JPH04262796A

JPH04262796A - 基質液の安定化法及び基質液

Info

Publication number: JPH04262796A
Application number: JP4594491A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiro Uryu; 瓜生　勝寛; Miho Tsubouchi; 坪内　美保; Midori Nagatomo; 永友　緑; Tsunekazu Fukushima; 恒和福島
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1991-02-18
Filing date: 1991-02-18
Publication date: 1992-09-18
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: JP3289280B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床検査などの分野で用
いられる基質液の安定化法及び安定化された基質液に関
する。より詳細には、本発明はペルオキシダーゼ標識−
酵素免疫測定法などにおいて使用されるペルオキシダー
ゼ活性測定用基質液に特に適した基質液の安定化法及び
安定化された基質液に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査などの分野では、生体試料中の
微量成分（例えば、蛋白質、酵素、脂質、薬物など）の
測定法（定量法）として、抗原抗体反応を利用した免疫
学的測定法（例えば、酵素免疫測定法、放射免疫測定法
、赤血球凝集反応試験法など）が汎用されている。これ
らの免疫学的測定法において、放射性物質を用いない酵
素免疫測定法（以下、ＥＩＡという）は取扱が容易なの
で一般の検査室で広く利用されている。ＥＩＡで用いら
れる標識酵素としては種々の酵素が用いらているが、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、
チトクロームＣペルオキシダーゼなどのペルオキシダー
ゼが汎用されており、ＥＩＡの常法に準じて固相などに
固定化したペルオキシダーゼ活性を測定することにより
検体中の測定対象物質の濃度（量）が測定される。また、生体成分量や酵素活性などの測定に用いられてい
る酵素測定法においても、ペルオキシダーゼを用いた酵
素反応を含む酵素反応共役系が広く利用されている。

【０００３】上記ペルオキシダーゼを用いる測定法にお
いて、ペルオキシダーゼの基質としては、通常、発色基
質と過酸化水素が用いられ、ペルオキシダーゼ活性の測
定は発色基質と過酸化水素とを含むペルオキシダーゼ活
性測定用基質液（以下、測定用基質液という）中、ペル
オキシダーゼと過酸化水素の作用により発色基質を酸化
して呈色色素を生じさせ、生成した呈色色素の吸光度を
測定することにより行われる。発色基質としては、芳香
族アミン、フェノール類、ロイコ色素などが用いられ、
その代表的な例としては３，３’，５，５’−テトラメ
チルベジジン（以下、ＴＭＢという）、２，２’−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン
酸）（以下、ＡＴＢという）、ｏ−フェニレンジアミン
などが挙げられる。これらの発色基質はいずれも酸化反
応を受け易い不安定な化合物であり、溶液状態において
は溶存酸素などにより酸化されて着色物質に変化する。特に、過酸化水素の存在下においては発色基質の酸化は
極めて容易に起る。発色基質の酸化による着色物質への
変化は、測定時において試薬ブランクの上昇となって現
れ、測定感度や精度の著しい低下をもたらす。そのため
、発色基質（及び過酸化水素）を含有する基質液を保存
することは実質的に不可能であった。かかる問題から、
発色基質は通常、過酸化水素を含まない状態で凍結乾燥
あるいは粉末状の形態で供給されており、使用時に別途
用意した溶解液で溶解し次いで過酸化水素を添加するか
、又は別途用意した過酸化水素水で溶解して使用されて
おり、測定のたびに基質液を調製しなければならず操作
が煩雑である。また、発色基質の中には水に対して難溶
性の物質もあり、発色基質を溶解させるのに手間取るこ
とがある。そして、この際、発色基質が酸化される場合
があり、測定値のバラツキをもたらすことがある。さらに、凍結乾燥あるいは粉末状の形態で供給される発
色基質は、通常、所定量（例えば、１００ｍｌ）の溶解
液で溶解するように小分けして包装されており、検体数
が少なく、少量の基質液で足りる場合であっても、所定
量の基質液を調製しなければならない。しかも、基質液
は安定性に欠け、保存することができないので余剰の基
質液は廃棄されており、無駄が多いという問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のようにペルオキ
シダーゼ活性測定に用いられる発色基質は非常に不安定
であり、容易に酸化されて着色物質に変化するので、発
色基質を含む基質液を予め調製し、保存しておくことは
できない。そのため、使用時に発色基質液及び測定用基
質液を調製しなければならず、操作が非常に煩雑であり
、また基質液の無駄が多いという問題がある。かかる問
題から、発色基質を含む基質液（特に測定用基質液）の
安定化が強く要望されているが安定化法として十分に満
足できる方法は知られていない。本発明は上記の従来技
術の欠点を解消するためになされたもので、発色基質液
及び測定用基質液の安定性を改善する方法並びに安定化
された基質液を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ペルオキ
シダーゼ活性測定に用いられる基質液の安定化について
鋭意検討した結果、安定化剤として還元剤を添加するこ
とより、発色基質の非酵素的酸化が抑制され、発色基質
液の安定化が図れること、及びかかる効果は過酸化水素
の存在下においても認められることを見出して本発明を
完成した。すなわち、本発明は、発色基質を含む基質液
に、発色基質の安定化剤として還元剤を添加するもので
ある。尚、本発明の安定化法は、過酸化水素の存在下に
おいても発色基質の安定化が図れることから、ペルオキ
シダーゼ活性の測定に適用した場合に特に顕著な効果を
奏するものであるが、ペルオキシダーゼ活性の測定に限
られず、当該発色基質を用いる他の検査方法においても
、発色基質液の安定化法として広く利用できるものであ
る。

