JPH09248199A - クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
クレアチンキナーゼ活性測定用試薬Info
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- JPH09248199A JPH09248199A JP5737396A JP5737396A JPH09248199A JP H09248199 A JPH09248199 A JP H09248199A JP 5737396 A JP5737396 A JP 5737396A JP 5737396 A JP5737396 A JP 5737396A JP H09248199 A JPH09248199 A JP H09248199A
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- Japan
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- reagent
- creatine kinase
- adp
- kinase activity
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 次の反応式（１）
【化１】
（式中、ＣＫはクレアチンキナーゼ、ＡＤＰはアデノシ
ン二リン酸、ＡＴＰはアデノシン三リン酸を示す）に基
づいてクレアチンキナーゼ活性を測定するための、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰ、チオール化合物及びマグネシウ
ム塩類を含有する測定試薬において、安定化剤として二
酸化イオウ誘導体を添加したことを特徴とするクレアチ
ンキナーゼ活性測定用試薬。 【効果】 本発明のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬
は、溶液状態でも安定で、長期間にわたり測定値の低下
を防ぐことが出来るので一度に大量の試薬を調製して、
保存することが可能となり、緊急調査への対応を容易に
できるとともに、測定値の信頼性を向上させることがで
きる。
ン二リン酸、ＡＴＰはアデノシン三リン酸を示す）に基
づいてクレアチンキナーゼ活性を測定するための、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰ、チオール化合物及びマグネシウ
ム塩類を含有する測定試薬において、安定化剤として二
酸化イオウ誘導体を添加したことを特徴とするクレアチ
ンキナーゼ活性測定用試薬。 【効果】 本発明のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬
は、溶液状態でも安定で、長期間にわたり測定値の低下
を防ぐことが出来るので一度に大量の試薬を調製して、
保存することが可能となり、緊急調査への対応を容易に
できるとともに、測定値の信頼性を向上させることがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はクレアチンキナーゼ
活性測定用試薬、更に詳しくは、クレアチンキナーゼ
（ＣＫ）の賦活剤としてのチオール化合物を含有するク
レアチンキナーゼ活性測定用試薬において、その安定性
を向上せしめたクレアチンキナーゼ活性測定用試薬に関
する。
活性測定用試薬、更に詳しくは、クレアチンキナーゼ
（ＣＫ）の賦活剤としてのチオール化合物を含有するク
レアチンキナーゼ活性測定用試薬において、その安定性
を向上せしめたクレアチンキナーゼ活性測定用試薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ＣＫは次の反応を触媒する酵素であり、
この反応は可逆的である。
この反応は可逆的である。
【０００３】
【化２】
【０００４】（式中、ＡＴＰはアデノシン三リン酸、Ａ
ＤＰはアデノシン二リン酸を示す） ＣＫは骨格筋や心筋に多く存在し、生体液中のＣＫ活性
を測定することは、筋疾患、心筋梗塞等を診断する上
で、臨床的に意義が高いものである。
ＤＰはアデノシン二リン酸を示す） ＣＫは骨格筋や心筋に多く存在し、生体液中のＣＫ活性
を測定することは、筋疾患、心筋梗塞等を診断する上
で、臨床的に意義が高いものである。
【０００５】ＣＫ活性測定方法としては、従来より正、
逆反応に関与するクレアチン（Ｃ）、ＡＴＰ、クレアチ
ンリン酸（ＣＰ）、ＡＤＰのいずれかを測定する種々の
方法が提案されている。
逆反応に関与するクレアチン（Ｃ）、ＡＴＰ、クレアチ
ンリン酸（ＣＰ）、ＡＤＰのいずれかを測定する種々の
方法が提案されている。
【０００６】正反応の活性を測定する方法としては、
（イ）ＣＰを加水分解し、無機リンを測定する方法、
（ロ）ＡＤＰをピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）と乳酸脱水
素酵素を共役させ、還元型βニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の吸収減少を測定する方法、
（ハ）ＡＤＰをＰＫでピルビン酸へ導き、２，４−ジニ
トロフェニルヒドラジンを反応させ、生成したヒドラゾ
ンを測定する方法などがある。
（イ）ＣＰを加水分解し、無機リンを測定する方法、
（ロ）ＡＤＰをピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）と乳酸脱水
素酵素を共役させ、還元型βニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の吸収減少を測定する方法、
（ハ）ＡＤＰをＰＫでピルビン酸へ導き、２，４−ジニ
トロフェニルヒドラジンを反応させ、生成したヒドラゾ
ンを測定する方法などがある。
【０００７】また、逆反応の活性を測定する方法として
は、（ａ）生成したＣを比色法や蛍光法で測定する方
法、（ｂ）生成したＡＴＰをヘキソキナーゼ（ＨＫ）と
グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用
いて測定する方法、（ｃ）ルシフェラーゼを用い、蛍光
法で測定する方法、（ｄ）ホスホグリセリン酸キナーゼ
とグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を用いて
測定する方法などがあるが、その中でも、生成したＡＴ
