JP5274590B2

JP5274590B2 - ロイコ色素の安定化方法

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Publication number: JP5274590B2
Application number: JP2011014758A
Authority: JP
Inventors: 成植田; 毅松岡; 亮彦菅
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2011-01-27
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2027-02-22
Also published as: JP2011120599A

Description

本発明は、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色の軽減
方法、及び前記方法を用いた分析試薬組成物に関する。

臨床検査分野において、酵素法による種々の測定法が確立されている。このうち酸化酵
素を用いる場合は生成された過酸化水素を種々の酸化発色剤を用い、パーオキシダーゼ存
在下に酸化的に色素を産生させその吸光度を測定する方法が従来から知られている。例え
ば、４−アミノアンチピリンに代表されるカップラーと各種トリンダー試薬との組み合わ
せが多用されている。一方、より少量の過酸化水素を高感度に検出する方法として、２，
２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）などの
ロイコ化合物を用いた方法も知られている。一般に、これらロイコ型色素と総称される高
感度な発色色素は、溶液状態での安定性が悪く自然発色してしまうため、試薬調製後の使
用期間が短く、しかも試薬ブランクが高くなりやすい傾向があり測定精度上に問題点が生
じるため、臨床検査試薬キットなどに実用化されることはほとんどなかった。
これまでに報告されているロイコ型色素の安定化方法として、特許文献１には、シクロ
デキストリン及びその誘導体による１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７）の安定化効果につ
いて報告されている。また、特許文献２には、ロイコ型色素Ｎ−（カルボキシメチルアミ
ノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ−６４）を安
定化するために、パーオキシダーゼ又はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを共存させる
方法が開示されている。更に特許文献３にはＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン・６Ｎａ（ＴＰＭ−ＰＳ）の安定化方法が開示されている。
特許文献１によれば、短期間（１０日以内）での効果は認められているが、長期間保存
した場合の挙動についての記載は一切なく長期保存の効果は疑問である。また特許文献２
は、波長のスペクトルのみから色素が安定であると判断しているが、これを用いて実際に
過酸化水素が定量できたかについての記載は一切ない。更に、特許文献３には特定の緩衝
液及びキレート剤による安定化効果が示されているが、短期間保存後の吸光度を測定し、
これを単純に比例計算して１年後の結果を推定しているため根拠が希薄であり、実際に長
期間保存した場合の効果に疑問があった。
一方、ロイコ型色素単独での安定化ができても、パーオキシダーゼが添加された過酸化
水素発色反応時に色素が非特異的に発色してしまい正確な測定を妨げてしまうという問題
点があった。すなわち、過酸化水素発色反応時にロイコ型色素とパーオキシダーゼが共存
した状態では、過酸化水素が存在しなくても、非特異的な反応により経時的に試薬ブラン
クが増加してしまうという問題があった。
ロイコ型色素は過酸化水素の高感度検出に適しているため、液状で長期間安定なロイコ
型色素の安定化方法が望まれている。

特開平０１−１１８７６８号公報国際公開第２００３／０３３６０１号パンフレット特開２００５−１１０５０７号公報

本発明の課題は、液状で長期間保存が可能なロイコ型色素の安定化方法ならびにロイコ
型色素の発色反応時の非特異的発色の軽減方法、及びこれを利用した液状で安定な試薬組
成物を提供することにある。

本発明者らは、鋭意検討した結果、ロイコ型色素を特定の還元剤と共存させることによ
り自然発色が抑えられ、溶液での安定性が格段に向上することを見出した。
また、ロイコ型色素を用いた過酸化水素との発色反応時にロイコ型色素の測定波長に影
響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素を反応液に
共存させると、驚くべきことに非特異的な発色が抑えられ、試薬ブランク値が下がること
、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定精度が飛躍的に向上することを見出
した。
さらに、本発明を、分析試薬へ応用し、糖化蛋白質であるヘモグロビンA1cの酵素的測
定法において、液状で安定な試薬組成物を完成するに到った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ば
れた１種以上の還元剤と共存させることを特徴とするロイコ型色素溶液の安定化方法。
（２）ロイコ型色素が１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジ
メチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウムである前記（１）記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
（３）ロイコ型色素の溶液中での濃度が０．０１〜２ｍＭである前記（１）又は（２）に
記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
（４）還元剤の溶液中での濃度が０．００５〜１０ｍＭである前記（１）〜（３）のいず
れかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法。
（５）還元剤が、システイン、システアミン、Ｎ−アセチルシステイン、チオグリセロー
ル、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれ
た１種以上である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のロイコ型色素溶液の安定化方法
。
（６）０．００５〜１０ｍＭの還元性チオアルコール類又は還元性硫酸塩類からなる群よ
り選ばれた１種以上の還元剤と、０．０１〜２ｍＭの１０−（カルボキシメチルアミノカ
ルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ
'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン・６ナトリウムからなるロイコ型色素の液状組成物。
（７）還元剤が、システイン、システアミン、Ｎ−アセチルシステイン、チオグリセロー
ル、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムからなる群より選ばれ
た１種以上である前記（５）に記載の液状組成物。
（８）ロイコ型色素を用いたパーオキシダーゼ共存下での過酸化水素発色反応において、
ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反
応しない別の色素を共存させることを特徴とするロイコ型色素の非特異発色反応を軽減す
る方法。
（９）ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素
と反応しない別の色素の極大吸収波長が、４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲である前記（８
）に記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。
（１０）ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水
素と反応しない別の色素が、オレンジＧ、オレンジＩＩ、食用赤色２号、食用赤色３号、
食用赤色４０号、食用赤色１０２号、食用赤色１０４号、食用赤色１０６号、食用黄色４
号、食用黄色５号より選ばれた１種以上である前記（８）又は（９）に記載のロイコ型色
素の非特異発色反応を軽減する方法。
（１１）ロイコ型色素が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス
（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウムである前記（８）〜（１０）のいずれかに記載のロイコ型色素の非特異発色反応を軽減する方法。
（１２）ロイコ型色素を、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選
ばれた１種以上の還元剤及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを
有しかつ過酸化水素とは反応しない別の色素と、共存させた状態で過酸化水素と反応させ
ることを特徴とする過酸化水素定量方法。
（１３）ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水
素とは反応しない別の色素とパーオキシダーゼを含む一の試薬と、還元性チオアルコール
類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤とロイコ型色素を含む一
の試薬を組み合わせたことを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。
（１４）前記（１３）記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化
蛋白質測定用試薬。
（１５）ロイコ型色素として１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビ
ス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素とは反応しない別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる前記（１４）記載の糖化蛋白質測定用試薬。
（１６）糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃであり、第一試薬で総ヘモグロビンを定量、第
二試薬でヘモグロビンＡ１ｃを定量し、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンＡ１ｃ量
の割合を求めるための前記（１４）記載の糖化蛋白質測定用試薬。
（１７）プロテアーゼ反応促進剤、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチ
ジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコル
ビン酸酸化酵素及びロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、か
つ過酸化水素と反応しない別の色素を含む第一試薬と、ヘモグロビンＡ１ｃの糖化β鎖末
端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできる
プロテアーゼ、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチル
アミノ）フェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類
及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤を含む第二試薬とからなる
前記（１６）記載の糖化蛋白質測定用試薬。
（１８）プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンＡ１ｃに作用してヘモグロビンＡ１ｃの
糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すこ
とのできるプロテアーゼ、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス
（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び
還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及びロイコ型色素の
測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素を含
む第二試薬とからなる前記（１６）記載の糖化蛋白質測定用試薬。
（１９）プロテアーゼ反応促進剤が、Ｎ−アシルアミノ酸（塩）またはＮ−アシルタウリ
ン（塩）から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモ
スポラ属またはカーブラリア属由来であり、ロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸
収スペクトルを有し、かつ過酸化水素と反応しない色素が黄色４号又は赤４０号又は赤１
０２号であり、ヘモグロビンＡ１ｃに作用してヘモグロビンＡ１ｃの糖化β鎖末端から１
−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテア
ーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が２−ヒドロキ
シプロピル−β−シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がＡＬＰＳ又はＡＤＰＳで
あり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体として用
いることを特徴とする前記（１７）記載の糖化蛋白質測定用試薬。
（２０）全血中の糖化蛋白質を測定するための測定試薬であって、さらに、第一試薬にケ
トアミンオキシダーゼを含む前記（１７）に記載の糖化蛋白質測定用試薬。

