，只能使用一周。
以上提到的方法都有着很多缺陷，如不同的蛋白质和/或氨基酸特异性，灵敏度以及试剂和/或形成产物的稳定性。
因此，需要一种克服以上缺陷的试剂。
发明内容
本发明设计了一种蛋白质和/或氨基酸的检测组合物，该组合物可用于作为一种原位检测试剂，如在溶液中或者表面上，如仪器的表面，以定性和定量确定蛋白质物质的痕量，从而满足无菌服务部门(SSD)使用试剂的要求。该蛋白质和/或氨基酸的检测组合物自身是稳定的，且贮藏时间延长了，当其与蛋白质反应时，其产生一种稳定的异吲哚荧光团衍生物，该衍生物可通过简单的仪器和定量的视觉快速装置或者数值数据装置来识别。
一方面，本发明提供一种蛋白质和/或氨基酸的检测组合物，该组合物包括：
（a）   邻苯二甲醛，
（b）   C3-C6硫醇，
（c）   pH值在约7.5到约10之间的缓冲溶液，和
（d）   表面活性剂，
其中该组合物进一步包括：
（e）   硫醇还原化合物。
在本发明的一个实施例中，提供了一种蛋白质和/或氨基酸的检测组合物，该组合物包括：
（a）   邻苯二甲醛，
（b）   C3-C6硫醇，
（c）   pH值在约7.5到约10之间的缓冲溶液，和
（d）   表面活性剂，
其中该组合物进一步包括：
（e）   浓度大约为0.05毫摩尔/升至大约5毫摩尔/升硫醇还原化合物。
在本发明的另外一个实施例中，提供了一种蛋白质和/或氨基酸的检测组合物，该组合物包括：
（a） 浓度大约为0.1毫摩尔/升至大约10毫摩尔/升的邻苯二甲醛，
（b） 浓度大约为1毫摩尔/升至大约20毫摩尔/升的C3-C6硫醇，
（c） 浓度大约为10毫摩尔/升至大约100毫摩尔/升的、pH值在7.5到10之间的缓冲溶液，和
（d） 浓度大约为0.01%（v/v，体积比）至大约为2%（v/v，体积比）的表面活性剂，以及
（e） 浓度大约为0.05毫摩尔/升至大约5毫摩尔/升硫醇还原化合物。
每种成分浓度和范围是指，本发明的所有成分都被混合到最终的原位蛋白检测试剂时，每种成分的浓度。
本发明提供一种蛋白质和/或氨基酸的检测组合物，该检测组合物在室温下稳定，对宽范围的蛋白质的检测具有特异性，对检测外科手术和其他仪器表面的微量（比如纳克或者皮克）蛋白质残留具有敏感性，以及只需使用简单的仪器。
因此，本发明的组合物适合检测蛋白质和/或氨基酸。
蛋白质是氨基酸共价连接在一起的有机分子。如上述定义，蛋白质包括肽和多肽。氨基酸来自于20种天然氨基酸或者其他氨基酸。每一个氨基酸包括有一个胺基，一个羧酸基，和一个侧链，不同的氨基酸中该侧链是不同的。
典型地，蛋白质和/或氨基酸的检测组合物是胺基（胺）检测组合物。
本发明的组合物包括邻苯二甲醛。邻苯二甲醛是化学分子式为C6H4（CHO）2的化合物。邻苯二甲醛也被称为o-phthaldialdehyde,Phthalic aldehyde,phtharal,Phthalic dialdehyde,Disopa,Phthalyldicarboxaldehyde,1,2-苯二甲醛;ortho-O-phthaldialdehyde,Orthophthaldialdehyde,Disopa(TN),o-phthaldialdehydes[法语],Phthalic dicarboxaldehyde,ortho-Phthalic Aldehyde,Phthaldialdehyde Reagent,o-Phthalic dicarboxaldehyde。通常可被简称为OPA(ortho-O-phthaldialdehyde)。
邻苯二甲醛是苯二甲醛，其结构是2个醛基(CHO)连接到苯环中心上相邻的碳原子上。邻苯二甲醛可与胺反应，尤其是一级胺。
在本发明一些实施例中，邻苯二甲醛溶解在有机溶剂中，帮助其溶解，从而提高试剂的喷雾特性。该有机溶剂可以选自甲醇、乙腈或者其他易挥发溶剂。易挥发溶剂包括有丙酮、乙醇和任何挥发快的溶剂。典型地，在一些实施例中，该有机溶剂是甲醇。
加入有机溶剂提高组合物的喷雾特性，使得组合物很容易干燥，从而阻止了表面的干燥蛋白质测定位点的散开。
在本发明一些实施例中，邻苯二甲醛的浓度大约为0.1毫摩尔/升至大约10毫摩尔/升。一些具体实施例中，邻苯二甲醛的浓度大约为0.5毫摩尔/升至大约5毫摩尔/升。一些优选实施例中，本发明使用的邻苯二甲醛的浓度是0.75毫摩尔/升、1毫摩尔/升、2毫摩尔/升、3毫摩尔/升或者4毫摩尔/升。典型地，在一些实施例中邻苯二甲醛的浓度是2毫摩尔/升。
在本发明一些实施例中，有机溶剂含量为0.1%（v/v，体积比）至大约为10%（v/v，体积比）。一些具体实施例中，有机溶剂含量为0.5%（v/v，体积比）至大约为5%（v/v，体积比）。一些优选实施例中，有机溶剂含量为0.5%（v/v，体积比）、0.6%（v/v，体积比）、0.7%（v/v，体积比）、0.8%（v/v，体积比）、0.9%（v/v，体积比）、1%（v/v，体积比）、1.5%（v/v，体积比）、2%（v/v，体积比）、2.5%（v/v，体积比）、3%（v/v，体积比）、3.5%（v/v，体积比）、4%（v/v，体积比）、4.5%（v/v，体积比），或者5%（v/v，体积比）。
本发明组合物还包括一种C3-C6硫醇。硫醇通常是无气味的。该硫醇不能包括有自由氨基，比如半胱氨酸。
硫醇包括有一个硫氢键（-SH）。该硫氢键通常被称为硫醇基，巯基或者硫氢基。一些传统观念里，硫醇(thiols)通常指的是硫醇（mercaptans）。
C3-C6硫醇可以是任何包括3、4、5或者6个碳原子和一个硫醇基官能团的化合物。C3-C6硫醇可以是饱和的或者不饱和的，也可以在碳链的一个或多个位置不饱和。可以是支链、直链、环状、碳氢自由基，或者可以在碳链上一个或多个位置羟(基)化。典型地，C3-C6碳氢链可以是有着通式CnH2n+1的烷基。
