JPS6066994A - 発色試液の安定化方法 - Google Patents
発色試液の安定化方法Info
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- JPS6066994A JPS6066994A JP17253083A JP17253083A JPS6066994A JP S6066994 A JPS6066994 A JP S6066994A JP 17253083 A JP17253083 A JP 17253083A JP 17253083 A JP17253083 A JP 17253083A JP S6066994 A JPS6066994 A JP S6066994A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、発色基質を用いて過酸化Ｔ’ｌヂ素活１イ１
．を測定するに当り、ポスポン酸系キレ−１・ｉ′ｉｌ
Ｉを安〉ビ化削として用いることを特徴とする発色試液
の安定化方法に関１−るものである。
．を測定するに当り、ポスポン酸系キレ−１・ｉ′ｉｌ
Ｉを安〉ビ化削として用いることを特徴とする発色試液
の安定化方法に関１−るものである。
一般に臨・１床化学の分！ｌｊ７．では、Ｊ大病の診断
、′ＩＩ’４１．１−二把渥等の目的で、生体試料（１
１１０Ｉ１１、尿、組織ｌイ）１．雪）中の生理活性物
質（例えば、酵素、脂質、蛋白質等）の測定か広く行な
イっれている。
、′ＩＩ’４１．１−二把渥等の目的で、生体試料（１
１１０Ｉ１１、尿、組織ｌイ）１．雪）中の生理活性物
質（例えば、酵素、脂質、蛋白質等）の測定か広く行な
イっれている。
過酸化酵素は、この臨床検査の分野に於て、従来より酸
化酵素として広く用いらオｔでいる酵素の１ってあり、
最近では、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ ）に代る
高感度測定法として注目されている酵素免疫測定法（Ｅ
ｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ 、以下Ｅ Ｉ
Ａと略称する）の標識酵素としても広く使用さり、微量
の免疫成分、例えば、インスリン、グルシカコン、−リ
”イロ４−シン等のホｌレモンや、ＩｇＦ；、α−−−
）エトプロティン、ＣＥＡ等の筒分子生理活性物質の検
出に役立っている。１！Ｅ Ｉ Ａは感度、並びｔこ局
光性の高い免疫測定法であるが、その側だ対象物は通常
生体試ｔｌ中では微量であり、これに７・１応して標ｌ
ａ酵素＋Ｉニーも微量となるため、その検出に計高感度
の発色試薬が安水される。
化酵素として広く用いらオｔでいる酵素の１ってあり、
最近では、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ ）に代る
高感度測定法として注目されている酵素免疫測定法（Ｅ
ｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ 、以下Ｅ Ｉ
Ａと略称する）の標識酵素としても広く使用さり、微量
の免疫成分、例えば、インスリン、グルシカコン、−リ
”イロ４−シン等のホｌレモンや、ＩｇＦ；、α−−−
）エトプロティン、ＣＥＡ等の筒分子生理活性物質の検
出に役立っている。１！Ｅ Ｉ Ａは感度、並びｔこ局
光性の高い免疫測定法であるが、その側だ対象物は通常
生体試ｔｌ中では微量であり、これに７・１応して標ｌ
ａ酵素＋Ｉニーも微量となるため、その検出に計高感度
の発色試薬が安水される。
一般に過酸化酵素の検出及び’ｊｊｌ ｆｆｌは、次の
ような反Ｌｌ−１に従って行４ｆわれている。
ような反Ｌｌ−１に従って行４ｆわれている。
（］）］過酸化酵素−１＝水素受６体＝世コンプレック
ス結合体） （２）コンプレ７クス（結合体）＋Ａ１−１２（水素Ｉ
）’ニー’ｉ体）；＝Ａ（酸化物；呈色色素） −１−
２）−１，０＋酵素水素受容体としては過酸化水素（１
１，０２）がノ１シも優れており、一方、水素化Ｊｊ体
は比色θ、ミに於てロクロモーゲン（色原間）を含むこ
と、即ら、りＩＪ七−ゲン基質（発色基質）であること
が要求され、通常は、フェノール額（クアヤコール、−
）−フト−ルなと）及び芳香族アミン類（・＼メチレノ
、０−フェニレンノアミンなと）かよく用いらスしてい
る。
ス結合体） （２）コンプレ７クス（結合体）＋Ａ１−１２（水素Ｉ
）’ニー’ｉ体）；＝Ａ（酸化物；呈色色素） −１−
