JP2909316B2 - 酵素含有組成物及び酵素活性の安定化方法 - Google Patents

酵素含有組成物及び酵素活性の安定化方法

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JP2909316B2
JP2909316B2 JP4219975A JP21997592A JP2909316B2 JP 2909316 B2 JP2909316 B2 JP 2909316B2 JP 4219975 A JP4219975 A JP 4219975A JP 21997592 A JP21997592 A JP 21997592A JP 2909316 B2 JP2909316 B2 JP 2909316B2
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】一般的には、本発明は臨床化学に
関する。詳細には、本発明はクレアチンキナーゼ活性の
安定化方法に関する。
【0002】
【従来の技術】クレアチンキナーゼ(本明細書では、C
Kと略書きするが、またクレアチンホスホキナーゼ及び
CPKとして既知である)の活性を測定することは、進
行性筋ジストロフィー、皮膚筋炎及び心筋梗塞のような
疾患の診断に有用である。CKは、ヒト体液及び組織中
に、異なるイソ酵素の形状で存在し、例えば、筋肉では
CK−MM、脳ではCK−BB及び心筋ではCK−MB
が存在する。一般的には、CK−BBは血流中に移行し
ないので、健康なヒト血清中に存在するCK活性は、通
常CK−MMイソ酵素によるものである。健康なヒトで
は、一般的にはCK−MBは特定の器官、例えば、心筋
に限定される。しかしながら、心筋硬塞の場合のよう
に、心筋が傷害を受ける場合、CK−MBが血清中に放
出され、そしてその中から検出できる。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】血清中のCKもしくは
CK−MBの量を測定する臨床デバイスは、診断デバイ
スが適切に操作されているかどうかを示すために、常に
品質管理並びに較正を必要とする。このような品質管理
もしくは較正に用いられる組成物類(以下本明細書で
は、対照組成物と称される)は、既知活性のアッセイし
ようとする酵素を含有する。このような対照の酵素活性
が、時間に対応して、実質的に変化しないことが公理で
ある。更に、対照組成物中に存在する酵素が患者サンプ
ル中に存在する酵素と同様に挙動することが重要であ
る。
【0004】活性消失に対して酵素(例えば、クレアチ
ンキナーゼ)を保護する幾つかの試みは、何らかの方法
で酵素自身を修飾することに主に集中している。例え
ば、米国特許第4,931,392号明細書は、(a)
酵素のジスルフィド修飾、及び(b)クレアチンキナー
ゼに対する活性化炭水化物の共有結合、を含んで成る2
段階方法を教示する。
【0005】この方法に伴う課題は、対照酵素が変性さ
れ、従ってそれがヒト血清中に見い出される天然の酵素
とは異なることである。この変性された状態では、酵素
は、天然の生理学的活性酵素と同様に挙動もしくは反応
しないかもしれず、従って患者サンプル中の酵素活性は
予測されないかもしれない。このような差異は、不正確
な結果を導き出しうる。更に、このような変性された酵
素は、市販されておらず、そしてそれらの製造は、アッ
セイの総経費を増大するであろう。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明は、非反応性スル
フヒドリル基を有するタンパク質中、還元型状態でスル
フヒドリル基を有する酵素を含んで成る組成物を提供す
ることにより、上記課題を解決する。
【0007】また、本発明は、(a)非反応性であるス
ルフヒドリル基を有するタンパク質の水溶液を調製する
段階、及び(b)還元型状態でスルフヒドリル基を有す
酵素を前記水溶液に添加する段階、を含んで成る前記
酵素の活性を安定化させる方法を提供する。
【0008】また別の様相では、本発明は、請求項1も
しくは2の組成物の1つが較正用組成物として使用され
る、酵素活性を検出するためのデバイスを較正する方法
を提供する。
【0009】非反応性スルフヒドリル基を有するタンパ
ク質を含む溶液中における酵素活性の安定化を教示する
従来技術文献がないことに、本発明者らは気付いてい