典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基和类似等。在优选实施例中，烷基为C3-C6的烷基。
特别地，“C3-C6的烷基”例子有正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1-乙基丁基、1-甲基丁基、2--甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基和类似化合物。烷基可选择性的有一个或多个氧原子在中间。
在本发明的一些实施例中，C3-C6硫醇化合物可以选自乙酰半胱氨酸(NAC)（（2R）-2-乙酰胺基-3-磺酰基丙酸）、2-巯基乙醇（2-羟基-1-乙硫醇）、二硫苏糖醇（DTT）（(2S,3S)-1,4-二-磺酰基丁基-2,3-二醇）、N-乙酰基-3-巯基-D-缬氨酸、N-乙酰基巯乙胺、N-乙酰基-高半胱氨酸和巯基琥珀酸。典型地，在一些实施例中，在蛋白质和/或氨基酸的检测组合物中的C3-C6硫醇化合物是乙酰半胱氨酸。
在本发明一些实施例中，C3-C6硫醇化合物的浓度是大约1毫摩尔/升至大约20毫摩尔/升。一些具体实施例中，C3-C6硫醇化合物的浓度是大约5毫摩尔/升至大约15毫摩尔/升。一些优选实施例中，本发明使用的C3-C6硫醇化合物的浓度是6毫摩尔/升、7毫摩尔/升、8毫摩尔/升、9毫摩尔/升、10毫摩尔/升、11毫摩尔/升、12毫摩尔/升、13毫摩尔/升或14毫摩尔/升。典型地，在一些实施例中C3-C6硫醇化合物的浓度是10毫摩尔/升。
本发明的组合物也包括pH值在约7.5到约10之间的缓冲溶液。
缓冲液是指即使加入强酸或者强碱，也能够将pH值稳定在一个常数或者接近常数的缓冲溶液。缓冲溶液通常是水溶液。
pH值在7.5到10范围的缓冲溶液是碱性缓冲溶液。本发明使用的缓冲溶液典型地是pH值大约是8、pH值大约是9、或者pH值大约是10。在一些具体实施例中，缓冲溶液的pH值范围是9到9.5。
在一些实施例中，C3-C6硫醇化合物在pH值在7.5到10范围的碱性缓冲溶液中。典型地，C3-C6硫醇化合物在pH值在9到9.5范围的缓冲溶液中。典型地，缓冲溶液大约是pH9.2-pH9.3。
具有pH7.5到10的缓冲溶液的例子有磷酸盐缓冲溶液和硼酸盐缓冲溶液。优选优选地，缓冲溶液是钠盐。优选优选地，缓冲溶液不是铵盐，也不是铵盐相关的，如甘氨酸缓冲溶液。
在一些具体实施例中，溶液的浓度大约是10毫摩尔/升至大约100毫摩尔/升。在一些具体实施例中，本发明的溶液的浓度大约是25毫摩尔/升至大约75毫摩尔/升。在一些具体实施例中，溶液的浓度大约是35毫摩尔/升至大约65毫摩尔/升。在一些优选实施例中，溶液的浓度大约是30毫摩尔/升、35毫摩尔/升、40毫摩尔/升、45毫摩尔/升、50毫摩尔/升、55毫摩尔/升、60毫摩尔/升、65毫摩尔/升或者70毫摩尔/升。典型地，在一些实施例中，溶液的浓度是50毫摩尔/升。
在优选实施例中，缓冲溶液是四硼酸钠（Na2B4O7）。典型地，在一些实施例中，缓冲溶液是pH值为9.23的四硼酸钠，浓度是50毫摩尔/升。
本发明组合物也包括表面活性剂。
表面活性剂可以是离子表面活性剂或者非离子表面活性剂。离子表面活性剂的例子有卵磷脂（磷脂酰胆碱）、胆汁盐和去垢剂。非离子表面活性剂的例子有单酸甘油脂、聚氧乙烯蓖麻油、脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪酸山梨醇酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚乙二醇硬脂酸酯15、泊洛沙姆或者以上的混合物。单酸甘油脂的例子有单辛酸甘油脂（也称为单碘苯腈辛酸甘油酯）、单癸酸甘油脂、月桂酸甘油酯、豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、甘油单棕榈酸酯、和甘油单油酸酯。脂肪酸山梨醇酯的例子包括有去水山梨糖醇月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯，以及山梨醇酐棕榈酸酯或者上述的混合物。聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯的例子包括有聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单棕榈酸酯，或者上述的混合物。
在一些实施例中，表面活性剂是非离子活性剂。在一些实施例中，非离子表面活性剂包括但不限于烷基聚（乙烯氧化物），比如，基于聚氧乙烯乙二醇的聚山梨醇酯，比如，吐温系列（吐温20，吐温80等），Brij系列，如Brij35，和Triton去垢剂系列（TritonX-100等），烷酚基聚（乙烯氧化物），或者聚（乙烯氧化物）和聚（丙烯氧化物）的共聚物（市场上称为泊洛沙姆（Poloxamer）或者泊洛阿敏（Poloxamine）。典型地，一些实施例中，表面活性剂和/或去垢剂是Triton X-100。
表面活性剂可以使蛋白残留失活，尤其是疏水蛋白残留，使得更好地与检测组合物反应。
Triton X-100的化学分子式是C34H22O（C2H4O）n，而且通常在实验室被用作去垢剂。
在一个或者多个实施例中，表面活性剂含量为大约0.01%（v/v，体积比）至大约2%（v/v，体积比）。在一些具体实施例中，表面活性剂含量为大约0.05%（v/v，体积比）至大约0.5%（v/v，体积比）。比如，若100毫升组合物中含有0.5毫升表面活性剂，则表面活性剂的含量为0.5%（v/v，体积比）。在优选实施例中，表面活性剂含量为0.06%（v/v，体积比），0.07%（v/v，体积比），0.08%（v/v，体积比），0.09%（v/v，体积比），0.1%（v/v，体积比），0.2%（v/v，体积比），0.3%（v/v，体积比），或者0.4%（v/v，体积比）。典型地，表面活性剂含量为0.1%（v/v，体积比）。