２）−１，０＋酵素水素受容体としては過酸化水素（１
１，０２）がノ１シも優れており、一方、水素化Ｊｊ体
は比色θ、ミに於てロクロモーゲン（色原間）を含むこ
と、即ら、りＩＪ七−ゲン基質（発色基質）であること
が要求され、通常は、フェノール額（クアヤコール、−
）−フト−ルなと）及び芳香族アミン類（・＼メチレノ
、０−フェニレンノアミンなと）かよく用いらスしてい
る。
生成する：”ａ化物を正確に１ｌｌｌｌ定するためには
、酵素変成剤又は不司逆的抑制剤、例えば、Ｊｊ Ｃ１
，１１２ＳＯ，、Ｎａ Ｎ３又はＮａ ｌ；”を導入し
て、酵素−基ｑ′↓反応を停止さぜれ（−１よい。
、酵素変成剤又は不司逆的抑制剤、例えば、Ｊｊ Ｃ１
，１１２ＳＯ，、Ｎａ Ｎ３又はＮａ ｌ；”を導入し
て、酵素−基ｑ′↓反応を停止さぜれ（−１よい。
ところで、倣）ｉ（′の過酸（１實・Ｉそ素を検出する
場合、例えば、Ｅ Ｉ Ａ智に於ては、１１ｊ」感度の
光色基Ｊｊｌ↓を用いる必要があり、現在、最も高感度
ｆ、ｆ児色基りＪｌとしてＯ−フエニレンソアミン（ｕ
’−Ｔ’ （Ｊ Ｐ Ｉ） ト１１１３称する）が重
用されて）いる。Ｉ！＋Ｉも５本発明者らの認識によれ
ばＯＬ） Ｄは他の光色基り′↓と比Ｉ改し−Ｃ−レな
くとも１０倍以上の感度をイＪしている。しかしｔｏＩ
：がら、Ｏｆ） Ｄは溶液中では極めて不安定であり、
共イｆする金属イオン、溶存酸素、更には光等により容
易に酸化を受け、その結果、ハックグラウンド゛が不安
ボて５実際の過酸化酵素の検出に於て著しい測定誤差を
生じやすいものであった。このため使用に際しては、反
応容器を塩酸洗浄して金属を除いたり、暗箱中で反応を
行なって光の影響を避けたり、史には、溶解後の使用時
間を制限したりしているのが実情である。このように、
０Ｐ１）は極めて高感度で有用である反面、使用上の制
限が多い発色基質であり、その安定化法が強く波望さノ
していた。
場合、例えば、Ｅ Ｉ Ａ智に於ては、１１ｊ」感度の
光色基Ｊｊｌ↓を用いる必要があり、現在、最も高感度
ｆ、ｆ児色基りＪｌとしてＯ−フエニレンソアミン（ｕ
’−Ｔ’ （Ｊ Ｐ Ｉ） ト１１１３称する）が重
用されて）いる。Ｉ！＋Ｉも５本発明者らの認識によれ
ばＯＬ） Ｄは他の光色基り′↓と比Ｉ改し−Ｃ−レな
くとも１０倍以上の感度をイＪしている。しかしｔｏＩ
：がら、Ｏｆ） Ｄは溶液中では極めて不安定であり、
共イｆする金属イオン、溶存酸素、更には光等により容
易に酸化を受け、その結果、ハックグラウンド゛が不安
ボて５実際の過酸化酵素の検出に於て著しい測定誤差を
生じやすいものであった。このため使用に際しては、反
応容器を塩酸洗浄して金属を除いたり、暗箱中で反応を
行なって光の影響を避けたり、史には、溶解後の使用時
間を制限したりしているのが実情である。このように、
０Ｐ１）は極めて高感度で有用である反面、使用上の制
限が多い発色基質であり、その安定化法が強く波望さノ
していた。
不発町名らは、上記の如き欠点を改良すへく鋭惹研冗を
重ね１こ結果、ＯＰ１〕溶液を不安定にする要因が、特
に微量の第二鉄イオン（Ｆｅ” ）及Ｑ・第二銅イオン
（Ｃｕ”−）にあることをつきとめ、ＯＰ Ｉ）ｍ液に
ポスポン酸系キレ−１・剤を添加せしめ金属イオンを一
／スクすることにより、該発色試液カ著し、く安定化さ
れることを見い出し、本発明を完成するに到った。
重ね１こ結果、ＯＰ１〕溶液を不安定にする要因が、特
に微量の第二鉄イオン（Ｆｅ” ）及Ｑ・第二銅イオン
（Ｃｕ”−）にあることをつきとめ、ＯＰ Ｉ）ｍ液に
ポスポン酸系キレ−１・剤を添加せしめ金属イオンを一
／スクすることにより、該発色試液カ著し、く安定化さ
れることを見い出し、本発明を完成するに到った。
即ち、本発明は、過酸化水素及び発色シ１１−質を用い
て過酸化酵素活性を測定するに当り、ホスホノ酸系キレ
ート剤を発色試液と組合わせて月１いることにより、そ
の目的が達成さノするものて、木光明者らの独自の知見
に基き、独自の溝成に、ｊ；り冗成され１こ顕著な効果
を有する発明である。
て過酸化酵素活性を測定するに当り、ホスホノ酸系キレ
ート剤を発色試液と組合わせて月１いることにより、そ
の目的が達成さノするものて、木光明者らの独自の知見
に基き、独自の溝成に、ｊ；り冗成され１こ顕著な効果
を有する発明である。
本発明ｔこ使用されるホスホノ酸系−１−レート削とは
、例工ば、アル−１−ル（Ｃ１〜８）ホスオノ酸及びそ
のＩｕ （Ｎａ、１く、＋Ｖ］ｇ ％ Ｍ 、１１１、
Ｓｌｌ、Ｃａ １、アルキル（Ｃ３（１〜１００）チオ
