JP2013536429A - タンパク質の検出のためのインサイチュ試薬 - Google Patents

Abstract

この発明は安定的にタンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物に係るものである。この組成物は表面のような、インサイチュでの検出のための試薬として使用可能である。また、この発明は、組成物を使った表面のタンパク質およびアミノ酸の検出のための方法、およびその組成物を含んだキットにも関する。

Description

この発明は表面のような、インサイチュ検出のための試薬として使用され、安定的にタンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物に関連している。また、この発明は組成物やその組成物を含んだキットを使用した表面のタンパク質および／またはアミノ酸の検出のための方法にも関連している。

未処理のタンパク質および／またはそれらのサブユニットであるアミノ酸とペプチドなどの検出は、特に微量のレベルにおいて、研究室や臨床、法医学的な環境下で使われる分析的技術、生物学的技術において、重要かつ基本的な過程である。通常、タンパク質および／またはアミノ酸の検出は種々の有効な技術と器具とともに、即座に利用可能な試薬を使用することによって達成される。これらの方法は、定性的および定量的方法において、検体の存在を決定するために可視的に着色された、または検出可能な蛍光物質を与えるための溶液中において、遊離アミノ酸、ペプチド中の末端アミノ基、タンパク質中の末端アミノ基もしくは側鎖、官能基と反応する試薬に依存する傾向がある。

研究によると、病院の滅菌・消毒部門（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔｉｏｎ ＆ Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔｓ（滅菌サービス部（Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ）、ＳＳＤとして知られる））で使用される標準的な滅菌方法は、再利用可能な手術器具の汚染除去に効果がないことが判明している（Ｂａｘｔｅｒ Ｒ.ＬらＪ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. ２００６, ６３, ４３９−４４）。これらの研究は手術用の器具上に残ったタンパク質が、手術、特に脳神経外科手術を介した変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の転移などの潜在的な病気の危険性と直接的に関連している可能性を示している。それ故に、極めて微量（ナノグラムまたはピコグラム）の手術器具に残ったタンパク質の測定は重要であると考えられ、また、急ぎ取り掛からなければならない。

ニンヒドリン（２, ２−ジヒドロキシインデン−１, ３−ジオン）は第一級、二級アミンの検出に用いられる化学物質である。ニンヒドリンはアミノ酸のαアミノ基と反応する。至適温度下で、ニンヒドリンがアミンと反応すると、ルーヘマン紫として知られる非常に強い青もしくは紫の発色団が産生される。このニンヒドリンの発色特性はアミノ酸の視覚的検出および定量的分析を可能にする。ニンヒドリンはクロマトグラフィやＨＰＬＣまたは固相ペプチド合成のような様々な分離技術の終わりに、現状のアミノ酸濃度を決定するための生化学的分析に用いられる。

ＳＳＤ部門は再利用可能な手術および／または歯科の器具の除染処理および／または滅菌処理の効果に対する定性的な監視のために市販のキットに含まれるニンヒドリンを使用している。オートクレーブ処理され、高温処理され、そして洗浄された器具の表面は、キットにあるニンヒドリンをしみこませた布を用いて拭き取られる。発色するとすぐに、アルギニン標準の布と比較して視覚的に評価することが可能である。ニンヒドリンは発色産生物の至適産生のために利用可能な遊離アミノ酸の存在に依存している。その試薬はアミノ基が露出しているような遊離アミノ酸の存在の確認にもっとも効果的である。しかしながら、器具が洗浄やオートクレーブの処理を受けると、遊離アミノ酸や分解されたタンパク質から形成されたアミノ酸は洗い流されてしまう。ニンヒドリンは、およそ５ μｇ／ｍｌの閾値でアルギニンを検出できる一方でウシ血清アルブミンでは５００ μｇ／ｍｌの検出感度を示す。これは実際面、検出にとって非常に高い閾値である。拭き取り技術が結合部位からタンパク質の脱着に効果的でない場合、検出感度はさらに減少される。残余タンパク質への反応性が低く、偽陰性を引き起こす高い危険性があるように、ニンヒドリンの感応性と特異性は特に乏しい。全体的に、試薬としてのニンヒドリン、及びキットに基づくニンヒドリンは汚染除去法に必須である感度の高いタンパク質の検出を提供しない。

オルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）は化学的、生物学的研究でアミノ酸の検出に用いられる試薬である。ＯＰＡはその高い感応性により、アミノ酸の検出に使用されている。ＯＰＡ／チオール溶液はアミノ酸の分析においてニンヒドリンに代わる試薬である （Ｓｔｏｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３５， ｐｐ．４９５−５０４）。ＯＰＡはチオールの存在下で第一級アミンと反応し、高い蛍光性のイソインドール誘導体を産生する（ＧａｒｃiａＡｌｖａｒｅｚ−Ｃｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ. （１９８９）, Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０, ｐｐ.１７２−１７６）。その蛍光はＥｘ／Ｅｍ ＝３５０／４５０ ｎｍで監視できる。

ＯＰＡ／チオール試薬は他の検出方法に比べいくつかの利点がある。それは、非蛍光性であり、可溶性であることだ。ＯＰＡ／チオール試薬はシステインとイミノ酸を除いた一般的なアミノ酸と反応することで検出可能な蛍光性誘導体を産生する。ＯＰＡ／チオール試薬は室温で素早く反応し様々な検出可能な蛍光色素分子を形成する（Ｇａｒｃｉａ Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ１９８９, ｓｕｐｒａ）。ＯＰＡ／チオールは、溶液中の遊離アミノ酸またはタンパク質の検出において、簡便で、素早く、高い感応性を持ち、さらに可溶性タンパク質の正確な定量的測定を達成する（Ｖｅｒｊａｔ ｅｔ ａｌ. （１９９９）, ＩｎｔＪ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １７９.ｐｐ ２６７−２７１）。

ニンヒドリンと比較すると、ＯＰＡ／チオール試薬を使用した蛍光色素分子の形態は、それらの構造がＯＰＡ／チオール試薬が反応したアミノ酸に依存するので、異なっている。しかしながら、ＯＰＡ／チオール試薬の制限の一つは、イソインドール蛍光色素分子誘導体の形態の不安定性から生じる。したがって、試薬としてＯＰＡ／チオールを使用するときは、分析の正確性を達成するために、慎重な適時選択を必要とする（Ｇａｒｃｉａ Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ １９８９, ｓｕｐｒａ）。加えて、ＯＰＡ／チオール試薬は、背景の蛍光を減少させるために、使用まで24時間を要し、さらに溶液中の試薬の安定性は比較的不安定であり、使用できる期間はせいぜい1週間である。

上記に述べた方法は、可変性のタンパク質および／またはアミノ酸の特異性、感応性、そして試薬および／または産生された形態の安定性のような様々な制限がある。

このように、これらの制限を技術的に克服する試薬が必要である。

本発明者らは、定性的、定量的に微量レベルのタンパク質を検出するための、溶液中や器具の表面のようなインサイチュで使用できる、タンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物を発明した。そして、この組成物はＳＳＤに使われる試薬としての要件を満たすものである。このタンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物は、それ自体が安定的であり、さらに、長期の保存可能期間を持つ。さらに、この組成物がタンパク質と反応すると、安定的なイソインドール蛍光色素分子誘導体を産生する。この誘導体は単純な計測手段を使って同定可能であり、視覚的に、または数値データ的方法により直ちに定量化可能である。

この発明の第１の態様においては、
（ａ）ｏ−フタルジアルデヒド
（ｂ）Ｃ_３−Ｃ_６チオール
（ｃ）ｐＨが約７．５〜１０の範囲の緩衝液
（ｄ）界面活性剤
を含み、
（ｅ）チオール還元性化合物
をさらに含むタンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物が提供される。