本发明的组合物也包括有硫醇还原化合物。
硫醇还原化合物包括含有硫醇基的化合物，比如，二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙胺，以及三氢化磷和它们的衍生物，比如，三(2-羧乙基)膦（TCEP）。
在溶液里，硫醇基容易受到氧化或者形成双硫键的影响。蛋白质和/或氨基酸的检测组合物中，硫醇还原化合物的存在可以防止多余二硫键的形成和硫醇化合物之间的化氧，该二硫键的形成和氧化是造成试剂贮藏寿命不稳定，以及反应中形成的化合物不稳定的原因。可以推断，硫醇还原化合物的增加可以稳定本发明的蛋白质和/或氨基酸的检测组合物。硫醇还原化合物也可以增加最终检测试剂中蛋白的灵敏度。
在一些具体实施例中，硫醇还原化合物的浓度大约是0.05毫摩尔/升至大约5毫摩尔/升。一些具体实施例中，硫醇还原化合物的浓度大约是0.1毫摩尔/升至大约2.5毫摩尔/升。在一些实施例中，本发明使用硫醇还原化合物的浓度大约是0.075毫摩尔/升，0.15毫摩尔/升，0.2毫摩尔/升，0.35毫摩尔/升，0.4毫摩尔/升，0.55毫摩尔/升，0.65毫摩尔/升，0.75毫摩尔/升，0.8毫摩尔/升，0.95毫摩尔/升，1毫摩尔/升，2毫摩尔/升，3毫摩尔/升，或者4毫摩尔/升。典型地，在一些实施例中，硫醇还原化合物的浓度是0.5毫摩尔/升。
在一些具体实施例中，本发明的组合物还可以进一步包括螯合剂。
螯合剂是可以通过2个或更多化合物的原子，和金属离子形成配位键的有机化合物。由螯合剂和金属离子形成的化合物称为螯合物。具有2个配位原子的螯合剂具有称为双配位基的；具有3个配位原子的螯合剂称为三配位基的；等等。螯合剂因此可以是双配位基，三配位基，四配位基，五配位基，六配位基，七配位基，八配位基，九配位基或者十配位基。
螯合剂提供了在水溶液中的多种多价螯合剂，以控制金属离子。通过和多价金属离子形成稳定的水溶性络合物，螯合剂通过限制金属离子的常规反应性，防止不期望的相互反应。
在一些实施例中，本发明的螯合剂包括但是不限于乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，二乙基三胺五乙酸(DTPA)，或者氨三乙酸(NTA)。优选的是螯合剂不含胺。
EDTA的化学分子式是C30H16O8N，是通用螯合剂的代表，含有氮原子和短链羧酸基。EDTA也被称为依地酸，EDTA游离碱，EDTA游离酸，H4EDTA，二氨基乙烷四乙酸,依地酸,乙二胺四乙酸盐,亚乙基二次氮基四乙酸,或乙二胺四乙酸。
DTPA的化学分子式是C34H23N3O10，也通常被称为二乙撑三胺-Ν,Ν,Ν',Ν',Ν''-五乙酸，H5dtpa,二亚乙基三胺五乙酸,N,N-二(2-(二(羧甲基)氨基)乙基)甘氨酸,二乙撑三胺五乙酸或[[(羧甲基)亚氨基]二(亚乙基次氮基)]四乙酸。
NTA的化学分子式是C6H9NO6，也通常被称为2,2',2"-氨三乙酸三钠，氨三乙酸，A,α,α',α"-三甲基胺氨基三羧酸,三(羧甲基)胺,次氨基三乙酸,Hampshire NTA酸,次氮基-2,2',2"-三乙酸,或次氮基三乙酸。
在一些具体实施例中，螯合剂的浓度大约是0.05毫摩尔/升至大约5毫摩尔/升。一些具体实施例中，螯合剂的浓度大约是0.1毫摩尔/升至大约2.5毫摩尔/升。在一些实施例中，本发明使用的螯合剂的浓度大约是0.075毫摩尔/升，0.15毫摩尔/升，0.2毫摩尔/升，0.35毫摩尔/升，0.4毫摩尔/升，0.55毫摩尔/升，0.65毫摩尔/升，0.75毫摩尔/升，0.8毫摩尔/升，0.95毫摩尔/升，1毫摩尔/升，2毫摩尔/升，3毫摩尔/升，或者4毫摩尔/升。典型地，在一些实施例中，螯合剂的浓度是0.5毫摩尔/升。
在一些实施例中，C3-C6硫醇化合物的浓度是组合物中邻苯二甲醛浓度的5倍。
在一些实施例中，螯合剂的浓度可与硫醇还原化合物的浓度相同，硫醇还原化合物浓度不超过2毫摩尔/升。
在一些实施例中，硫醇还原化合物的浓度可以是组合物中C3-C6硫醇化合物的浓度的20倍。在上述这些条件下，试剂的灵敏度得到提高。需要注意的是，高浓度硫醇还原化合物浓度会降低检测组合物的灵敏度。
在4°C下，组合物可以6个月保持稳定；在室温下，组合物可以3个月保持稳定。为了降低来自大气中氨的背景荧光的干扰，组合物在使用前可在4°C下保存24小时。在使用新鲜去离子水配置后，组合物可以达到一个大约35±10任意单位（RFU）的低的背景荧光。
本发明的第二个方面，提供了制备本发明第一方面描述的蛋白质和/或氨基酸的组合物的过程。
制备蛋白质和/或氨基酸的组合物的过程需要将成分（a），（b），（d）和（e）混合加入缓冲溶液（c）中。成分可以依次或者同时混合。
本发明的第三个方面，提供了一种检测蛋白质和/或氨基酸的方法，包括有：
a）将本发明的组合物施用到一个表面和/或底物，以及
b）检测荧光。
本发明第一方面描述的组合物可以以喷雾、棉签、溶液或者任何其他本领域人员知道的形式适当使用。
包含有本发明组合物的喷雾可以进一步包括瓶子或者容器，以及喷雾器或者喷嘴，或者其它任何合适的装置。
喷雾的瓶子或者容器可以是任何瓶子或者任何容器。比如，这样的瓶子或者容器可以由玻璃、塑料或者其他惰性材料制成。容器不可以是金属，因为金属会氧化硫醇化合物。优选地，容器是透明的或不透明的。
本发明此喷雾的实施例的喷雾器或者喷嘴可以使液体通过喷嘴，将大块的液体变为薄雾（微滴的集合），使得本发明组合物均匀施用。
薄雾的密度很重要，因为密度与检测组合物变干、从而发荧光所需的时间直接成正比。