ホスホンＩＭ２ ／ ＜リツｔ１．２−りＩＪ ｌコニ
チルホスホノｆ唆、−ｊ′ミ／］−クツホスポン酸、二
１−１ｊ口 トリス メチレノ ホスホン酸、二１・ｉ
口 １リスノクン Ｉ・リホスホノ酸す１・＋１ツ１１
塩、ニドすｔｊトリス ノチレノポスホン酸すトリワム
、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’ −−１トラ−１＝ス（ホス７ト
ノメテル）Ｊニチレンソつ′ミノ、上−ブーレノンアミ
ノ四ホスポン酸ヒトう／ノ＠ｉｊ体、１．２− Ｐス（
Ｎ、Ｎ −１ニスホスボツメチｌし）つ′ミノー１−ク
ノリートリウム塩、ホスポノニｊハクｉ灸す１・り鳴ツ
ノ、及（）・２−ボスポノフクン−１，２，４−トリカ
ル７ｊ−ン醒及υ・そのプートリツｊ１塩などのホスホ
ン酸系−Ｙ−レート斉１１て−旧こ有効な化合物として
は、■−ヒトロキシエチリテンー１，１−ジホスホン酸
及びそのナト１」ラム塩、ニトリロ トリス メチレン
；１１ス、ｊ二ン酸などが挙げられる。これらキレ−
１−首１］は＄ ’ＩＪ（で用いても、また、２種以上
のキレート首１［をイＪトＩＴ］ シて用いてもかまわ
ない。また、そＱ〕添力Ｏｈｊとしては、過酸化酵素活
性を阻害しなし）饋度であ才しは゛よく、ホスホノ酸誘
導体の１！１り〕“１により多／Ｊ＞異なる力・、１−
ヒトロニ１−シエチリテンー１．１−ジ１１スフ１１ン
酸及ヒそのすトリウム塙ては、通常０．０５〜２．０Ｗ
／Ｖ％である。ホスホン醪系以夕１のキレ−１・斉１ｊ
、例えば、ＪＣＩ） Ｔ Ａ −２Ｎａ 、アセチルア
セトンリフルオルテノイルアセ！・ン等は、金属イＡ−
ンＱ）マス；１−ンクには有効であるが、発色試液σ）
ｊ１分二液長に影響を力えるので好まし，くなＧ）。
、例工ば、アル−１−ル（Ｃ１〜８）ホスオノ酸及びそ
のＩｕ （Ｎａ、１く、＋Ｖ］ｇ ％ Ｍ 、１１１、
Ｓｌｌ、Ｃａ １、アルキル（Ｃ３（１〜１００）チオ
ホスホンＩＭ２ ／ ＜リツｔ１．２−りＩＪ ｌコニ
チルホスホノｆ唆、−ｊ′ミ／］−クツホスポン酸、二
１−１ｊ口 トリス メチレノ ホスホン酸、二１・ｉ
口 １リスノクン Ｉ・リホスホノ酸す１・＋１ツ１１
塩、ニドすｔｊトリス ノチレノポスホン酸すトリワム
、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’ −−１トラ−１＝ス（ホス７ト
ノメテル）Ｊニチレンソつ′ミノ、上−ブーレノンアミ
ノ四ホスポン酸ヒトう／ノ＠ｉｊ体、１．２− Ｐス（
Ｎ、Ｎ −１ニスホスボツメチｌし）つ′ミノー１−ク
ノリートリウム塩、ホスポノニｊハクｉ灸す１・り鳴ツ
ノ、及（）・２−ボスポノフクン−１，２，４−トリカ
ル７ｊ−ン醒及υ・そのプートリツｊ１塩などのホスホ
ン酸系−Ｙ−レート斉１１て−旧こ有効な化合物として
は、■−ヒトロキシエチリテンー１，１−ジホスホン酸
及びそのナト１」ラム塩、ニトリロ トリス メチレン
；１１ス、ｊ二ン酸などが挙げられる。これらキレ−
１−首１］は＄ ’ＩＪ（で用いても、また、２種以上
のキレート首１［をイＪトＩＴ］ シて用いてもかまわ
ない。また、そＱ〕添力Ｏｈｊとしては、過酸化酵素活
性を阻害しなし）饋度であ才しは゛よく、ホスホノ酸誘
導体の１！１り〕“１により多／Ｊ＞異なる力・、１−
ヒトロニ１−シエチリテンー１．１−ジ１１スフ１１ン
酸及ヒそのすトリウム塙ては、通常０．０５〜２．０Ｗ
／Ｖ％である。ホスホン醪系以夕１のキレ−１・斉１ｊ
、例えば、ＪＣＩ） Ｔ Ａ −２Ｎａ 、アセチルア
セトンリフルオルテノイルアセ！・ン等は、金属イＡ−
ンＱ）マス；１−ンクには有効であるが、発色試液σ）
ｊ１分二液長に影響を力えるので好まし，くなＧ）。
）！ＩＩも、、４，： ’＋乙明に於て使用しイ４）る
マスキンク剤としてｌｄ，：Ｊ酸化酵素活性に影響がな
いこと、及び有効＆ ＋）Ｊ−て片１色しないことが必
須要件であり、Ｎ＝〜：す］３名らは、Ｆｅ Ｎ＋及び
ＣＩＩ ２’ｔ−の各独マスキンクー剤０）＋１１で，
１【−明のホスポン酸系キレ−１−剤のみが本発明の目
的を達し得るものであることを実験によってＣ１１゛認
した。
マスキンク剤としてｌｄ，：Ｊ酸化酵素活性に影響がな
いこと、及び有効＆ ＋）Ｊ−て片１色しないことが必
須要件であり、Ｎ＝〜：す］３名らは、Ｆｅ Ｎ＋及び
ＣＩＩ ２’ｔ−の各独マスキンクー剤０）＋１１で，
１【−明のホスポン酸系キレ−１−剤のみが本発明の目
的を達し得るものであることを実験によってＣ１１゛認