この発明の一つの実施形態においては、
（ａ）ｏ−フタルジアルデヒド
（ｂ）Ｃ_３−Ｃ_６チオール
（ｃ）ｐＨが約７．５〜１０の範囲の緩衝液
（ｄ）界面活性剤
を含み、
（ｅ）チオール還元性化合物を０．０５〜約５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに含むタンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物が提供される。

この発明の第１の態様の他の実施形態においては、以下の物質を含む組成物が提供される。

（ａ）約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌのｏ−フタルジアルデヒド
（ｂ）約１〜約２０ｍｍｏｌ／ＬのＣ_３−Ｃ_６チオール
（ｃ）約１０〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨ７．５〜１０の緩衝液
（ｄ）約０．０１〜約２％ｖ／ｖの界面活性剤
（ｅ）約０．０５〜約５ｍｍｏｌ／Ｌのチオール還元性化合物。

各構成成分の濃度および範囲は、本発明に係るすべての構成成分が混合されて最終的なインサイチュタンパク質検出試薬とされた際の各構成成分の濃度である。

本発明は、タンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物を提供する。この組成物は室温において安定で、タンパク質の広い範囲のスペクトルの検出に特異的であり、ナノグラムやピコグラムのような微量のタンパク質の残基の検出に感応し、さらに、単純な器具の使用で利用できる。

したがって、本発明の組成物はタンパク質および／またはアミノ酸の検出における使用に適している。

図１は、ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬がＢＳＡと反応したときに形成される蛍光色素分子の励起スペクトルと発光スペクトルを示している。図１（ａ）は不安定なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬がＢＳＡと反応した際の蛍光色素分子の励起と発光のピークを示している。 図１（ｂ）は安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬がＢＳＡと反応した際に形成された蛍光色素分子の励起と発光のピークを３Ｄスキャンした結果を示している。 図２は六ヶ月の期間で、一ヶ月ごとにＢＳＡと反応させた際の、安定化させたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の安定性と感度を示している。 図３は安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を使用して形成された蛍光産生物の安定性を示している。 図４は、水溶液中の安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の感度を示している。 図５は、一連のステンレス鋼の鉗子上で発明の組成物を使用して得られた定性的な分析とＧ−ＢＯＸで撮影されたスクリーンショットを示している。図５（ａ）はＳＳＤクリーニングの後、発明に係る組成物を塗布する前の鉗子の白色光の画像のスクリーンショットを示している。 図５（ｂ）は鉗子に発明に係る組成物を噴霧した後に放出された蛍光のスクリーンショットを示している。 図５（ｃ）はタンパク質の存在を示す疑似色のオーバーレイのスクリーンショットを示している。 図６は４か月経過した試薬を噴霧した、汚染された手術用のメスの刃を示している。画像はＧ−ＢＯＸで撮影し、および光学的に拡大された。 図７はこの発明に係る安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣがタンパク質と反応した際に形成された蛍光色素分子の安定性を示している。刃は１ヶ月間、大気中で卓上に放置されていた。画像は、試薬を再度噴霧することなく、Ｇ−ＢＯＸを用いて撮影した。 図８はタンパク質の可視化と（安定化したＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を）ＢＳＡ基準に噴霧した半定量分析を示している。図はＧ−ＢＯＸを使って撮影し、Ｄ−Ｐｌｏｔソフトウェアを使って分析した。 図８はタンパク質の可視化と（安定化したＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を）ＢＳＡ基準に噴霧した半定量分析を示している。図はＧ−ＢＯＸを使って撮影し、Ｄ−Ｐｌｏｔソフトウェアを使って分析した。 図９は手術用の刃に安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を使用したタンパク質の可視化とＢＳＡ（０から１００ナノグラム）の定量化を示している。画像はＧ−ＢＯＸを使って撮影し、Ｄ−Ｐｌｏｔソフトウェアを使って分析した。回帰と線形はエクセル２００３で計算した。 図９は手術用の刃に安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を使用したタンパク質の可視化とＢＳＡ（０から１００ナノグラム）の定量化を示している。画像はＧ−ＢＯＸを使って撮影し、Ｄ−Ｐｌｏｔソフトウェアを使って分析した。回帰と線形はエクセル２００３で計算した。 図１０は手術用機器上のタンパク質残基の可視化と定量化を示している。 図１０は手術用機器上のタンパク質残基の可視化と定量化を示している。 図１１は、一連のステンレス鋼製鉗子上でこの発明に係る組成物を使用して得られた定量的分析を示している。図１０（ａ）はＳＳＤクリーニングの後の一連の鉗子の疑似色オーバーレイのスクリーンショットを示している。このスクリーンショットは鉗子上の異なった場所における明度の違いで残存タンパク質を示している。 図１１は、一連のステンレス鋼製鉗子上でこの発明に係る組成物を使用して得られた定量的分析を示している。図１０（ｂ）は、鉗子上に残存するタンパク質の様々な量を示すために作成された３Ｄプロットを示す。 図１１は、一連のステンレス鋼製鉗子上でこの発明に係る組成物を使用して得られた定量的分析を示している。 図１２はフィブリノーゲン基準の結果である。図１２（ａ）はフィブリノーゲンの様々な基準の疑似色オーバーレイのスクリーンショットにおいて放出され、撮影された蛍光を示している。 図１２（ｂ）の３Ｄプロットは基準の様々な量を示している。 図１２はフィブリノーゲン基準の結果である。

タンパク質は共有結合したアミノ酸からなる有機分子である。本明細書で定義される場合、タンパク質はペプチドおよびポリペプチドを含む。アミノ酸は２０種類の天然アミノ酸とその他のアミノ酸のいずれかである。それぞれのアミノ酸は、アミン基、カルボキシル基、アミノ酸によって違う様々な側鎖からなる。

典型的に、タンパク質および／またはアミノ酸を検出する組成物はアミン基を検出する。

この発明の組成物はｏ−フタルジアルデヒドを含む。ｏ−フタルジアルデヒドはＣ_６Ｈ_４（ＣＨＯ）_２の化学式であらわされる化合物である。フタルジアルデヒドはｏ−フタルジアルデヒド、フタル酸アルデヒド、フタラール、フタル酸ジアルデヒド、ジスパ（Ｄｉｓｏｐａ）、フタルジカルボキシアルデヒド、１，２−ベンゼンジカルボキシアルデヒド、オルト−Ｏ−フタルジアルデヒド、オルトフタルジアルデヒド、ジスパ（Ｄｉｓｏｐａ）（ＴＮ）、ｏ−フタルジアルデヒド［Ｆｒｅｎｃｈ］、フタル酸ジカルボキシアルデヒド、オルト−フタル酸アルデヒド、フタルジアルデヒド試薬、ｏ−フタル酸ジカルボキシアルデヒドとしても知られている。それらは共通してＯＰＡ（オルト−Ｏ−フタルジアルデヒド）と略される。

ＯＰＡはベンゼン環の隣接する炭素中心に結合した二つのホルミル（ＣＨＯ）基からなるジアルデヒドである。ＯＰＡはアミン、特に第一級アミンと反応する。

いくつかの実施形態において、ＯＰＡは、ＯＰＡを溶解するために、および試薬の噴射特性を強化するために有機溶媒に浸される。有機溶媒はメタノール、アセトニトリル、その他の易揮発性の溶媒から選択可能である。易揮発性溶媒にはアセトン、エタノールその他のすぐに蒸発する溶媒が含まれる。典型的に、いくつかの実施形態においては、有機溶媒はメタノールである。

