CN103173519A - 酶法检测肌酸激酶试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酶法检测肌酸激酶试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2，按4份∶1份的比例组成：试剂1由下列重量配比的成分组成：咪唑3-10g，醋酸镁2-10g，N-乙酰半胱氨酸2-10g，羟基亚乙基二膦酸1-5g，叠氮钠0.1-3g，辅酶I1-5g，丙醇1-10g，D-葡萄糖2-8g，己糖激酶2-10KU去离子水加至1L。试剂2由下列重量配比的成分组成：咪唑2-10g，羟基亚乙基二膦酸1-10g，单磷酸腺苷二钠盐3-20g，二磷酸腺苷一钾盐2-10g，二(5-腺苷)五磷酸锂盐0.01-1g，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶5-50KU，磷酸肌酸10-80g，叠氮钠0.2-2g，去离子水加至1L。本发明的试剂盒检测效果好，对试剂中的巯基有很强的保护作用，随着储存时间的增加，巯基的保护作用很显著，确保了试剂的稳定，有利于检测的敏感性和正确性，有较大的临床应用价值。

Description

酶法检测肌酸激酶试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物试剂，具体涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种酶法检测肌酸激酶试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌酸激酶在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2-4小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。此酶是继转氨酶后至今临床上最重要的酶，特别是在诊断心肌梗死上有较高价值。和常用的谷草转氨酶、乳酸脱氢酶相比，有下列优点：肌酸激酶最先升高，疼痛出现后4小时肌酸激酶急剧上升，最高可达正常上限的10～12倍，是目前最敏感的酶试验。因肝中肌酸激酶含量很少，心脏疾病伴有肝郁血或肝损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氨酶往往升高而肌酸激酶无变化，特异性较强。红细胞中此酶活力很低，溶血标本对此酶测定干扰较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶小，已成为临床化学方面常用酶之一，每年全世界约进行一亿次肌酸激酶测定。在心肌梗死病程中，如肌酸激酶活力再次升高，往往说明心肌再次梗死。但此酶活力增高持续时间短，2～4天后就可恢复正常。所以如用此酶诊断心肌梗死，一定要注意病程时间。发病时间较长的病例，应测定能较长维持增高的酶活力的乳酸脱氢酶，此时肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死诊断。另一方面，肌酸激酶可用于肌肉疾病诊断。在Duchenne肌萎缩患者血中，肌酸激酶极度增高，甚至可高出正常值上限50倍，而后随病程延长下降。此病是和性染色体有关的遗传病，在无症状的女性，隐性携带者约75％肌酸激酶也高于正常。其他类型的原发性肌萎缩患者肌酸激酶也有不同程度的升高，这可用于区别继发性肌病如神经性或废用性肌萎缩，此时肌酸激酶活力往往正常。此外，肌酸激酶还可用于脑疾病诊断。高肌酸激酶活力常见于发作性癫痫、破伤风。肌酸激酶增高也见于器质性神经疾病，如脑梗死、脑膜炎和脑炎等。
肌酸激酶检测方法：
Figure BDA0000122634310000021
Figure BDA0000122634310000022
Figure BDA0000122634310000023
Figure BDA0000122634310000024
由于肌酸激酶的巯基很容易失活，检测时候要用带巯基的物质来激活巯基，常用的物质有N-乙酰半胱氨酸，巯基乙醇，硫代甘油等。但是巯基在试剂中极不稳定，很容易失活。需要用很多方法来保护巯基。
专利文献报道了很多稳定巯基化合物的方法，包括充氮气，加巯基保护剂等，但是还有缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计稳定肌酸激酶的巯基，提高试剂稳定性。
本发明提供了一种酶法检测肌酸激酶试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按4份∶1份的比例组成：
试剂1：(1L)(试剂体积)，由下列重量配比的成分组成：
Figure BDA0000122634310000031
去离子水加至1L。
试剂2：(1L)(试剂体积)，由下列重量配比的成分组成：
Figure BDA0000122634310000032
去离子水加至1L。
本发明检测肌酸激酶试剂盒，在使用时，试剂1(200微升)加检测样本后(10微升)，再加入50微升试剂2，即可进行检测。
本发明的另一目的是提供了肌酸激酶试剂盒的制备方法：该方法包括下列步骤：
(一)制备试剂1：(1L)(试剂体积)
(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；
(2)依次加入咪唑、醋酸镁、N-乙酰半胱氨酸、羟基亚乙基二膦酸、叠氮钠、辅酶I、岩藻糖、D-葡萄糖；
(3)加入己糖激酶；
(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为1L混合均匀，即得；
(二)制备试剂2：(1L)(试剂体积)
向容器内依次加入咪唑、羟基亚乙基二膦酸、单磷酸腺苷、二钠盐
二磷酸腺苷，一钾盐、二(5-腺苷)五磷酸，锂盐、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸肌酸叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。
本发明人经过研究试验，在试剂盒中加入了巯基保护剂羟基亚乙基二膦酸和丙醇，比现有的的保护剂乙二胺四乙酸稳定性好。
本发明的试剂盒检测效果好，对试剂中的巯基有很强的保护作用，随着储存时间的增加，巯基的保护作用很显著，确保了试剂的稳定，有利于检测的敏感性和正确性，有较大的临床应用价值。
具体实施方式
以下实施例所用试剂原料均通过市售得到。
  咪唑   国药公司   AR(分析纯)