した。
発色試液の液性は、ｐＨ４〜９の範囲てあｉシば、通常
特に問題はないが、中でもＩ） Ｈ ４〜６のｉｊｊ：
ｊ囲が好ましく、またその為の緩衝剤としては、過酸化
酵素活性を阻害しないものであれば自体公知の緩衝剤、
例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グンド緩（！ｌ
ｉｉ液などがガタ１なく用いら）しるが、、＋１（１常
クエン酸−リン酸緩佃Ｊ散がよくハ］いられ５そのセル
濃度は０．０］〜０．２Ｍが好ましい。
特に問題はないが、中でもＩ） Ｈ ４〜６のｉｊｊ：
ｊ囲が好ましく、またその為の緩衝剤としては、過酸化
酵素活性を阻害しないものであれば自体公知の緩衝剤、
例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グンド緩（！ｌ
ｉｉ液などがガタ１なく用いら）しるが、、＋１（１常
クエン酸−リン酸緩佃Ｊ散がよくハ］いられ５そのセル
濃度は０．０］〜０．２Ｍが好ましい。
ポスホン酸系−１−シー１−削のイ征加時期とし一Ｃに
、少ｊ、Ｃくとも酵素反応の際にその系内にイＩ（１す
）′Ｌばよく、発色基質のにり解用溶媒中にあらかしめ
添加するのが最も好ましい。
、少ｊ、Ｃくとも酵素反応の際にその系内にイＩ（１す
）′Ｌばよく、発色基質のにり解用溶媒中にあらかしめ
添加するのが最も好ましい。
このように過酸化水素及び発色基′Ｊ）１、／Ｉ，ｌに
ＯＰＪ）を月」いて過酸化酵素活性をｉｌ１口Ｊｌする
にｌ′＋ ’ｒＥ、本発明の方法、即ちホスホン酸系−
１−レ−１・削を′！ｌ：カニ化剤として用いることに
より、発色試液が治しく安定化され、ｌ腎素の検出も極
めて正イ１了１に１’； Ｌ イｉ＃る。
ＯＰＪ）を月」いて過酸化酵素活性をｉｌ１口Ｊｌする
にｌ′＋ ’ｒＥ、本発明の方法、即ちホスホン酸系−
１−レ−１・削を′！ｌ：カニ化剤として用いることに
より、発色試液が治しく安定化され、ｌ腎素の検出も極
めて正イ１了１に１’； Ｌ イｉ＃る。
更に又本発明の方法は発色試液の在霧に幻しても顕著な
効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ沫だ大
１Ｌ′るものがある。
効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ沫だ大
１Ｌ′るものがある。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明の範囲はここに使用されている特定の酵ふ及び発色
基質に制限されるものでなＩ／）こ・とは云うまでもな
い。即ち、他の過酸化酵素、例えハ、ラクトベルオキシ
ターゼ、ミエロペルオキシクーゼ、グルタチオンベルオ
キシグーゼ、ナトりｔａ − ｌｘ Ｃベルオキシター
ゼ及びこの蛋白分電酵素による分解産物であるミクロペ
ルオキシターセなども西洋ノ”リーヒ過ｉＰＪ ！”１
． ＩＩＹ素と同じく適当てあり、り月こは他の芳香，
゛ ノ類の発色基質、例え＆″．［、０−ノアニシジン
、ヘノチジン、ビロカロール、Ｎ，Ｎ−ツメチル−ｐ−
’ノエニレノ／・アミン、ｐ−−ノエニレンノアミン、
ｌ−リレノー３．４−）つ′ミン、３、４−ノアミノ安
息香酸、Ｏ − １・ＩＩ ／ン及びｐ−１゛ルイジン
などもＵＰＩ）と同じく本発明Ｏ）ノｊ法力；適用し得
る。
発明の範囲はここに使用されている特定の酵ふ及び発色
基質に制限されるものでなＩ／）こ・とは云うまでもな
い。即ち、他の過酸化酵素、例えハ、ラクトベルオキシ
ターゼ、ミエロペルオキシクーゼ、グルタチオンベルオ
キシグーゼ、ナトりｔａ − ｌｘ Ｃベルオキシター
ゼ及びこの蛋白分電酵素による分解産物であるミクロペ
ルオキシターセなども西洋ノ”リーヒ過ｉＰＪ ！”１
． ＩＩＹ素と同じく適当てあり、り月こは他の芳香，
゛ ノ類の発色基質、例え＆″．［、０−ノアニシジン
、ヘノチジン、ビロカロール、Ｎ，Ｎ−ツメチル−ｐ−
’ノエニレノ／・アミン、ｐ−−ノエニレンノアミン、
ｌ−リレノー３．４−）つ′ミン、３、４−ノアミノ安
息香酸、Ｏ − １・ＩＩ ／ン及びｐ−１゛ルイジン
などもＵＰＩ）と同じく本発明Ｏ）ノｊ法力；適用し得
る。
ま１こ、本発明のホスポン酸系キレ−１・剤ば、過酸化
酵素活性Ｌを測圧する場合に１奴らず、一般に芳香族ア
ミン類を発色基質又は染色原として月１シ）ろその他の
臨床検査に於ても、発色試液又Ｕ：Ｌ染色散の安定化剤
として広く用いらり．る。
酵素活性Ｌを測圧する場合に１奴らず、一般に芳香族ア
