JP6590244B2 - 値付けされた物質量濃度標準物質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光相関解析を利用した生体分子等の物質量濃度(モル濃度)絶対定量法に関し、とくに、各種検査、診断の標準試料として用いる試料溶液にＳＩトレーサブルな物質量濃度を値付けする物質量濃度標準物質の値付け方法、および当該方法によって値付けされた物質量濃度標準物質に関する。

標準物質は、計測機器の校正や分析方法の評価の目的で用いられる物質であり、その中でも認証標準物質はトレーサビリティが確立された手順で認証値が付与された物質である。質量分析のような絶対定量法で値が求められ、他の標準への参照なしに値が認められる一次標準物質はアメリカのＮＩＳＴや日本の産総研のＮＭＩＪのような公的機関によって作製される。一方、二次標準物質は、一次標準(認証標準)との比較によって値が付与され紐付けされた標準物質であり、日常利用における校正・評価のためのワーキングスタンダードとして用いられる(特許文献３参照)。
蛍光相関分光法(Fluorescence correlation spectroscopy：以下略して「ＦＣＳ」と記載することがある)は、共焦点光学系を利用し、水溶液中に存在する蛍光分子がブラウン運動して生じる蛍光強度の時間ゆらぎを観測することで分子の拡散速度、数に関する情報を取得する手法として知られている(特許文献１、２等参照)。ＦＣＳはレーザー焦点領域である測定領域内の“分子数”の統計的解析にもとづき、直接物質量濃度を算出可能な数少ない方法である。ＦＣＳで得られる分子数を濃度に変換するには測定領域の体積を精確に求めることが必要である。現在、測定領域の体積はRhodamine 6Gの拡散定数(４１４μｍ²／ｓ)と測定拡散時間の関係からガウシアンプロファイルのレーザー焦点領域を仮定して求められている(後述の図３参照)。一方、濃度既知の試料の測定を通じて測定領域の体積を求める理論も提唱されている(非特許文献１参照)が、用いる試料は実験者が調製したものであり標準物質といえる物ではなかった。
他にも、分子数を定量可能な蛍光相関解析はラスター走査画像相関分光法(RICS)やNumber & Brightness(N&B)解析が存在する。

図１、２は、蛍光相関分光法(ＦＣＳ)による測定領域内の分子数の絶対定量について説明した図である。図１はＦＣＳによる測定装置の一例を説明した概略図であり、試料台上に載置した試料液滴(Sample droplet)中に、共焦点蛍光顕微鏡光学系の対物レンズ(Objective)によりレーザー光(波長４７３ｎｍ)の焦点を結ばせ、光強度の強い励起領域となる測定領域を形成し、測定領域中の分子に蛍光を発せしめ、発せられた蛍光を対物レンズの焦点と共役の位置に配置されたピンホール(Pinhole)により測定領域で発せられた蛍光のみを通過させ、フォトマルチプライヤ(ＰＭＴ)によるフォトンカウンティングで蛍光を測定し、パソコンＰＣで自己相関関数による演算を行ってデータ処理を行う。なお、図１中、ＤＭはダイクロイックミラー、Emission filter は発せられた蛍光を分離するフィルターである。開口数の高い対物レンズによって集光された測定領域の大きさは光の回折限界によって波長の半分程度のビーム半径(ｗ)、その数倍程度の軸長(ｚ)と規定される。
図２は測定領域内に存在する分子数が少ない場合と、多い場合において測定した蛍光強度(Fluorescence Intensity)の時間変化Ｉ(ｔ)と、それらの自己相関関数(Autocorrelation function)のグラフ
Ｇ(τ)＝＜Ｉ(ｔ)Ｉ(ｔ＋τ)＞／＜Ｉ(ｔ)＞²
を模式的に示したものである。式内＜＞はアンサンブル平均であることを示す。蛍光相関分光法では、微小な測定領域で低濃度の蛍光物質を観察すると、１分子がブラウン運動によって拡散し測定領域内外を出入りすることで蛍光強度シグナルにゆらぎが生じる。測定領域内に同時に存在する分子数が少ない(すなわち濃度が低い)場合には、平均蛍光強度に対してゆらぎの幅が大きくなり、一方、分子数が多い(濃度が高い)場合にはゆらぎの幅が小さくなる。分子の数を反映するこのゆらぎの幅は自己相関関数では曲線の振幅(ｙ軸)の高さで表現される。そして、原理的には自己相関関数のグラフのいわゆるｙ切片、すなわち零時間遅れのとき(τ＝０のとき)の自己相関係数の値から１を引いた値が、分子数の絶対量Ｎの逆数１／Ｎになることが知られている。また、ｘ軸で表される相関時間(τ)方向の減衰時間は分子の拡散速度、すなわち大きさを反映する。以上のパラメータは実測定では理論式に対するフィッティング解析等で求められる。