本発明は、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色の軽減
方法、及び前記方法を用いた糖化蛋白質分析試薬組成物を提供する。

特許文献１２記載のプロテアーゼ反応促進剤による総ヘモグロビンの定量を示すグラフである。還元剤有無による総ヘモグロビン量の相関関係を示すグラフである。還元剤有無によるＨｂＡ１ｃ量の相関関係を示すグラフである。還元剤有りの場合における酵素法と免疫法の相関関係を示す式グラフである。免疫法と酵素法の相関関係を示す式グラフである（色素なし）。免疫法と酵素法の相関関係を示す式グラフである（色素あり）。免疫法（血球）と酵素法（全血）の相関関係を示す式グラフである。

以下、本願発明について具体的に説明する。
一般に、還元剤は、ロイコ型色素などの酸化発色色素とパーオキシダーゼによる過酸化
水素の発色反応を阻害し、発色強度の低下を引き起こすことが知られている。従って、還
元剤添加によってロイコ型色素が安定化されても、発色強度が低下してしまい実用的でな
い場合も考えられる。この還元剤による発色阻害の程度は、酸化発色色素の種類によって
異なるので、本発明に用いることのできるロイコ型色素は、安定化剤として加える還元剤
により発色の阻害を受けにくいか、あるいは低濃度の還元剤によっても安定化効果が認め
られるものであることが望ましい。

本発明に使用できるロイコ型色素の好適な例としては、１０−（カルボキシメチルアミ
ノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６
７）又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム（ＴＰＭ−ＰＳ）が挙げられる。ロイコ型色素の濃度は例えば０．００５〜１０ｍＭ、好ましくは０．０２から３ｍＭの範囲、さらに好ましくは０．０５から１ｍＭの範囲である。

次に、本発明に用いることのできる還元剤として、還元性チオアルコール類や還元性硫
酸塩類が挙げられる。
還元性チオアルコール類としては、チオグリセロール、システイン、Ｎ−アセチルシス
テイン、システアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオール塩酸塩）が、また、還元性硫酸
塩類としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリ
ウム、ニ亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸カリウムなどが挙げられる。これらは、単独、ある
いは組み合わせて用いることができる。

これら還元剤の濃度は、選択された還元剤による発色阻害の程度と安定化の程度を実験
的に確認し、対象とする非測定物の濃度範囲を参考にその濃度を設定すればよいが、例え
ば０．００５〜１０ｍＭ、好ましくは０．０２から３ｍＭの範囲である。
更に、シクロデキストリン及びその誘導体などの従来から知られている安定化剤と組み
合わせることによって、相乗的な効果も期待できる。

このようにロイコ型色素を還元剤と共存することにより、溶液状態で長期間着色しない
ロイコ型色素の安定化が達成された。これにより、実用的でより精度の高い分析試薬への
応用が可能となったが、この場合の好適な例としては２種類の試薬に分け、一方に本発明
のロイコ型色素と還元剤を共存させた溶液を、他方にパーオキシダーゼ溶液を用いればよ
い。

一方、先に述べたように、ロイコ型色素の安定化ができても、パーオキシダーゼが添加
された過酸化水素発色反応時にロイコ型色素が非特異的に発色してしまい正確な測定を妨
げてしまうという問題点があった。すなわち、過酸化水素発色反応時のロイコ型色素とパ
ーオキシダーゼが共存した状態で過酸化水素が存在しなくても、非特異的な反応により経
時的に試薬ブランクが増加してしまう。通常、発色強度を定量的に測定するためには、反
応溶液に光を当てて、個々の酸化色素に特有な波長での吸光度を測定する分光分析法が用
いられる。例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメ
チルアミノ）フェノチアジンナトリウム（DA-67）の場合は６６０ｎｍ付近に、また、Ｎ
，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン・6Na（TPM-PS）の場合は６００ｎｍ付近に極大吸収波長を持つ。

本発明者らは、試薬ブランクが分析装置の光源ランプの強さや光路長などによって大き
く影響を受けるのは、吸光度を測定するために光源として照射する光が、試薬ブランクの
一因になっているのではないかと考え、このことを確認するために仕様が異なる２種類の
自動分析装置を用いて検討したところ、実際に試薬ブランクの値が大きく異なることを見
出した。試薬ブランクの値は、分析装置の仕様、例えば、主に光源ランプの出力、反応液
に照射される光量に大きく左右されることが判明したが、実用上、試薬ブランクが大きけ
れば大きいほど、結果的に測定精度が悪くなってしまうという問題点が生じる。このこと
は、たとえ特定の還元剤を共存させてロイコ型色素を溶液中で安定化させることができて
も、パーオキシダーゼが共存して実際の発色反応が進行する時には、光源ランプを照射し
て分光分析法にて吸光度をモニターする過程で光源ランプの影響を受け、結果として非特
異発色として試薬ブランクが増大し測定精度が悪くなると考えられた。

そこで、本発明者らは、鋭意検討を加えた結果、ロイコ型色素を用いた過酸化水素の発
色反応時に測光時の光源ランプの影響を軽減するため、４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸
収波長を有する色素を反応液に共存させると、驚くべきことにこの非特異的な発色が抑え
られ、試薬ブランク値が下がること、かつ試薬ブランク値のバラツキも大きく軽減し測定
精度が飛躍的に向上することを見出した。

本発明でいうロイコ型色素の測定波長に影響を与えない吸収スペクトルを有し、かつ過
酸化水素とは反応しない色素とは、自らパーオキシダーゼによる酸化発色反応を起こさな
いこと、またロイコ型色素とパーオキシダーゼによる過酸化水素発色反応に影響を及ぼさ
ないこと、つまりロイコ型色素発色時の極大吸収波長と干渉しない色素をいう。具体的に
は、上に示した４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する色素を適宜選択すればよ
い。

本発明に用いることのできる４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する色素とし
ては、例えば食用色素が挙げられ、このうち合成食用色素として、食用赤色２号（アマラ
ンス、極大吸収波長５０８ｎｍ）、食用赤色３号（エリスロシン、極大吸収波長５２
６ｎｍ）、食用赤色４０号（アルラレッドＡＣ、極大吸収波長４９９ｎｍ）、食用赤色
１０２号（ニューコクシン、極大吸収波長４２８ｎｍ）、食用赤色１０４号（フロキシ
ン、極大吸収波長５３８ｎｍ）、食用赤色１０６号（アシッドレッド、極大吸収波長
５０８ｎｍ）、食用黄色４号（タートラジン、極大吸収波長４２８ｎｍ）、食用黄色５
号（サンセットイエローＦＣＦ、極大吸収波長４８２ｎｍ）などが、また、食用色素以
外の色素でも、オレンジＧ（極大吸収波長４８０ｎｍ）、オレンジＩＩ（極大吸収波長
４８０ｎｍ）などを用いてもよい。更に、天然食用色素として知られているコチニール
色素、タマネギ色素、ベニバナ黄色素、クチナシ赤色素等を用いることもできる。

これら４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する色素の好適な濃度は、例えば０
．００５〜３ｍＭ、好ましくは０．０２から１ｍＭの範囲であるが、これに限定されるも
のではない。また、２種以上の色素を組み合わせて用いることもできる。

これら４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する色素は、本発明に用いる還元剤
により安定化されたロイコ型色素溶液と共存させても、またパーオキシダーゼ溶液と共存
させてもよい。