“棉签”方式包括任何吸收性材料，比如，人造纤维或者任何其他本领域人员知道的吸收性材料，附着在一个棍，或者丝上，用于清洁或使用。一定量的压力和/或摩擦施加在表面和/或底物上。棉签上会收集蛋白质和/或氨基酸，然后浸入本发明组合物中。或者，棉签可以先浸入本发明组合物中，然后擦拭、摩擦或者在表面和/或底物上，施加压力和/或摩擦力。
典型地，本发明的组合物可以直接施用于表面和/或底物上。在表面和/或底物上的蛋白质和/或氨基酸的存在下，本发明组合物的反应的检测，可以是非直接或者直接的。本发明组合物的反应的检测可以在干燥形式下稳定一年或者更久。
本发明组合物所施用的表面和/或底物可以是任何表面，例如但不限于玻璃、金属（比如不锈钢金属，钛金属，铂金属或者铝金属）、塑料或者其他惰性材料或者水界面。尤其是，表面和/或底物可以是其上存在有蛋白质和/或氨基酸的表面和/或底物，例如但不限于医疗仪器或者牙医仪器、实验室仪器或者溶液的表面。
医疗仪器包括在净化和/或灭菌处理后对患者施用或插入患者体内的可回收使用的仪器。这些仪器包括尿液管、套管、外科手术刀、针头、窥器、支架或者钳子。这些仪器可进一步包括有在牙科实践中使用的仪器，如，提取器、成型片、手机（口腔用）。
有蛋白质和/或氨基酸存在下，本发明组合物和蛋白质和/或氨基酸反应，产生改进的和稳定的荧光产物。稳定的荧光团发射出可以被探测的荧光。表面的蛋白荧光团在干燥形式下，可以稳定一年或者更久。因此，使用本发明的组合物时，不需要很小心地掌握检测时间，以获得可靠和稳定的结果。
探测荧光涉及使用一束光，通常是紫外光，其将一定化合物分子的电子激发，使得电子释放出低能量的光，典型地，但是不必须是可见光。该反应所释放的光的波长范围是约300纳米到约500纳米。
荧光的探测可以通过检测荧光的仪器来实现。用来检测荧光的仪器称为荧光计或者荧光仪。现有的2种通用的仪器是滤光萤光计和分光荧光计，滤光萤光计用滤片分离出入射光和荧光，而分光荧光计是用衍射光栅单色器分离出入射光和荧光。使用各种光源作为激发光源，包括但是不限于激光、光电二极管和灯；尤其是氙灯和汞汽灯。
荧光计用于检测荧光。荧光计产生选定波长的光，所述光激发溶液和/或反应所在的底物中的分子。光促使分子处于激发状态，该状态可以释放光，产生荧光。随后，在针对所发生的反应的特定波长下检测所述光。
然而，还有一种合适的仪器可以检测和测量荧光，该仪器在同时待审的PCT专利申请中有所描述，该申请要求申请号为GB1014016.8、名称是“检测蛋白污染的影像系统和相关方法”（Imaging System and Associate Method for Detection of Protein Contamination）、申请日为2010年8月20日的专利申请为优先权。
检测蛋白污染的影像系统和相关方法可以提供表面和/或底物的影像，其中标注出了蛋白残余物残留所在的区域。本系统包括一个光密闭腔室，用于容纳仪器。在腔室内，有两个可见光源和激发光源，分别用可见和激发类型的光来照亮腔室。数码相机可以捕捉到仪器被可见光照亮的第一图像，和从表面和/或底物发出的荧光体产生的荧光模式的第二图像，其中该表面和/或底物都施用了本发明的组合物。将第一图像和第二图像结合得到标注出蛋白污染区域的仪器合成图。
为了最大的灵敏度，荧光需要具有适当光谱特征（波长和强度）的光源的结合，来绘制任何蛋白质-荧光团附属物的荧光特征和一个完全黑暗的环境。镭射光束给出很高强度的同时，具有特定的波长，这些波长可能无法绘制荧光团，而且还很昂贵。强光灯、比如汞、氙、和汞掺杂的氙更加适合传统蛋白检测。此外，试剂本身不应当发荧光，因此，降低背景和增加灵敏度是很重要的。
不稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和蛋白质（牛血清蛋白）反应产生荧光团产物，使用分光荧光计来检测荧光（图1a），激发峰和发射峰分别大约是350纳米和450纳米。稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和蛋白质（牛血清蛋白）反应产生荧光团产物（图1b），激发峰和散射峰也分别大约是350纳米和450纳米。由于激发波长和发射波长对于荧光衍射反应是特定的，可以推断出：使用稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂形成的荧光团是相同的。
本发明的组合物的一个优点是，作为蛋白检测器，其荧光灵敏度可以达到检测纳克级别的蛋白，而不需要加热，也不需要用汞灯先达到激发波长。检测组合物甚至还可以检测很难检测的痕量的细胞色素C。
荧光的检测可以是定性或者定量的方式检测。
荧光的定性检测可以以任何检测光的装置和/或仪器达到。在黑暗的房间，荧光是可见的，或者通过一个合适的滤片可见。通过使用合适的检测器和发射滤片，荧光可以被检测到，荧光的强度可以被测量。。可以是光电二极管，或者为了可视化，整个仪器的荧光可以通过数码相机或者配备有适当滤片以及适当软件的类似装置来测量，所述滤片位于安装在合适的黑暗环境中的CCD检测器的前方。。用于检测光的装置和/或仪器可以是可见，或具有特殊的摄影装置，该装置包括有可检测荧光的滤片。
可通过使用荧光灯、汞灯或者汞灯派生物等简单仪器来得到合适的激发波长，然后通过合适颜色的滤片观察荧光。
荧光的定量检测可以通过一系列的已知蛋白质组合物标准来判断。用做标准的蛋白质为牛血清蛋白（BSA）。对不同浓度牛血清蛋白的含量分析，和本发明组合物反应而发射的荧光也通过荧光计或者能检测并定量所产生的荧光的其它任何合适仪器来测量和检测，从而产生标准曲线并控制。
对于对表面的检测，可制备干燥于不锈钢条上的一系列标准牛血清蛋白溶液。使用标准曲线，来测量本发明的组合物与表面和/或底物的反应所发射的相对荧光，从而定量评估表面和/或底物上存在的痕量蛋白质的量。
