JPWO2005088305A1 - 被酸化性呈色試薬の安定化方法 - Google Patents

Abstract

被酸化性呈色試薬、特にロイコ色素の保存安定化方法、及びその安定化試薬を提供する。被酸化性呈色試薬をｐＨ１〜５の溶液中で保存する被酸化性呈色試薬の安定化方法、及び安定化試薬。

Description

本発明は、生体中の微量成分測定に使用する被酸化性呈色試薬の安定化方法、及び該方法により安定化された試薬に関するものである。

血液や尿などの生体試料中の種々の成分の測定は、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患の診断、病態の解明、治療経過の判定を行う上で必須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロール、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ等をはじめ、非常に多種類の微量成分の測定法が開発され、疾病の診断に役立っている。

現在、血清成分の測定法としては、目的成分に特異的に作用する酵素を作用させ、この生成物を測定して目的成分量を求める酵素法が広く普及している。なかでも、目的成分に特異的に作用する酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、これをパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色定量することにより目的成分量を求める方法が一般的である。この方法で用いられる被酸化性呈色試薬としては、例えば、ＰＯＤの存在下で４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール系、アニリン系又はトルイジン系の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬類が知られている。しかし、このような被酸化性呈色試薬を用いる発色系は、微量成分の定量には感度が低く、測定試料中のヘモクロビンやビリルビン等の吸収スペクトルの変化の影響を受け易いという欠点がある。近年、このような欠点を解決する被酸化性呈色試薬として、ＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するトリフェニルメタン系又はジフェニルナフチルメタン系のロイコ色素が数多く報告され（例えば、特許文献１参照）、更にロイコ色素の低水溶性を改善したトリフェニルメタン系化合物も知られている（特許文献２）。ロイコ色素は測定感度が非常に高く、微量成分の定量に好適である。

しかしながら、ロイコ色素は溶液中で保存安定性が低いため、経時的に非特異的な発色を呈することが問題となっていた。
特開昭６２−９３２６１号公報 特開平３−２０６８９６号公報

従って、本発明は、被酸化性呈色試薬、特にロイコ色素の保存安定化方法、及び該方法により安定化された試薬を提供することにある。

本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意研究を行った結果、被酸化性呈色試薬をｐＨ１〜５の溶液中で保存することにより、長期間にわたって被酸化性呈色試薬を安定に保存できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、被酸化性呈色試薬をｐＨ１〜５の溶液中で保存する被酸化性呈色試薬の安定化方法を提供するものである。
本発明はまた、ｐＨ１〜５の被酸化性呈色試薬溶液を提供するものである。

本発明の安定化方法によれば、被酸化性呈色試薬を溶液中で長期間安定に保存することができる。また。本発明の被酸化性呈色試薬溶液を用いると、生体中の微量成分を高感度で測定することができ、本発明の被酸化性呈色試薬溶液は臨床検査の分野において極めて有用である。

本発明の被酸化性呈色試薬溶液は、被酸化性呈色試薬を発色成分として用いる酸化性物質の定量であれば、如何なるものにも使用できる。酸化性物質としては、例えば過酸化水素が挙げられる。本発明の被酸化性呈色試薬溶液は、基質又は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の微量成分の測定に特に有用である。

本発明の被酸化性呈色試薬溶液により測定可能な生体試料中の微量成分としては、特に限定されるものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量することにより測定が可能な生体成分は全て該当する。例えば、糖化蛋白質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、コレステロール、グルコース、グリセリン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、シアル酸、胆汁酸、ピルビン酸、無機リン、クレアチニン、クレアチン、ＧＯＴ、ＧＰＴ、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられる。

本発明における被酸化性呈色試薬としては、特に限定されないが、例えば、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組み合わせ、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ロイコ色素、ベンジジン誘導体、ｏ−トリジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等が挙げられ、ロイコ色素が好ましい。

