JP2013536429A - タンパク質の検出のためのインサイチュ試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)o−フタルジアルデヒド
(b)C3−C6チオール
(c)pHが約7.5〜10の範囲の緩衝液
(d)界面活性剤
を含み、
(e)チオール還元性化合物
をさらに含むタンパク質および/またはアミノ酸を検出する組成物が提供される。
(a)o−フタルジアルデヒド
(b)C3−C6チオール
(c)pHが約7.5〜10の範囲の緩衝液
(d)界面活性剤
を含み、
(e)チオール還元性化合物を0.05〜約5mmol/Lの濃度でさらに含むタンパク質および/またはアミノ酸を検出する組成物が提供される。
(b)約1〜約20mmol/LのC3−C6チオール
(c)約10〜約100mmol/Lであり、pH7.5〜10の緩衝液
(d)約0.01〜約2%v/vの界面活性剤
(e)約0.05〜約5mmol/Lのチオール還元性化合物。
チオール還元性化合物の存在は、タンパク質そしてアミノ酸の組成物の中で、試薬の保存可能期間の不安定性を引き起こすチオールと反応の過程で形成される不安定な産生物間の過剰なジスルフィドと酸化の形成の防止に役立つ。チオール還元性化合物の添加は、本発明に係るタンパク質および/またはアミノ酸検出組成物を安定化する要素であると考えられる。チオール還元性化合物は、最終的な検出試薬におけるタンパク質の検出感度を強化するという点で有利である。
また、C34H23N3O10の化学式によるDTPAは、ジエチレントリアミン−N,N,N’,N’,N”−五酢酸(Diethylenetriamine−N,N,N’,N’,N”−pentaacetic acid)、H5dtpa、ペンテト酸、N,N−ビス(2−(ビス(カルボキシメチル)アミノ)エチル)−グリシン(N,N−Bis(2−(bis−(carboxymethyl)amino)ethyl)−glycine)、ジエチレントリアミン五酢酸または[[(カルボキシメチル)イミノ]ビス(エチレンニトリロ)]−四−酢酸([[(Carboxymethyl)imino]bis(ethylenenitrilo)]−tetra−acetic acid)として知られている。
a)本発明に係る組成物を表面および/または基板に塗布すること、および
b)蛍光を検出すること。
この組成物と方法はすべての器具上のタンパク質残基を明らかにすることができる。
定量的なデータを得ることができる
タンパク質特異的である
タンパク質残基に対する既存の手法よりも少なくとも100倍の感度がある
瞬時に結果を得ることができる
迅速で、高い処理能力と自動化が可能
器具類はすぐに使用可能で、レーザーを使用する必要はない
安定的である
検出される産生物も安定的である
この方法はほとんどの素材の表面で働く
比較的無毒であり、安全な試薬である
ステンレススチールの表面から簡単に取り除くことができる
キャピタルコストもランニングコストも低い
ここに書かれている発明の組成物と方法は、タンパク質および/またはアミノ酸の検出および/または除去を決定するための化学的分析のすべての態様において使用することができる。
脱イオン水500mlに9.5gのテトラホウ酸二ナトリウム十水和物を溶解し、数滴の1M NaOHでpHを調整して、pH9.23のホウ酸ナトリウム緩衝液を調製した。60mgのN−アセチル−L−システインを緩衝液中に加え、完全に溶けるまで、マグネチックスターラ―で攪拌した。60mgのOPAを5mlのメタノール中に溶解することによってOPA溶液を調製し、そしてこの溶液をホウ酸緩衝液中に加えた。このOPA/NAC試薬溶液は週一回調製され、バックグラウンドの蛍光を減少させるため、使用の前に24時間、4℃で暗所に保存した。
900mlの脱イオン水に19gのテトラホウ酸二ナトリウム十水和物を溶解して、数滴の1M NaOHによってpHを調整して、ホウ酸ナトリウム水溶液を調製した。次いで、緩衝液に1mlのTriton(登録商標)X−100、1.63gのN−アセチル−L−システイン、0.077gのDTTを加え、完全に溶解するまでマグネチックスターラ―で攪拌した。0.268gのOPAを10mlのメタノールに溶解することによってOPA溶液を調製し、ホウ酸緩衝液に加えた。この溶液は1Lで調製した。OPA/NAC溶液は、バックグラウンドの蛍光を減少させるため、使用の前に24時間、4℃で暗所に保存した。
0.32gの二ナトリウムEDTAを加えて、実施例2で述べたのと同様のOPA溶液を調製した。二ナトリウムEDTAを緩衝液に加え、完全に溶解するまでマグネチックスターラ―で攪拌した。
安定的なOPA/NAC試薬の安定性と感度を評価するために、BSAとのインターアッセイを6ヶ月の期間実施した。
形成されたイソインドール産生物の安定性を評価するために、既知の濃度で、分析を10回反復して実施し、蛍光性キュベットの中で、(実施例4で述べた)安定化OPA/NAC試薬と混合した。これは、蛍光の検出においての産生物の損失を比較するために、時間ごとにイソインドール産生物からの蛍光を測定することによって達成された。
BSA、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、シトクロム−C、グロブリン、ミオグロビンを含むタンパク質標準溶液(0から100μg/ml)は実施例2に述べられた通り、脱イオン水を用いて準備された。方法の再現性は、それぞれ10回反復したBSAとシトクロム−Cの分析によって評価された。
安定化OPA/NAC試薬(実施例2,3に記載)は表面上のインサイチュでタンパク質残基を検出するために用いられた。インサイチュでのタンパク質残基の検出の利点は、すべてのアミノ酸およびアンモニア残基が単純な水洗浄で取り除かれているか確認できることにある。
撮影された画像をD−Plotソフトウェアプログラムに取り込んだ。画像は、ソフトウェアLプラグインを用いて、ビットマップから3Dに変換した。表面のプロットにおいて、プラグインはピクセル値をZ値へマップする。蛍光スポットの表面の値は、蛍光の強度の程度として計測される。