  醋酸镁   国药公司   AR
  N-乙酰半胱氨酸   国药公司   AR
  羟基亚乙基二膦酸   国药公司   AR
  叠氮钠   国药公司   AR
  辅酶I   罗氏公司   AR
  丙醇   罗氏公司   AR
  D-葡萄糖   国药公司   AR
  己糖激酶   罗氏公司   AR
  单磷酸腺苷二钠盐   国药公司   AR
  二磷酸腺苷一钾盐   罗氏公司   AR
  二(5-腺苷)五磷酸，锂盐   罗氏公司   AR
  葡萄糖-6-磷酸脱氢酶   罗氏公司   AR
  磷酸肌酸   国药公司   AR
实施例1制备肌酸激酶检测试剂盒
组成：试剂1：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000051
试剂2：(1L)(试剂体积)
制备：
(一)制备试剂1：(1L)(试剂体积)
(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；
(2)依次加入咪唑、醋酸镁、羟基亚乙基二膦酸、叠氮钠、辅酶I、岩藻糖、D-葡萄糖；
(3)加入己糖激酶；
(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为1L混合均匀，即得；
(二)制备试剂2：(1L)(试剂体积)
向容器内依次加入咪唑、羟基亚乙基二膦酸、单磷酸腺苷、二钠盐
二磷酸腺苷，一钾盐、二(5-腺苷)五磷酸，锂盐、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸肌酸叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。
实施例2
组成：试剂1：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000071
去离子水加至总体积为1L。
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000072
去离子水加至总体积为1L。
制备方法同实施例1。
实施例3
组成：试剂1：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000081
去离子水加至总体积为1L。
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000082
去离子水加至总体积为1L。
制备方法同实施例1
实施例4
本发明实施例1的试剂盒检测效果试验：
测定方法：
步骤一：输入参数于自动生化分析仪：温度37℃，主波长340nm，副波长405nm，
R1200ul(实施例1试剂1).R250ul  (实施例1试剂2).
检测样本10ul(血清样本)
读数点：16-24
步骤二：测定前将R1与R2平衡至室温.，然后放入试剂仓内
步骤三输入定标因子：4127在使用时，试剂1(200ul)加检测样本后再加入试剂250ul，即可进行检测。
实施例1试剂与样本试剂(血清样本)对巯基的保护作用
Figure BDA0000122634310000091
上述检测结果表明本发明的试剂盒加入羟基亚乙基二膦酸和丙醇对试剂中的N-乙酰半胱氨酸的巯基有很强的保护作用，随着时间的推移，对巯基保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂的样本值只降低了3％。
实施例5与德赛肌酸激酶试剂盒的临床相关性比较试验
本实施例1试剂盒与德赛肌酸激酶试剂盒作了临床相关性比较：
取30例不同浓度的临床样本与市售得到的德赛试剂盒(试剂1：4*64ml试剂2：4*16ml)生产商(德国德赛公司)平行进行检测
使用仪器：奥林巴斯400
测定方法
步骤一：输入参数于自动生化分析仪：温度37℃，主波长340nm，辅波长405nm，
在使用时，试剂1加检测样本后再加入试剂2，即可进行检测。
对照试剂：德国德赛肌酸激酶试剂盒(试剂1200ul；试剂250ul，)生产商(德国德赛公司)；
检测样本10ul(血清样本)
读数点：24-27
步骤二：测定前将R1与R2平衡至室温.，然后放入试剂仓内
步骤三输入定标因子：4127
在奥林巴斯400上输入以上参数，在使用时，试剂1加检测样本后再加入试剂2，即可进行检测。
试验结果：
Figure BDA0000122634310000101
Figure BDA0000122634310000111
根据上面的临床比对数据，本试剂与德赛试剂的临床相关性良好，没有差异。可以用于临床，降低医疗费用。
实施例6
组成：试剂1：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000122
去离子水加至总体积为1L。
试剂2：(1L)(试剂体积)
Figure BDA0000122634310000123
Figure BDA0000122634310000131
去离子水加至总体积为1L。
制备方法同实施例1。

Claims (2)

1.一种酶法检测肌酸激酶试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列试剂1和试剂2，按4份∶1份的比例组成：
所述试剂1由下列重量配比的成分组成：1L
Figure FDA0000122634300000011
去离子水加至1L；
试剂2由下列重量配比的成分组成：1L
Figure FDA0000122634300000012
去离子水加至1L。
2.如权利要求1所述肌酸激酶试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(一)制备试剂1：1L
(1)先向容器内加入为总量80％的去离子水；
(2)依次加入咪唑、醋酸镁、N-乙酰半胱氨酸、羟基亚乙基二膦酸、叠氮钠、辅酶I、岩藻糖、D-葡萄糖；
(3)加入己糖激酶；
(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为1L混合均匀，即得；
(二)制备试剂2：1L
向容器内依次加入咪唑、羟基亚乙基二膦酸、单磷酸腺苷、二钠盐
二磷酸腺苷，一钾盐、二(5-腺苷)五磷酸，锂盐、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸肌酸叠氮钠，去离子水加至总体积为1L混合均匀，即得。
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