ミン類を発色基質又は染色原として月１シ）ろその他の
臨床検査に於ても、発色試液又Ｕ：Ｌ染色散の安定化剤
として広く用いらり．る。
実施例 ｌ。
■４□０２．０．０１７Ｗ／Ｖチ及びＯ−フエニレ７ノ
７ ミ７ （ Ｏ Ｐ Ｄ ） ３ ｌｌＩｙ ／ ｍ
ｌを含むｐ Ｈ ＝ ４，、Ｈの０．０５Ｍクエン酸−
０．１１Ｖｌす７ ｔｌｌ．緩衝液（す、下、基質発色
試液という）に、反力ｌ化削として１−にトロギシエチ
リテノー１．１ーンホスホン＋Ｖ （ ）ｘリオノクス
−１１５ 、ライオン株式会（１’． ａ ） ０ ５
Ｗ／Ｖチ（終仏′縫度）を加え、巡ゲＣ容’／．’ｒ’
ｒ （ イ）５色ツノラス瓶）中、５゛′Ｃ及び２５′
″Ｃて採石する。ま１こ、′ｉ定化削無．窮加の基１１
児色試液を〃・４ヅ１し、回−ゴ汀ｌて採石して対照と
づ−る。保悩後１υ１−１、安定化ｉ′ｉｌｌ添加及び
無冷加の基質発色試液をＩｌｉ（、１て以１’ ０）
；ｉ戊−リ３を行なう。
７ ミ７ （ Ｏ Ｐ Ｄ ） ３ ｌｌＩｙ ／ ｍ
ｌを含むｐ Ｈ ＝ ４，、Ｈの０．０５Ｍクエン酸−
０．１１Ｖｌす７ ｔｌｌ．緩衝液（す、下、基質発色
試液という）に、反力ｌ化削として１−にトロギシエチ
リテノー１．１ーンホスホン＋Ｖ （ ）ｘリオノクス
−１１５ 、ライオン株式会（１’． ａ ） ０ ５
Ｗ／Ｖチ（終仏′縫度）を加え、巡ゲＣ容’／．’ｒ’
ｒ （ イ）５色ツノラス瓶）中、５゛′Ｃ及び２５′
″Ｃて採石する。ま１こ、′ｉ定化削無．窮加の基１１
児色試液を〃・４ヅ１し、回−ゴ汀ｌて採石して対照と
づ−る。保悩後１υ１−１、安定化ｉ′ｉｌｌ添加及び
無冷加の基質発色試液をＩｌｉ（、１て以１’ ０）
；ｉ戊−リ３を行なう。
（ａ）安定化削添加及び無曜加の基質発色試液０．５ｒ
ｎｌに１．５Ｎ硫Ｍｌ ３．Ｏ ｍｌｔ ４−加え、４
９２ｎｍｉこｈりυする吸光度を測定する。
ｎｌに１．５Ｎ硫Ｍｌ ３．Ｏ ｍｌｔ ４−加え、４
９２ｎｍｉこｈりυする吸光度を測定する。
（１〕）安′／Ｊｌ化剤姫加及びり（（１、冷加の〕Ｉ
（り′↓光色＋ｉ＋ｔ： ／ｆり、（）、５ｍｅζこ西
洋′ノ→ノービ過１藪化酵素 約１ ｎ９を加え、 こ
の反ＬＩＺ、混合物を：（７°′Ｃて３０分間静置する
。次いて、この混合物に１．５Ｎ硫酸 ３．Ｏｍｌを加
え反応を停止し、４９２冊に於ける吸光度を測定する。
（り′↓光色＋ｉ＋ｔ： ／ｆり、（）、５ｍｅζこ西
洋′ノ→ノービ過１藪化酵素 約１ ｎ９を加え、 こ
の反ＬＩＺ、混合物を：（７°′Ｃて３０分間静置する
。次いて、この混合物に１．５Ｎ硫酸 ３．Ｏｍｌを加
え反応を停止し、４９２冊に於ける吸光度を測定する。
（ａ）、（１））の結果を纂ｌ衣に示す。尚、相対活性
に、用時調製した対照の基質発色試液（安定化剤無添加
）の４９２ｎｍに於ける吸光度を１００チとする。
に、用時調製した対照の基質発色試液（安定化剤無添加
）の４９２ｎｍに於ける吸光度を１００チとする。
第 １ 表
ａは該発色試液の試薬画検に相″！′１する。
ａが０．＋５以上は使用不可である。
第１表より、安定化剤添加系のものは、５°Ｃ保存で１
０日、２５℃保存で２日使用可能であるが、無除加系の
ものに、５℃保存で４日、２５ ”Ｃ保存で１］コしか
使用できないことがわかる。
０日、２５℃保存で２日使用可能であるが、無除加系の
ものに、５℃保存で４日、２５ ”Ｃ保存で１］コしか
使用できないことがわかる。
実施例 ２゜
０−フェニレンシアミン（ＯＰ Ｄ ） ３ ＋ｌ＋９
／ ｍｅを含むｐ Ｈ＝ ４．８４７．） ０．０５
Ｍクエン酸−０，１Ｍ Ｉｒン酸緩衝液（以下、発色試
液という）に、安定化Ａｌｌとして１−ヒドロ＝１−ン
エチリデン−１，１−ジホスホン酸（フェリオソクスー
１１５．ライオン株式会社製） ０．５ Ｗ ／ Ｖ％
（終濃度）を加え、遮光容器（褐色カラス瓶）中、５“
′Ｃ及び２５℃で保管する。また、安定化剤無添加の発
色試液をＮ’ｌ”Ｈし、同一条件で保管して対照とする
。保看後１ツノ日、安定化剤添加及び無添加の発色試液
を用いて以下の操作を行なう。
／ ｍｅを含むｐ Ｈ＝ ４．８４７．） ０．０５
Ｍクエン酸−０，１Ｍ Ｉｒン酸緩衝液（以下、発色試
液という）に、安定化Ａｌｌとして１−ヒドロ＝１−ン
エチリデン−１，１−ジホスホン酸（フェリオソクスー
１１５．ライオン株式会社製） ０．５ Ｗ ／ Ｖ％
（終濃度）を加え、遮光容器（褐色カラス瓶）中、５“
′Ｃ及び２５℃で保管する。また、安定化剤無添加の発
色試液をＮ’ｌ”Ｈし、同一条件で保管して対照とする