除上述检测方法外，一个申请名称是“检测蛋白污染的影像系统和相关方法”（IMAGINGSYSTEM AND ASSOCIATED METHOD FOR DETECTION OF PROTEINCONTAMINATION），2010年8月20日递交的共同待审的申请中描述了另外一个合适的影像系统，该系统涉及一种用于捕获表面和/或底物上发射出来的荧光的图片的仪器，该荧光是本发明的组合物施用于表面和/或底物时发出的。
该影像系统可以提供快速准确的判断，确定表面和/或底物是否被蛋白质所污染，以及存在的蛋白残留的内容，其中，还应用了处理器和相关分析软件。
表面和/或底物的可见图，可以很方便的用肉眼观察，判断在常规净化周期后、消毒服务部门消毒和灭菌可回收仪器之前，表面（如外科手术刀或者牙科杆）是否仍然含有蛋白残留。自此，相关软件可以用于分析图像以判断蛋白污染的定量水平。
本发明的组合物也可用于监测表面蛋白质的去除，确认荧光产物已经彻底从表面清除，减小了毒物问题。
本发明第四个方面，提供了一种用于检测表面上的蛋白质和/或氨基酸的试剂盒，包括有本发明的组合物以及使用说明书。典型地，说明书指导用户依据本发明第三方面使用本试剂盒。
本发明第五个方面，提供了一种用于检测蛋白质和/或氨基酸的试剂盒，包括有本发明的组合物、将组合物施用于表面和/或底物的装置以及使用说明书。典型地，说明书指导用户依据本发明第二方面使用本试剂盒。
本发明的组合物可用于作为一种原位检测试剂，可以喷到表面和/或底物上。在本发明一个实施例中，组合物包括有约2毫摩尔/升的邻苯二甲醛的甲醇溶液。浓度大约是50毫摩尔/升的缓冲溶液的pH大约为9，加入约0.1%（v/v，体积比）的非离子表面活性剂，搅拌至溶解。然后，加入约10毫摩尔/升硫醇，如乙酰半胱氨酸，和0.5毫摩尔/升的二硫代苏糖醇，搅拌。组合物在使用前，储存在4°C下约24小时。然后通过直接或间接的方式将组合物施用在表面和/或底物上。在蛋白质和/或氨基酸存在时，组合物和被施用的表面和/或底物上的蛋白质和/或氨基酸反应。反应会产生稳定的荧光团产物，发射荧光，该荧光可以用简单的仪器定性和/或定量的检测，如使用荧光灯，如汞灯或者荧光计。发射的荧光对比标准蛋白质的曲线检测，存在表面和/或底物的蛋白质和/或氨基酸的量就会被定量出来。发现的和定量出的蛋白质的量对于监测蛋白质在临床，生物和化学环境中的存在是鉴定性的。
本发明的检测组合物有以下优点：
● 组合物和方法可以揭示“整个”仪器上的蛋白残余
● 简单-适合于消毒服务部门的使用环境
● 可以得到永恒不变的记录
● 可以产生定量数据
● 可以针对特定蛋白
● 比现有蛋白残余检测灵敏100倍
● 瞬间知道结果
● 快速-能够高通量和自动化
● 采用现有仪器且不需镭射光
● 稳定
● 被检测产物稳定
● 可以作用于绝大多数材料表面
● 无毒，即安全的试剂
● 可以容易地从不锈钢表面去除
● 低费用-资金和运转
这里描述的本发明的组合物及其方法可被用于科学分析的各个方面，来判断蛋白质和/氨基酸的检测，和/或蛋白质和/或氨基酸的去除。
本发明的第二以及后续方面的优选技术特征是在第一方面上加上必要的变更。
附图说明
通过下面实施例以及附图，本发明将被进一步描述，实施例和附图的作用仅仅是为了说明，不能被用于限制本发明。引用下列的附图：
图1：显示邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和牛血清蛋白反应产生的荧光团的激发和发射光谱。图1a显示不稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和牛血清蛋白反应产生的荧光团的激发和发射峰。图1b显示稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和牛血清蛋白反应产生的荧光团的激发和发射峰的3D扫描。
图2：显示稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂与牛血清蛋白反应超过6个月后的稳定性和灵敏度。
图3：显示使用稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂形成的荧光团的稳定性。
图4：显示稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和水溶液蛋白质反应的灵敏度。
图5：显示通过在一套不锈钢镊子上施用本发明组合物、且用G-BOX抓屏所获得的定性分析。图5a显示在消毒服务部门清洁后以及在本发明组合物施用在镊子之前,镊子的白光影像抓屏；图5b显示本发明组合物喷到镊子后发射的荧光的抓屏；图5c显示的是伪色彩覆盖的抓屏，显示蛋白质的存在。
图6：显示的是将存放4个月的试剂喷在被污染的外科手术刀刀片上。影像被捕获且用G-BOX光学放大。
图7：显示的是本发明稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和蛋白质反应形成的荧光团的稳定性。刀片在台上暴露于空气中放置1个月。不需要重新喷试剂到仪器，用G-BOX捕获影像。
图8：显示的是蛋白质和（将稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂）喷到牛血清蛋白标准上的半定量分析。用G-BOX捕获影像以及用D-Plot软件分析。
图:9：显示的是在手术刀刀片上使用稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的蛋白质和定量的牛血清蛋白（0到100纳克）的可视化。用G-BOX捕获影像以及用D-Plot软件分析。回归和线性用Excel2003来计算。