特開２０００−１６６５９８号公報 再公表ＷＯ２０１２−１４４５２８号公報 特開２００３−３２９５５１号公報

S. Ruttinger et al., J Microscopy Vol.232, pp343-352 (2008)

上記のとおり、蛍光相関分光法(ＦＣＳ)によると、測定領域内の分子数をアボガドロ数で割り付けることで物質量の絶対量(ｍｏｌ)が直接求まり、分子の形や大きさ等に影響されることがない。しかしながら、物質量濃度(ｍｏｌ／Ｌ)を求めるには測定領域の体積Ｖの正確な値が必要となるが、従来、図３に説明するように、レーザーの焦点領域は３Ｄ−ガウシアンの強度分布を持つと仮定して、蛍光色素ローダミン６Ｇ(Ｒ６Ｇ)のＦＣＳ実測値から、拡散時間τＤ＝ｗ²／４Ｄ、Ｄ：拡散定数［μｍ²／ｓ］、Ｒ６Ｇ＝４１４［μｍ²／ｓ］、Structure parameter Ｓ＝ｚ／ｗ(焦点領域は長径ｚ：短径ｗの楕円体をなす)
実効体積：Ｖ_eff＝π^3/2ω₀ ³Ｓ
で求めるしかなかった。このように算出する実効体積では、焦点領域は３Ｄ-ガウシアンの強度分布を持つという仮定を前提にしており、実際のレーザーの焦点領域は装置条件次第できれいな楕円体からゆがんでいることが容易に推測され、計算で正確に見積もることは困難である。
一般的に、日常の分析で利用されるワーキングスタンダードとなる標準物質は、多様な試料を対象とする汎用的な標準物質となる。産業界には各利用者の測定系に合った標準物質のニーズが存在するが、全ての対象試料に対して一次標準物質(認証標準物質)を作製するには膨大なコストと時間がかかるため、各試料に対し標準を揃えることは現実的でない。したがって、いかにワーキングスタンダードとなる標準物質(二次標準、三次標準等)を簡便かつ理論的正確性を持って値付けするかが重要である。二次標準等の値づけは一次標準(認証標準)と比較して行うが、例えば核酸の場合、様々な生物種や遺伝子を対象とするため、大部分の試料で対象となる核酸の配列や鎖長が異なり、一般的な吸光法等では前記比較が不正確になってしまう。
そこで、本発明では以上の状況を鑑み、試料の種類によらない物質量濃度の値付け方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、本発明では、物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)の認証値または質量濃度認証値を当該標準物質の既知分子量を用いて換算した物質量濃度もしくはそれにトレーサブルな標準物質濃度を用いてＦＣＳの測定領域体積を正確に規定することで、蛍光相関分光法(ＦＣＳ)により、試料の種類によらない標準物質の物質量濃度の値付け方法を可能にしたものである。
本発明は、ＦＣＳ測定を用いた物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)にトレーサブルな物質量濃度標準物質の値付け方法であって、
蛍光染色した物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質をＦＣＳ測定し、測定結果からＦＣＳ測定の測定領域中の分子数Ｎを求め、前記物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)の標準濃度または質量濃度認証値を当該標準物質の既知分子量を用いて換算した物質量濃度もしくはそれにトレーサブルな標準物質濃度Ｃとアボガドロ数Ｎ_Aから、前記測定領域の体積Ｖを、式
Ｖ＝Ｎ／(Ｎ_A×Ｃ)
により算出して求める工程１と、
蛍光染色した値付け対象物質をＦＣＳ測定で測定し測定結果からＦＣＳ測定の測定領域中の分子数を求め、当該求めた分子数と、前記工程１で求めた測定領域の体積Ｖから、前記値付け対象物質の物質量濃度を、式
物質量濃度＝当該求めた分子数／(Ｎ_A×Ｖ)
により算出して求めた値で物質量濃度標準物質として値付けする工程２と、
からなる物質量濃度標準物質の値付け方法である。
また、本発明は、上記物質量濃度標準物質の値付け方法において、前記物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質および前記値付け対象物質のＦＣＳ測定において、質量比混合法により希釈して測定した場合には、希釈倍率を勘案して前記測定領域の体積Ｖの算出および値付け対象物質の物質量濃度を算出することを特徴とする。
また、本発明は、上記物質量濃度標準物質の値付け方法によって値付けされた物質量濃度標準物質である。

