JPH052942B2

JPH052942B2 -

Info

Publication number: JPH052942B2
Application number: JP17253083A
Authority: JP
Inventors: Yoshitsugu Sakata; Motoo Goto; Yoshitaka Hamaguchi; Tomoko Yamamoto
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1983-09-19
Filing date: 1983-09-19
Publication date: 1993-01-13
Also published as: JPS6066994A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ｏ−フエニレンジアミンを発色基質
とする発色試液の安定化方法に関する。一般に臨床化学の分野では、疾病の診断、病態
把握等の目的で、生体試料（血清、尿、組織液
等）中の生理活性物質（例えば、酵素、脂質、蛋
白質等）の測定が広く行なわれている。過酸化酵素は、この臨床検査の分野に於て、従
来より酸化酵素として広く用いられている酵素の
１つであり、最近では、ラジオイムノアツセイ
（RIA）に代る高感度測定法として注目されてい
る酵素免疫測定法（Enzyme immunoassay、以
下EIAと略称する）の標識酵素としても広く使用
され、微量の免疫成分、例えば、インスリン、グ
ルカゴン、サイロキシン等のホルモンや、IgE、
α−フエトプロテイン、CEA等の高分子生理活
性物質の検出に役立つている。EIAは感度、並び
に特異性の高い免疫測定法であるが、その測定対
象物は通常生体試料中では微量であり、これに対
応して標識酵素量も微量となるため、その検出に
は高感度の発色試薬が要求される。一般に過酸化酵素の検出及び定量は、次のよう
な反応に従つて行なわれている。 (1) 過酸化酵素＋水素受容体コンプレツクス（結合体） (2) コンプレツクス（結合体）＋AH₂ （水素供与体）Ａ（酸化物；呈色色素）＋2H₂O＋酵素水素受容体としては過酸化水素（H₂O₂）が最
も優れており、一方、水素供与体は比色法に於て
はクロモーゲン（色原団）を含むこと、即ち、ク
ロモーゲン基質（発色基質）であることが要求さ
れ、通常は、フエノール類（グアヤコール、ナフ
トールなど）及び芳香族アミン類（ベンチジン、
ｏ−フエニレンジアミンなど）がよく用いられて
いる。生成する酸化物を正確に測定するために
は、酵素変成剤又は不可逆的抑制剤、例えば、
HCl、H₂SO₄、NaN₃又はNaFを添加して、酵素
−基質反応を停止させればよい。ところで、微量の過酸化酵素を検出する場合、
例えば、EIA等に於ては、高感度の発色基質を用
いる必要があり、現在、最も高感度な発色基質と
してｏ−フエニレンジアミン（以下OPDと略称
する）が重用されている。即ち、本発明者らの認
識によればOPDは他の発色基質と比較して少な
くとも10倍以上の感度を有している。しかしなが
ら、OPDは溶液中では極めて不安定であり、共
存する金属イオン、溶存酸素、更には光等により
容易に酸化を受け、その結果、バツクグラウンド
が不安定で、実際の過酸化酵素の検出に於て著し
い測定誤差を生じやすいものであつた。このため
使用に際しては、反応容器を塩酸洗浄して金属を
除いたり、暗箱中で反応を行なつて光の影響を避
けたり、更には、溶解後の使用時間を制限したり
しているのが実情である。このように、OPDは
極めて高感度で有用である反面、使用上の制限が
多い発色基質であり、その安定化法が強く要望さ
れていた。本発明者らは、上記の如き欠点を改良すべく鋭
意研究を重ねた結果、OPD溶液を不安定にする
要因が、特に微量の第二鉄イオン（Fe³⁺）及び
第二銅イオン（Cu²⁺）にあることをつきとめ、
OPD溶液に特定のホスホン酸系キレート剤を添
加せしめ金属イオンをマスクすることにより、該
溶液（即ち、ｏ−フエニレンジアミンを発色基質
とする発色試液）が著しく安定化されることを見
い出し、本発明を完成するに到つた。即ち、本発明は、１−ヒドロキシエチリデン−
１，１−ジホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデ
ン−１，１−ジホスホン酸ナトリウム、ニトリロ
トリスメチレンホスホン酸及びニトリロ
トリスメチレンホスホン酸ナトリウムから成
る群より選ばれた１種又は２種以上を安定化剤と
して用いることを特徴とする、ｏ−フエニレンジ
アミンを発色基質とする発色試液の安定化方法に
関する発明である。本発明に使用される特定のホスホン酸系キレー
ト剤としては、１−ヒドロキシエチリデン−１，
１−ジホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−
１，１−ジホスホン酸ナトリウム、ニトリロト
リスメチレンホスホン酸及びニトリロトリ
スメチレンホスホン酸ナトリウムが挙げられ
る。これらキレート剤は単独で用いても、また、
２種以上のキレート剤を併用して用いてもかまわ
ない。また、その添加量としては、過酸化酵素活
性を阻害しない濃度であればよく、ホスホン酸誘
導体の種類により多少異なるが、１−ヒドロキシ
エチリデン−１，１−ジホスホン酸及びそのナト
リウム塩では、通常0.05〜2.0W／Ｖ％である。
上記本発明のホスホン酸系キレート剤以外のキレ
ート剤、例えば、EDTA・2Na、アセチルアセ
トン、トリフルオルテノイルアセトン等は、金属
イオンのマスキングには有効であるが、発色試液
の測定波長に影響を与えるので好ましくない。即
ち、本発明に於て使用し得るマスキング剤として
は、Fe³⁺、Cu²⁺のマスキング剤を有しているこ
と、及び有効濃度で着色しないことが必須要件で
あり、更に、当該発色試液を例えば過酸化酵素活
性測定用の発色試液として用いる場合を考慮に入
れると過酸化酵素活性に影響がないことも要件の
一つとして挙げられる。本発明者らは、Fe³⁺及
びCu²⁺の各種マスキング剤の中で本発明のホス
ホン酸系キレート剤のみが本発明の目的を達し得
るものであることを実験によつて確認した。 OPDを含む試液の液性は、PH４〜９の範囲で
あれば、通常特に問題はないが、中でもPH４〜６
の範囲が好ましく、またその為の緩衝剤として
は、過酸化酵素活性を測定する場合を考慮に入れ
ると過酸化酵素活性を阻害しないものであれば自
体公知の緩衝剤、例えば、リン酸緩衝液、トリス
緩衝液、グツド緩衝液などが例外なく用いられる
が、通常クエン酸−リン酸緩衝液がよく用いら
れ、そのモル濃度は0.01〜0.2Mが好ましい。本発明のホスホン酸系キレート剤の添加時期
は、酵素反応の際にその系内に存在させてもそれ
なりに効果はあるが、OPDの溶解用溶媒中にあ
らかじめ添加するのが最も好ましい。このように過酸化水素及びOPDを用いて過酸
化酵素活性を測定するに当り、本発明の方法、即
ち本発明のホスホン酸系キレート剤を安定化剤と
して用いることにより、OPDを含む試液が著し
く安定化され、酵素の検出も極めて正確になし得
る。更に又本発明の方法はOPDを含む試液の保
存に対しても顕著な効果を奏するものであり、斯
業に貢献するところ甚だ大なるものがある。以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明の範囲はここに使用されている特定
の酵素に制限されるものでないことは云うまでも
ない。即ち、他の過酸化酵素、例えば、ラクトペ
ルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、グル
タチオンペルオキシダーゼ、チトクロームＣペル
オキシダーゼ及びこの蛋白分解酵素による分解産
物であるミクロペルオキシダーゼなども西洋ワサ
ビ過酸化酵素と同じく適当である。また、本発明のホスホン酸系キレート剤は、過
酸化酵素活性を測定する場合に限らず、一般に
OPDを発色基質又は染色原として用いるその他
の臨床検査に於ても、発色試液又は染色液の安定
化剤として広く用い得る。実施例１ H₂O₂0.017W／Ｖ％及びＯ−フエニレンジアミ
ン（OPD）３mg／mlを含むPH＝4.8の0.05Mクエ
ン酸−0.1Mリン酸緩衝液（以下、基質発色試液
という）に、安定化剤として１−ヒドロキシエチ
リデン−１，１−ジホスホン酸（フエリオツクス
−115、ライオン株式会社製）0.5W／Ｖ％（終濃
度）を加え、遮光容器（褐色ガラス瓶）中、５℃
及び25℃で保管する。また、安定化剤無添加の基
質発色試液を調製し、同一条件で保管して対照と
する。保管後毎日、安定化剤添加及び無添加の基
質発色試液を用いて以下の試験を行なう。 (a) 安定化剤添加及び無添加の基質発色試液0.5
mlに1.5N硫酸3.0mlを加え、492nmに於ける吸
光度を測定する。 (b) 安定化剤添加及び無添加の基質発色試液0.5
mlに西洋ワサビ過酸化酵素約1ngを加え、この
反応混合物を37℃で30分間静置する。次いで、
この混合物に1.5N硫酸3.0mlを加え反応を停止
し、492nmに於ける吸光度を測定する。 (a)、(b)の結果を第１表に示す。尚、相対活性
は、用時調製した対照の基質発色試液（安定化剤
無添加）の492nmに於ける吸光度を100％とする。