图10：显示的是在外科手术仪器上蛋白质的可视化和量化。
图11：显示通过在一套不锈钢镊子上使用本发明组合物而获得的定量分析；图11（a）显示的是在消毒服务部门清洗后，覆盖在一套镊子上伪色彩的抓屏，显示在镊子的不同地方不同强度的蛋白质残留存在；图11（b）显示蛋白质残留在镊子上不同量的3-D图；图11（c）显示的是蛋白质强度的图。
图12：显示的是纤维蛋白原标准的结果。图12（a）显示的是不同浓度纤维蛋白原的标准的发射和捕捉的荧光以伪色彩覆盖的抓屏；图12（b）显示的是不同量的标准的3D图；图12（c）显示的是纤维蛋白原的标准曲线。
具体实施方式
实施例
实施例1：制备邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂
将9.5g无水四硼酸二钠溶解于500毫升去离子水中，加入几滴1M的NaOH调节pH，配成pH9.23的硼酸钠缓冲溶液。60毫克的N-乙酰半胱氨酸加入到缓冲溶液中，用磁搅拌子搅至完全溶解。将60毫克邻苯二甲醛溶解在5毫升甲醇中，将其全部加入上述硼酸钠缓冲溶液中，制得乙酰半胱氨酸溶液。邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸溶液每周都要新鲜配置，且使用前在黑暗4°C冷藏24小时以降低背景荧光干扰。
实施例2：制备稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸用于蛋白检测
将19g无水四硼酸二钠溶解于900毫升去离子水中，加入几滴1M的NaOH调节pH，配成pH9.23的硼酸钠缓冲溶液。将1毫升TritonX-100、1.63克N-乙酰半胱氨酸、0.077克二硫苏糖醇加入缓冲溶液中，用磁搅拌子搅至完全溶解。将0.268克乙酰半胱氨酸溶解在10毫升甲醇中，将其全部加入上述硼酸钠缓冲溶液中，制得OPA溶液。溶液补足至1升。邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸溶液在使用前在黑暗4°C冷藏24小时以降低背景荧光干扰。
实施例3：制备稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸，进一步包括乙二胺四乙酸钠
实施例2中的同样的邻苯二甲醛溶液配置后，加入0.32克乙二胺四乙酸二钠，用磁搅拌子搅至完全溶解。
实施例4：判断稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的稳定性
进行牛血清蛋白的化验来评估稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂超过6个月的稳定性和灵敏度。
准备牛血清蛋白的标准化验。准备牛血清蛋白的标准溶液，用去离子水稀释，得到浓度范围是0-100微克/毫升的牛血清蛋白的标准溶液。牛血清蛋白的标准化验和空白检测使用新鲜准备的、储藏在室温和4°C冷藏不同时间的稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂溶液（如实施例2和3描述）来进行。
稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂（如实施例2和3所述）和牛血清蛋白的反应化验在1毫升的亚克力玻璃或者硅玻璃的荧光比色皿中进行制备，即，300微升的不同浓度的牛血清蛋白和200微升的稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂混合，允许反应混合物在室温下保持5分钟，然后检测荧光，激发波长/发射波长为350纳米/450纳米。
用HITACHI F4500荧光分光光度计来检测反应中形成的异吲哚发射出的荧光。将分光光度计的激发和发射波长设置为350纳米和450纳米，激发波长有10纳米的带宽，发射波长有2.5纳米的带宽，PM电压为700伏特。数据用于计算关于蛋白检测的试剂的检测极限。
试剂的灵敏度在室温下可以稳定3个月。图2的结果显示4°C下，试剂灵敏度可以稳定6个月。在6个月的时间，牛血清蛋白标准的线性是0.99，灵敏度是36±3.2微克/毫升/RFU（表1）。
表1：稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和牛血清蛋白的化验在6个月储藏期的稳定性和灵敏度。
稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和蛋白反应速度和荧光的发生是非常快速的，在3分钟以内就完成。实际上，在影像系统中，荧光的发生在第一幅图被捕获时就已经结束了。
实施例5：确定稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和蛋白质反应形成产物的稳定性
在荧光比色皿中，配制的已知浓度样品和稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂混合（如实施例4所提到的），重复10个上述化验，评估形成的异吲哚产物的稳定性。在特定时间间隔检测异吲哚产物的荧光，对比在荧光检测中，产物的损失。
在反应混合物在室温下维持5分钟后（如实施例4所说），检测反应混合物发出的荧光，检测荧光的激发波长/发射波长=350纳米/450纳米。
反应混合物放置360分钟（6小时）后，每隔1个小时测量反应混合物的荧光，来检测异吲哚的稳定性。
本例说明，不仅稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂可以稳定6个月，且溶液中的异吲哚产物也可稳定6个月。