本発明では、ＦＣＳは分子の形状等によらず分子数の定量が可能な点に特長があるため、物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質を用いてＦＣＳの測定領域体積を規定することで、鎖長や配列の異なる核酸並びにタンパク質のような様々な値付け対象標準物質に対して、迅速(分オーダー)かつ簡便(精製等のプロセス無し)に一次標準(認証標準)にトレーサブルな物質量濃度の値付けが可能になる。

図１は、本発明の値付け方法に用いるＦＣＳ測定装置の概略図である。 図２は、図１のＦＣＳ測定装置を用いて測定して得られる蛍光強度の時間変化Ｉ(ｔ)とその自己相関係数Ｇ(τ)のグラフを説明した図である。 図３は、レーザーの焦点領域がガウシアン強度分布を持つと仮定することによる従来の測定領域体積の推定法を説明した図である。 図４は、本発明の工程１：一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質による測定領域体積の測定を説明した図である。 図５は、本発明の工程２：値付け対象標準物質の物質量濃度の値付け、におけるＦＣＳ測定結果を示したグラフである。 図６は、図５の測定結果と工程１で求めた測定領域体積Ｖを使って求めた物質量濃度を縦軸に、工程２で用いた対象物質(検証のため認証標準物質を用いている)の認証濃度を横軸で表した図である。 図７は、値付け対象物質としてＲＮＡの塩基配列が異なるＲＮＡ標準溶液(ＲＮＡ５００−Ａ，Ｂ，Ｃ)、ＲＮＡの鎖長の異なるＲＮＡ標準溶液(ＲＮＡ１０００−Ａ，Ｂ)を用いて本発明の値付け方法によりＦＣＳ測定値と工程１で得られた測定領域体積の値を利用して濃度を算出し値付けした値と、標準溶液としての認証値とを比較した表に示した図である。

ＦＣＳは観察領域内の“分子数”にもとづき、直接物質量濃度を算出可能な数少ない方法である。ＦＣＳを用いれば、核酸の配列や鎖長によらず核酸分子の数を算出することができる。本発明者等は、鋭意研究の結果、物質量濃度一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質を用いてＦＣＳの測定領域体積を規定することで、試料の種類(核酸・タンパク質等)を問わず値付け対象標準物質に対して一次標準(認証標準)にトレーサブルな物質量濃度の値付けが可能であることを見出し、本発明に至ったものである。