【０００６】上記構成からなる本発明において、発色基
質としては、従来からペルオキシダーゼ活性測定用に用
いられる各種発色基質、例えば、ＴＭＢ、ＡＴＢ、ｏ−
フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ
−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、ピ
ロガロール、グアヤコールなどが挙げられる。本発明の
方法をペルオキシダーゼ活性の測定に用いる場合には、
測定感度の点でＴＭＢ、ＡＴＢ及びｏ−フェニレンジア
ミンが好ましい。

【０００７】また、本発明で用いられる還元剤としては
、目的とする反応（例えば、ペルオキシダーゼの酵素反
応）を阻害しないものであれば何れの還元剤も使用する
ことができるが、好ましくは含硫還元剤が用いられる。かかる含硫還元剤としては、分子中に硫黄原子を含む有
機及び無機還元剤が包含され、例えば、亜硫酸及びその
塩（亜硫酸水素塩、メタ亜硫酸塩等を含む）、チオ硫酸
塩などの無機含硫還元剤、グルタチオン、２−メルカプ
トエタノール、チオフェノール等及びそれらの塩などの
有機含硫還元剤が挙げられ、これらの含硫還元剤は２種
以上を併用してもよい。上記の無機及び有機含硫還元剤
の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の
金属塩、トリエチルアミン塩、トリブチルアミン塩等の
有機塩基塩、アンモニウム塩などが挙げられる。特に好
ましい含硫還元剤の例としては、亜硫酸ナトリウム、亜
硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム
、グルタチオンが挙げられる。

【０００８】本発明の安定化法は、前記発色基質とその
安定化剤である還元剤とを組合せて用いることにより発
色基質液の安定化を図るもので、発色基質を精製水又は
適当な緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液
、酢酸緩衝液など）に溶解した溶液に還元剤を添加し、
必要に応じて他の添加成分を加え又ｐＨ調整することに
より、所期の目的が達成される。また、本発明の基質液
はかくして調製された基質液であり、還元剤の共存によ
り著しい安定化が図れる。還元剤の添加量は、発色基質
の種類及び量、還元剤の種類、溶存酸素量、所望する安
定性などにより適宜調整されるが、基質液１００ｍｌ当
り１〜１０００ｍｇ程度に調整される。

