CN1904062B - 肌酸激酶活性测定用试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含有环己二胺四醋酸(以下称CyDTA)和SH化合物的CK活性测定用试剂以及SH化合物的稳定方法。其特征是让CyDTA与SH化合物共存于试剂中。
Description
技术领域
本发明涉及用于测定试样中的肌酸激酶(CK)活性的试剂以及稳定含有SH基的化合物(以下称SH化合物)的方法。
背景技术
CK是由二个亚组构成的二聚物的磷酸酶。CK的亚组中有B型(脑型)和M型(肌型)两种。CK因两种亚组组合，而存在三种不同的异酶(CK-MM、CK-MB和CK-BB)，CK-MM多含于筋骨，CK-MB多含于心肌，CK-BB多含于脑中。因心肌梗塞和肌肉营养不良等疾病，本存在于发病部位的CK异酶会流失到血液中，因此，在临床检查中存在于血清和血浆等试样中的CK的活性值就成为诊断上述疾病的重要指标。
CK在血液中会迅速钝化，故从生物抽取的试样中要加入SH化合物活化CK后再进行活性测定。因此，CK活性测定用试剂中含有N-乙酰-L-半胱氨酸(以下称NAC)和硫代丙三醇等SH化合物。
SH化合物为不稳定物质，试剂保存过程中SH基渐渐被氧化，从而使SH化合物变质。因此，试剂要有稳定SH化合物的物质。一般使用螯合剂来稳定SH化合物。作为稳定SH化合物的螯合剂已知有二亚乙基三胺五醋酸(DTPA)(Japanese Laid-open Patent：11-032798)。然而，DTPA虽然可以使SH化合物稳定，但试剂保存期间试剂本身的吸光度会提高。因此，试剂与试样刚混合后的吸光度(初期吸光度)也会升高，测定的精确度有时会因此而下降。
发明内容
本发明的目的在于提供含有可以防止试剂溶液中的SH化合物变质及抑制试剂自身吸光度提高的螯合剂的CK活性测定用试剂，提供使用这种螯合剂稳定SH化合物的方法。
本发明提供含有环己二胺四醋酸(以下称CyDTA)和SH化合物的CK活性测定用试剂。
同时，本发明还提供SH化合物的稳定方法，其特征是让CyDTA与SH化合物共存于试剂中。
本发明可以提供保存稳定性优越的CK活性测定用试剂，该试剂中含有的螯合剂可以使SH化合物稳定，还能抑制试剂本身的吸光度提高。
附图说明
图1：显示CK活性测定的反应历程的模式图。
具体实施方式
本实施方式的CK活性测定用试剂含有CyDTA和SH化合物。CyDTA为白色粉末状，化学名称为环己二胺四醋酸(trans-1，2-Diaminocyclohexane-N，N，N’，N’-tetraacetic acid)，有螯合作用。试剂中的CyDTA浓度以能稳定SH化合物为准，并无特别要求。本明细书中的“CyDTA”含有CyDTA的盐。所谓CyDTA的盐，有CyDTA的钾盐、钠盐、镁盐等。
作为SH化合物没有特定，只要可以活化试样中的CK即可，比如可以使用：N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、N-鸟苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤藓糖醇、巯基醋酸、2-巯基乙醇、溴2-氨乙基异硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)2-巯基乙烷磺酸及硫代丙三醇。这些SH化合物也可以组合两种以上使用，但最好单独使用。混合试样和试剂的反应液中的SH化合物的浓度(最终浓度)为0.1～200mM，优选10～100mM。
关于CK活性测定用试剂的溶液状态下的pH值并无特定，但最好是5.0～10.0。要维持pH值，最好让试剂中含有缓冲剂。
作为缓冲剂可以使用树枝状盐酸缓冲剂、咪唑醋酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、草酸缓冲剂、酞酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、碳酸缓冲剂等良好缓冲剂等。
CK活性测定用试剂中最好含有：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。
CK活性测定用试剂既可以将各种成份冻结干燥为固态也可以将其溶解在溶液里形成液态。
含有G6PDH的试剂可由第一试剂和第二试剂两个试剂组成，这时第一试剂和/或第二试剂可以是冻结干燥状态，两个试剂也可以是液态。CyDTA和SH化合物可以在第一试剂和第二试剂的任何一个当中，也可含在两个试剂当中，但最好是在第一试剂当中。
