CN104374905B - 一种血清肌酸激酶检测试剂 - Google Patents

一种血清肌酸激酶检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肌酸激酶检测试剂。本发明的试剂是由试剂R1和试剂R2按照体积比4：1的比例组成的，其中试剂R1是由咪唑缓冲液、葡萄糖、纳米粒子、N-乙酰半胱氨酸、乙二胺四乙酸二钠、腺苷二磷酸、辅酶Ⅰ、腺嘌呤核糖核苷酸、丙酮酸脱羧酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、己糖激酶和十二烷基苯磺酸钠组成的，试剂R2是由咪唑缓冲液、磷酸肌酸、防腐剂和十二烷基苯磺酸钠组成的。本发明的肌酸激酶检测试剂中添加丙酮酸脱羧酶和γ-Fe2O3纳米粒子，可有效清除血清样本中的干扰物质，十二烷基苯磺酸钠配合乙二胺四乙酸二钠螯合血清样本中的金属离子，减少对反应酶的影响，是一种稳定、准确、敏感、抗干扰性强的检测试剂。

Description

一种血清肌酸激酶检测试剂
技术领域
本发明涉及一种涉及生物试剂，具体涉及一种检测试剂，尤其涉及一种血清肌酸激酶检测试剂。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK) (ATP: Creatine N-phosphotransferase EC 2.7.3.2)又名磷酸肌酸激酶(CPK)。CK主要存在于骨骼肌、脑和心肌中。肌酸激酶对诊断急性心肌梗死有较高价值。通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、腺嘌呤核苷三磷酸 （ATP）再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。CK活性增高：主要见于心肌梗塞及各种类型进行性肌萎缩、骨胳肌损伤、肌营养不良、急性心肌炎、脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能减退、剧烈运动、使用氯丙嗪、青霉素等药物。CK活性的测定对以上疾病的诊断具有重要的价值。
CK活力的测定大多都是根据Oliver所建立的酶促体系，以后Rosalki等又加以改进。一般有两种反应过程，可任选其一，其中（1）反应过程是可逆性反应，（2）是不可逆反应。
现在国内较多应用反应（1）作为检测的方法，反应（1）中利用CK催化产生ATP的效果，通过一连串反应，最终在340nm的波长检测NADH的含量，获得CK的酶活力。常规的试剂检测时经常因为样本中存在的丙酮酸、肝素等干扰物，影响检测结果的准确性，进而影响了试剂在市场上的应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种准确度高、稳定性好、抗干扰能力强的血清肌酸激酶检测试剂。
本发明采用的技术方案如下：
一种血清肌酸激酶检测试剂是由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
所述的，试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 50-100 mmo1
葡萄糖 20-50mmo1
纳米粒子 10-50mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 20-30mmo1
乙二胺四乙酸二钠 1-10mmo1
腺苷二磷酸 1-10mmo1
辅酶Ⅰ 1-10mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 10-30mmo1
丙酮酸脱羧酶 0.5-2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2-5KU
己糖激酶 2-5KU
十二烷基苯磺酸钠 1-20g
去离子水加至1L；
所述的，试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 50-100mmo1
磷酸肌酸 100-200mmo1
防腐剂 1-10g
十二烷基苯磺酸钠 1-20g
去离子水加至1L。
所述的，纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径为3-50nm。
所述的，防腐剂为叠氮化钠、Proclin300中的一种或是两种的混合物。
所述的，咪唑缓冲液的pH值为6.5-7.5。
优选的，试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 70 mmo1
葡萄糖 30mmo1
纳米粒子 30mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 25mmo1
乙二胺四乙酸二钠 6mmo1
腺苷二磷酸 10mmo1
辅酶Ⅰ 5mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 20mmo1
丙酮酸脱羧酶 1.2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 4KU
己糖激酶 3KU
十二烷基苯磺酸钠 10g
去离子水加至1L。
优选的，试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 80mmo1
磷酸肌酸 150mmo1
防腐剂 5g
十二烷基苯磺酸钠 10g
去离子水加至1L。
本发明一种血清肌酸激酶检测试剂的使用方法为：配制试剂R1和试剂R2，先将试剂R1于全自动生化分析仪37℃预孵育3分钟，再将试剂R2加至试剂R1中，混匀后于全自动生化分析仪37℃孵育5分钟，试剂R1和试剂R2的体积比为4:1，调整生化分析仪的参数，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道校准品和样本，测定肌酸激酶的活力。
本发明的优点：
1.本发明采用双试剂的方式，反应时先利用试剂R1中的丙酮酸脱羧酶将血清样本中的干扰物质（如丙酮酸、肝素）去除，γ-Fe2O3纳米粒子可增强丙酮酸脱羧酶的活性，使得反应进行的更加彻底，有效清除血清样本中的干扰物质，以保证试剂R2对肌酸激酶进行检测时结果的准确性。
2.本发明的试剂中添加了阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠配合乙二胺四乙酸二钠螯合血清样本中的金属离子，减少对反应酶的影响，提高检测的准确性和稳定性。
3.本发明的试剂中加入防腐剂确保了试剂的稳定性，使试剂达到临床应用要求。
4.本发明的试剂是一种稳定、准确、敏感、抗干扰性强的肌酸激酶检测试剂。
附图说明
图1为本发明实施例1的相关性检测结果；
图2为本发明实施例2的相关性检测结果；
图3为本发明实施例3的相关性检测结果；
图4为本发明实施例4的相关性检测结果；
图5为本发明实施例1至4的稳定性检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
以下实施例所用试剂原料均为市售分析纯。
实施例 1
一种血清肌酸激酶检测试剂是由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=6.5） 50 mmo1
葡萄糖 50mmo1