【０００９】前述のように、本発明の方法は特にペルオ
キシダーゼ活性の測定に好適に用いられる。本発明をペ
ルオキシダーゼ活性の測定に用いられる基質液の安定化
に適用する場合、本発明は種々の態様で実施することが
できる。例えば、還元剤を含む発色基質液を調製して保
存しておき、使用時に過酸化水素を添加して測定用基質
液を調製する方法；当初より発色基質、過酸化水素及び
還元剤を含有する測定用基質液を調製し保存しておく方
法；従来から用いらている粉末状又は凍結乾燥発色基質
を溶解液に溶解する際に還元剤を添加し、次いで過酸化
水素を加え測定用基質液を調製する方法などが挙げられ
る。上記の各基質液における発色基質及び過酸化水素の
濃度は適宜調製することができるが、通常、測定用基質
液を調製した際に、発色基質の濃度が０．１〜３ｍＭ程
度、好ましくは０．２〜２ｍＭ程度、より好ましくは０
．５〜１ｍＭ程度となるように、また過酸化水素の濃度
が０．０１〜０．１％程度、好ましくは０．０２〜０．
０８％程度、より好ましくは０．０３〜０．０６％程度
となるように調整される。安定化剤として加えられる還
元剤の添加量は、ペルオキシダーゼ活性を阻害しない範
囲で、還元剤の種類、発色基質の種類及び濃度、過酸化
水素の濃度、所望する安定性などにより適宜調整される
が、通常、基質液中の還元剤濃度が０．００１〜１％程
度となるように調整され、好ましい還元剤である亜硫酸
ナトリウム、亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、チ
オ硫酸カリウム、グルタチオンをもってより具体的に説
明すると、亜硫酸ナトリウム（又はカリウム）及びチオ
硫酸ナトリウム（又はカリウム）においては０．０１〜
１％、好ましくは０．１〜０．５％の濃度と、またグル
タチオンにおいては０．００１〜０．０１％、好ましく
は０．００１〜０．００５％の濃度となるように調整さ
れる。また、上記の各基質液の性状は、通常、ｐＨ３〜
５程度、より好ましくはｐＨ３．５〜４．５程度の範囲
に調整され、また基質液の溶媒としては精製水、適当な
緩衝液などが用いられるが、緩衝液を用いるのが好まし
い。緩衝液としては、ペルオキシダーゼ活性を阻害しな
いものであればいずれの緩衝液も使用することができ、
例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液な
どが挙げられ、特にクエン酸緩衝液が好ましい。かくして調製された各基質液は冷暗所にて保存するのが
好ましい。

【００１０】本発明の方法をペルオキシダーゼ活性測定
に適用する場合、その操作は従来の方法と同様にして行
うことができ、例えば、前記の方法により調製した測定
用基質液とペルオキシダーゼを含む試料とを混合し、所
定温度（通常、室温〜３７℃程度）で所定時間（通常、
５〜６０分間程度）反応させた後、反応停止剤（例えば
、硫酸、塩酸、アジ化ナトリウム等）を添加して酵素−
基質反応を停止させる。次いで吸光度を測定することに
より、ペルオキシダーゼ活性を求めることができる。更
に、ＥＩＡなどの常法に準じて、得られたペルオキシダ
ーゼ活性に基づいて、予め作成した検量線と対比するこ
とにより、検体中の測定対象物質の濃度（量）を求める
ことができる。

【００１１】

【発明の効果】本発明によれば、発色基質の安定化剤と
して還元剤が用いらており、発色基質の非酵素的酸化が
抑制されるので、基質液の安定化が図れ、基質液を長期
間、安定的に保存することができる。更に過酸化水素の
共存下においても、発色基質の酸化を抑制することがで
きるので、測定用基質液などのような過酸化水素と発色
基質を含有する基質液をも長期間、安定的に保存するこ
とができる。従って、本発明によれば、長期間安定な基
質液を提供することができるので、測定時において基質
液の調製作業が容易となり測定操作を著しく簡便化する
ことができ、また基質液を無駄なく利用することができ
るという効果を奏する。

【００１２】

【実施例】以下、実施例及び実験例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。実施例１下記の組成からなる測定用基質液を調製した（以下、基
質液（１）という）。なお、各試薬液はクエン酸緩衝液
を用いて調製した。基質液（１）２ｍＭ　ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　１
００ｍｌ１％　　過酸化水素　　　　　　　　　　　　
５ｍｌ０．５％　　グルタチオン　　　　　　５００μ
ｌ１％　　亜硫酸ナトリウム　　　　５００μｌ　　　
　　　ｐＨ　　　４．０

【００１３】実施例２実施例１と同様にして、下記の組成からなる測定用基質
液を調製した（以下、基質液（２）という）。基質液（２）２ｍＭ　ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　１
００ｍｌ１％　　過酸化水素　　　　　　　　　　　　
５ｍｌ０．５％　　グルタチオン　　　　　　５００μ
ｌ　　　　　　ｐＨ　　　４．０