有機溶媒の添加は組成物の噴射特性を改善し、組成物を素早く乾燥させるため、表面にみられる乾燥したタンパク質のスポットの拡大を防ぐ。

いくつかの実施形態において、ＯＰＡの濃度は約０．１ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌである。特定の実施形態においては、ＯＰＡの濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌから５ｍＭである。好ましい実施形態においては、この発明において使用されるＯＰＡは典型的に、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌまたは４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度である。典型的にいくつかの実施態様のＯＰＡの濃度は２ｍｍｏｌ／Ｌである。

いくつかの実施形態において、有機溶媒は０．１％ ｖ／ｖから１０％ｖ／ｖからなる。特定の実施形態においては、有機溶媒は０．５％ ｖ／ｖから５％ ｖ／ｖからなる。 好ましい実施形態においては、有機溶媒は０．５％ｖ／ｖ、０．６％ｖ／ｖ、０．７％ｖ／ｖ、０．８％ｖ／ｖ、０．９％ｖ／ｖ、１％ ｖ／ｖ、１．５％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、２．５％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、３．５％ｖ／ｖ、４％ｖ／ｖ、４．５％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖの量で含まれる。

本発明に係る組成物はＣ_３−Ｃ_６チオールも含む。チオールは典型的に無臭である。このチオールはシステインのような遊離アミノ酸を含むべきではない。

チオールは硫黄と水素の結合（ｓｕｌｆｕｒ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ （−ＳＨ））によって構成されている。それは一般的にチオール基、メルカプト基もしくはスルフヒドリル基といわれる。より伝統的な意味では、チオールはメルカプタンと称されることもよくある。

Ｃ_３−Ｃ_６チオール分子は、３、４、５つまたは６つの炭素原子とチオール官能基を含む任意の有機化合物でありうる。Ｃ_３−Ｃ_６チオールは、飽和、不飽和の場合があり、炭素鎖に沿って一つ以上の位置で不飽和であってもよい。Ｃ_３−Ｃ_６チオールは、分枝状、直鎖状、環状、炭化水素ラジカルであってもよいし、直鎖に沿って一つ以上の位置でヒドロキシル化されていてもよい。典型的なＣ_３−Ｃ_６炭化水素鎖は一般的な化学式としてＣ_ｎＨ_２ｎ＋１のアルキルでありうる。

典型的なアルキル基としては、以下のものに限られないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。好ましい実施形態においては、アルキル基はＣ_３−Ｃ_６アルキルである。

特に、「Ｃ_３−Ｃ_６アルキル基」の例としては以下のものが挙げられる：ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−エチルブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基など。場合によっては、アルキル基は、一つ以上の酸素原子によって中断されてもよい。

いくつかの実施形態においては、Ｃ_３−Ｃ_６チオール分子は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（（２Ｒ）−２−アセトアミド−３−スルファニルプロパノイック酸（（（２Ｒ）−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−３−ｓｕｌｆａｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）））、２−メルカプトエタノール（２−ヒドロキシ−１−エタンチオール）、ヂチオスレイトール（ＤＴＴ）（２Ｓ，３Ｓ）−１，４−ビス−スルファニルブタン−２，３−ジオール，Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミン，Ｎ−アセチル−システアミン，Ｎ−アセチル−ホモシステイそしてメルカプトコハク酸から選択することができる。典型的に、いくつかの実施様態において、タンパク質および／もしくはアミノ酸を検出する組成物中のＣ_３−Ｃ_６チオール分子はＮ−アセチル−Ｌ−システインである。

いくつかの実施形態において、Ｃ_３−Ｃ_６チオールの濃度は、約１ｍｍｏｌ／Ｌから約２０ｍｍｏｌ／Ｌである。特定の実施形態においては、Ｃ_３−Ｃ_６チオールの濃度は約５ｍｍｏｌ／Ｌから約１５ｍｍｏｌ／Ｌであることがある。好ましい実施形態においては、本発明で使用されるＣ_３−Ｃ_６チオールの濃度は、典型的に６ｍｍｏｌ／Ｌ、７ｍｍｏｌ／Ｌ、８ｍｍｏｌ／Ｌ、９ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１１ｍｍｏｌ／Ｌ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ、１３ｍｍｏｌ／Ｌまたは１４ｍｍｏｌ／Ｌ．典型的ないくつかの実施形態においては、Ｃ_３−Ｃ_６チオール濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌである。

本発明の組成物は、ｐＨが約７．５〜約１０の範囲の緩衝液を含む。

緩衝液は、強い酸またはアルカリが加えられた時でも、ｐＨを固定するか、ほぼ恒常的な値に維持するために機能する。緩衝液は、一般的に水溶性の緩衝液である。

ｐＨが約７．５から１０までの緩衝液は、アルカリ性の緩衝液である。この発明で用いられる緩衝液は、典型的に、約ｐＨ８、約ｐＨ９または約ｐＨ１０のｐＨを持つ。特定の実施態様においては、緩衝液は、ｐＨ９からｐＨ９．５の間のｐＨを持つ。

いくつかの実施形態において、Ｃ_３−Ｃ_６チオール分子はｐＨ７．５からｐＨ１０の範囲のｐＨのアルカリ性の緩衝液中にある。典型的には、Ｃ_３−Ｃ_６チオールは約ｐＨ９からｐＨ９．５の範囲にあるｐＨの緩衝溶液中にある。典型的には、緩衝溶液のｐＨは約ｐＨ９．２からｐＨ９．３である。

ｐＨ７．５からｐＨ１０のｐＨを持つ緩衝液の例は、リン酸塩緩衝液とホウ酸塩緩衝液である。緩衝液はナトリウム塩であることが好ましい。緩衝液は、アンモニウム塩でなく、またグリシン緩衝液のようなアミノ酸に基づくものでないことが好ましい。

特定の実施形態においては、緩衝液の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌから約１００ｍｍｏｌ／Ｌであることがある。特定の実施形態では、本発明の緩衝液は、約２５ｍｍｏｌ／Ｌから約７５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となることがある。特定の実施形態では、本発明の緩衝液は、約３５ｍｍｏｌ／Ｌから約６５ｍｍｏｌ／Ｌであることがある。好ましい実施形態においては、この発明の緩衝液は３０ｍｍｏｌ／Ｌ、３５ｍｍｏｌ／Ｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ、４５ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５５ｍｍｏｌ／Ｌ、６０ｍｍｏｌ／Ｌ、６５ｍｍｏｌ／Ｌまたは７０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度である。典型的に、いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。

好ましい実施形態では、緩衝剤はテトラホウ酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７）である。典型的に、いくつかの実施形態では、緩衝剤はｐＨ９．２３、濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌのテトラホウ酸ナトリウムである。

発明の組成物は表面活性剤も含む。

表面活性剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。イオン性界面活性剤の例は、レシチン（ホスファチジル基コリン）、胆汁酸塩、および洗剤である。非イオン性界面活性剤の例は、モノグリセリド、クリモファー（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）、ポリエチレングリコール脂肪アルコール・エーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、ポロクサマーまたはそれらの組合せを含む。モノグリセリドの例は、グリセリル・モノカプリル酸塩（別名グリセリモノオクタン酸）、グリセリルモノデカン酸、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノミリスチン酸塩、グリセリル・モノステアリン酸塩、グリセリル・モノパルミチン酸塩とグリセロールオノオレートである。ソルビタン脂肪酸エステルの例は、ソルビタン・モノラウレート、ソルビタン・モノオレイン酸塩そしてソルビタン・モノパルミチン酸塩（Ｓｐａｎ（登録商標）４０）またはそれらの組合せを含む。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸塩（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸塩またはその組合せを含む。