纳米粒子 50mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 20mmo1
乙二胺四乙酸二钠 1mmo1
腺苷二磷酸 5mmo1
辅酶Ⅰ 10mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 10mmo1
丙酮酸脱羧酶 0.5KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 5KU
己糖激酶 2KU
十二烷基苯磺酸钠 1g
去离子水加至1L；
试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.5） 100mmo1
磷酸肌酸 100mmo1
叠氮化钠 1g
十二烷基苯磺酸钠 20g
去离子水加至1L。
纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径为3nm。
本实施例肌酸激酶检测试剂的使用方法为：配制试剂R1和试剂R2，先将试剂R1于东芝40全自动分析仪37℃预孵育3分钟，再将试剂R2加至试剂R1中，混匀后于全自动生化分析仪37℃孵育5分钟，试剂R1和试剂R2的体积比为4:1，调整生化分析仪的参数，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道校准品和样本，先通过检测蒸馏水和朗道校准品获得校准品检测的吸光度变化，根据朗道校准品肌酸激酶试剂的靶值（220U/L），得到试剂的K因子，之后根据全自动生化分析仪测定样本的吸光度，计算即可获得样本的肌酸激酶浓度。具体操作如表1所示。
表1 肌酸激酶检测试剂的使用方法
计算：肌酸激酶活力（U/L）＝（∆A测定/min÷∆A校准/min）×C校准
实施例 2
一种血清肌酸激酶检测试剂是由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.5） 70mmo1
葡萄糖 30mmo1
纳米粒子 30mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 25mmo1
乙二胺四乙酸二钠 6mmo1
腺苷二磷酸 10mmo1
辅酶Ⅰ 5mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 20mmo1
丙酮酸脱羧酶 1.2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 4KU
己糖激酶 3KU
十二烷基苯磺酸钠 10g
去离子水加至1L；
试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=6.5） 80mmo1
磷酸肌酸 150mmo1
Proclin300 5g
十二烷基苯磺酸钠 10g
去离子水加至1L。
纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径为50nm。
一种血清肌酸激酶检测试剂的使用方法同实施例1。
实施例 3
一种血清肌酸激酶检测试剂是由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.0） 100 mmo1
葡萄糖 20mmo1
纳米粒子 10mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 30mmo1
乙二胺四乙酸二钠 10mmo1
腺苷二磷酸 1mmo1
辅酶Ⅰ 1mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 30mmo1
丙酮酸脱羧酶 2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2KU
己糖激酶 5KU
十二烷基苯磺酸钠 20g
去离子水加至1L；
试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.0） 50mmo1
磷酸肌酸 200mmo1
叠氮化钠 5g
Proclin300 5g
十二烷基苯磺酸钠 1g
去离子水加至1L。
纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径为25nm。
一种血清肌酸激酶检测试剂的使用方法同实施例1。
实施例 4
一种血清肌酸激酶检测试剂是由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.0） 100 mmo1
葡萄糖 20mmo1
N-乙酰半胱氨酸 30mmo1
乙二胺四乙酸二钠 10mmo1
腺苷二磷酸 1mmo1
辅酶Ⅰ 1mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 30mmo1
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2KU
己糖激酶 5KU
去离子水加至1L；
试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液（pH=7.0） 50mmo1
磷酸肌酸 200mmo1
叠氮化钠 5g
Proclin300 5g
十二烷基苯磺酸钠 1g
去离子水加至1L。
一种血清肌酸激酶检测试剂的使用方法同实施例1。
相关性检测结果
选择同一高值血清样本，该血清样本应用肝素钠采血管处理，检验机构确定样本中肌酸激酶的浓度为1026U/L，该样本用生理盐水进行稀释，稀释梯度如表2所示。
表2 对样本梯度稀释体积比
样本浓度（X） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
生理盐水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
浓度 X 0.8X 0.6X 0.4X 0.2X 0
分别利用实施例1至4制得的试剂对各浓度梯度样本进行检测，结果如图1至4所示。
由图1至4可知，实施例1、2、3随稀释浓度呈线性变化，相关系数分别为r=0.99487、r=0.9999和r=0.99685，说明实施例1、2、3的试剂对于各个浓度的样本检测结果都比较准确，而且能够检测到1000U/L以上浓度的样本。对比而言，实施例4的线性相关系数为r=0.9732，远远小于0.9900，线性相关性很差，主要原因是样本中存在干扰物质，影响了检测结果的准确性，而本发明制得的试剂中添加了丙酮酸脱羧酶和γ-Fe2O3纳米粒子，将血清样本中的干扰物质（如丙酮酸、肝素）去除，另外发明中加入表面活性剂十二烷基苯磺酸钠配合乙二胺四乙酸二钠螯合血清样本中的金属离子，减少对反应酶的影响，提高检测的准确性。
稳定性检测结果
将试剂放置在4℃冰箱中，跟踪试剂的稳定性，对同一稳定样本，分别利用实施例1至4制得的试剂进行检测，每季度定时检测一次，跟踪检测5个季度（15个月），检测结果如图5所示。
由图5可知，随着时间的推移，试剂的检测结果在衰减，但是对比而言，实施例1、2、3的试剂稳定性明显比实施例4的试剂要好，这说明加入十二烷基苯磺酸钠后，试剂的稳定性明显提高。
本领域技术人员应该理解，在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对这些实施例进行各种修改和变换。