当CK活性测定用试剂是由第一试剂和第二试剂组成的套装试剂时，最好第一试剂中含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、环己二胺四醋酸(CyDTA)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)、镁离子及SH化合物，第二试剂含有磷酸肌酸。第一试剂可以将上述物质溶解在蒸馏水等适当的溶剂中来配制，第二试剂可以将磷酸肌酸溶解在蒸馏水等适当的溶剂中配制。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、乙糖激酶(HK)和葡萄糖激酶(GK)其来源无特定，可以来自细菌、酵母、动植物等，也可来源于用基因重组技术生成的物质。G6PDH的最终浓度为0.5～40U/ml之间，最好是1～10U/ml。HK或GK的最终浓度为0.5～20U/ml之间，最好为1～6U/ml。
本实施方式的CK活性测定用试剂的测定对象是试剂中含有的全部CK的活性、CK-MM的活性、CK-MB的活性和CK-BB的活性之中的任意一个。在临床检查中一般是测定试剂中的全部CK的活性或CK-MB的活性。通过在CK活性测定用试剂中加入与CK的M型亚组特异缔合的抗体(以下称抗CK-M抗体)，即可测定试剂中的CK-MB的活性(Wurzburg et al.，1977，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，15：131-135)。作为抗CK-M抗体，只要是能特别识别M型亚组的抗体，它既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，还可以将二者混合起来使用。另外，还可以使用抗体的碎片及其衍生物。抗体的碎片及其衍生物具体来说有：Fab，Fab’，F(ab)2以及sFv碎片等(Blazar et al.，1997，J.Immunol.，159：5821-5833及Bird et al.，1988，Science，242：423-426)。抗体的次类并不限定于IgG，也可以是IgM等。
用于测定的试样，可以是血清，血浆、血液、髓液、尿液和精液等，以血浆或血清为好。
下面就CK活性测定的反应过程进行说明。
在含有CK的试样中加入含有上述成份的CK活性测定用试剂，将出现如图1所示的反应。在图1中，被SH化合物活化的CK催化了由磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP的反应(反应1)。含在试剂中的HK或GK又会从含在试剂中的葡萄糖和反应1生成的ATP生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP(反应2)。含在试剂中的G6PDH又从反应2中生成的G6P和NAD或NADP生成6-磷酸葡萄糖酸δ-内酯和NADH或NADPH(反应3)。NADH或NADPH生成后试样和试剂的混合液中波长340nm附近的吸光度就会升高。监视此吸光度升高过程，就可以测定试样中的CK的活性。
如上所述，试剂中的SH化合物在试剂的保存过程中会逐渐变质，因此必须使其稳定。通常，螯合剂都是以稳定SH化合物为目的添加到试剂中的。作为这种螯合剂的一种，二亚乙基三胺五醋酸(DTPA)可以防止长期保存试剂时SH化合物变质，但是，试剂在保存过程中自身的吸光度会升高。而乙二胺四醋酸(EDTA)可以做到试剂即使长期保存，其自身的吸光度也不会升高，但是不能有效地控制SH化合物的变质。当用经过长期保存的含有EDTA的试剂测定CK活性很高的试样的CK活性时，由于保存过程中试剂中的SH化合物已经变质，无法充分地活化含在试样中的CK，从而导致有时无法准确地测定。
通过让CyDTA和SH化合物在CK活性测定用试剂中共存，可以控制试剂在长期保存过程中SH基变质。CyDTA还可以控制试剂本身吸光度的升高。而且，含有CyDTA的CK活性测定用试剂即使测定CK活性很高的试样，也可以控制S H化合物的变质，故能准确地测定CK活性。
最好在CK活性测定用试剂中加入镁离子。在试剂中添加镁盐，即可使试剂含有镁离子。作为镁盐可以使用醋酸镁、硫酸镁、氯化镁等。
也可以在试剂中添加有防腐剂和表面活性作用的化合物。作为防腐剂，比如可以使用叠氮化钠等。有表面活性作用的化合物可使用非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂和白朊等，具体地说，可以使用三通类(Union Carbide Chemicals andPlastics Co.的注册商标)、乳液类(花王(株)的注册商标)、牛血清白蛋白(BSA)等等。
试样中有时会含有腺嘌呤脱氨酶。腺嘌呤脱氨酶特别是多含在溶血试样中，给CK的活性测定带来负面影响。为了避免这种负面影响，最好在试剂中添加阻止腺嘌呤脱氨酶作用的抑制剂。对抑制剂种类并无特定，只要是抑制腺嘌呤脱氨酶作用的东西即可，比如可以用腺苷一磷酸(AMP)和P1P5二腺苷-5’-五氯乙烷酸(AP5A)等。