発明者らは上記記載のように、鋭意検討した結果、（１）還元剤を共存させることによ
って液状でのロイコ型色素の安定化が達成され、さらに（２）ロイコ型色素の吸光度測定
波長に影響を与えない４００〜５５０ｎｍ付近に極大吸収波長を有する別の色素を発色反
応時の液に共存させることにより、ロイコ型色素の非特異的な発色を抑止し、これにより
測定精度の高く実用性にすぐれた液状で長期間安定なロイコ型色素を含む過酸化水素定量
用試薬組成物を完成するに到った。

本発明による分析試薬組成物への応用については、測定対象物が定量的に過酸化水素に
変換できる反応系であれば特に限定はされない。
ここでは、好適な例として糖化蛋白質であるヘモグロビンＡ１ｃの酵素的な測定法へ
の応用を挙げる。ヘモグロビンＡ１ｃの酵素的な測定法及び測定用酵素についてはこれま
でに以下のとおり種々報告されている。
特許第３０３４６８公報国際公開第２００２／０６５１９号パンフレット国際公開第２００５／５６８２３号パンフレット特開２００１−９５５９８号公報特開２００３−２３５５８５号公報特開２００５−１１０６５７号公報国際公開第２００５／４９８５７号パンフレット国際公開第２００４／１０４２０３号パンフレット国際公開第２００６／０１３９２１号パンフレットＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４９（２）：２６９−２７４（２００３）ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ４０（１）：７８−８９（２００２）臨床検査４６（６）：７２９−７３４（２００２）

＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさし、α鎖及
びβ鎖Ｎ末端のバリンのα−アミノ基や分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されている
と言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとは糖化ヘモグロビンが分解されるこ
とによりできるペプチドのことをいう。
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端
のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされている（非特許文献２）
＜ケトアミンオキシダーゼ＞
ケトアミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のことで、別名フ
ルクトシルアミンオキシダーゼともいう。

一般的にヘモグロビンＡ１ｃはプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼを用いて定量さ
れるが、国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖
Ｎ末端のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされているため、その
特異性が課題となる。ヘモグロビンにおいて、β鎖Ｎ末端のバリン以外にα鎖Ｎ末端のバ
リンや、分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されているため、これらのものを測定せず
に、ヘモグロビンＡ１ｃのヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化バリン部位のみを選択的に定量
しなければならない。このための酵素として、ある特定の生成物を切り出すプロテアーゼ
又はある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼが数多く見出されている。
しかしながら特定の生成物を切り出すプロテアーゼといっても、ヘモグロビンを基質と
した場合、目的とする生成物以外にも多かれ少なかれ通常は他のペプチド又はアミノ酸も
生成する。ある特定のペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼについても同様で、作
用する基質はその他複数種あるのが通常である。すなわちこれらの特異性の高いといわれ
る酵素を用いても、ヘモグロビンからプロテアーゼにより切り出される生成物は複数種あ
るため、プロテアーゼ単独の特異性もしくは、ケトアミンオキシダーゼ単独の特異性のみ
でヘモグロビンＡ１のβ鎖Ｎ末端の糖化バリン部位だけを測り分けたという報告はこれま
でにはなく、特定のプロテアーゼと特定のケトアミンオキシダーを組み合わせて用いるこ
とによって実質的にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化バリン部位に対する特異性を高めた方
法が報告されている。
例えば、特許文献７〜１２には、プロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖Ｎ末端より糖化
バリルヒスチジンを切り出し、これに作用するケトアミンオキシダーゼを用いて測定する
方法が開示されている。また、特許文献１１によれば、プロテアーゼの基質特異性の確認
方法として、例えばヘモグロビンのα鎖Ｎ末端及びβ鎖Ｎ末端５残基の糖化ペプチドを用
いて、β鎖Ｎ末端の糖化ペプチド、例えば糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジル
ロイシン、糖化バリルヒスチジルロイシルスレオニンのみが生成され、α鎖Ｎ末端由来の
糖化バリルロイシン、糖化バリルロイシルセリン、糖化バリルロイシルセリルプロリンを
生じないプロテアーゼが挙げられる。
またヘモグロビンＡ１ｃは、糖化されないものに対する糖化されたものの割合（％）と
して測定されるため、前記ヘモグロビンＡ１ｃ濃度の測定のみならず、総ヘモグロビンの
測定も必須である。
こうして測定された、総ヘモグロビン濃度、ＨｂＡ１ｃ濃度の比からヘモグロビンＡ１
ｃの割合、すなわちヘモグロビンＡ１ｃ（％）が計算される。
総ヘモグロビンについては、シアンメトヘモグロビン法等、これまでに種々の測定法が
報告されているのでヘモグロビンＡ１ｃ濃度の測定とは別個に測定することもできるが、
望ましくは、同一反応槽で測定できることである。
例えば、特許文献１２にはヘモグロビンを変性させその色調を変化させるプロテアーゼ
反応促進剤及びこれをプロテアーゼ、ケトアミンオキシダーと組み合わせた同一反応槽で
のＨｂＡ１ｃ測定例が記載されている。

我々は、本発明を上記特異的なヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃということが
ある）測定方法と組み合わせることにより実用性にすぐれたＨｂＡ１ｃ測定試薬を完成す
るに到った。すなわち、例えば特許文献１１記載の特異性の高いプロテアーゼ及びケトア
ミンオキシダーゼを用いて、一方の試薬に過酸化水素と反応しない色素、パーオキシダー
ゼ及びケトアミンオキシダーゼを含有させ、他方に還元剤、ロイコ型色素及びプロテアー
ゼを含有させた２種類の試薬から構成される液状で安定なＨｂＡ１ｃ定量用試薬を完成す
るに到った。

以下、より好適な例を述べる。ＨｂＡ１ｃ定量用試薬は、２種類の液状試薬から構成さ
れ、以下の組み合わせ方が挙げられる。
（組み合わせ１）
第一試薬：
プロテアーゼ反応促進剤
１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用するケトアミンオキシ
ダーゼ
パーオキシダーゼ
トリンダー試薬
過酸化水素と反応しない色素
第二試薬：
ＨｂＡ１ｃの糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジ
ンを切り出すことのできるプロテアーゼ
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェ
ノチアジンナトリウム
シクロデキストリン類
還元剤
（組み合わせ２）
第一試薬：
プロテアーゼ反応促進剤
ＨｂＡ１ｃに作用してＨｂＡ１ｃの糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェ
ノチアジンナトリウム
カタラーゼ
シクロデキストリン類
還元剤
第二試薬：
フルクトシルアミンオキシダーゼ
パーオキシダーゼ
過酸化水素と反応しない色素

本発明のＨｂＡ１ｃ定量用試薬は、上記組み合わせのいずれかの組成物を用いることが
でき、第一試薬で総ヘモグロビンを定量し、第二試薬で糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出
された１−デオキシフルクトシル−バリン−Ｌ−ヒスチジンを定量することにより、総ヘ
モグロビン量に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を求め、ＨｂＡ１ｃに特異的な液状で安
定な測定試薬を完成させるに到った。
なお、ここで、ロイコ型色素として、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウムの代わりにＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン・６ナトリウムを用いることも出来る。

ここで、プロテアーゼ反応促進剤とは、酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ−アシルタ
ウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩であり
、より具体的には特許文献１２に記載されている。好適な例としては、ラウロイルサルコ
シンナトリウム（商品名：サルコシネートＬＮ、日光ケミカル株式会社）、ミリストイル
サルコシンナトリウム（サルコシネートＭＮ）ラウロイルメチルアラニンナトリウム（ア
ラニネートＬＮ−３０）などが挙げられる。

また、組み合わせ１におけるトリンダー試薬は、第一試薬中に持ち込まれる過酸化物を
消去し、試薬ブランクを軽減させるためのものであり、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スル
ホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル
）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニ
リン（ＡＬＰＳ）、ＭＡＰＳ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルア
ニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、
ＡＬＯＳ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチ
ルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（
ＤＡＰＳ）、ＨＤＡＰＳ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）などを用いることができ、その添加濃度として
は、０．０５〜１ｍＭである。また、組み合わせ１において、アスコルビン酸の影響を軽
減するためにアスコルビン酸オキシダーゼを添加することもでき、また胆汁酸塩などの界
面活性剤や塩を適宜加えることもできる。