实施例6：稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的特异性
如实施例2中，用去离子水，配置包含有牛血清蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原、细胞色素C、球蛋白、肌红蛋白的蛋白标准溶液（0-100微克/毫升）。该方法的重复性通过分别重复10组合物析牛血清蛋白和细胞色素C来评估。
稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和不同的蛋白质反应，用分光光度计测量荧光，在所有的蛋白质测试中均给出线性结果（图4）。由于蛋白质天然性质不同，灵敏度也会变化。系统中牛血清蛋白的检测极限是0.3微克/毫升（表2）。
表2：水溶液中稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂和不同的蛋白质反应的灵敏度。
实施例7：外科手术仪器上的蛋白残留的原位检测
稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂（如实施例2和3所述）用于检测表面上原位的蛋白残留。原位蛋白检测的优点意味着，通过一次简单水洗已经去除所有的氨基酸和氨了。
制备一个牛血清蛋白的标准化验（如实施例4提到的）。
使用SY NGENE（剑桥，英国）的改进的胶文件编制系统（G-BOX）来进行蛋白质可视化实验。该系统使用带有优化了的磷光管的汞灯，发出激发波长为350纳米的光，非常接近邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的最佳值。发出的光线在透过440纳米的干扰滤光片（直径7厘米）后，被冷却的CCD摄像机捕获。喷雾瓶在街上的药店可以得到。所有的喷雾都喷到黑色无荧光的艺术纸上，每次使用完即更换。
使用来自HydeSoft电脑公司（维克堡，美国）的软件D-Plot对G-BOX影像进行半定量分析。
将蛋白质点用移液管移取到不锈钢表面，让其在室温下空气中干燥至少4个小时，然后进行实验。将仪器和/或表面放置在平台上，喷上稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的细雾。平台的腔室关闭，在白光以及随后的紫外线（350纳米）下，用设置相同的摄像机捕捉一系列的后继影像，。影像叠加上伪颜色，蛋白质点用于定性（图5）和半定量分析（请参照实施例8）。
实施例8：半定量分析
捕捉的影像导入D-Plot软件程序。使用软件L插件图像从位图转变为3D图。所述插件图像的像素值映射为曲面图上的z值。荧光点表面下方的量作为荧光的强度测量值进行测量。该值被用于定量分析。
A：干燥的荧光衍生物的稳定性。
在4°C下，试剂可以稳定6个月。用4个月的试剂来检测在外科手术刀刀片（图6）上的蛋白质。令人惊讶的是，形成的荧光团在空气中暴露了9个月时长之后还能发出荧光。图7展示这一发现。
B:稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂原位检测蛋白点的灵敏度
标准蛋白（牛血清蛋白）用于判断系统在检测位于仪器的不锈钢表面上的蛋白残留方面的灵敏度。含有牛血清蛋白（0到1200毫克）的1微升的点（2平方毫米）移液到一个干净的不锈钢表面，在室温下干燥。在点上喷上稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂，然后，如实施例5和6的描述进行分析。表面下的量相对于浓度作图，来检查原位蛋白质视觉化的线性（图8）。标准校准的回归指数是0.98。使用所定义的系统，检测极限目前是平均每个点500皮克蛋白质，或250皮克/平方毫米。（图9）
C：外科医疗仪器上蛋白残留的半定量分析
为了测试该成熟系统在检测经一次洗涤后的外科仪器上的蛋白残余物方面的实用性，将疏水蛋白质（纤维蛋白原）涂在剪刀上。在仪器被污染并在典型的消毒服务部门进行洗涤后，向仪器喷上邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸/二硫苏糖醇。洗涤后的仪器被摄影，并重新喷上试剂，随后用同样的装置再次摄影。分析影像来量化残留的蛋白质残留。
结果显示任何残留的蛋白质都可以视觉化和定量。在一个特定例子中，140纳克的纤维蛋白原残留可以从纤维蛋白原校准中计算出来（图9）。为实现这一目的，蛋白区域用D-Plot手动地标记出来。蛋白点内荧光的体积通过D-plot来计算，且蛋白质实际的量通过参照一系列标准点计算得出，如图12所示。显然，使用合适的边缘检测软件和蛋白质校准物，该过程可以自动化和简单化。通过Excel2003计算回归和线性。
讨论
邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸溶液/试剂的不稳定性是由于试剂混合物中硫醇之间形成双硫键；这阻碍邻苯二甲醛和溶液中硫醇结合而形成反应试剂，因此随着时间失去它的灵敏度和稳定性。通过加入硫醇还原化合物，如二硫苏糖醇，或三(2-羧乙基)膦（TCEP）得到溶液/试剂的稳定性。
稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂形成的异吲哚的稳定性
邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的第二个缺点是产生不稳定的异吲哚衍生物，从而快速失去荧光信号。会导致使用该试剂化验时的时间紧张。
计算和统计