用双动法测定活性也可以避免腺嘌呤脱氨酶的负面影响。所谓双动法就是先测定腺嘌呤脱氨酶的活性，然后添加磷酸肌酸，让CK进行酶反应，再测定试样中的激酶的活性(CK活性和腺嘌呤脱氨酶活性之和)。这些测定结果的差即为CK的活性值。
(实施例1)
将下列物质溶解到蒸馏水中，使之达到如下浓度。
咪唑 125mM
醋酸镁 12.5mM
ADP 2.5mM
AMP 6.25mM
AP5A 12.5μM
葡萄糖 25mM
NADP 2.5mM
硫代丙三醇44mM
G6PDH 1875U/L
乙糖激酶 3750U/L
另，溶液的pH调整为6.6。
在上述溶液中添加CyDTA，配制出CyDTA浓度不同的三种CK活性测定用试剂。这些试剂的CyDTA浓度分别为1mM、2mM及4mM。对这些试剂以37℃施加5天的温度负荷，试剂中的SH基的残留量即定量完毕。
CK活性测定用试剂由上述试剂(第一试剂)和含有磷酸肌酸的试剂(第二试剂)组成，但本实施例中因对上述试剂施加温度负荷，以评价硫代丙三醇的稳定性，故不使用第二试剂。
SH基的定量是用DTNB5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5，5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))做的。在试剂中添加DTNB，如果有SH化合物，则相当于SH化合物所含SH基的量的二硫化物键断裂，产生5-巯基-2-硝基苯(甲)酸。5-巯基-2-硝基苯(甲)酸一产生，则波长412nm处的吸光度升高，测定之以定量试剂中的SH基。
(比较例1～6)
比较例1中，给在-80℃保存过的上述试剂的SH基做了定量。在此，没有添加螯合剂，也没有施加温度负荷。
比较例2中，除不添加螯合剂外，其他与实施例1一样对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。
比较例3中，除在上述成份添加了二亚乙基三胺五醋酸(DTP
A)而非环己二胺四醋酸(CyDTA)，以配制DTPA浓度不同的三种试剂以外，其他与实施例1相同，对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。试剂的DTPA浓度分别为1mM、2mM和4mM。
比较例4中，除添加乙二醇乙二胺四醋酸(GEDTA)而非CyDTA，以配制GEDTA浓度不同的三种试剂外，其他与实施例1相同，对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。试剂的GEDTA浓度分别为1mM、2mM和4mM。
比较例5中，除添加乙二胺四醋酸(EDTA)而非CyDTA，以配制EDTA浓度不同的三种试剂外，其他与实施例1相同，对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。试剂的EDTA浓度分别为1mM、2mM和4mM。
比较例6中，除添加乙二胺四乙酸醇(EDTA-OH)而非CyDTA，以配制EDTA-OH浓度不同的三种试剂外，其他与实施例1相同，对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。试剂的EDTA-OH浓度分别为1mM、2mM和4mM。
比较例7中，除添加乙二胺双乙酸(EDDA)而非CyDTA，以配制EDDA浓度不同的三种试剂外，其他与实施例1相同，对残留硫代丙三醇的SH基进行了定量。试剂的EDDA浓度分别为1mM、2mM和4mM。
实施例1和比较例1～7的测定结果如下表1所示。在表1中，硫代丙三醇的残余量用百分率表示。这些值是相对于比较例1的测定结果的数值。
表1
| 螯合剂 | 温度负荷 | 添加浓度(mM) | SH基残留量 | |
| 实施例1 | CyDTA | 37℃ 5天 | 1 | 87.9 |
| 2 | 83.1 | |||
| 4 | 84.6 | |||
| 比较例1 | 无添加 | 无 | 0 | 100.0 |
| 比较例2 | 无添加 | 37℃ 5天 | 0 | 71.4 |
| 比较例3 | DTPA | 37℃ 5天 | 1 | 90.2 |
| 2 | 87.7 | |||
| 4 | 83.0 | |||
| 比较例4 | GEDTA | 37℃ 5天 | 1 | 74.0 |
| 2 | 72.7 | |||
| 4 | 68.4 | |||
| 比较例5 | EDTA | 37℃ 5天 | 1 | 75.7 |
| 2 | 72.0 | |||
| 4 | 77.8 |
| 螯合剂 | 温度负荷 | 添加浓度(mM) | SH基残留量 | |