Claims (5)

1.一种血清肌酸激酶检测试剂，其特征在于，该试剂由试剂R1和试剂R2，按照体积比4：1的比例组成的；
所述试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 50-100 mmo1/L
葡萄糖 20-50mmo1
纳米粒子 10-50mmol
N-乙酰半胱氨酸 20-30mmo1
乙二胺四乙酸二钠 1-10mmo1
腺苷二磷酸 1-10mmo1
辅酶Ⅰ 1-10mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 10-30mmo1
丙酮酸脱羧酶 0.5-2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2-5KU
己糖激酶 2-5KU
十二烷基苯磺酸钠 1-20g
去离子水加至1L；
所述纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，其粒径为3-50nm；
所述试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 50-100mmo1/L
磷酸肌酸 100-200mmo1
防腐剂 1-10g
十二烷基苯磺酸钠 1-20g
去离子水加至1L。
2.根据权利要求1所述的肌酸激酶检测试剂，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、Proclin300中的一种或是两种的混合物。
3.根据权利要求1所述的肌酸激酶检测试剂，其特征在于，所述咪唑缓冲液的pH值为6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的肌酸激酶检测试剂，其特征在于，所述试剂R1是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 70 mmo1/L
葡萄糖 30mmo1
纳米粒子 30mmol
N-乙酰半胱氨酸 25mmo1
乙二胺四乙酸二钠 6mmo1
腺苷二磷酸 10mmo1
辅酶Ⅰ 5mmo1
腺嘌呤核糖核苷酸 20mmo1
丙酮酸脱羧酶 1.2KU
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 4KU
己糖激酶 3KU
十二烷基苯磺酸钠 10g
去离子水加至1L。
5.根据权利要求1所述的肌酸激酶检测试剂，其特征在于，所述试剂R2是由以下配比的成分组成的：
咪唑缓冲液 80mmo1/L
磷酸肌酸 150mmo1
防腐剂 5g
十二烷基苯磺酸钠 10g
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