。保看後１ツノ日、安定化剤添加及び無添加の発色試液
を用いて以下の操作を行なう。
（ａ）安定化削除加及び無添加の発色試液 ０．５＋ｎ
ｆｆに１．５ Ｎ硫酸 ；う、Ｏｍｌを加え、４９２ｎ
ｍ に於ける吸光度を６１り定する。
ｆｆに１．５ Ｎ硫酸 ；う、Ｏｍｌを加え、４９２ｎ
ｍ に於ける吸光度を６１り定する。
（ｂ）安定化削ＳＳ加及び無添加の発色試液 ０．５ｍ
ｌに、Ｈ２Ｏ２０，０１７Ｗ／ Ｖチ（終濃ＩＪｆ ）
及び西汀ワサビ過酸化酵素 約Ｉ ｎ、９を加え、この
反応混合物を３７℃で３０分間静置する。θζいて、こ
の１琵合物に１．５ Ｎ硫酸 ３．Ｏｍｌを加えて反１
心を停ｔＬＬ、、４９２ｎｍに於ける吸光度を測定する
。
ｌに、Ｈ２Ｏ２０，０１７Ｗ／ Ｖチ（終濃ＩＪｆ ）
及び西汀ワサビ過酸化酵素 約Ｉ ｎ、９を加え、この
反応混合物を３７℃で３０分間静置する。θζいて、こ
の１琵合物に１．５ Ｎ硫酸 ３．Ｏｍｌを加えて反１
心を停ｔＬＬ、、４９２ｎｍに於ける吸光度を測定する
。
（ａ）、（ｂ）の結果を第２表に示す。尚、相苅イ古性
は、用時調製した対照の発色試液（安定化ｊｊｌｌ ；
（ｌｊｌ、ン、ｈ加）Ｑ）４９２ｎｍに於ける１吸尤度
を１００チとする。
は、用時調製した対照の発色試液（安定化ｊｊｌｌ ；
（ｌｊｌ、ン、ｈ加）Ｑ）４９２ｎｍに於ける１吸尤度
を１００チとする。
第 ２ 表
ａは該発色試液の試薬１倹に相当する。
ａが０，１５以上は使用不用である。
第２表より、安定化ハ添加系のものに、５゛Ｃ保存で２
５日、２５℃保存で：３日使用Ｉｉｆ ｌ１ｌｉである
が、無添加系のものは、５″Ｃ保存で１（］１ミ１．２
５″゛Ｃ保存で１日しか使用できないことがわかる。
５日、２５℃保存で：３日使用Ｉｉｆ ｌ１ｌｉである
が、無添加系のものは、５″Ｃ保存で１（］１ミ１．２
５″゛Ｃ保存で１日しか使用できないことがわかる。
実施例 ３゜
Ｈ２Ｏ２０，、Ｏｉ ７ Ｗ／ Ｖ％および０−７１．
ニレンジアミン（ＯＰ Ｉ） ） ３１％’ ／ ｍｅ
を含むｐ Ｈ＝ ４．８の０．０５Ｍクエン酸−０１Ｍ
リン酸緩偵Ｉ液（以１：基質発色試液）に安定化剤とし
てニドすτＪトリス メチレフ ポスホン酸ｏ、ｓｗ／
ｖ％（終ＴｃＪ度を加え、遮光容器（出色〕Ｊラス瓶）
中、５゛Ｃ奴υ・２５ ”Ｃで保管し１こ。安定化剤無
７＋１５加の基り′↓兄色試液を調製し、同一条件で保
管して対照とした。保ゞｆ！１゛後１θ［」、安定化剤
、企加及び無添加の基り！↓発色試液を用いて以下の試
験をＴｊつた。
ニレンジアミン（ＯＰ Ｉ） ） ３１％’ ／ ｍｅ
を含むｐ Ｈ＝ ４．８の０．０５Ｍクエン酸−０１Ｍ
リン酸緩偵Ｉ液（以１：基質発色試液）に安定化剤とし
てニドすτＪトリス メチレフ ポスホン酸ｏ、ｓｗ／
ｖ％（終ＴｃＪ度を加え、遮光容器（出色〕Ｊラス瓶）
中、５゛Ｃ奴υ・２５ ”Ｃで保管し１こ。安定化剤無
７＋１５加の基り′↓兄色試液を調製し、同一条件で保
管して対照とした。保ゞｆ！１゛後１θ［」、安定化剤
、企加及び無添加の基り！↓発色試液を用いて以下の試
験をＴｊつた。
（ａ）安定化ハリ添加及び無添加の基質発色試液＋１
、５ ｍ１３ に１．５Ｎ硫酸 ３ 、０ ｍ／ｌを加
え、４ り ２ ｎ ｍ ＩＣおける吸光度を４１１１
定した。
、５ ｍ１３ に１．５Ｎ硫酸 ３ 、０ ｍ／ｌを加
え、４ り ２ ｎ ｍ ＩＣおける吸光度を４１１１
定した。
（ｂ）安定化剤ぢ≦加及び無姫加の晶質′４６色試散（
＋、５ｍｌに西洋ワサビ過酸化酵素 約１ ｎｇを加え
、この反り己・混合物を３７”Ｃて：（（］９分間１静
した。次いてこの混合物ｔこ１，５Ｎ硫Ｃｌｌ３．Ｏｍ
ｌを加え反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光度を測
定した。
＋、５ｍｌに西洋ワサビ過酸化酵素 約１ ｎｇを加え
、この反り己・混合物を３７”Ｃて：（（］９分間１静
した。次いてこの混合物ｔこ１，５Ｎ硫Ｃｌｌ３．Ｏｍ
ｌを加え反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光度を測
定した。
（ａ）（ｂ）の結果を第３衣に示した。なお相対活性は
用時１ｖＩ、ｌ裏した対照のｈ号質発色試液（安定化ハ
リ添加）の４９２ｎｍにおける吸光度を１００チとした
。
用時１ｖＩ、ｌ裏した対照のｈ号質発色試液（安定化ハ
リ添加）の４９２ｎｍにおける吸光度を１００チとした
。
第 ３ 表
ａ、は該発色試液の試液盲検に相当する。
ａ、が０．１５以上は使用率ＩＪＪである。