| 比较例6 | EDTA-OH | 37℃ 5天 | 1 | 75.2 |
| 2 | 85.2 | |||
| 4 | 77.5 | |||
| 比较例7 | EDDA | 37℃ 5天 | 1 | 68.0 |
| 2 | 70.2 | |||
| 4 | 70.8 |
从实施例1和比较例2～7的测定结果可以看出，含有CyDTA的试剂(实施例1)和含有DTPA的试剂(比较例3)比不含螯合剂的试剂和含有其他螯合剂的试剂其施加温度负荷后的SH基的残留量多，即在上述试剂中添加DTPA或CyDTA可以提高硫代丙三醇的保存稳定性。
(实施例2)
将下列物质溶解在蒸馏水中，使其浓度如下，配制CK活性测定用试剂的第一试剂和第二试剂，用这些试剂测定初期吸光度。
<第一试剂>pH 6.6
咪唑 125mM
醋酸镁 12.5mM
ADP 2.5mM
AMP 6.25mM
AP5A 12.5μM
葡萄糖 30mM
NADP 2.5mM
NAC 44mM
G6PDH 1875U/L
乙糖激酶 3750U/L
CyDTA 2mM
<第二试剂>pH9.0
磷酸肌酸 150mM
用日立7170S型自动分析仪将180μl第一试剂、45μl第二试剂和不含CK的生理盐水试样5.6μl混合，测定在波长340nm处的吸光度。
分别用在4℃下保存1周的第一试剂、在4℃下保存2周的第一试剂、在4℃下保存3周的第一试剂和在4℃下保存4周的第一试剂用上述同样方法测定初期吸光度。
(比较例8～13)
在上述第一试剂的成份中不是添加了CyDTA，而是添加其他种类的螯合剂，测定初期吸光度。
比较例8除添加2mM二亚乙基三胺五醋酸(DTPA)取代CyDTA外，其他与实施例2相同，测定初期吸光度。
比较例9除添加2mM乙二醇乙二胺四醋酸(GEDTA)取代CyDTA外，其他与实施例2相同，测定初期吸光度。
比较例10除添加2mM EDTA取代CyDTA外，其他与实施例1相同，测定初期吸光度。
比较例11除添加2mM乙二胺四乙酸醇(EDTA-OH)取代CyDTA外，其他与实施例1相同，测定初期吸光度。
比较例12除添加2mM乙二胺双乙酸(EDDA)取代CyDTA外，其他与实施例1相同，测定初期吸光度。
比较例13除添加2mM腈三醋酸(NTA)取代CyDTA外，其他与实施例1相同，测定初期吸光度。
实施例2和比较例8～13的测定结果如下表2所示。表2中的值是将测定的吸光度增大10000倍后的值，而且，上升率一栏中用百分率表示保存4周后的初期吸光度比刚配制完的试剂的初期吸光度升高了多少。表2
| 刚配制完 | 1周后 | 2周后 | 3周后 | 4周后 | 上升率％ | |
| 实施例2(添加CyDTA) | 1378 | 1501 | 1552 | 1555 | 1578 | 14.6 |
| 比较例8(添加DTPA) | 1408 | 1593 | 1689 | 1725 | 1748 | 24.1 |
| 比较例9(添加GEDTA) | 1397 | 1615 | 1737 | 1786 | 1836 | 31.4 |
| 比较例10(添加EDTA) | 1354 | 1433 | 1481 | 1515 | 1543 | 14.0 |
| 比较例11(添加EDTA-OH) | 1376 | 1461 | 1480 | 1498 | 1524 | 10.7 |
| 比较例12(添加EDDA) | 1500 | 1582 | 1718 | 1774 | 1820 | 21.3 |
| 比较例13(添加NTA) | 1383 | 1518 | 1604 | 1671 | 1728 | 25.0 |
从实施例2和比较例8～13的测定结果可以看出，添加了CyDTA的试剂(实施例2)、添加EDTA的试剂(比较例10)和添加EDTA-OH的试剂(比较例11)比含有其他螯合剂的试剂经长期保存后的初期吸光度的上升率低，即CyDTA、EDTA和EDTA-OH可以控制试剂本身吸光度的升高。
(实施例3)
用在实施例2中配制的第一试剂和第二试剂测定含约2000U/l CK的试样的C K活性。
用日立7170S型自动分析仪将180μl第一试剂、45μl第二试剂和5.6μl试样混合，测定340nm处的吸光度，计算出试样中所含CK的活性值。
分别用在4℃下保存了2周的第一试剂和在4℃下保存了4周的第一试剂象上述一样，计算出CK的活性值。
(比较例14～19)
比较例14，除使用比较例8中配制的第一试剂外，其他与实施例3一样，计算出CK的活性值。
比较例15，除使用比较例9中配制的第一试剂外，其他与实施例3相同，计算出CK的活性值。
比较例16，除使用比较例10中配制的第一试剂外，其他与实施例3相同，计算出CK的活性值。