いくつかの実施形態では、界面活性剤は非イオン性物質である。いくつかの実施態様では、非イオン性界面活性剤は、アルキルポリ（エチレンオキサイド）に限られず、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０その他）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５のようなＢｒｉｊ（登録商標）シリーズ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）洗剤シリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、その他）のようなポリキシエチレングリコールに基づくポリソルベートやポリ（エチレンオキサイド）やポリ（プロピレンオキサイド）（商業的にＰｏｌｏｘａｍｅｒｓ（登録商標）またはＰｏｌｏｘａｍｉｎｅｓ（登録商標）と呼ばれている）コポリマーを含む。一般的に、いくつかの実施態様において、界面活性剤や洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００である。

界面活性剤はタンパク質残基、特に疎水性タンパク質残基を変性させるため、検出する組成物とより容易に反応する。

Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００は化学式が（Ｃ_３４Ｈ_２２Ｏ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ）であり、界面活性剤として研究所で一般的に用いられる。

一つ以上の実施態様において、界面活性剤はおよそ０．０１％ｖ／ｖからおよそ２％ｖ／ｖまでの量で含まれる。特定の実施形態において、界面活性剤はおよそ０．５％ｖ／ｖからおよそ０．０５％ｖ／ｖの量で含まれる。たとえば、１００ｍｌ中の０．５ｍｌは、組成物の１００ｍｌに対し０．５％ｖ／ｖに相当する。

好ましい実施形態において、界面活性剤は０．０６％ｖ／ｖ、０．０７％ｖ／ｖ、０．０８％ｖ／ｖ、０．０９％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ、０．２％ｖ／ｖ、０．３％ｖ／ｖまたは０．４％ｖ／ｖの量で含まれる。一般的に、界面活性剤は０．１％ｖ／ｖである。

発明の組成物はチオール還元性化合物も含む。

チオール還元性化合物は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と２−メルカプトエチルアミンのようなチオール基を含む合成物を含み、さらにそれらはホスフィンとそれらの誘導体（例えばトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））である。

溶液中で、スルフヒドリル基は酸化とジスルフィド構造に影響されやすい。
チオール還元性化合物の存在は、タンパク質そしてアミノ酸の組成物の中で、試薬の保存可能期間の不安定性を引き起こすチオールと反応の過程で形成される不安定な産生物間の過剰なジスルフィドと酸化の形成の防止に役立つ。チオール還元性化合物の添加は、本発明に係るタンパク質および／またはアミノ酸検出組成物を安定化する要素であると考えられる。チオール還元性化合物は、最終的な検出試薬におけるタンパク質の検出感度を強化するという点で有利である。

特定の実施形態において、チオール還元性化合物の濃度は、およそ０．０５ｍｍｏｌ／ｌからおよそ５ｍｍｏｌ／ｌでありうる。特定の実施形態において、チオール還元性化合物の濃度は、およそ０．１ｍｍｏｌ／ｌからおよそ２．５ｍｍｏｌ／ｌでありうる。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるチオール還元性化合物の濃度はおよそ０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、０．９５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌまたは４ｍｍｏｌ／Ｌである。典型的にいくつかの実施形態において、チオール還元性化合物の濃度は、０．５ｍｍｏｌ／ｌである。

特定の実施形態において、本発明に係る組成物はキレート剤をさらに含むことがある。

キレート剤は、有機化合物の二つ以上の原子を通して金属イオンと配位結合を形成可能な有機化合物である。キレート剤と金属イオンによって形成されたこの化合物はキレートと呼ばれている。元素との配位結合を２つ持つキレート剤は二座と呼ばれている。配位結合を３つ持つキレート剤は三座と呼ばれている。それ故に、キレート試薬は二座、三座、四座、五座、六座、七座、八座、九座、十座でありうる。

キレート剤は水溶媒の金属イオンをコントロールするための金属イオン封鎖剤として幅広い範囲を示す。キレート剤は、多価金属イオンで安定な水溶性複合体を形成することで、金属イオンの通常の反応性を妨げ、望ましくない相互作用を防ぐ。

いくつかの実施様態においては、この発明のキレート剤は、２、２’、２”、２’”−（エタン−１、２−ジルジニトリロ）四酢酸（エチレンジアミン四酢酸）（２，２’，２”，２’”−（ｅｔｈａｎｅ−１，２−ｄｉｙｌｄｉｎｉｔｒｉｌｏ） ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））、エチレンジニトリロ四酢酸、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）に限られない。好ましくは、キレート試薬はアミンを含まないものとする。

Ｃ_３０Ｈ_１６Ｏ_８Ｎの化学式によるＥＤＴＡは、窒素原子と短い鎖のカルボキシル基を持つ一般的なキレート試薬の良い例だ。ＥＤＴＡは、エデト酸、ＥＤＴＡフリーベース、ＥＤＴＡ遊離酸、Ｈ_４ＥＤＴＡ、ジアミノエタン四酢酸、エデト酸（Ｅｄｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、エデト酸（Ｅｄｅｔａｔｅ）、エチレンジニトリロ四酢酸、バーセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ（登録商標））またはエチレンジアミン四酢酸塩としても知られている
また、Ｃ_３４Ｈ_２３Ｎ_３Ｏ_１０の化学式によるＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、Ｈ_５ｄｔｐａ、ペンテト酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−グリシン（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−（ｂｉｓ−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）−ｇｌｙｃｉｎｅ）、ジエチレントリアミン五酢酸または［［（カルボキシメチル）イミノ］ビス（エチレンニトリロ）］−四−酢酸（［［（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏ］ｂｉｓ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉｔｒｉｌｏ）］−ｔｅｔｒａ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）として知られている。

化学式Ｃ_６Ｈ_９ＮＯ_６をもつＮＴＡは、２、２’、２”−ニトリロ三酢酸、トリグリコールラミック酸（Ｔｒｉｇｌｙｃｏｌｌａｍｉｃ ａｃｉｄ）、トリロン（Ｔｒｉｌｏｎｅ（登録商標）Ａ）、α、α’、α”−トリメチルアミントリカルボン酸、トリ（カルボキシメチル）アミン、アミノ三酢酸、ハンプシャーＮＴＡ酸（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ ＮＴＡ ａｃｉｄ）、ニトリロ−２、２’、２”−三酢酸、ティトリプレックス（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ（登録商標））またはニトリロ三酢酸として知られている。

特定の実施形態において、キレート試薬の濃度は、およそ０．０５ｍｍｏｌ／ｌからおよそ５ｍｍｏｌ／ｌでありうる。特定の実施形態において、キレート試薬の濃度は、およそ０．１ｍｍｏｌ／ｌからおよそ２．５ｍｍｏｌ／ｌでありうる。いくつかの実施形態において、本発明で用いられるキレート剤は、約０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、０．９５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌまたは、４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を持つ。典型的にいくつかの実施形態においては、キレート剤の濃度は０．５ｍｍｏｌ／ｌである。

いくつかの実施形態において、組成物中のＣ_３−Ｃ_６チオールの濃度は、ｏ−フタルジアルデヒドの濃度の５倍である。

いくつかの実施形態において、キレート剤の濃度は、最大で２ｍｍｏｌ／Ｌまでのチオール還元性化合物の濃度と等しい。

いくつかの実施形態において、組成物中のチオール還元性化合物の濃度はＣ_３−Ｃ_６チオールの濃度の２０倍でありうる。これらの状況下では、試薬の感度は増強される。高濃度のチオール還元性化合物は、検出組成物の感度を減少させる可能性があることに注意しなければならない。