また、組み合わせ２において、カタラーゼは、過酸化物を消去し試薬ブランクを軽減さ
せるためのものであり、容易に入手が可能な牛肝臓由来の市販酵素（シグマなど）を用い
ればよく、その好適な濃度は、１００〜２０００ｕ／ｍｌである。

このようにして調製された液状試薬を用い糖化ヘモグロビンＡ１ｃの糖化されていない
ヘモグロビンに対する割合を測定するためには、抗凝固剤入り採血管で採取された血液を
遠心分離して血球部分を沈降させ、これを市販の溶血希釈混和装置などを用いて、水
で適宜希釈することにより溶血させたものを検体として用い、測定すればよい。
また、特に、組み合わせ１の場合は、全血を測定する場合に妨害物質の影響を回避でき
て望ましい。すなわち、血漿からの想定される妨害成分として、アスコルビン酸、ビリル
ビン、乳びの他に内在性の糖化ペプチドが挙げられる。従って、血漿成分からのアスコル
ビン酸等の影響を回避するためにアスコルビン酸酸化酵素及びケトアミンオキシダーゼを
第一試薬に加えることにより、内在性の糖化ペプチド、アスコルビン酸を処理することが
でき血漿成分に混入する妨害成分の影響を回避できる。
このように本発明によれば、遠心分離血球だけでなく、全血そのものでの測定も可能で
あり、これにより遠心分離操作が不要な簡便な測定も可能となる。
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はなんらこれにより限定されるもの
でない。

〔実施例１〕還元剤の効果
ロイコ型色素溶液として０．２ｍＭＤＡ−６７を含んだ４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．１）溶液（以下、ＤＡ−６７溶液ということがある）に、還元剤としてＮ−ア
セチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、チオ硫
酸ナトリウム、２メルカプトエタノール、ジチオスレイトールを各々１ｍＭおよび１０ｍ
Ｍになるように加え（ジチオスレイトールのみ１ｍＭだけ）３７℃にて４日間遮光保存し
た。これらの溶液について調製直後と３７℃、４日保存後の６６０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより、保存前後のロイコ型色素溶液そのものの着色度を判定した。
また別に、１０ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ（シグマ社製）を含む４０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）溶液を調製し、これに５０μＭの過酸化水素溶液を添加し予め３
７℃に５分加温した後６６０ｎｍの吸光度を測定し、上記還元剤を添加したＤＡ−６７溶
液０．２ｍｌを加え、混合後５分後の吸光度から差し引いた値を発色強度として観測した
。ここで、過酸化水素を添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表１に示す。
表１からわかるように、還元剤の添加がない場合のＤＡ−６７単独溶液の初期吸光度は
４日後に１９３４（ｍＡｂｓ）であったのに対して、各還元剤添加系においては発色強度
が小さかった。尚、過酸化水素発色強度の相対％は０日目の還元剤無添加の発色強度を１
００％としたときのものである。

〔実施例２〕還元剤の効果
ロイコ色素溶液として０．１ｍＭＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学製）を含む４０ｍＭＰＩ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に各種還元剤を加え、３７℃にて半年間、遮光保存した。Ｔ
ＰＭ−ＰＳによる過酸化水素発色の極大波長付近である６００ｎｍの吸光度を測定し、表
２の結果を得た。検討に用いた還元剤のなかで、亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム
、チオ硫酸ナトリウムに非特異的な発色を抑制する顕著な効果が認められた。

〔実施例３〕還元剤の効果
ロイコ型色素溶液として０．２ｍＭＤＡ−６７（以下、ＤＡ−６７溶液ということがあ
る）および２％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリンを含んだ４０ｍＭＰＩＰ
ＥＳ（ｐＨ６．５）溶液に、還元剤としてＮ−アセチルシステイン、亜硫酸ナトリウム、
二亜硫酸ナトリウム、チオグリセロールを各々１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭに
なるように加え３７度にて７日間遮光保存した。これらの溶液について調製直後と３７℃
、７日保存後の６６０ｎｍの吸光度を測定することにより、保存前後のロイコ型色素溶液
そのものの着色度を判定した。次に、日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用いて、試薬ブラ
ンクと発色強度を調べた。すなわち、１０ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ（シグマ社製）、
５ｕ／ｍｌケトアミンオキシダーゼ（カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来）を含む
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液０．１８ｍｌに、５０μＭの糖化バリル
ヒスチジン（Ｆ−ＶＨ：ペプチド研究所）０．０２ｍｌを加え、３７℃に５分加温した後
６６０ｎｍの吸光度を測定した（Ａ１）。次に上記各濃度の還元剤を含むＤＡ−６７溶液
０．０４５ｍｌを加え、混合後５分後の吸光度Ａ２からＡ１を差し引いた値を発色強度と
して観測した。ここで、Ｆ−ＶＨを添加しないものを試薬ブランクとした。結果を表３に
示す。
表３からわかるように、Ｆ−ＶＨを基質とした場合のＤＡ−６７溶液の発色強度は、
還元剤を添加したものでは、還元剤の濃度依存的に小さくなる傾向を示した。１０ｍＭの
二亜硫酸ナトリウムを除き、いずれの還元剤についてもその濃度が１０ｍＭまでは、発色
強度は還元剤無添加のときを１００％とした場合に、８０％以上であった。また、３７℃
４日後の試薬ブランクは還元剤無添加に比べ、いずれの還元剤についてもその濃度依存的
に小さくなることが示された。尚、Ｆ−ＶＨの相対％は０日目の還元剤無添加の発色強度
を１００％としたときのものである。

〔実施例４〕還元剤の効果
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．２％ＯＰ−１０ＦＦ−０（日光ケミカルズ株式会社）
０．０４ｍＭＤＡ−６７
１ｍＭ塩化カルシウム
４００ｕ／ｍｌカタラーゼ
２％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
各種還元剤
（第二試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
３０ｕ／ｍｌＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
９０ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ
日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。

（ＤＡ−６７溶液の着色度測定）
検体に蒸留水を用いて、検体／第一試薬：２μｌ／２００μｌで混合。測光ポイントは
８ポイント目の１ポイント測定。主波長６６０ｎｍ。

（糖化バリルヒスチジンの感度（発色強度）測定（Ｆ−ＶＨの定量））
検体／第一試薬／第二試薬：２０μｌ／１８０μｌ／４５μｌ。測光ポイントは１６、
３４ポイントの２ポイント。主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍ。

（操作）
ＤＡ−６７を含む第一試薬に各種還元剤を加え、茶褐色のガラス容器に入れ、３７℃で
保存する。第一試薬に還元剤としてそれぞれチオグリセロール（２ｍＭ）、Ｎ−アセチル
システイン（２ｍＭ）、チオ硫酸ナトリウム（５ｍＭ）を添加した。還元剤添加後３日目
、７日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化バリルヒスチジン（Ｆ−ＶＨ
）の感度（発色強度）を測定した。
表４に示したように、第一試薬の着色度は、還元剤非添加のものに比べて、還元剤を添
加したものが、チオ硫酸ナトリウム、チオグリセロール、Ｎ−アセチルシステインの順に
低くなった。一方、試薬ブランクについても還元剤の添加効果が認められ、チオ硫酸ナト
リウムにその効果が最も大きかった。還元剤添加時の、糖化バリルヒスチジンの発色強度
は、還元剤非添加のそれを１００％とした場合、７５〜８９％を示した。

〔実施例５〕還元剤の組み合わせの効果
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．０２ｍＭＤＡ−６７
１ｍＭ塩化カルシウム
８００ｕ／ｍｌカタラーゼ
４％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
還元剤
（第二試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
３０ｕ／ｍｌＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
９０ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ

実施例４で、ＤＡ−６７含有試薬の着色度抑制効果の大きかったＮ−アセチルシステイ
ンと、試薬ブランク抑制効果の高いチオ硫酸ナトリウムの組み合わせ効果を確認した。還
元剤は第一試薬に含まれる。
日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。