试剂内部和之间的化验显示反应的可重复性，即试剂的验证。通过计算描述性的统计资料（平均值，标准偏差和变异系数）显示稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂检测极限的显著提高。考虑95%的置信区间，以及用下列方程计算检测和定量的极限：
LoD=（（CV*2）/100）*平均浓度
LoQ=LoD*2.5
用MS-Excel2003来统计计算。
邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的长期稳定性呈现灵敏度的衰减，从配制好24小时后的76微克/毫升/RFU降至72小时后的16微克/毫升/RFU。这确认了试剂稳定性的常数衰变。
试剂的不稳定性来自于硫醇化合物在试剂混合物中形成双硫键，而不能和邻苯二甲醛键合，以与蛋白质和/或氨基酸反应，产生反应的异吲哚衍生物。此外，异吲哚荧光团衍生物自身很不稳定，会在反应发生30分钟后产生信号衰减，会极大限制任何分析研究的精确度。
在试剂混合物中引入硫醇还原化合物，可以降低试剂中硫醇化合物之间双硫键的形成。结果显示，试剂的长期稳定性得到提高。此外，本发明的组合物也提高了试剂的灵敏度和与牛血清蛋白反应时候的稳定性，以及反应混合物形成的异吲哚衍射物的稳定性。
与原来的不稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸对比，稳定的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂通过维持常数灵敏度信号随着时间不变，提高了试剂的长期稳定性。
基于所执行的内部化验变数的变异系数，计算本发明邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的LoD值。这些确定了：加入硫醇还原试剂和螯合试剂到邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂内，提高了和牛血清蛋白反应的检测极限。原始的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂显示的LoD是约840纳克/毫升，以需要的量加入二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸到邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂中，显示的是约750-530纳克/毫升，以及加入三(2-羧乙基)膦显示试剂的LoD的显著变化，从700降至10纳克/毫升。
异吲哚的稳定性
原始的邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸显示检测开始后30分钟，异吲哚产物的荧光信号衰减33%。对比地，增加三(2-羧乙基)膦，显示约2-80%的异吲哚荧光信号的增大，而加入二硫代苏糖醇证明有约1-27%的降低。时间依赖性明显展示了与引入邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂混合物硫醇还原剂的量和类型相关的变化。
这些结果显示的是邻苯二甲醛/乙酰半胱氨酸试剂的长期稳定性可以通过加入硫醇还原剂来达到。硫醇还原化合物的添加带来更大的LoD、更少的信号荧光变化、试剂及其产物随时间推移的持续稳定性，以及在蛋白检测方面比茚三酮灵敏300倍的检测极限。

Claims (13)

1.一种蛋白质和/或氨基酸检测组合物，该组合物包括：
(a)0.1毫摩尔/升至10毫摩尔/升的邻苯二甲醛，
(b)1毫摩尔/升至20毫摩尔/升的乙酰半胱氨酸，
(c)10毫摩尔/升至100毫摩尔/升的、pH值在7.5到10之间的缓冲溶液，
(d)0.01％(v/v，体积比)至2％(v/v，体积比)的表面活性剂，和
(e)0.05毫摩尔/升至5毫摩尔/升硫醇还原化合物，所述硫醇还原化合物选自二硫苏糖醇、2-巯基乙胺和三(2-羧乙基)膦。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值在pH9到pH9.5之间。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括螯合剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述螯合剂的浓度在0.05毫摩尔/毫升至5毫摩尔/毫升之间。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括有机溶剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述溶剂选自于乙醇、甲醇、丙酮或者乙腈。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述溶剂是甲醇。
9.用于制备权利要求1-8任一项所述的组合物的方法，该方法通过将成分(a)、(b)、(d)和(e)混合到缓冲溶液(c)中而进行。
10.检测蛋白质和/或氨基酸的方法，包括：
a)施用权利要求1-8任一项所述的组合物至表面和/或底物上，和
b)检测荧光。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使用能探测荧光的任何装置或仪器来检测荧光。
12.用于检测蛋白质和/或氨基酸的试剂盒，包括：
a)如权利要求1-8任一项所述的组合物，和
b)使用说明。
13.用于检测蛋白质和/或氨基酸的试剂盒，包括：
a)如权利要求1-8任一项所述的组合物，和
b)用于将所述组合物施用到表面和/或底物上的装置，和
c)使用说明。
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