組成物は、４℃では６ヶ月まで、室温では３か月まで安定である。大気中のアンモニアによるバックグラウンドの蛍光を減少させるために、当該組成物を使用前、４℃、２４時間で保存してもよい。組成物は脱イオン化された真水を使用したとき、調製から２４時間後、３５±１０周辺の任意のユニット（相対蛍光ユニット、ＲＦＵ）の低いバックグラウンド蛍光を達成することができる。

本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様において述べられたタンパク質および／またはアミノ酸の組成物を調製する方法が提供される。

組成物を調製する方法は単純に（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の成分を緩衝液（ｃ）に入れて混合することである。

本発明の第３の態様は、タンパク質および／またはアミノ酸を検出するための方法を提供することである。その方法は、以下を含む：
ａ）本発明に係る組成物を表面および／または基板に塗布すること、および
ｂ）蛍光を検出すること。

本発明の第１の態様に示した通り、組成物はスプレーや拭き取り、液体、その他、当業者にはよく知られている適当な方法で塗布される。

本発明に係る組成物を含むスプレーは瓶、または容器、および噴霧器もしくは噴射ノズルまたはその他適した手段をさらに含む。

スプレーの瓶または容器はどのようなものでもよい。例えば、そのような瓶または容器はガラス製またはプラスチック製またはその他の不活性物質製であることがありうる。容器はチオールを酸化させるような金属性であってはならない。好ましくは、容器は透明体もしくは不透明体であることがありうる。

この発明の実施形態における噴霧器または噴射ノズルは、ノズルの中を通すことによってバルク液体を霧（粒子の集まり）へ変換し、発明の組成物のむらのない塗布を可能にする。

霧の密度は、組成物の乾燥、さらに蛍光物質の検出に要する時間に直接的に比例するため重要である。

「布（ｓｗａｂ）」の用語は、棒やワイヤーの端に取り付けられ、洗浄や塗布に使用される、レーヨンまたはその他の吸収性の素材のような当業者に知られているどんな吸収性の素材も含む。圧力および／または摩擦の量が表面および／または基板へ塗布される。タンパク質および／またはアミノ酸は布上に集められ、および布は本発明に係る組成物に浸される。あるいは、布は本発明に係る組成物に浸された後に、拭き取り、こすられ、圧力および／または摩擦が表面および／または基板へ塗布される。

典型的に、本発明に係る組成物は表面および／または基板へ直接塗布されうる。表面および／または基板のタンパク質および／またはアミノ酸の存在下での、本発明に係る組成物の反応の検出は、直接的に、または間接的に測定できる。組成物反応の検出は１年またはそれよりも長い間、乾燥状態で安定である。

本発明に係る組成物が塗布される表面および基板はどんな表面でも可能であり、例えば、ガラス、金属（例えばステンレススチール、チタン、プラチナまたはアルミニウム）、プラスチック、その他不活性の材質、水性媒体に限られない。特に、表面および／または基板は、医療用または歯科用器具、研究室の装置または溶液の表面に限られることなく、タンパク質および／またはアミノ酸が存在しているであろう表面および／または基板であれば可能である。

医療機器は、汚染除去および／または滅菌工程を経て、患者に適用されるまたは挿入される再利用可能な機器を含む。そのような機器はカテーテル、カニューレ、メス、針、検鏡、ステントまたは鉗子を含む。そのような機器はさらに、エクストラクター（ｅｘｔｒａｃｔｏｒｓ）、マトリックスバンド（ｍａｔｒｉｘ ｂａｎｄｓ）、ハンドピース（ｈａｎｄ ｐｉｅｃｅｓ）のような、歯の診療に使用される機器も含む。

タンパク質および／またはアミノ酸の存在下では、本発明の組成物はタンパク質および／またはアミノ酸と反応し、改良された、および安定的な蛍光色素分子を産生する。安定的な蛍光色素分子は検出される蛍光を発する。タンパク質の蛍光色素分子は乾燥状態で１年以上安定である。それ故に、本発明に係る組成物を用いて検出すると、信頼性があり、矛盾のない結果を達成するために検出のタイミングに注意を払う必要はない。

蛍光の検出は、ある化合物の分子内の電子を励起する光線、および典型的には可視光だが、必ずしもそうではない低いエネルギーの光の放出を引き起こす光線、通常紫外線、を利用することを含む。反応によって放出される光は約３００から５００ナノメーターの範囲でありうる。

蛍光検出は、蛍光を検出できるどのような機器を使用しても実行可能である。蛍光を測定する機器は蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒｓまたはｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒｓ）と呼ばれる。蛍光光度計には２つのタイプが存在する。一つは、それは入射光線と蛍光を孤立させるためにフィルタを使用したフィルタ蛍光測定器、もう一つは、それは入射光線と蛍光を孤立させるために回折格子モノクロメーターを使う分光蛍光計である。様々な光源が励振源として使われる。レーザー、光ダイオード、特にキセノンアークや水銀灯などのランプが含まれるがそれらに限られない。

蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）は蛍光を検出するために用いられる。蛍光光度計は生じた反応の溶液および／または基質中の分子を励起する選ばれた波長を生み出すことによって機能する。その光は分子を、光が放出される、および蛍光が産生される励起状態へ促進する。その後、その光は生じた反応に特有の波長で検出される。

さらに、蛍光を測定し、検出できる他の適した機器は、２０１０年８月２０日に出願されたタンパク質汚染の検出のための画像システムおよび関連方法（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）という名称の特許出願ＧＢ １０１４０１６．８号から優先権を主張した同時継続のＰＣＴ出願中に書かれている。

タンパク質汚染検出のための画像システムと関連方法はタンパク質残基が存在する場所を強調する表面および／または基板の画像を提供することができる。このシステムは機器を受け取るための光不浸透性のチャンバを含む。それぞれ可視光と励起光で暗室を照らすために、チャンバの中は２つの可視光源と励振タイプの光源がある。デジタルカメラは、表面および／または基板に本発明に係る組成物を塗布したその場所で、可視光によって照らされた機器の画像の第１の画像、そして表面および／または基質から放出された蛍光色素分子によって産生された蛍光のパターンの第２の画像を撮影するために使用可能である。これら２つの画像を合わせることによってタンパク質に汚染された場所を強調した、器具の合成画像を作ることができる。

もっとも高い感度を求めるためには、蛍光は、タンパク質と蛍光色素分子の補助剤の蛍光特性をマップするのに適したスペクトル特性（波長と強度）を持つ光源と全体的に暗い環境の組み合わせが必要である。レーザービームは非常に高い強度を持つ一方で、高価なだけでなく、蛍光色素分子をマップしないであろう特殊な波長をもつ。水銀、キセノン、および水銀ドープキセノンのような強力なランプはタンパク質の日常分析により適している。加えて、背景をより低くし、感度を上げることが重要であるので、試薬はそれ自身が発行するべきではない。

蛍光色素分子産生物はタンパク質（ＢＳＡ）と不安定なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬との反応で蛍光を発したときに形成され、その蛍光は蛍光分光計を使って計測される。図１（ａ）に示されているように、励起と発光のピークはそれぞれおよそ３５０と４５０ナノメーターである。タンパク質（ＢＳＡ）と安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬との反応で蛍光を発した際に形成された蛍光色素分子産生物も、図１（ｂ）に示す通り、励起と発光のピークはそれぞれおよそ３５０と４５０ｎｍである。励起と発光の波長は蛍光の誘導体化反応に特異的であるから、それ故に安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を使用したときに形成された蛍光色素分子は同じものであるといえる。