添加系ｆこおいて５′°ｃ保イｊて６旧 ２５ ”Ｃ保
イｆで１日使用可、−力無添加系において５ ′し保存
で４日、２５℃保存て１１１１史用１りてＡ・・−・た
。
イｆで１日使用可、−力無添加系において５ ′し保存
で４日、２５℃保存て１１１１史用１りてＡ・・−・た
。
実施例 ４゜
０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ ） ３ｍｇ７ｍ１を
含むｐ Ｈ＝ ４．８の＋１．０５Ｍクエン酸−ｆＪ、
１Ｍリン１ツ緩衝液（以下発色試液）に安疋化剤として
ニトリロ トリス メチレン ホスポン酸０．５Ｗ／■
％（終濃Ｈｆ ）を加え、遮光容器（褐色カラス瓶）中
、５°Ｃ及び２５°Ｃで保管し１こ。安定化剤無深加の
発色試＆、を調製し、同一条件で保管して対照とした。
含むｐ Ｈ＝ ４．８の＋１．０５Ｍクエン酸−ｆＪ、
１Ｍリン１ツ緩衝液（以下発色試液）に安疋化剤として
ニトリロ トリス メチレン ホスポン酸０．５Ｗ／■
％（終濃Ｈｆ ）を加え、遮光容器（褐色カラス瓶）中
、５°Ｃ及び２５°Ｃで保管し１こ。安定化剤無深加の
発色試＆、を調製し、同一条件で保管して対照とした。
保肯後毎目、安定化剤旅加及び無添加の発色試液を用い
て以下の操作を行った。
て以下の操作を行った。
（ａ）安定化ハリ添加及び無研加の発色試液 （１，５
＋＋＋ｅに１．５Ｎ硫ｄ！ ３．０ｍｌを加え、４９２
ｎｍ における吸光度を測定し１こ。
＋＋＋ｅに１．５Ｎ硫ｄ！ ３．０ｍｌを加え、４９２
ｎｍ における吸光度を測定し１こ。
（ｂ）安定化削添加及び無添加の発色試液 １］、５＋
ｎ６にｌＩ２０□ （１，０１７Ｗ／Ｖ％（終濃度）及
び西ｔＴ、ワーリ“ヒ過？被化酵素 約１１１＆を加え
、この反応混合物を３７ ”Ｃで３０分間静置した。次
いてこの混合物に１．５Ｎ硫酸 ：（、Ｏｍｌ ｆ：加
えて反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光１現を測定
し１こ。
ｎ６にｌＩ２０□ （１，０１７Ｗ／Ｖ％（終濃度）及
び西ｔＴ、ワーリ“ヒ過？被化酵素 約１１１＆を加え
、この反応混合物を３７ ”Ｃで３０分間静置した。次
いてこの混合物に１．５Ｎ硫酸 ：（、Ｏｍｌ ｆ：加
えて反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光１現を測定
し１こ。
（ａ） （１１）の結果を第４表に示した。
なお相対活性は用時調製した対照の発色試’ＩＩＩ（安
定化ハリ添加）の４９２ｎｍに１３ける吸光度苓−１０
０％とした。
定化ハリ添加）の４９２ｎｍに１３ける吸光度苓−１０
０％とした。
第 ４ 表
ａ、は該発色試液の試薬盲検０こ相当する、ａ、が０．
１５以上は使用不可である。
１５以上は使用不可である。
添加系において５°Ｃ保存で１５日、２５°Ｃ保持許出
願人 和元純薬工業株式会社
願人 和元純薬工業株式会社
Claims (4)
- （１） 発色基質を用いて過酸化酵素活性を測定するｌ
こ当りホスホン酸系キレート剤を安定化剤として用いる
ことを特徴とする発色試液の安定化方法。 - （２） 発色基質が芳香族アミン類である特許請求の範
囲第１項記載の安定化方法。 - （３）芳香族Ｊ′ミン類がＯ−フェニレンシアミンであ
る特♂Ｉ’ 請求の範囲第２項記載の安定化方法。 - （４） ポスホン酸系キレ−１・剤がアルキル（Ｃ１〜
８）、ｊ−スホン酸及びその塩（Ｎａ 、 Ｋ 、 Ｍ
ｇ 。 Ａｅ、 Ｚ＋＋ 、 Ｓｎ ＋ Ｃａ ） ＋アルキル
（Ｃ３０−Ｈ）ｏ ）チオホスボン酸バリウム、２−ク
ロロ−１−デルポスポン酸、アミノエグンホスポン醒。 ニドすＤ ｌ・リス メチレン ポスポンＣｊ！２゜ニ
トリｒｌ ｌ・＋１スメ〃ン １・り土ス土ン醍十）１
ワム塩、ニトリロ トリス メチレンホスホン酸すトリ
ウム、 Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ホスボッメ
チル）エチレンソアミン。 エチレンジアミン四ポスポン酸ヒドラノン銘体、ｌ、２
−ヒス（Ｎ、Ｎ−ヒスポスホノノチル）アミノエタンナ
トリワム塩、１−ヒドロギシエチリテン−１，１−ンポ
スホン酸及びそのナトリツム塩、ホスボッコハク酸すト
す１ツム及び２−ホスポツプクツ−１，２，４−トリカ
ルホン酸及びそのすトリツム堪から成るｌ＋１より選ば
れた一種又は二種り、上である′１ケ♂Ｉ’ ｔ’、請
求の１叱囲第１項、第２項又ｌＩｉ第３項Ｍ’ｖ載の安