（工程１：一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質による測定領域体積の算出）
本発明の工程１の一次標準物質(認証標準物質)もしくはそれにトレーサブルな標準物質による測定領域体積の算出では、従来の拡散定数からの推定ではなく、直接既知濃度の色素溶液(標準物質)をＦＣＳ測定することで、測定領域体積を精確に見積った。本発明の工程１によれば、測定領域の形状を考慮する必要が無く、体積のみを精確に求めることができる。前記既知濃度の標準物質は蛍光染色した核酸標準物質を用いても良い。
図４は、本発明の工程１の一例を示したものであり、この例では、ＦＣＳ測定領域体積を求めるための標準物質(一次標準物質にトレーサブル)としてフルオレセイン物質量濃度標準溶液(Fluorescein NIST Traceable：Life Technologies社製)を利用した。この溶液を質量比混合法により測定濃度Ｃに希釈しＦＣＳ測定に供した。得られた測定領域内の平均分子数Ｎの値と試料調製濃度Ｃから、ＦＣＳ測定領域体積ＶをＶ＝Ｎ／(Ｎ_A×Ｃ)より算出した。ここでＮ_Aはアボガドロ数である。図４中の実測例では、Ｎ＝１２.１、Ｃ＝５２ｎＭであるので、最終的にＶ＝０.３９０ｆＬが得られた。この値はレーザー発振や光学系の条件、すなわち気温や湿度等の環境要因に影響されうるため装置調整回毎に測定する必要がある。
なお、フルオレセインは非常にガラス等への吸着が少ないため標準溶液に向いているが、ｐＨ依存的に蛍光強度が変化するという特徴をもつ。フルオレセインの蛍光強度はアルカリ性に最適値と持つため、希釈バッファーには１００ｍＭホウ酸バッファー(ｐＨ９.５)を用い、ｐＨを一定に保った。

（工程２：二次標準物質の物質量濃度の値付け）
本発明の工程２では、上記工程１により算出したＦＣＳ測定領域体積Ｖを使って、被値付け物質に対して物質量濃度二次標準物質としての物質量濃度の値付けをＦＣＳ測定により行う。
ここでは、本発明の値付け方法の説明と同時に、本発明の値付け方法の妥当性をも検証可能とするために、被値付け物質として、本出願人のバイオメディカル研究部門および物質計測標準研究部門で開発したＲＮＡ標準溶液(NMIJ CRM6204-a)を用いた例で説明する。このＲＮＡ標準溶液は、一次標準物質(認証標準物質)であり、この物質を複数の異なる濃度に希釈したものに対して、本発明の値付け方法で物質量濃度標準として値付けした値を、一次標準物質(認証標準物質)としての認証値と比較することにより本発明の値付け方法の妥当性が検証できる。
このＲＮＡ標準溶液(以下「ＲＮＡ５００−Ａ」等と記載することがある)を質量比混合法によって４つの混合比で希釈した試料を用い、核酸定量用のプローブであるQuant-iT RiboGreen RNA Assay kit(Life Technologies社製)で蛍光染色してＦＣＳ測定して得られた自己相関関数Ｇ(τ)のグラフを図５に示す。ｘ軸は相関時間(τ)、ｙ軸は相関関数値を表す。図５のグラフをそれぞれ理論式でフィッティング解析することで測定領域中の分子数Ｎが求まる。なお、図５中のＲＮＡ５００Ａ ４４.５ｎｍｏｌ／Ｌ、２２.３ｎｍｏｌ／Ｌ、１１.１ｎｍｏｌ／Ｌ、５.５６ｎｍｏｌ／Ｌは、ＲＮＡ標準溶液を希釈した４種類の試料の物質量濃度を表しており、４本のグラフはそれぞれに対応している。
図５の自己相関関数Ｇ(τ)のグラフから得られた測定領域中の分子数を、工程１で得られた測定領域体積Ｖの値(Ｖ＝０.３９０ｆＬ)で割り算して得た物質量濃度、すなわち１リットル当たりのＲＮＡモル数をプロットしたのが図６のグラフであり、図６の横軸がＲＮＡ標準溶液の認証値から得られる物質量濃度(ｎｍｏｌ／Ｌ)、縦軸がＦＣＳ測定から算出した本発明による値付け値となる物質量濃度(ｎｍｏｌ／Ｌ)を表し、実線(横軸の値＝縦軸の値を表す直線)上に載れば両者は完全に一致するといえ、図６からは本発明の値付け方法によってＦＣＳ測定で導き出された測定定量値はＲＮＡ標準溶液の認証値と誤差の範囲で一致していることがわかる。