タンパク質検出におけるこの発明に係る組成物の大きな利点は、その蛍光分析による検出感度である。検出限界は非加熱でナノグラムまでおよび、また水銀灯で直ちに達成される励起波長で検出することができる。検出用組成物は検出が困難であることで知られるシトクロム−Ｃの検出も可能である。

蛍光の検出は定量的または定性的な方法で計測することができる。

蛍光の定性的な検出は、光を検出するどんな方法および／または機器によっても可能である。蛍光は暗室で、または適切なフィルタを通して視認可能である。適切な検出器およびエミッションフィルターを用いて、蛍光は検出可能であり、その強度は測定される。これは蛍光ダイオードで可能であり、、あるいは、可視化のために、同様に、すべての機器上の蛍光は、適切な暗い環境中に設置され、適切なソフトウェアを装備したＣＣＤ検知器の前に、適切なフィルタを装備したディジタル・カメラか同様の装置を介して測定することができる。光を検知する手段および／または装置は視覚的になりえるか、あるいは特化された写真の手段で蛍光が検知されることを可能にするフィルタを含むことが可能である。

また、それは適切な励起波長を得るため、蛍光ランプ、水銀灯あるいは水銀灯の派生品を使用し、適切な有色フィルターを通して蛍光を観察する単純な器械によっても達成することができる。

蛍光の定量的な検出は一連の既知のタンパク質組成物の基準を作ることによって決定できる。標準として使われるタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。検量線を得るため、およびコントロールを得るため、様々な濃度のＢＳＡを使って分析は行われ、この発明に係る組成物との反応によって放出された蛍光は、産生された蛍光を検出し、定量できる蛍光光度計またはその他の適切な機器によって測定および検出される。

表面上の検出のため、ステンレス鋼帯の上で乾燥させられた一連のＢＳＡの標準溶液が準備されうる。その次に、検量線は、表面および／または基盤上に存在する微量のタンパク質の量を定量的に評価するために表面および／または基盤と発明の組成物の反応によって放出された関連のある蛍光の計測に用いることができる。

上記の検出方法に加えて、他の適したイメージングシステムは２０１０年８月に出願された「タンパク質汚染の検出のためのイメージングシステムおよび関連方法」（“ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＴＡＭＩＮＡＴＩＯＮ”）という名称の同時継続出願において述べられている。この同時継続出願は、表面および／または基質にこの発明に係る組成物が塗布されたときに表面および／または基質から放出される蛍光の画像を捉えるための機器に関連する。

さらに処理装置と関連のある解析用ソフトウェアを適用することで、イメージングシステムはタンパク質および残存しているタンパク質残基量によって汚染されているかどうか、迅速で、正確な決定を提供することができる。

表面および／または基板の視覚的なイメージはＳＳＤにおいて再利用可能な器具を殺菌、滅菌する前に、表面が（例えば、外科手術用のメスまたは歯科用の針）が日常的な周期での除染の後に、残存タンパク質を含んでいるかどうかを決定する迅速な方法として、裸眼での観察と同様に、有利である。

本発明の組成物は、蛍光色素分子産生物を直ちに表面から取り除き、毒性面での問題も最小化することを確認するために、表面からのタンパク質の除去を監視することに用いることもできる。

本発明の第４の態様は、本発明の組成物と使用のための説明書を含む、表面のタンパク質および／またはアミノ酸を検出するためのキットを提供する。

本発明の第５の態様は、本発明に係る組成物、当該組成物を表面および／または基板へ塗布する手段、および使用のための説明書を含む、タンパク質および／またはアミノ酸の検出のためのキットを提供する。典型的に説明書は本発明の第２の態様にしたがって、キットを使うよう使用者を導くためのものである。

本発明に係る組成物は表面および／または基板に噴霧されるインサイチュ試薬でありうる。本発明の一つの実施形態では、典型的に組成物はメタノール中に溶解した約２ｍｍｏｌ／ＬのＯＰＡを含む。緩衝液は約９のｐＨ、約５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で作られ、０．１％ｖ／ｖの非イオン性界面活性剤を加え、さらに溶解するまで攪拌する。その後、約１０ｍｍｏｌ／Ｌのチオール、典型的にはＮＡＣが加えられ、約０．５ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴを加え、攪拌する。組成物は使用まで約４℃で、およそ２４時間保存することができる。組成物は直接的にまたは間接的に表面および／または基板に塗布することができる。タンパク質および／またはアミノ酸の存在下では、組成物は、それが塗布された表面および／または基質上のタンパク質および／またはアミノ酸と反応する。反応は例えば蛍光（例えば水銀灯または蛍光計）の使用のような、単純な機器によって定性的および／または定量的な方法で検出することができる蛍光を放出する安定的な蛍光色素分子を産生する。放出された蛍光はタンパク質検量線と照合され、定量される。発見されおよび定量化されたタンパク質の量は臨床的、生物学的および科学的環境下で、タンパク質の存在の監視において重要である。

発明に係る検出用組成物は以下の利点がある
この組成物と方法はすべての器具上のタンパク質残基を明らかにすることができる。

単純である。ＳＳＤの環境での使用に適している。

永久の記録を得ることができる
定量的なデータを得ることができる
タンパク質特異的である
タンパク質残基に対する既存の手法よりも少なくとも１００倍の感度がある
瞬時に結果を得ることができる
迅速で、高い処理能力と自動化が可能
器具類はすぐに使用可能で、レーザーを使用する必要はない
安定的である
検出される産生物も安定的である
この方法はほとんどの素材の表面で働く
比較的無毒であり、安全な試薬である
ステンレススチールの表面から簡単に取り除くことができる
キャピタルコストもランニングコストも低い
ここに書かれている発明の組成物と方法は、タンパク質および／またはアミノ酸の検出および／または除去を決定するための化学的分析のすべての態様において使用することができる。

本発明の第２および後続の態様のために推奨される特徴は、本発明の第１の態様のものが準用される。

本発明はさらに以下の実施例と図を参照することによって説明される。それらは実例を示すだけの目的で提供され、発明を限定解釈するものではない。参照はいくつかの図で構成されている。

実施例１：ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の調製
脱イオン水５００ｍｌに９．５ｇのテトラホウ酸二ナトリウム十水和物を溶解し、数滴の１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを調整して、ｐＨ９．２３のホウ酸ナトリウム緩衝液を調製した。６０ｍｇのＮ−アセチル−Ｌ−システインを緩衝液中に加え、完全に溶けるまで、マグネチックスターラ―で攪拌した。６０ｍｇのＯＰＡを５ｍｌのメタノール中に溶解することによってＯＰＡ溶液を調製し、そしてこの溶液をホウ酸緩衝液中に加えた。このＯＰＡ／ＮＡＣ試薬溶液は週一回調製され、バックグラウンドの蛍光を減少させるため、使用の前に２４時間、４℃で暗所に保存した。

実施例２：タンパク質検出のための安定化されたＯＰＡ／ＮＡＣの調製
９００ｍｌの脱イオン水に１９ｇのテトラホウ酸二ナトリウム十水和物を溶解して、数滴の１Ｍ ＮａＯＨによってｐＨを調整して、ホウ酸ナトリウム水溶液を調製した。次いで、緩衝液に１ｍｌのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１．６３ｇのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０７７ｇのＤＴＴを加え、完全に溶解するまでマグネチックスターラ―で攪拌した。０．２６８ｇのＯＰＡを１０ｍｌのメタノールに溶解することによってＯＰＡ溶液を調製し、ホウ酸緩衝液に加えた。この溶液は１Ｌで調製した。ＯＰＡ／ＮＡＣ溶液は、バックグラウンドの蛍光を減少させるため、使用の前に２４時間、４℃で暗所に保存した。