【表】第１表より、安定化剤添加系のものは、５℃保
存で10日、25℃保存で２日使用可能であるが、無
添加系のものは、５℃保存で４日、25℃保存で１
日しか使用できないことがわかる。実施例２Ｏ−フエニレンジアミン（OPD）３mg／mlを
含むPH＝4.8の0.05Mクエン酸−0.1Mリン酸緩衝
液（以下、発色試液という）に、安定化剤として
１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン
酸（フエリオツクス−115、ライオン株式会社製）
0.5W／Ｖ％（終濃度）を加え、遮光容器（褐色
ガラス瓶）中、５℃及び25℃で保管する。また、
安定化剤無添加の発色試液を調製し、同一条件で
保管して対照とする。保管後毎日、安定化剤添加
及び無添加の発色試液を用いて以下の操作を行な
う。 (a) 安定化剤添加及び無添加の発色試液0.5mlに
1.5N硫酸3.0mlを加え、492nmに於ける吸光度
を測定する。 (b) 安定化剤添加及び無添加の発色試液0.5mlに、
H₂O₂0.017W／Ｖ％（終濃度）及び西洋ワサビ
過酸化酵素約1ngを加え、この反応混合物を37
℃で30分間静置する。次いで、この混合物に
1.5N硫酸3.0mlを加えて反応を停止し、492nm
に於ける吸光度を測定する。 (a)、(b)の結果を第２表に示す。尚、相対活性
は、用時調製した対照の発色試液（安定化剤無添
加）の492nmに於ける吸光度を100％とする。