る。従来技術方法は、酵素自体を修飾することを試みて
いる。発明者らの研究の経過中に、発明者らは、予期せ
ずに、溶液中に用いられるタンパク質のスルフヒドリル
基の反応性に依存して、酵素活性が変化することを見い
出した。
【0010】
【具体的な態様】本明細書で使用される「対照組成物」
の語は、一般的には、既知酵素活性を有する水性もしく
は凍結乾燥された組成物を表す。それは、酵素活性を試
験するための方法、分析要素もしくは装置の正確さを調
査するのに用いられる。対照組成物は、既知酵素活性を
有する標品として使用してもよく、又、それは、装置を
較正するのに用いてもよい。
【0011】「反応性スルフヒドリル基」の語は、酵素
上のスルフヒドリル基と反応できるタンパク質上の遊離
スルフヒドリル基を称する。「非反応性スルフヒドリル
基」は、実質的に反応性スルフヒドリル基を持たない
ンパク質を称する。
【0012】「修飾されたスルフヒドリル」の語は、タ
ンパク質上のスルフヒドリル基が遮断され(また、当該
技術分野では「保護され」と表される)、そしてそれに
より酵素上のスルフヒドリル基と非反応性にされたこと
を意味する。
【0013】酵素活性の安定性に影響を及ぼす重要な機
構は、酵素上の遊離スルフヒドリル基の酸化及びその結
果生じるジスルフィドの形成である。これらのスルフヒ
ドリルが還元型状態である場合、酵素は活性であり、酸
化型状態である場合、酵素は不活性である。
【0014】通常遭遇するほとんどのタンパク質は、遊
離スルフヒドリル基を含有する。これらのスルフヒドリ
ル基の1つ以上が、別の遊離スルフヒドリル基と反応で
き、そして酸化されうる。一般的には、酸化は、酵素活
性の消失をもたらす。
【0015】反応性スルフヒドリルを有する酵素が、反
応性タンパク質溶液中に保たれる場合、タンパク質上の
スルフヒドリル基と酵素上のスルフヒドリル基の間の反
応が、酵素上のスルフヒドリル基を酸化できると発明者
らは仮定した。従って、タンパク質由来の遊離スルフヒ
ドリルの排除は、酵素不活性化率を低減するであろう。
【0016】スルフヒドリル基は、多くの試薬類を用い
て非反応性にできる。下記本発明の具体例には、遮断さ
れたスルフヒドリル基を有するBSAの市販製剤を用い
た。スルフヒドリル基を遮断するのに有用な試薬として
は、ヨードアセテート、N−エチルマレイミド、5,
5′−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)
(Ellman試薬)、p−マーキュリベンゾエート(p−m
ercuribenzoate)、2−メルカプトエタ
ノール、シスチン、還元グルタチオン及びチオグリコレ
ートが挙げられる。これらの試薬の使用方法は、「The
Tools of Biochemistry 」、Terrence A. Cooper、(197
7)及び「Means and Teeney」タンパク質の化学修飾、Ho
lden and Day, Inc., (1977), に記載されているが、し
かしタンパク質溶液中のスルフヒドリル基が還元型状態
に維持されそして酵素上の遊離スルフヒドリル基と相互
作用しない限り、いずれかの方法が有用であるだろう。
いずれか過剰の遮断試薬(すなわち、スルフヒドリル基
を遮断しない遮断試薬)を酵素と反応しないように除去
することが重要である。
【0017】非反応性タンパク質の多様な製剤(スルフ
ヒドリル基を遮断することを意味する)は、商業的に入
手可能である。本発明の組成物は、非反応性にされたス
ルフヒドリル基を有するタンパク質基質で製造される。
このようなタンパク質は、動物の血清及び血清アルブミ
ン、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)より選ばれ
る。市販されている各種の製剤が存在し、そしてこれら
が精製され、分析され、そして製造業者らにより詳細に
記載されているように、より限定され、より一貫した材
料であるため、BSAが好ましい。このような材料を用
いる場合、結果は、再現可能である。
【0018】本発明の組成物に関して、発明者らは、研
究室で処理し、そして未修飾品種(grade) より十分に少
ない遊離スルフヒドリル基を有することが確認された、
スルフヒドリル修飾品種のBSA(Miles, Inc.) を用い
た。
【0019】本発明の酵素組成物は、4℃〜25℃で液