（ＤＡ−６７溶液の着色度測定）
検体に蒸留水を用いて、検体／第一試薬：２μｌ／２００μｌ、測光ポイントは８ポイ
ント目の１ポイント測定。主波長６６０ｎｍ。

（糖化バリルヒスチジンの定量）
検体／第一試薬／第二試薬：２０μｌ／１８０μｌ／４５μｌ。測光ポイントは１６、
３４ポイントの２ポイント。主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍ。

（操作）
ＤＡ−６７を含む第一試薬に還元剤としてＮ−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウ
ムの濃度をそれぞれ０．５〜２ｍＭ、３〜９ｍＭになるように組み合わせて加え、茶褐色
のガラス容器に入れ、３７℃で保存する。調製初日、７日目にサンプリングし、着色度、
試薬ブランク、糖化ＶＨの感度を測定した。表５に示したように、還元剤無添加の反応液
に比べて、Ｎ−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの組み合わせは、いずれの系列
においても顕著な効果を示した。最適な濃度は、Ｎ−アセチルシステインが１．５または
２ｍＭでチオ硫酸ナトリウムが５ｍＭの時であった。

〔実施例６〕還元剤以外の他の安定化剤との組み合わせの効果
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．０２ｍＭＤＡ−６７
１ｍＭ塩化カルシウム
１％ＭＭＴ（日光ケミカル株式会社）
８００ｕ／ｍｌカタラーゼ
１０％エチレングリコール
５ｋｕ／ｍｌニュートラルプロテアーゼ（バチラス・エスピー由来：東洋紡社製）
還元剤、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン
（第二試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
３０ｕ／ｍｌＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
９０ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ

還元剤としてＮ−アセチルシステインと、チオ硫酸ナトリウムを用い、更にヒドロキシ
プロピル−β−サイクロデキストリンを組み合わせて用いた。還元剤およびヒドロキシプ
ロピル−β−サイクロデキストリンは第一試薬に含まれる。日立７１７０Ｓ型自動分析装
置を用い、以下のパラメータで測定した。

（ＤＡ−６７溶液の着色度測定）
検体に蒸留水を用いて、検体／第一試薬：２μｌ／２００μｌ、測光ポイントは８ポイン
ト目の１ポイント測定。主波長６６０ｎｍ。

（糖化−バリルヒスチジンの定量）
検体／第一試薬／第二試薬：２０μｌ／１８０μｌ／４５μｌ測光ポイントは１６、３
４ポイントの２ポイント。主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍ。

（ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドの定量）
ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のアミノ酸配列を参考に、５アミノ酸からなる１−デオキシフル
クトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−プロリン
（以下、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチド（糖化ＶＨＬＴＰ）ともいう）を合
成し、これを基質として用いた。

（操作）
ＤＡ−６７を含み、Ｎ−アセチルシステインとチオ硫酸ナトリウムの濃度が２ｍＭ、５
ｍＭを含む第一試薬に、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン濃度が２〜５％
になるように加え、茶褐色のガラス容器に入れ、３７℃で保存する。調製初日、３日目、
７日目にサンプリングし、着色度、試薬ブランク、糖化ＶＨ、糖化ＶＨＬＴＰの感度を測
定した。表６に示したように、還元剤無添加の反応液に比べて、還元剤としてＮ−アセチ
ルシステインとチオ硫酸ナトリウムを用いたものは対照に比べて試薬の着色が殆ど認めら
れなかった。また、還元剤と組み合わせれば、ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキス
トリンの量は２％以上であれば充分であった。

〔実施例７〕亜硫酸ナトリウム量の検討
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５００ｍＭＮａＣｌ
１．０ｍＭＣａＣｌ₂
０．０５％ＮａＮ₃
０．１ｍＭＡＤＰＳ
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
０〜３．０ｍＭ亜硫酸Ｎａ
０．１０ｍＭＤＡ−６７
１２ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ由来：大和化成）

日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「２ポイント」を選択し、第二試薬添加後のＨｂＡ１ｃ濃度または糖
化ＶＨＬＴＰ濃度を測定した。測光ポイントは１６、３４ポイントの２ポイント。主波長
６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍ。

（第二試薬の着色度の測定）
検体に蒸留水を用いて、検体／第二試薬：２０μｌ／２００μｌ、測光ポイントは８ポイ
ント目の１ポイント測定とした。主波長６６０ｎｍ。（ヘモグロビンコントロールの定量
）
亜硫酸ナトリウムを３ｍＭまで変化させた第二試薬を用いて、市販のヘモグロビンコン
トロールＬ（４．８％）、ヘモグロビンコントロールＨ（１０．５％）、および５０μＭ
の糖化ＶＨＬＴＰをサンプルに用い、着色度、試薬ブランク、ＨｂＡ１ｃまたは糖化ＶＨ
ＬＴＰの感度を試薬調製初日、冷蔵および３７℃で１０日間まで保存したものを、測定し
た吸光度変化量を表７に示した。亜硫酸ナトリウム濃度依存的に、ＤＡ−６７の安定化が
図れた。一方、感度も亜硫酸ナトリウム濃度依存的に低下したが、亜硫酸３ｍＭのときの
感度低下率は約２５％と実用上問題はなかった。

〔実施例８〕長期保存における還元剤の効果
（第一試薬）
実施例７に同じ
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
無添加または２ｍＭ亜硫酸Ｎａ
０．１０ｍＭＤＡ−６７
１２ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来：大和化成）
日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二反応でＨｂ
Ａ１ｃ濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。

（総Ｈｂ濃度、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
検体に市販のヘモグロビンコントロールを用い、検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞ
れ１８μｌ／１８０μｌ／３６μＬとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントは、１４
ポイント、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを用いた。主波長は６
６０ｎｍ、副波長は８００ｎｍ。

（第二試薬の着色度の測定）
第二試薬の着色度の測定は、主波長６６０ｎｍで、検体に蒸留水を用いて、検体／第二試
薬：２０μｌ／２００μｌ、測光ポイントは８ポイント目の１ポイント測定とした。
ＤＡ−６７を含む第二試薬に、亜硫酸ナトリウムを２ｍＭ加えたものと加えないものを
調製し、遮光ボトルに入れ、冷蔵（５℃）にて６ヶ月保存した。
市販のヘモグロビンコントロールＬ（４．８％）、ヘモグロビンコントロールＨ（１０
．５％）をサンプルとして用い、試薬ブランク、感度を２ｍＭ亜硫酸ナトリウムを含む試
薬の調製初日の測定値を対照に、測定した。Ｈｂ濃度に対応する１４ポイントの測定値、
ＨｂＡ１ｃ濃度に対応する１６、３４ポイントの測定値を用いた吸光度変化量の結果を表
８に示した。総Ｈｂ測定値については、亜硫酸ナトリウムの有無に関わらず、６ヵ月後の
感度低下は認められなかった。
一方、試薬ブランクについて、２ｍＭ亜硫酸ナトリウムでは、総ヘモグロビン、ＨｂＡ
１ｃ（ＨｂＡ１ｃの場合の試薬ブランクは調製直後で９．７ｍＡｂｓ、冷蔵半年後で８．
８ｍＡｂｓ）ともに６ヶ月間の変化は殆どなかった。
一方、亜硫酸ナトリウム非添加の試薬は、ＨｂＡ１ｃについて５０．６ｍＡｂｓと調製
時の２倍以上に上昇していた。更に、コントロール測定結果において、試薬ブランクを差
し引いた値も若干低めになっていた。このことから、ＤＡ−６７含有試薬の長期保存にも
亜硫酸ナトリウムの効果が顕著に表れていることが確認できた。尚、試薬自体の着色度は
、亜硫酸ナトリウム添加の場合、肉眼的には全く変化なかった。

〔参考例〕特許文献１２記載のプロテアーゼ反応促進剤による総ヘモグロビンの定量
（反応液）
４０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）
６％アラニネートＬＮ−３０
４．５ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ
２ｍＭ塩化カルシウム
１ｍＭＴＯＤＢ（Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン
：同仁化学）