試薬は4℃で最大6ヶ月間、安定している。作成から4か月過ぎた試薬を手術用のメスの刃のタンパク質検出に用いた。驚くべきことに、形成された蛍光色素分子は、外気に触れる状態で9か月間放置した後でも蛍光を発していた。これは図7に示す。
標準タンパク質(BSA)を、ステンレス鋼表面上のタンパク質残基の検出におけるシステムの安定性を決定するために使用した。1μgのスポット(2mm2)中のBSA(0から1200ng)を、汚染されていないステンレス鋼の表面上に滴下し、室温で乾燥させた。スポットには安定化OPA/NAC試薬を噴霧し、実施例5および6に示した通りに分析した。インサイチュでのタンパク質の可視化のための試薬の線形の分析のために表面の値は濃度に対してプロットした(図8)。標準校正の回帰分析におけるR2乗値は0.98であった。このシステムを使用した検出限界は現在1スポットあたり500ピコグラムまたは250pg/mm2である(図9)。
洗浄後の手術用器具上のタンパク質残基を検出するための発達した系の適用性を評価するために、疎水性タンパク質(フィブリノーゲン)をはさみに使用した。器具は、汚染後、SSDの典型的な洗浄を受け、OPA/NAC/DTTを噴霧した。洗浄された器具を撮影し、再度噴霧し、さらに同じ条件で撮影した。画像を分析して、タンパク質残基を定量した。
OPA/NAC溶液/試薬の不安定性は、試薬混合物中に存在するチオール間のジスルフィド架橋の形成によって引き起こされる。これは、反応試薬を形成するための溶液中でOPAとチオールの結合を阻害し、それ故に経時的に感度と安定性を失う。溶液/試薬の安定性はDTT(ジチオスレイトール)またはTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)のようなチオール還元性化合物を添加することによって達成される。
OPA/NAC試薬の第二の制限は蛍光信号を急速に失う不安定なイソインドール誘導体を産生することである。これは、この試薬を使って分析を実施する際、時間的な制約を引き起こす。
試薬の分析内および分析間の分析は、反応の再現性と試薬の妥当確認検証を示した。記述統計(平均値、標準偏差、変動係数)は安定化OPA/NAC試薬の検出限界の大きな改善を示すために計算された。検出限界および定量化は、95%の信頼区間を考慮に入れ、以下の式によって計算された。
LoQ=LoD×2.5
統計的な計算はマイクロソフト社のエクセル2003を使って実施された。
原型のOPA/NACは当初の測定後30分で、イソインドール産生物の蛍光信号において、33%の低下を示した。対照的に、TCEPを加えた場合、〜2−80%のイソインドール蛍光信号が増加した。DTTは〜1−27%の範囲の低下を示した。時間依存性は有意に、OPA/NAC試薬混合物に投入されるチオール試薬の量と種類によって変動性を示している。
Claims (16)
- (a)フタルジアルデヒド、
(b)C3−C6チオール、
(c)pH約7.5〜約10の範囲の緩衝液、および
(d)界面活性剤
を含有する、タンパク質および/またはアミノ酸を検出するための組成物であって、
(e)チオール還元剤、
をさらに含む、組成物。 - (a)約0.1〜約10mmol/Lのo−フタルジアルデヒド、
(b)約1〜約20mmol/LのC3−C6チオール、
(c)約10〜約100mmol/Lであり、pH7.5〜10の範囲の緩衝液、
(d)約0.01〜約2%v/vの界面活性剤、および
(e)約0.05〜約5mmol/Lのチオール還元性化合物、
を混合することにより調製される、請求項1に記載の組成物。 - 前記C3−C6チオールが、N−アセチル−L−システイン、2−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールである、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、pH9〜9.5の範囲のものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記チオール還元性化合物が、ジチオスレイトールまたはトリス(2−カルボシキエチル)ホスフィンからなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- キレート剤をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記キレート剤の濃度が、約0.05〜約5mmol/Lである、請求項7に記載の組成物。
- 有機溶媒をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトンおよびアセトニトリルからなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記有機溶媒が、メタノールである、請求項9または10に記載の組成物。
- (a)、(b)、(d)および(e)の各成分を緩衝液(c)に入れて攪拌することによる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物を調製する方法。
- a)表面および/または基板に請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物を塗布し、
b)蛍光を検出する、
ことを含む、タンパク質および/またはアミノ酸の検出方法。 - 前記蛍光が、蛍光を検出できる任意の手段または装置によって検出される蛍光である、請求項13に記載の方法。
- a)請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物、および
b)使用のための説明書、
を含む、タンパク質および/またはアミノ酸を検出するためのキット。 - a)請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物、
b)表面および/または基板に前記組成物を塗布するための手段、および
c)使用のための説明書、
を含む、タンパク質および/またはアミノ酸を検出するためのキット。
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