図７は、さらに、被値付け標準物質としてＲＮＡの塩基配列が異なるＲＮＡ標準溶液(ＲＮＡ５００−Ａ，Ｂ，Ｃ)、ＲＮＡの鎖長の異なるＲＮＡ標準溶液(ＲＮＡ１０００−Ａ，Ｂ)を用いて本発明の値付け方法によりＦＣＳ測定値と工程１で得られた測定領域体積の値を利用して濃度を算出し値付けした値と、標準溶液としての認証値とを比較した図である。本測定例では、ＲＮＡ標準物質の認証値が質量濃度(ｇ／Ｌ)で与えられていたため、ＦＣＳで値付けした物質量濃度(図７右)に、既知である当該ＲＮＡの分子量をかけて質量濃度に換算した後に比較した(図７左)。図７から、いずれの試料でも図６と同様に物質量濃度を決定することができ、本発明によるＦＣＳ測定を用いた値付け方法では、核酸の配列や鎖長を選ばず精確な定量値を導出することが示された。
なお、本発明の値付け用法に用いる標準物質、および被値付け対象となる二次標準物質の試料としては、蛍光標識さえ可能であれば核酸のみならずタンパク質、小分子等多様な標的物質に適用可能である。

ＦＣＳは分子の形状等によらず分子数の定量が可能であるので、本発明で用いる物質量濃度標準物質および被値付け物質量濃度標準物質としては、蛍光標識さえ可能であれば核酸のみならずタンパク質、小分子等多様な標的物質に適用可能である。また、本発明によれば、様々な標準物質に対して、迅速(分オーダー)かつ簡便(精製等のプロセス無し)に一次標準(認証標準)にトレーサブルな濃度の値付けが可能になることから、広く産業界で利用される様々なワーキングスタンダードの構築に威力を発揮し、バイオ測定の標準化に大いに貢献するものである。

Claims (2)

1. ＦＣＳ測定を用いた物質量濃度一次標準物質もしくは認証標準物質にトレーサブルな下位の物質量濃度標準物質の製造方法であって、
   蛍光染色した物質量濃度一次標準物質、認証標準物質もしくはそれにトレーサブルな標準物質をＦＣＳ測定し、測定結果からＦＣＳ測定の測定領域中の分子数Ｎを求め、前記物質量濃度一次標準物質、認証標準物質の認証物質量濃度もしくはそれにトレーサブルな標準物質濃度Ｃとアボガドロ数Ｎ_Aから、前記測定領域の体積Ｖを、次式
   Ｖ＝Ｎ／(Ｎ_A×Ｃ)
   により算出して求める工程１と、
   蛍光染色した値付け対象物質をＦＣＳ測定で測定し測定結果からＦＣＳ測定の測定領域中の分子数を求め、当該求めた分子数と、前記工程１で求めた測定領域の体積Ｖから、値付け対象物質の物質量濃度を、次式
   物質量濃度＝当該求めた分子数／(Ｎ_A×Ｖ)
   により算出して求めた値で物質量濃度標準物質として値付けする工程２と、
   を含み、
   前記物質量濃度一次標準物質、認証標準物質、物質量濃度標準物質および標準物質が核酸である、
   物質量濃度標準物質の製造方法。
2. 前記物質量濃度一次標準物質、認証標準物質もしくはそれにトレーサブルな標準物質および前記値付け対象物質のＦＣＳ測定において、質量比混合法により希釈して測定した場合には、希釈倍率を勘案して前記測定領域の体積Ｖの算出および値付け対象物質の物質量濃度を算出することを特徴とする請求項１に記載の物質量濃度標準物質の製造方法。

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