＞’Ｉｌ化力広。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17253083A JPS6066994A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 発色試液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17253083A JPS6066994A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 発色試液の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6066994A true JPS6066994A (ja) | 1985-04-17 |
| JPH052942B2 JPH052942B2 (ja) | 1993-01-13 |
Family
ID=15943621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17253083A Granted JPS6066994A (ja) | 1983-09-19 | 1983-09-19 | 発色試液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6066994A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0553820A2 (en) * | 1992-01-30 | 1993-08-04 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Composition and test strip for measuring peroxidatively active substances |
| US5318894A (en) * | 1990-01-30 | 1994-06-07 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for peroxidatively active substances |
| WO2005088305A1 (ja) * | 2004-03-17 | 2005-09-22 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 被酸化性呈色試薬の安定化方法 |
-
1983
- 1983-09-19 JP JP17253083A patent/JPS6066994A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5318894A (en) * | 1990-01-30 | 1994-06-07 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for peroxidatively active substances |
| US5362633A (en) * | 1990-01-30 | 1994-11-08 | Miles Inc. | Method of assaying for peroxidatively active substances |
| EP0553820A2 (en) * | 1992-01-30 | 1993-08-04 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Composition and test strip for measuring peroxidatively active substances |
| WO2005088305A1 (ja) * | 2004-03-17 | 2005-09-22 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 被酸化性呈色試薬の安定化方法 |
| JPWO2005088305A1 (ja) * | 2004-03-17 | 2008-01-31 | 第一化学薬品株式会社 | 被酸化性呈色試薬の安定化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH052942B2 (ja) | 1993-01-13 |
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