市販のＨｂＡ１ｃコントロール試料およびヒトヘモグロビン（シグマ製）を用いて、ヘ
モグロビン濃度０〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲になるようにヘモグロビン試料を調製した。
ラウリル硫酸ナトリウム法を原理とする市販ヘモグロビン測定用試薬「ヘモグロビンＢ−
テストワコー」にて、ヘモグロビンを測定し、濃度を算出した。次に、上記反応液１．８
ｍｌを３７℃にて予備加温後、同一のヘモグロビン試料を０．２ｍｌ添加し混和した。５
分後の６６０ｎｍにおける吸光度を読み取った。試料の代わりに蒸留水を用いたものを試
薬ブランクとし、各々の試料につきこれを差し引き、表９に示した。これをプロットした
図１より明らかなように、ヘモグロビン濃度に対して、本反応液を用いた吸光度差は総ヘ
モグロビン約２０ｍｇ／ｍｌまで直線関係であった。

〔実施例９〕総ヘモグロビン、糖化へモグロビンＡ１ｃの測定（還元剤有無）
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．０２ｍＭＤＡ−６７
２％ＨＰ−β−ＣＤ
１％ＭＭＴ（日光ケミカル株式会社製）
０．５ｍＭＣａＣｌ₂
１０％エチレングリコール
５ｋｕ／ｍｌニュートラルプロテイネース（東洋紡製）
８００ｕ／ｍｌカタラーゼ
１０ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（和光純薬製）
（第二試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
９０ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ
０．０５％ＮａＮ₃
３１ｕ／ｍｌＦＯＤ（（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミ
ンオキシダーゼ）

日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のように測定した。
［Ｈ７１７０パラメータ］
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二反応でＨｂ
Ａ１ｃ濃度を測定する。測定結果は、吸光度で表した。

（総Ｈｂ濃度、ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞれ２０μｌ／１８０μｌ／４５μＬとし、総ヘモ
グロビンの測定の測光ポイントは、１４ポイント、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１
６、３４ポイントを用いた。主波長は６６０ｎｍ、副波長は８００ｎｍ。
試料として、市販ＨｂＡ１ｃコントロール（凍結乾燥品および凍結品）を用いて、ヘモ
グロビン濃度がおおよそ０．８〜５ｍｇ／ｍｌになるように溶解したものを用いた。第一
試薬に還元剤（１ｍＭＮ−アセチルシステイン、５ｍＭチオ硫酸ナトリウム）を添加し
たもの、添加しないものそれぞれについて測定を行った。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二試薬添加
後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞれ２
０μｌ／１８０μｌ／４５μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、１４
ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを用いた。また、総
ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ濃度ともに、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測光し
た。濃度への換算は、ＨｂＡ１ｃの場合、既知濃度に調製した糖化β−ペンタペプチド（
ペプチド研究所製）より、また総ヘモグロビンは、市販ＨｂＡ１ｃコントロールＬ（ＢＭ
Ｌ社）の表示値より計算した。
表１０および図２、図３より明らかなように、還元剤有無によるＨｂＡ１ｃ量、総ヘモ
グロビン量の相関係数はいずれもｒ＝０．９９以上と良好であり還元剤を添加しても測定
への影響は認められなかった。

〔実施例１０〕ＨｂＡ１ｃの測定（免疫法との比較）
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．０２ｍＭＤＡ−６７
２％ＨＰ−β−ＣＤ
１％ＭＭＴ（日光ケミカル株式会社製）
０．５ｍＭＣａＣｌ₂
１０％エチレングリコール
５ｋｕ／ｍｌニュートラルプロテイネース（東洋紡製）
８００ｕ／ｍｌカタラーゼ
１０ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（和光純薬製）
１ｍＭＮ−アセチルシステイン
５ｍＭチオ硫酸ナトリウム
（第二試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
９０ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ
０．０５％ＮａＮ₃
３１ｕ／ｍｌＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミン
オキシダーゼ）
日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、以下のように測定した。

（免疫法）
「デタミナーＨｂＡ１ｃ」（協和メデックス株式会社）を用い、添付文書に従い測定した
。検体は血球を所定のＨｂＡ１ｃ測定用検体希釈液にて、１０１倍希釈して測定に用いた
。

（本発明法）
第一試薬にＤＡ−６７と還元剤（Ｎ−アセチルシステインおよびチオ硫酸ナトリウム）
とプロテアーゼを、第二試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを含む組成の
試薬を用いた。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二試薬添加
後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞれ２
０μｌ／１８０μｌ／４５μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、１４
ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを用いた。また、総
ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ濃度ともに、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測光し
た。検体は血球を蒸留水で７１倍希釈したものを用いた。
濃度への換算は、総ヘモグロビンは、市販ＨｂＡ１ｃコントロール（ＢＭＬ社）の表示
値（単位：ｍｇ／ｍｌ）より、またＨｂＡ１ｃ濃度は既知濃度に調製した糖化バリルヒス
チジン（ペプチド研究所製）水溶液の吸光度より求め、ＨｂＡ１ｃ（％）はＨｂＡ１ｃ濃
度を総ヘモグロビン濃度で割ることにより求めた。なお、ヘモグロビン濃度（Ｍ）はヘモ
グロビンの分子量を６４５５０として算出した。

（結果）
図４に示したように、２２種類の検体を用いた時の相関式ｙ＝１．０５５ｘ−０．３
９１７，Ｒ２＝０．９７９８と良好であった。

〔実施例１１〕ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列と同一の糖化ペンタペプチド（１−デオキシ
フルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−プロ
リン）測定時の色素添加効果）
（第一試薬）
４０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）
１０ｕ／ｍｌＰＯＤ
０．１ｍＭＡＤＯＳ（同人化学）
１５ｕ／ｍｌＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミン
オキシダー由来）
（第二試薬）
１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．１２ｍＭＤＡ−６７
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
３ｋｕ／ｍｌニュートラルプロテイネース（東洋紡製）

以下の二種類の製造メーカーの異なる自動分析装置を用いた。
（ａ）日立自動分析装置７１７０型
検体／第一試薬／第二試薬：２０μｌ／１８０μｌ／４５μｌ測光ポイントは１６、３
４ポイントの２ポイント。主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍ。
（ｂ）日本電子ＢＭ１２自動分析装置
検体／第一試薬／第二試薬：８μｌ／７２μｌ／１８μｌ測光ポイントは４４−４７、
９５−９８の２ポイントエンド。主波長６５８ｎｍ、副波長８０５ｎｍ。

上記試薬を用いて、それぞれの自動分析装置で試薬ブランクを２０回連続測定し、平均
吸光度、標準偏差（ＳＤ）を算出した。次に、５０μＭヘモグロビンβ鎖Ｎ末端配列から
なる糖化ペンタペプチドを測定し、試薬ブランク（２０回の平均値）を差し引いた吸光度
を算出した。表１１に示したように日本電子ＢＭ１２の試薬ブランクの平均値５８．８ｍ
Ａｂｓは、日立７１７０Ｓの試薬ブランク１７．６ｍＡｂｓの３倍以上の値を示した。一
方、５０μＭ糖化ペンタペプチドの試薬ブランクを差し引いた吸光度はほぼ同じ値を示し
た。また、試薬ブランク値が大きい日本電子装置でより、大きな標準偏差を示し、測定精
度が劣ることが示された。そこで、この反応液の第一試薬に本発明の黄色４号（三栄源エ
フエフアイ）を０．３ｍＭになるように加え、同様の操作を行った。日本電子ＢＭ１２に
おける試薬ブランクが５８．８ｍＡｂｓから１８．８ｍＡｂｓと劇的に低下し、その標準
偏差も小さくなった。一方、日立７１７０の場合の試薬ブランクも１７．６から１３．８
ｍＡｂｓに低下し、標準偏差も小さくなった。以上より、黄色４号を添加することにより
、添加しない場合に認められた装置間差が解消された。

〔実施例１２〕色素添加の効果
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５００ｍＭＮａＣｌ
０．０５％ＮａＮ₃
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
各種色素
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１２Ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来：大和化成）