状で貯蔵できるのみならず、25℃までのいずれかの温
度で凍結乾燥した状態で貯蔵できる。従来技術の方法を
用いて、凍結乾燥状態から再構成された組成物は、冷蔵
温度でほんの数時間しか安定性を維持できない。思いが
けないことに、本発明方法に従って調製された酵素組成
物は、室温で7日間まで、そして冷蔵した場合には14
日間安定性を保持する。スルフヒドリル修飾タンパク質
溶液で調製されなかった別の組成物は、確実に酵素活性
が低減し始め、それらのほとんどが、室温で直ちに消失
する。
【0020】この発明は、非安定性酵素溶液が前述のよ
うであることを必要とせず、そして新たな調製方法で置
き換えられることを必要としていないので、この発明
は、酵素アッセイの再現性及び正確さを改良し、そして
このようなアッセイを遂行する経費を低減する。
【0021】
【実施例】材料: CK−MBは、Scripps 、カタログ#C1223、San
Diego 、CA 92131より得た。Scripps 由来のC
K−MBを、50%グリセロール、5ミリモル コハク
酸塩、10ミリモル 塩化ナトリウム、2ミリモル B
−メルカプトエタノール、1ミリモル EDTA中、約
pH7.0で安定化した。調製物を−20℃で貯蔵しそ
して貯蔵期間中光から保護することをすすめる。
【0022】本明細書に記載される実施例のタンパク質
溶液は、Miles. Inc., Kankakee, Il 60901 市販のスル
フヒドリル修飾BSAを含んで成る。Miles の製品カタ
ログは、スルフヒドリル修飾品種のBSAにおける遊離
スルフヒドリル修飾BSAがL−シスチンで遮断されて
いることを提示し、そして発明者らの研究室で行われた
試験は、このBSA品種が遊離スルフヒドリルをほとん
ど有さないもしくは全く有さないことを確認した。
【0023】酢酸マグネシウム、1,4−ピペラジンビ
ス(エタンスルホン酸)(PIPES)緩衝液、トリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)緩衝液
及びエチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、すべて市
販品である。総CKもしくはCKのCK−MBサブユニ
ットをアッセイするための乾式分析要素を、イーストマ
ン・コダック・カンパニー、臨床製品部門、ロチェスタ
ー、NY 14650より入手した。また、5,5′−
ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)をコダ
ックから入手した。
【0024】例1スルフヒドリル修飾非反応性BSAを用いたCK−MB
の組成物 本発明の組成物を製造するために、まずタンパク質溶液
を調製した。タンパク質溶液は、選択された酵素を除い
て、組成物のすべての成分から成る。貯蔵溶液の容量
は、必要とされる最終容量より約10%多い量で製造す
べきである。過剰のタンパク質溶液は、必要とされる酵
素濃度に最終組成物を調整するために使用する。
【0025】1,4−ピペラジンビス(エタンスルホン
酸)(PIPES緩衝液)(25ミリモル、シグマ P
−6757、MW=302.4)7.56g;酢酸マグ
ネシウム(3ミリモル、MW=214.46)0.64
34g;EDTA(1ミリモル、MW=372.23)
0.3722g;及びウシ血清アルブミン(Miles のス
ルフヒドリル修飾品種)30gを、イオン交換蒸留水
(以下本明細書では、水と称する)500mLに添加し、
そしてすべての成分が溶解するまで攪拌することによ
り、タンパク質溶液を調製した。水約100mLを添加
し、そして分間攪拌し続けた。クロラムフェニコール
(シグマ、C−0378)60mg;硫酸ゲンタマイシン
(U.S.バイオケミカル Corp.、カタログ#1605
1 CAS 1405−41−0)25mg;及びメチル
パラベン(p−ヒドロキシ安息香酸メチル、コダック)
1.50gを添加し、そして混合物を再度すべての成分
が溶解するまで攪拌した。その溶液を、10N NaO
Hで pH約7.0〜8.5まで調整し、そして25℃で
一晩冷蔵した。次いで溶液を容量1リットルのフラスコ
に移し、そして容量1リットルまで水を添加した。フラ
スコを反転してタンパク質溶液を混合した。
【0026】また、組成物の最終 pHが約7.0〜8.