【００１４】実施例３下記の組成からなる発色基質液を調製した（以下、基質
液（３）という）。なお、ペルオキシダーゼ活性の測定
に基質液（３）を使用する際には、測定時に基質液（３
）　１００ｍｌに、別途調製した１％　過酸化水素２．
５ｍｌを添加して測定用基質液を調製し、それを用いた
。基質液（３）２ｍＭ　ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０ｍｌ１％　　亜硫酸ナトリウム　　　　　　１０
ｍｌクエン酸緩衝液　　　　　　　　　　　　７０ｍｌ
　　　　　　ｐＨ　　　３．２

【００１５】比較例比較例として、下記の組成からなる発色基質液を調製し
た（以下、基質液（４）という）。上記基質液（３）と
同様に、基質液（４）をペルオキシダーゼ活性の測定に
使用する場合には、基質液（４）　１００ｍｌに、別途
調製した１％　過酸化水素２．５ｍｌを添加して測定用
基質液を調製し、それを用いた。基質液（４）２ｍＭ　ＴＭＢ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２０ｍｌクエン酸緩衝液　　　　　　　　　　　　８
０ｍｌ　　　　　　ｐＨ　　　３．０〜３．２

【００１
６】実験例１上記基質液（１）〜（４）を用いて、ヘモグロビンのペ
ルオキシダーゼ様活性を測定した。すなわち、各基質液
（但し、基質液（３）及び（４）は過酸化水素を添加し
た測定用基質液として）　１５０μｌに精製ヒトヘモグ
ロビン溶液（０〜２００ｍｇ／ｄｌ）　５０μｌを添加
し、室温で１０分間静置した後、２Ｎ−硫酸５０μｌを
添加し反応を停止し、基質盲険を対照として、４５０ｎ
ｍにおける吸光度測定を行なった。得られた吸光度を表
１に示す。また、測定結果に基づき、精製ヒトヘモグロ
ビン濃度に対して吸光度をプロットした図（検量線）を
図１に示した。

【００１７】

【００１８】表１及び図１に示されるように、ヘモグロ
ビン濃度と吸光度は相関しており、本発明にかかる基質
液を用いてペルオキシダーゼ活性を測定できることが明
らかとなった。

【００１９】実験例２前記基質液（１）〜（３）及び比較例の基質液（４）を
、それぞれ室温及び１０℃の冷蔵庫に保存し、経時安定
性を測定した。すなわち、所定期間保存した基質液につ
いて、精製ヒトヘモグロビン溶液（１５０ｍｇ／ｄｌ）
を用いて実験例１と同様の操作を行い吸光度を測定した
。基質液を室温で保存した結果を表２に、１０℃で保存
した結果を表３に示す。なお、表２及び表３において、「無添加」は実験例１の
方法において精製ヒトヘモグロビン溶液に代えて同量の
緩衝液を用いて測定した吸光度を意味し、「添加」は実
験例１に準じて処理した後の吸光度を意味する。

【００２０】

【００２１】

【００２２】表２及び表３に示されるように、比較例で
ある基質液（４）においては、室温及び１０℃で保存し
た何れの場合も「無添加」の吸光度が経時的に増加して
おり、発色基質の酸化が認められ、そして３ケ月後には
著しく着色しており使用不能であった。それに対して、
本発明にかかる基質液（１）〜（３）においては、室温
及び１０℃で保存した何れの場合も保存中における吸光
度の変化がほとんど認められず、極めて安定であり、室
温で３ケ月保存しても使用できることが明らかとなった
。

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例１における、基質液（１）〜（４）を用
いたペルオキシダーゼ活性測定の検量線を示す図である
。図中、●−●は基質液（１）、○−○は基質液（２）
、■−■は基質液（３）及び□−□は基質液（４）を用
いた場合を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　　　ペルオキシダーゼ活性測定に用い
られる発色基質を含有する基質液に、発色基質の安定化
剤として還元剤を添加したことを特徴とする基質液の安
定化法。
【請求項２】　　　　基質液が、さらに過酸化水素を含
有する請求項１記載の基質液の安定化法。
【請求項３】　　　　ペルオキシダーゼ活性測定に用い
られる発色基質及び還元剤を含有することを特徴とする
基質液。
【請求項４】　　　　さらに過酸化水素を含有する請求
項３記載の基質液。