日本電子ＢＭ１６５０自動分析装置を用いた。
パラメータは、以下のように設定した。
分析方式に「ＥＰＡ」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二試薬添
加後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞれ
１２μｌ／１２０μｌ／２４μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、３
８−４１ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては４４−４７、９５−９８ポイン
トを用いた。測定主波長は６５８ｎｍ、測定副波長は８０５ｎｍ。
また、計算方式にはＡＢＳを選び、吸光度値として出力させた。

（操作）
上記組成よりなる第一試薬に、食用赤色２号、赤色１０２号、黄色４号（三栄源エフエ
フアイ）をそれぞれ０．０２５ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ添加したものを調製し
た。対照に色素を添加しないものをおいて、これら４種類の第一試薬に対して、それぞれ
蒸留水、および市販ＨｂＡ１ｃコントロール（ＨｂＡ１ｃ％が１０％。Ｈｂ濃度が２ｍｇ
／ｍｌになるように溶解）を検体として２０回測定した。蒸留水については吸光度を測定
しこれを試薬ブランクとした。また、ＨｂＡ１ｃコントロールについては、蒸留水の値を
差し引いた差し引き吸光度を総ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ測定パラメータそれぞれに対
して吸光度値として出力させた。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、ＣＶ％
を算出し、結果を表１２に示した。
表１２に示したように、総ヘモグロビンの測定値には色素添加の影響はなかった。一方
、ＨｂＡ１ｃの測定値については、色素無添加の試薬ブランクが２６．４ｍＡｂｓである
のに対して、色素を添加したものはいずれも１２−１５ｍＡｂｓの値と小さく、しかも標
準偏差、ＣＶ％ともに、色素無添加のものに比べて小さく、測定精度が向上したことが示
された。また、ＨｂＡ１ｃコントロールについて、試薬ブランクを差し引いた吸光度は色
素無添加の約７−８割程度に低下していたが、標準偏差、ＣＶ％ともに、色素無添加のも
のに比べて小さかった。

〔実施例１３〕
（第一試薬）
４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５００ｍＭＮａＣｌ
０．０５％ＮａＮ₃
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
各種色素
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１２ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来：大和化成）

日本電子ＢＭ１２自動分析装置を用い、パラメータは実施例１２と同様の設定で実施し
た。
第一試薬に、食用赤色４０号、黄色４号、およびオレンジＧをそれぞれ０．０５ｍＭ、
０．４ｍＭ、１．２５ｍＭ添加したものを調製した。対照に色素を添加しないものをおい
て、これら４種類の第一試薬に対して、市販超低値ＨｂＡ１ｃコントロール（ＨｂＡ１ｃ
％が１．５％でＨｂ濃度が２ｍｇ／ｍｌ）を検体として２０回測定した。蒸留水を検体の
変わりに測定しこれを試薬ブランクとした。また、ＨｂＡ１ｃコントロールについては、
蒸留水の値を差し引いた差し引き吸光度をＨｂＡ１ｃ測定パラメータに対して出力させた
。吸光度の最大値、最小値、差平均値、標準偏差、ＣＶ％を算出し、結果を表１３に示し
た。
ＨｂＡ１ｃの測定値について、試薬ブランクは色素無添加の４０．５ｍＡｂｓであるの
に対して、色素を添加したものはいずれも１０〜１３ｍＡｂｓの値と小さく、しかも標準
偏差、ＣＶ％ともに、色素無添加のものに比べて小さかった。また、超低値ＨｂＡ１ｃコ
ントロールについて、試薬ブランクとの差は色素無添加のものは試薬ブランクよりも小さ
くマイナス値となり、標準偏差が０．３３５であるのに対し、色素添加のものは、試薬ブ
ランクとの吸光度差は試薬ブランクよりも僅かに大きく、標準偏差も小さくなり、測定の
ばらつきが改善されたことが示された。

〔実施例１４〕免疫法との比較（色素添加効果の確認）
（第一試薬）
４０ｍＭＢＥＳ（ｐＨ７．２）
０．０５％ＮａＮ₃
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
黄色４号
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１５ｋｕ／ｍＬプロテアーゼ（リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６由来）

日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、フッ化ナトリウム採血管により採取された血液
検体を用い以下のように測定した。

（免疫法）
「デタミナーＨｂＡ１ｃ」（協和メデックス株式会社）を用い、添付文書に従い測定した
。検体は血球を所定のＨｂＡ１ｃ測定用検体希釈液にて、１０１倍希釈して測定に用いた
。

（本発明法）
第一試薬にケトアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼを、第二試薬（遮光ボトル容器
を使用）にＤＡ−６７と還元剤（亜硫酸ナトリウム）とプロテアーゼを含む組成の試薬を
用いた。試薬ブランクを低下させ、測定精度を保つための色素として、黄色４号を第一試
薬に加えたもの、および加えないものを比較した。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Ｈｂ濃度
を、第二試薬添加後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬
の量はそれぞれ２０μｌ／１８０μｌ／４５μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイ
ントとして、１４ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを
用いた。また、総ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ濃度ともに、主波長６６０ｎｍ、副波長８０
０ｎｍにて測光した。検体は遠心分離（１５００Ｇｘ５分）後の血球を蒸留水で７１倍希
釈したものを用いた。
検量は、ＨｂＡ１ｃ測定用標準物質ＪＣＣＬＳＣＲＭ−００４ａ（ＨＥＣＴＥＦＳ
ＲＣ）を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、ＨｂＡ１ｃ濃度はＣＲＭ−０
０４ａのＨｂＡ１ｃ（％）表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブ
レーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。

（結果）
表１４に示したように、色素添加により、ＨｂＡ１ｃのシグナルは無添加に比べて２〜
３割低下するが、試薬ブランクは、１１．５ｍＡｂｓと約半分に低下する。
２０種類の検体を用いた時の免疫法（Ｘ）と酵素法（Ｙ）との相関式は黄色４号無添
加の場合は、ｙ＝０．９９９７ｘ−０．１３８、Ｒ２＝０．９５５、また添加の場合は、
ｙ＝０．９９２７ｘ＋０．０２４６、Ｒ２＝０．９８８４であった（図５、６）。免疫法
との相関係数は、本発明の黄色４号添加の方が高いことから、色素添加によりＨｂＡ１ｃ
（％）がより正確に測定できることが示された。

〔実施例１５〕液状試薬の安定性過酷試験
（第一試薬）
３０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
５００ｍＭＮａＣｌ
０．０５％ＮａＮ₃
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミン
オキシダーゼ）
０．６ｍＭ黄色４号（三栄源エフエフアイ）
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１２ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ由来：大和化成）

測定には、日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二試薬添加後
の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞれ１８
μｌ／１８０μｌ／３６μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、１４ポ
イントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを用いた。
測定結果は、吸光度で表した。

（ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動）
上記反応液（第二試薬は遮光ボトル容器中に保存）を用い、市販のヘモグロビンコント
ロール（ＶＬ（３．５％）、Ｌ（４．８％）、Ｈ（１０．５％）、ＶＨ（１６．８％）お
よびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびＨｂＡ１ｃの感度を吸光度とし
て測定した。第一試薬、第二試薬ともに冷蔵または３７℃に２週間保存後、３７℃に保存
した第一試薬には冷蔵保存した第二試薬（表中、Ｒ-２を過酷）を、また３７℃に保存し
た第二試薬に対しては冷蔵保存した第一試薬（表中、Ｒ-1を過酷）を、また対象には両試
薬ともに冷蔵保存したもの（表中、冷蔵）を用いた。
表１５より、総ヘモグロビンのシグナルは９９％以上、ＨｂＡ１ｃのシグナルも９４％
以上残存していた。表１５のなかで括弧内の数字はサンプル中のヘモグロビン濃度（ｍｇ
／ｍｌ）である。また、試薬ブランクについても、ロイコ型色素ＤＡ−６７を含む第二試
薬を３７℃２週間処理した後においても上昇は認められなかった。

〔実施例１６〕液状試薬の安定性
（第一試薬）
３０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
５００ｍＭＮａＣｌ
０．０５％ＮａＮ₃
０．５ｍＭ塩化カルシウム
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオ
キシダーゼ）
０．６ｍＭ黄色４号
（第二試薬）
１００ｍＭＨＥＰＥＳ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１２Ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来：大和化成）