5であり、そして緩衝剤が組成物の別の成分に悪影響を
及ぼさないことを条件として、別のモル濃度のPIPE
S緩衝液及び別の緩衝剤が有用である。また、別のマグ
ネシウム塩、例えば塩化マグネシウムを用いてもよい。
エチレングリコールビス(B−アミノエチルエーテル)
(EGTA)もしくは別の金属キレート化剤をEDTA
の代わりに用いてもよい。また、非反応性スルフヒドリ
ル基を有するいずれか適当なタンパク質を用いてもよ
い。また、微生物の成長に対してタンパク質溶液を保護
するために、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン及
びメチルパラベンの代わりに、別の抗生物質類もしくは
微生物成長の阻害剤類を用いてもよい。
【0027】組成物中、1〜500U/Lの間のCK−
MB活性を提供するのに十分なCK−MBをタンパク質
溶液に添加することにより、最終組成物を製造した。組
成物中の総タンパク質は約0.3〜約10.0g/dLで
あるが、好ましくは約0.7〜約5.0g/dLである。
【0028】更なる試験のために、上記組成物(スルフ
ヒドリル修飾BSA3g/dL含有、pH7.5)を2つ
に分け、下記更なる実験のために、1つ半量を冷蔵し、
残りの半量を室温で保存した。
【0029】A.冷蔵庫の温度で貯蔵されたCK−MB
の組成物 冷蔵(4℃)した例1の上記組成物の一部を、サンプル
Aと表示し、そしてCK−MB活性について100時間
に亘ってアッセイした。サンプルA10μLを、CK−
MBアッセイ用コダック・エクタケム(Ektachem)(商
標)分析要素上にスポットした。CK−MB活性をエク
タケム(商標)自動分析器で測定した。結果を図1に示
す。
【0030】B.室温で貯蔵したCK−MBの組成物 安定性試験を行う場合に当該技術分野で慣例であるよう
に、別に取っておいた例1記載の組成物の一部(サンプ
ルBと表示)は、熱的なストレスを受けるまで室温で貯
蔵した。サンプルDは、 pH7.0、反応性ヒト血清
5.3g/dLのタンパク質溶液で調製された従来技術由
来のCK組成物を表し、そしてそれは、還元剤、B−チ
オ−D−グルコース(3ミリモル)、ヒト心臓由来のC
K−MB及びヒト血清中に認められるCK−MMを含
む。サンプルB及びDを、サンプルAと同様の方法でC
K−MB活性についてアッセイした。
【0031】また、図1に示される結果は、本発明の組
成物が冷蔵されていようと、冷蔵されていなかろうと、
約96時間までCK−MB活性を保持することを具体的
に示している。約96時間冷蔵していない状態を維持さ
せた後でさえ、冷蔵していないサンプルは十分なCK−
MB活性を示す。サンプルD中の酵素活性は、0時間
(開始時間)から確実に減少した。
【0032】C.非反応性BSAの増加に伴うCK−MB安定性 CK−MB組成物を、スルフヒドリル修飾BSAの濃度
を増加させて例1のように調製した。また、タンパク質
を含まない対照を調製した。コダック・エクタケム(Ekt
achem)(商標)700分析器でCK−MB活性を測定す
る間、組成物を冷蔵したままにした。図2の結果は、タ
ンパク質溶液が、組成物中のCK−MBの活性を安定化
するのに必要とされることを示している。溶液中にタン
パク質が全く存在しない場合には、CK−MBの活性は
速やかに消失する。非反応性BSA3g/dLを用いた調
製物が、最も安定な酵素活性を有することが明らかであ
る。
【0033】例2 総CKを用いた組成物 本発明の組成物における総CK活性の長期間安定性を測
定する研究を行った。総CKは、サブユニットもしくは
イソ酵素、CK−MM、CK−MB、及びCK−BBを
含んで成る。
【0034】この試験では、CK−MB活性のアッセイ
用に先に規定された組成物、サンプルBにCK−MMを
添加してサンプルCを生成した。本試験用のCK−MM