【表】第２表より、安定化剤添加系のものは、５℃保
存で25日、25℃保存で３日使用可能であるが、無
添加系のものは、５℃保存で10日、25℃保存で１
日しか使用できないことがわかる。実施例３ H₂O₂0.017W／Ｖ％およびＯ−フエニレンジア
ミン（OPD）３mg／mlを含むPH＝4.8の0.05Mク
エン酸−0.1Mリン酸緩衝液（基質発色試液）に
安定化剤としてニトリロトリスメチレンホ
スホン酸0.5W／Ｖ％（終濃度）を加え、遮光容
器（褐色ガラス瓶）中、５℃及び25℃で保管し
た。安定化剤無添加の基質発色試液を調製し、同
一条件で保管して対照とした。保管後毎日、安定
化剤添加及び無添加の基質発色試液を用いて以下
の試験を行つた。 (a) 安定化剤添加及び無添加の基質発色試液0.5
mlに1.5N硫酸3.0mlを加え、492nmに於ける吸
光度を測定した。 (b) 安定化剤添加及び無添加の基質発色試液0.5
mlに西洋ワサビ過酸化酵素約1ngを加え、この
反応混合物を37℃で30分間静置した。次いでこ
の混合物に1.5N硫酸3.0mlを加え反応を停止し、
492nmに於ける吸光度を測定した。 (a)(b)の結果を第３表に示した。なお相対活性は
用時調製した対照の基質発色試液（安定化剤無添
加）の492nmにおける吸光度を100％とした。

【表】添加系において５℃保存で６日、25℃保存で１
日使用可、一方無添加系において５℃保存で４
日、25℃保存で１日使用可であつた。実施例４Ｏ−フエニレンジアミン（OPD）３mg／mlを
含むPH＝4.8の0.05Mクエン酸−0.1Mリン酸緩衝
液（発色試液）に安定化剤としてニトリロトリ
スメチレンホスホン酸0.5W／Ｖ％（終濃度）
を加え、遮光容器（褐色ガラス瓶）中、５℃及び
25℃で保管した。安定化剤無添加の発色試液を調
製し、同一条件で保管して対照とした。保管後毎
日、安定化剤添加及び無添加の発色試液を用いて
以下の操作を行つた。 (a) 安定化剤添加及び無添加の発色試液0.5mlに
1.5N硫酸3.0mlを加え、492nmにおける吸光度
を測定した。 (b) 安定化剤添加及び無添加の発色試液0.5mlに
H₂O₂0.017W／Ｖ％（終濃度）及び西洋ワサビ
過酸化酵素約1ngを加え、この反応混合物を37
℃で30分間静置した。次いでこの混合物に
1.5N硫酸3.0mlを加えて反応を停止し、492nm
における吸光度を測定した。 (a)(b)の結果を第４表に示した。なお相対活性は用時調製した対照の発色試液
（安定化剤無添加）の492nmにおける吸光度を100
％とした。

【表】添加系において５℃保存で15日、25℃保存で２
日使用可、一方無添加系において５℃保存で10
日、25℃保存で１日使用可であつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホス
ホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジ
ホスホン酸ナトリウム、ニトリロトリスメチ
レンホスホン酸及びニトリロトリスメチレ
ンホスホン酸ナトリウムから成る群より選ばれ
た１種又は２種以上を安定化剤として用いること
を特徴とする、ｏ−フエニレンジアミンを発色基
質とする発色試液の安定化方法。