ロイコ色素としては、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが挙げられる。トリフェニルメタン誘導体としては、特開平３−２０６８９６号公報、特開平６−１９７７９５号公報等に記載の水溶性の高い化合物、フェノチアジン誘導体としては、特公昭６０−３３４７９号公報に記載の化合物、ジフェニルアミン誘導体としては、特公昭６０−３３４７９号公報、特開昭６２−９３２６１号公報等に記載の化合物が使用できる。これらの中で、ロイコマラカイトグリーン、ロイコクリスタルバイオレット、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４；和光純薬工業社製）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７：和光純薬工業社製）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ：同仁化学社製）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ：同仁化学社製）等が好ましく、ＴＰＭ−ＰＳ、ＤＡ−６４、ＤＡ−６７又はＭＣＤＰがより好ましく、ＴＰＭ−ＰＳ又はＭＣＤＰが特に好ましい。
その他、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、オルトフェニレンジアミン等も使用できる。

ｐＨの調整には、ｐＨを酸性にできるものならいずれも使用でき、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸等の無機酸、グリシン、フタル酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、酢酸、乳酸等の有機酸が使用できる。無機酸又は有機酸の濃度は特に制限されないが、０．０００１〜１０００ｍＭが好ましく、特に０．０１〜１０００ｍＭが好ましい。ｐＨは１〜５であればよいが、特にｐＨ１〜４が好ましい。

被酸化性呈色試薬溶液中の被酸化性呈色試薬の濃度は、特に限定されないが、０．００１〜１００ｍＭが好ましく、特に０．００１〜５０ｍＭが好ましい。

本発明の被酸化性呈色試薬溶液には、他にポリオキシエチレン構造を有する陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤；血液中の夾雑成分を処理する酵素；反応調整剤；安定化剤；アルブミン等の蛋白質類；塩化ナトリウム、塩化カリウム、フェロシアン化カリウム等の塩；グリシン、リジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸；還元性物質の影響回避のためのテトラゾリウム塩；抗生物質、アジ化ナトリウム、ホウ酸等の防腐剤；陽イオン性界面活性剤等も添加できる。これらの使用量は、被酸化性呈色試薬を用いる公知の酵素的定量法に準じて適宜選択すればよい。

本発明の被酸化性呈色試薬溶液は、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の形態で提供することができる。また、これらの容器は遮光することが望ましい。

以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］ ＴＰＭ−ＰＳの安定化−１
下記の各水溶液にＴＰＭ−ＰＳの濃度が６０μＭとなるように溶解した後、３７℃で保存し、日立７１５０形自動分析装置を用いて、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。表１に、０時間後、２週間後、３週間後の吸光度を示す。

表１から明らかなように、ＴＰＭ−ＰＳは、ｐＨ１〜５の水溶液中では非特異的な発色が抑制され、安定であることが分かった。

実施例２ ＴＰＭ−ＰＳの安定性−２
下記の各水溶液にＴＰＭ−ＰＳの濃度が１００μＭとなるように溶解した後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。２５℃で１０日間保存後、再度、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、調製直後の吸光度との差を「１０日間の変化量(ＯＤ)」として表２に示す。

表２から明らかなように、ＴＰＭ−ＰＳは、ｐＨ１〜５の水溶液中では吸光度の変化量が小さく、安定であることが分かった。

実施例３ ＭＣＤＰの安定性
ＭＣＤＰをメタノールに溶かして４ｍＭとした後、０．１％ トリトンＸ−１００を含む下記の各水溶液に１００μＭになるように溶解した。３７℃で２４時間保存し、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表３に示す。

表３から明らかなように、ＭＣＤＰは、ｐＨ１〜５の水溶液中では吸光度の変化量が小さく、非特異的な発色が抑制され、安定であることが分かった。

Claims (7)

1. 被酸化性呈色試薬をｐＨ１〜５の溶液中で保存する被酸化性呈色試薬の安定化方法。
2. 被酸化性呈色試薬が、トリフェニルメタン系、フェノチアジン系及びジフェニルアミン系から選ばれるロイコ色素である請求項１記載の方法。
3. トリフェニルメタン系ロイコ色素が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタンである請求項２記載の方法。
4. フェノチアジン系ロイコ色素が、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン又は１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項２記載の方法。
5. ｐＨ１〜５の溶液が、塩酸、硫酸、リン酸及び有機酸から選ばれる１種以上を含有する請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 有機酸がマレイン酸又はクエン酸である請求項５記載の方法。
7. ｐＨ１〜５の被酸化性呈色試薬溶液。