は、Scripps 、カタログ#C1324より入手したが、
また別の供給源のCK−MMが有用であろう。コダック
・エクタケム(商標)CK分析要素を用いてコダック・
エクタケム(商標)自動分析器で測定したサンプルCの
初期のCK活性は、100U/Lであり、約25U/L
はCK−MBを表し、そして残りのCK活性はCK−M
Mとして表した。
【0035】サンプルDは、 pH7.0、反応性ヒト血
清5.3g/dLのタンパク質溶液で調製した従来技術の
CK組成物を表し、そしてそれは、還元剤、B−チオ−
D−グルコース(3ミリモル)、ヒト心臓由来のCK−
MB、及びヒト血清中に認められるCK−MMを含む。
両サンプルC及びDを、熱的ストレスを受けるまで室温
で貯蔵し、そして7日間に亘ってCK活性安定性につい
て試験した。試験期間の継続時間が異なることを除い
て、この試験を例1のように行った。
【0036】図3に、本発明の組成物(サンプルC)及
び従来技術の組成物(サンプルD)の総CK活性の安定
性を示す。図3のグラフは、本発明のCK組成物が7日
後にCK活性消失をわずかしか示さず、同時に、従来技
術の組成物が非常に早い日時から確実に低減されること
を示している。これらの結果は、本発明方法が、総CK
と同様にCK−MBに適応できることを具体的に示して
いる。
【0037】
【発明の効果】還元型状態でスルフヒドリル基を有する
酵素は、非反応性スルフヒドリル基を有するタンパク質
中で安定化される。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明の2つの組成物(一方は冷蔵し
たものであり、もう一方は、室温で保存したものであ
る)についての経過時間に対応するCK−MB活性を示
すグラフである。
【図2】図2は、多様な濃度のスルフヒドリル修飾ウシ
血清アルブミン(BSA)を含む各種の組成物について
の経過時間に対応するCK−MB活性を示すグラフであ
る。
【図3】図3は、本発明の組成物及び従来技術の組成物
についての総CKの安定性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 9/96 BIOSIS(DIALOG) EPAT(QUESTEL) WPI(DIALOG)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 非反応性スルフヒドリル基を有するタン
    パク質中に、還元型状態でスルフヒドリル基を有する酵
    素を含んで成る組成物。
  2. 【請求項2】 (a)非反応性であるスルフヒドリル基
    を有するタンパク質及び(b)クレアチンキナーゼ、を
    含んで成る組成物。
  3. 【請求項3】 請求項1もしくは2の組成物の1つが較
    正用組成物として使用される、酵素活性を検出するため
    のデバイスを較正する方法。
  4. 【請求項4】 (a)非反応性であるスルフヒドリル基
    を有するタンパク質の水溶液を調製する段階、及び
    (b)還元型状態でスルフヒドリル基を有する酵素を
    記水溶液に添加する段階、を含んで成る前記酵素の活性
    を安定化させる方法。
  5. 【請求項5】 (a)非反応性であるスルフヒドリル基
    を有するタンパク質の水溶液を調製する段階、及び
    (b)クレアチンキナーゼを溶液に添加する段階、を含
    んで成るクレアチンキナーゼの活性を安定化させる方
    法。
JP4219975A 1991-08-20 1992-08-19 酵素含有組成物及び酵素活性の安定化方法 Expired - Lifetime JP2909316B2 (ja)

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