実施例３：ナトリウムＥＤＴＡをさらに含む安定的なＯＰＡ／ＮＡＣの調製
０．３２ｇの二ナトリウムＥＤＴＡを加えて、実施例２で述べたのと同様のＯＰＡ溶液を調製した。二ナトリウムＥＤＴＡを緩衝液に加え、完全に溶解するまでマグネチックスターラ―で攪拌した。

実施例４；安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の安定性の決定
安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の安定性と感度を評価するために、ＢＳＡとのインターアッセイを６ヶ月の期間実施した。

ウシ血清アルブミンとの標準分析を実施した。標準ＢＳＡ溶液は、作成され、脱イオン水に希釈され、０−１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で作成された。空測定とＢＳＡの標準分析は、新たに調製されたＯＰＡ／ＮＡＣ試薬溶液と室温および冷蔵庫内、４℃で様々な期間保存された（実施例２、３で述べられたように）保存されていた安定的なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬溶液を用いて行われた。

ＢＳＡと（実施例２、３で言及された）ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を用いた反応分析は１ｃｍのアクリルＰＭＭＡまたはシリカの細胞蛍光キュベット内で実施された。３００μｌのＢＳＡ濃度は２００μｌの安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬と完全に混合させ、その反応混合物は蛍光が励起／発光室温で３５０／４５０ｎｍで測定されるまで、室温で５分間放置した。

イソインドール生成物からの反応から放出られた蛍光はＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ４５００蛍光分光光度計によって計測された。分光光度計は、１０ｎｍの励起および２．５ｎｍの放射の帯域幅および７００ＶのＰＭ電圧で、励起と放射は３５０ｎｍおよび４５０ｎｍの波長でそれぞれ設定した。

室温における試薬の感度は最大３か月の間、室温で安定的であった。図２に示されている結果は、試薬の感度が４℃で最大６ヶ月の間、安定性を保ったことを示している。ＢＳＡ標準の線形は６ヶ月の期間を超えて０．９９であり、その感応性は３６±３．２μｇ ｍＬ^−１ ／ＲＦＵ （表１）である。

表１：６ヶ月の保存期間を超えたＢＳＡと安定的ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の安定性と感度

安定的ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬とタンパク質の反応速度と蛍光の発生は、完了時間が３分より短く、非常に速い。実際、イメージングシステムにおいて、蛍光の発生は画像が最初に捉えられる時間までには完了した。

実施例５：タンパク質との反応後に形成される安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬産生物の安定性の決定
形成されたイソインドール産生物の安定性を評価するために、既知の濃度で、分析を１０回反復して実施し、蛍光性キュベットの中で、（実施例４で述べた）安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬と混合した。これは、蛍光の検出においての産生物の損失を比較するために、時間ごとにイソインドール産生物からの蛍光を測定することによって達成された。

反応混合物から放出された蛍光は、その反応混合物を蛍光が励起／発光が３５０／４５０ｎｍで測定されるまで、室温で５分間放置した後に、検出された。

反応混合物は３６０分（６時間）放置され、および反応混合物から出た蛍光は、イソインドール産生物の安定性を検出するために、１時間おきに計測された。

この例は、安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬が６ヶ月間を超えて安定ということだけではなく、溶液中のイソインドール産生物も６ヶ月の期間を超えて安定であることも示している。

実施例６：安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の特異性
ＢＳＡ、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、シトクロム−Ｃ、グロブリン、ミオグロビンを含むタンパク質標準溶液（０から１００μｇ／ｍｌ）は実施例２に述べられた通り、脱イオン水を用いて準備された。方法の再現性は、それぞれ１０回反復したＢＳＡとシトクロム−Ｃの分析によって評価された。

異なるタンパク質と安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を用いて、分光光度計によって測定された蛍光によって、試験したすべてのタンパク質に対応する検量線を得ることができた。感応性はタンパク質の性質によって異なっていた。この系におけるＢＳＡの検出限界は０．３μｇ／ｍｌであった（表２）。

表２：水溶液中のタンパク質と安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の感応性

実施例７：手術用器具上でのタンパク質残基のインサイチュ検出
安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬（実施例２，３に記載）は表面上のインサイチュでタンパク質残基を検出するために用いられた。インサイチュでのタンパク質残基の検出の利点は、すべてのアミノ酸およびアンモニア残基が単純な水洗浄で取り除かれているか確認できることにある。

ＢＳＡを用いた標準分析は実施例４に述べられた通り実施された。

タンパク質の可視化実験はシンジーン社（ＳＹＮＧＥＮＥ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ））製の修正されたゲルドキュメンテーションシステム（ｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ （Ｇ−ＢＯＸ） ）を用いて行った。リン光チューブ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｕｂｅｓ）を備えた水銀灯を使ったシステムはＯＰＡ／ＮＡＣ試薬に最適な３５０ｎｍの励起波長を得るために最適化した。放出された光は、４４０ｎｍ干渉フィルタ（ｉ．ｄ． ７ｃｍ）を通過した後、冷却ＣＣＤカメラによって撮影した。スプレーボトルは大手の量販店で購入した。噴霧はすべて、黒の非蛍光性のアート紙のシート上でなされた。アート紙は各使用の後に交換した。

Ｇ−ＢＯＸイメージの半定量分析は、ハイドソフトコンピューティング社、ビックスバーグ、米国（ＨｙｄｅＳｏｆｔ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， Ｖｉｃｋｓｂｕｒｇ， ＵＳＡ）のソフトウェアプログラムＤ−ＰＬＯＴを用いて行われた。

タンパク質のスポットはステンレス鋼の表面に滴下され、調査前に、少なくとも４時間室温で空気乾燥した。器具および／または表面は基板上に置き、そしてＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の霧状ミストを噴霧した。基板のチャンバは閉じられ、および一連の画像はカメラで、正確に同じ設定で、最初の白色光、その後、ＵＶ（３５０ｎｍ）を撮影した。画像は疑似色と重ね合わせ、タンパク質スポットは定性的分析（図５）および半定量的分析（実施例８参照）に用いられた。

実施例８：半定量的分析
撮影された画像をＤ−Ｐｌｏｔソフトウェアプログラムに取り込んだ。画像は、ソフトウェアＬプラグインを用いて、ビットマップから３Ｄに変換した。表面のプロットにおいて、プラグインはピクセル値をＺ値へマップする。蛍光スポットの表面の値は、蛍光の強度の程度として計測される。

Ａ：乾燥した蛍光誘導体の安定性
試薬は４℃で最大６ヶ月間、安定している。作成から４か月過ぎた試薬を手術用のメスの刃のタンパク質検出に用いた。驚くべきことに、形成された蛍光色素分子は、外気に触れる状態で９か月間放置した後でも蛍光を発していた。これは図７に示す。

Ｂ：インサイチュでのタンパク質スポット検出における安定的なＯＰＡ／ＮＡＣの感度
標準タンパク質（ＢＳＡ）を、ステンレス鋼表面上のタンパク質残基の検出におけるシステムの安定性を決定するために使用した。１μｇのスポット（２ｍｍ^２）中のＢＳＡ（０から１２００ｎｇ）を、汚染されていないステンレス鋼の表面上に滴下し、室温で乾燥させた。スポットには安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬を噴霧し、実施例５および６に示した通りに分析した。インサイチュでのタンパク質の可視化のための試薬の線形の分析のために表面の値は濃度に対してプロットした（図８）。標準校正の回帰分析におけるＲ２乗値は０．９８であった。このシステムを使用した検出限界は現在１スポットあたり５００ピコグラムまたは２５０ｐｇ／ｍｍ^２である（図９）。