比较例17，除使用比较例11中配制的第一试剂外，其他与实施例3相同，计算出CK的活性值。
比较例18，除使用比较例12中配制的第一试剂外，其他与实施例3相同，计算出CK的活性值。
比较例19，除使用比较例13中配制的第一试剂外，其他与实施例3相同，计算出CK的活性值。
实施例3和比较例14～19的测定结果如表3所示。下降率一栏中用百分率显示了保存4周后的试剂的CK活性值比刚配制完的值下降多少。
表3
| 刚配制完 | 2周后 | 4周后 | 下降率％ | |
| 实施例3(添加CyDTA) | 2005 | 1985 | 1945 | 2.99 |
| 比较例14(添加DTPA) | 2011 | 2005 | 1966 | 2.24 |
| 比较例15(添加GEDTA) | 2010 | 1989 | 1917 | 4.63 |
| 比较例16(添加EDTA) | 2016 | 1974 | 1901 | 5.68 |
| 比较例17(添加EDTA-OH) | 2022 | 1948 | 1917 | 5.19 |
| 刚配制完 | 2周后 | 4周后 | 下降率％ | |
| 比较例18(添加EDDA) | 1992 | 1948 | 1890 | 5.10 |
| 比较例19(添加NTA) | 2027 | 1945 | 1855 | 8.47 |
从实施例3和比较例14～19的测定结果可以看出，添加CyDTA的试剂(实施例3)和添加DTPA的试剂(比较例14)比含有其他螯合剂的试剂保存4周后的测定值的下降率很小，即使用添加了CyDTA或DTPA的试剂，即使长期保存也可以准确测定CK活性。
从实施例1、2、3和比较例1～18可以知道，含有CyDTA的试剂在SH化合物保存稳定性方面具有优越性；即使长期保存，试剂自身的吸光度也不会大幅度升高；而且用这种试剂，即使是CK活性值很高的试样也能准确测定其活性。
Claims (10)
1.一种肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：含有环己二胺四醋酸和含SH基的化合物。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述含SH基的化合物是选自N-乙酰-L-半胱氨酸、N-鸟苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤藓糖醇、巯基醋酸、2-巯基乙醇、溴2-氨乙基异硫糖醛、2-巯基乙烷磺酸及硫代丙三醇中的至少一种。
3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：还含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸及磷酸肌酸中的至少一种化合物。
4.如权利要求2所述的试剂，其特征在于：还含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸及磷酸肌酸中的至少一种化合物。
5.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：还含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸及磷酸肌酸。
6.如权利要求2所述的试剂，其特征在于：还含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸及磷酸肌酸。
7.如权利要求1-6中任一所述的试剂，其特征在于：含有与肌酸激酶M型亚组特异缔合的抗体。
8.一种套装肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：包括二种试剂，其分别是含有环己烷二胺四醋酸、含SH基的化合物、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸的第一试剂和含有磷酸肌酸的第二试剂。
9.一种稳定含SH基化合物的方法，其特征在于：使环己二胺四醋酸与含SH基化合物共存于同一试剂中。
10.一种配制含第一试剂和第二试剂的套装肌酸激酶活性测定用试剂的方法，其特征在于：该试剂的配制步骤如下：
a)将环己二胺四醋酸、含SH基的化合物以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、二磷酸吡啶核苷酸或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸溶解在溶液中配制第一试剂；
b)将磷酸肌酸溶解在溶液中配制第二试剂。
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