測定には、日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い以下のパラメータで測定した。
測定モードとして、「３ポイント」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Ｈｂ濃度を
、第二試薬添加後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の
量はそれぞれ１８μｌ／１８０μｌ／３６μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイン
トとして、１４ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては１６、３４ポイントを用
いた。

（ヘモグロビンコントロールおよびプール検体の感度の変動）
上記反応液（第二試薬は遮光ボトル容器中に保存）を用い、市販のヘモグロビンコント
ロール（ＶＬ（３．５％）、Ｌ（４．８％）、Ｈ（１０．５％）、ＶＨ（１６．８％）お
よびプール検体をサンプルに用い、総ヘモグロビンおよびＨｂＡ１ｃの感度を測定した。
第一試薬、第二試薬を調製直後、そして冷蔵状態で６ヶ月保存した後の２回測定した。検
量はＨｂＡ１ｃ測定用標準物質ＪＣＣＬＳＣＲＭ−００４ａ（ＨＥＣＴＥＦＳＲＣ）
を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、ＨｂＡ１ｃ濃度はＣＲＭ−００４ａ
のＨｂＡ１ｃ（％）表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて計算し、自社キャリブレータ
ーに値をトランスファーし、これを用いて計算した。
表１６より明らかなように、６ヶ月保存後の値は、総ヘモグロビン濃度、ＨｂＡ１ｃ濃
度、ＨｂＡ１ｃ（％）ともに、調製直後の値と同等であった。また、試薬ブランクも上昇
していなかった。

〔実施例１７〕全血を用いた測定
（第一試薬）
３０ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
５００ｍＭＮａＣｌ
０．０５％ＮａＮ₃
０．５ｍＭ塩化カルシウム
０．１ｍＭＡＬＰＳ（同仁化学製）
３．０％アラニネートＬＮ−３０（日光ケミカル株式会社）
１０ｕ／ｍＬパーオキシダーゼ
１０ｍＭコール酸（和光純薬株式会社）
１５ｕ／ｍＬＦＯＤ（ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミン
オキシダーゼ）
０．６ｍＭ黄色４号
１０ｕ／ｍｌアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＢ：ロシュ）
（第二試薬）
１００ｍＭＰＯＰＳＯ（８．０）
２．０％ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ
）
０．０５％ＮａＮ₃
１０ｍＭＣｈｏｌｉｃａｃｉｄ
２ｍＭ亜硫酸ナトリウム
０．１２ｍＭＤＡ−６７
１２ｋｕ／ｍＬサーモリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ由来：大和化成）
日本電子の自動分析装置ＢＭ９０２０を用いた。

（免疫法）
「デタミナーＨｂＡ１ｃ」（協和メデックス株式会社）を用い、添付文書に従い測定した
。遠心分離後の血球を用いた検体の希釈は、ＢＭ９０２０装置の希釈機構を用い、蒸留水
にて、１０１倍希釈して測定に用いた。

（本法）
分析方式に「ＥＰＡ」を選択し、第一試薬添加後の第一反応で総Ｈｂ濃度を、第二試薬
添加後の第二反応でＨｂＡ１ｃ濃度を測定する。検体／第一試薬／第二試薬の量はそれぞ
れ１２μｌ／１２０μｌ／２４μｌとし、総ヘモグロビンの測定の測光ポイントとして、
２６−２８ポイントを、ＨｂＡ１ｃの測光ポイントとしては２９−３２、６２−６５ポイ
ントを用いた。測定主波長は、Ｈｂは５９６ｎｍを、ＨｂＡ１ｃは６５８ｎｍを用い、測
定副波長は８０５ｎｍとした。
上記反応液（第二試薬は遮光ボトル容器中に保存）を用い、血糖用採血管で採血した検
体を用いた。検体は測定前に転倒混和した後装置にセットし、装置の希釈機構により蒸留
水にて３４倍に希釈した。検量はＨｂＡ１ｃ測定用標準物質ＪＣＣＬＳＣＲＭ−００４
ａ（ＨＥＣＴＥＦＳＲＣ）を用い、総ヘモグロビン濃度はシアンメト法により、ＨｂＡ
１ｃ濃度はＣＲＭ−００４ａのＨｂＡ１ｃ（％）表示値と前記ヘモグロビン濃度を用いて
計算し、自社キャリブレーターに値をトランスファーし、これを用いて計算した。
表１７、図７より明らかなように、免疫法（血球を使用）と酵素法（全血を使用）の相
関係数はｙ＝０．９９２４ｘ＋０．１１４５、Ｒ２＝０．９８と大変良好であった。この
ことにより、遠心分離後の血球のみならず、遠心分離前の全血での状態でも測定が可能で
あることが示された。

本発明によれば、ロイコ型色素の溶液中での安定化方法及び発色反応時の非特異的発色
の軽減方法、及び前記方法を用いた糖化蛋白質分析試薬組成物を提供することができ、糖
化蛋白質の正確な測定が可能となる。

Claims

以下の１）〜５）を含み、５）は１）と一の試薬であり、２）と３）は一の試薬であることを特徴とする過酸化水素を定量するための試薬。
１）ロイコ型色素
２）極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素
３）パーオキシダーゼ
４）シクロデキストリン類
５）還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤
極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素が、オレンジＧ、オレンジＩＩ、食用赤色２号、食用赤色３号、食用赤色４０号、食用赤色１０２号、食用赤色１０４号、食用赤色１０６号、食用黄色４号、食用黄色５号より選ばれた１種以上である請求項１に記載の試薬。
ロイコ型色素が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウムである請求項１または２に記載の試薬。
請求項１〜３のいずれかに記載の過酸化水素を定量するための試薬を用いた液状で安定な糖化蛋白質測定用試薬。
ロイコ型色素として１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム又はＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン６ナトリウム、還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤、シクロデキストリン類及び糖化蛋白質に作用するプロテアーゼを含む一の試薬、パーオキシダーゼ、極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素及びケトアミンオキシダーゼを含む一の試薬を組み合わせてなる糖化蛋白質測定用試薬。
糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃであり、総ヘモグロビンを定量する第一試薬、ヘモグロビンＡ１ｃを定量する第二試薬を含み、総ヘモグロビン量に対するヘモグロビンＡ１ｃ量の割合を求める請求項４に記載の糖化蛋白質測定用試薬であって、
第一試薬が、プロテアーゼ反応促進剤、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに作用するケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、トリンダー試薬、アスコルビン酸酸化酵素及び極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含み、
第二試薬が、ヘモグロビンＡ１ｃの糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤を含む、
糖化蛋白質測定用試薬。
プロテアーゼ反応促進剤、ヘモグロビンＡ１ｃに作用してヘモグロビンＡ１ｃの糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼ、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、カタラーゼ、シクロデキストリン類及び還元性チオアルコール類及び還元性硫酸塩類からなる群より選ばれた１種以上の還元剤を含む第一試薬、ケトアミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及び極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素を含む第二試薬とからなる請求項６に記載の糖化蛋白質測定用試薬。
プロテアーゼ反応促進剤が、Ｎ−アシルアミノ酸（塩）またはＮ−アシルタウリン（塩）から選ばれた陰イオン界面活性剤であり、ケトアミンオキシダーゼがネオコスモスポラ属またはカーブラリア属由来であり、極大吸収波長が４００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲であって、かつ過酸化水素とは反応しないロイコ型色素と別の色素が黄色４号又は赤４０号又は赤１０２号であり、ヘモグロビンＡ１ｃに作用してヘモグロビンＡ１ｃの糖化β鎖末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出すことのできるプロテアーゼがバチルス属又はリゾバクター属由来であり、シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり、トリンダー試薬がＡＬＰＳ又はＡＤＰＳであり、還元剤が亜硫酸ナトリウムであり、血球を水により溶血させ、これを検体として用いることを特徴とする請求項６または７に記載の糖化蛋白質測定用試薬。