Ｃ：手術用器具上のタンパク質残基の半定量的分析
洗浄後の手術用器具上のタンパク質残基を検出するための発達した系の適用性を評価するために、疎水性タンパク質（フィブリノーゲン）をはさみに使用した。器具は、汚染後、ＳＳＤの典型的な洗浄を受け、ＯＰＡ／ＮＡＣ／ＤＴＴを噴霧した。洗浄された器具を撮影し、再度噴霧し、さらに同じ条件で撮影した。画像を分析して、タンパク質残基を定量した。

結果は、残存したタンパク質が可視化され、定量化されたことを示している。この写真の場合、フィブリノーゲンのキャリブレーションから計算すると１４０ｎｇのフィブリノーゲンが存在した。これを達成するために、タンパク質の区域はＤ−Ｐｌｏｔを用いて、手動で描かれた。タンパク質スポットの蛍光量は、Ｄ−Ｐｌｏｔによって計算され、実際のタンパク質量は、図１２に示された通り、一連の標準スポットを参照することで計算される。安定的な端線検出ソフトウェアとタンパク質のキャリブラントによって、この工程は自動化および単純化が可能であることは明白である。回帰と線形はエクセル２００３で計算する。

考察
ＯＰＡ／ＮＡＣ溶液／試薬の不安定性は、試薬混合物中に存在するチオール間のジスルフィド架橋の形成によって引き起こされる。これは、反応試薬を形成するための溶液中でＯＰＡとチオールの結合を阻害し、それ故に経時的に感度と安定性を失う。溶液／試薬の安定性はＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）のようなチオール還元性化合物を添加することによって達成される。

安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬によって形成されたイソインドールの安定化
ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の第二の制限は蛍光信号を急速に失う不安定なイソインドール誘導体を産生することである。これは、この試薬を使って分析を実施する際、時間的な制約を引き起こす。

計算と統計
試薬の分析内および分析間の分析は、反応の再現性と試薬の妥当確認検証を示した。記述統計（平均値、標準偏差、変動係数）は安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の検出限界の大きな改善を示すために計算された。検出限界および定量化は、９５％の信頼区間を考慮に入れ、以下の式によって計算された。

ＬｏＤ＝（（ＣＶ×２）／１００））×平均濃度
ＬｏＱ＝ＬｏＤ×２．５
統計的な計算はマイクロソフト社のエクセル２００３を使って実施された。

ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の長期間の安定性は、作成から２４時間後の観察では、感応性が７６μｇｍｌ^−１／ＲＦＵであるが、７２時間経過後では１６μｇｍｌ^−１／ＲＦＵまで低下する。試薬の安定性において、継続的な衰退が確認された。

試薬の不安定性はチオール化合物が反応のイソインドール誘導体を産生するためにタンパク質および／またはアミノ酸と反応するためにＯＰＡと結合するよりも試薬混合物とジスルフィド架橋を形成することに起因する。加えて、イソインドール蛍光色素分子誘導体は、それら自身が不安定であり、そして分析的研究の正確性の主要な制約の原因となる反応によって、３０分後のシグナルの喪失を生じさせる。

反応混合物にチオール還元性化合物を添加することで、試薬中におけるチオール間のジスルフィド架橋の形成が効果的に減少した。この結果は、試薬の長期的な安定性を改善することを示している。加えて、本発明に係る組成物は、ＢＳＡと試薬が反応する際の感度と安定性の増加、および反応混合物から産生されるイソインドール誘導体の長期間にわたる安定性の増加を示している。

安定化ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬は、長期間にわたり継続的に感応信号を維持することによって、原型および不安定なＯＰＡ／ＮＡＣ試薬に比べ、試薬の長期間の安定性を増強する。

本発明のＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の検出限界は、分析間の変動性から得られた変動係数に基づいて計算された。これらは、チオール還元性化合物とキレート剤のＯＰＡ／ＮＡＣ試薬への添加がＢＳＡとの反応の検出限界値を増加させたことを確認した。原型のＯＰＡ／ＮＡＣは、〜８４０ｎｇｍｌ^−１の検出限界を示すが、ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬に所要のＤＴＴおよびＥＤＴＡを添加すると〜７５０−５３０ｎｇｍｌ^−１の検出限界を示し、さらにＴＣＥＰを加えると、７００から１０ｎｇ ｍｌ^−１という検出限界の著しい増加を示した。

イソインドールの安定化
原型のＯＰＡ／ＮＡＣは当初の測定後３０分で、イソインドール産生物の蛍光信号において、３３％の低下を示した。対照的に、ＴＣＥＰを加えた場合、〜２−８０％のイソインドール蛍光信号が増加した。ＤＴＴは〜１−２７％の範囲の低下を示した。時間依存性は有意に、ＯＰＡ／ＮＡＣ試薬混合物に投入されるチオール試薬の量と種類によって変動性を示している。

これらの結果はＯＰＡ／ＮＡＣ試薬の長期間の安定性がチオール還元剤の添加によって達成されることを示している。チオール還元剤の添加は、検出限界値を増大させ、蛍光シグナルの変動性を減少させ、さらに試薬とその産生物の継続的な安定性と、タンパク質検出において少なくともニンヒドリンの３００倍の検出限界値を持つことを示している。

Claims (16)

1. （ａ）フタルジアルデヒド、
   （ｂ）Ｃ_３−Ｃ_６チオール、
   （ｃ）ｐＨ約７．５〜約１０の範囲の緩衝液、および
   （ｄ）界面活性剤
   を含有する、タンパク質および／またはアミノ酸を検出するための組成物であって、
   （ｅ）チオール還元剤、
   をさらに含む、組成物。
2. （ａ）約０．１〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌのｏ−フタルジアルデヒド、
   （ｂ）約１〜約２０ｍｍｏｌ／ＬのＣ_３−Ｃ_６チオール、
   （ｃ）約１０〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨ７．５〜１０の範囲の緩衝液、
   （ｄ）約０．０１〜約２％ｖ／ｖの界面活性剤、および
   （ｅ）約０．０５〜約５ｍｍｏｌ／Ｌのチオール還元性化合物、
   を混合することにより調製される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記Ｃ_３−Ｃ_６チオールが、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールである、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記緩衝液が、ｐＨ９〜９．５の範囲のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記チオール還元性化合物が、ジチオスレイトールまたはトリス（２−カルボシキエチル）ホスフィンからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. キレート剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記キレート剤の濃度が、約０．０５〜約５ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項７に記載の組成物。
9. 有機溶媒をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトンおよびアセトニトリルからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
11. 前記有機溶媒が、メタノールである、請求項９または１０に記載の組成物。
12. （ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の各成分を緩衝液（ｃ）に入れて攪拌することによる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物を調製する方法。
13. ａ）表面および／または基板に請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物を塗布し、
    ｂ）蛍光を検出する、
    ことを含む、タンパク質および／またはアミノ酸の検出方法。
14. 前記蛍光が、蛍光を検出できる任意の手段または装置によって検出される蛍光である、請求項１３に記載の方法。
15. ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物、および
    ｂ）使用のための説明書、
    を含む、タンパク質および／またはアミノ酸を検出するためのキット。
16. ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物、
    ｂ）表面および／または基板に前記組成物を塗布するための手段、および
    ｃ）使用のための説明書、
    を含む、タンパク質および／またはアミノ酸を検出するためのキット。