Ｐを次の（２）及び（３）で示される反応によって測定
する方法が主流となっている。
は、（ａ）生成したＣを比色法や蛍光法で測定する方
法、（ｂ）生成したＡＴＰをヘキソキナーゼ（ＨＫ）と
グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用
いて測定する方法、（ｃ）ルシフェラーゼを用い、蛍光
法で測定する方法、（ｄ）ホスホグリセリン酸キナーゼ
とグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を用いて
測定する方法などがあるが、その中でも、生成したＡＴ
Ｐを次の（２）及び（３）で示される反応によって測定
する方法が主流となっている。
【０００８】
【化３】
【０００９】（式中、Ｇ−６−Ｐはグルコース−６−リ
ン酸、ＮＡＤ（Ｐ）はβ−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（リン酸）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは還元型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）を示
す）
ン酸、ＮＡＤ（Ｐ）はβ−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（リン酸）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは還元型β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）を示
す）
【００１０】しかるところ、ＣＫは不安定で、保存中
に、温度依存性の不可逆的失活、活性中心のＳＨ基がブ
ロックされる可逆的失活が起こるため、測定値の臨床評
価において問題となる。そのため、一般に、ＣＫ活性測
定試薬には、賦活剤として、システイン、Ｎ−アセチル
システイン（ＮＡＣ）、ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、ジチオエリトール（ＤＴＥ）、臭化２−アミノエ
チルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、還元型グルタチオ
ン（ＧＳＨ）、メルカプトエタノール（ＭＥ）、チオグ
リセロール等のチオール化合物を添加し、予備加温後活
性化されたＣＫ活性を測定することが行われている。こ
れらのチオール化合物の中でも、ＮＡＣが好ましいとさ
れ、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）が推奨するヒト血清中
酵素活性の勧告法−クレアチンキナーゼにおいても、チ
オール化合物としてＮＡＣが使用されているが、その酸
化物は、ＣＫ活性を逆に阻害することが知られている。
に、温度依存性の不可逆的失活、活性中心のＳＨ基がブ
ロックされる可逆的失活が起こるため、測定値の臨床評
価において問題となる。そのため、一般に、ＣＫ活性測
定試薬には、賦活剤として、システイン、Ｎ−アセチル
システイン（ＮＡＣ）、ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、ジチオエリトール（ＤＴＥ）、臭化２−アミノエ
チルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、還元型グルタチオ
ン（ＧＳＨ）、メルカプトエタノール（ＭＥ）、チオグ
リセロール等のチオール化合物を添加し、予備加温後活
性化されたＣＫ活性を測定することが行われている。こ
れらのチオール化合物の中でも、ＮＡＣが好ましいとさ
れ、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）が推奨するヒト血清中
酵素活性の勧告法−クレアチンキナーゼにおいても、チ
オール化合物としてＮＡＣが使用されているが、その酸
化物は、ＣＫ活性を逆に阻害することが知られている。
【００１１】チオール基は、酸化剤により酸化を受ける
のはもちろん、空気中の酸素によっても酸化されるもの
で、この分子状酸素によるチオールの酸化速度は、微量
の金属イオンにより非常に加速される。従って、Sandif
ort は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加
が、内因性の多価カチオン（Ｃａ2+，Ｆｅ3+，Ｃｕ2+な
ど）によるＣＫ活性の阻害の回避及びチオール化合物の
安定化に寄与することを報告している。
のはもちろん、空気中の酸素によっても酸化されるもの
で、この分子状酸素によるチオールの酸化速度は、微量
の金属イオンにより非常に加速される。従って、Sandif
ort は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加
が、内因性の多価カチオン（Ｃａ2+，Ｆｅ3+，Ｃｕ2+な
ど）によるＣＫ活性の阻害の回避及びチオール化合物の
安定化に寄与することを報告している。
【００１２】しかしながら、ＥＤＴＡの添加によっても
チオール化合物の安定化は充分でなく、特公平５−３４
９６０号では、ＮＡＣとＥＤＴＡを含む試薬群とマグネ
シウム塩類を含む試薬群とに分けて調製してＮＡＣの安
定化を図っている。しかし、この方法は、第二試薬添加
前に検体盲検測定を行うDouble Kinetic法（日本臨床検
査自動化学会会誌 第１６巻 第１号 Ｐ６９〜７１参
照）の際には不都合であり、より効果的な安定化方法の
開発が望まれていた。
チオール化合物の安定化は充分でなく、特公平５−３４
９６０号では、ＮＡＣとＥＤＴＡを含む試薬群とマグネ
シウム塩類を含む試薬群とに分けて調製してＮＡＣの安
定化を図っている。しかし、この方法は、第二試薬添加
前に検体盲検測定を行うDouble Kinetic法（日本臨床検
査自動化学会会誌 第１６巻 第１号 Ｐ６９〜７１参
照）の際には不都合であり、より効果的な安定化方法の
開発が望まれていた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、チ
オール化合物とマグネシウム塩類の共存下においても、
長期間安定なクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を提供
せんとするものである。
オール化合物とマグネシウム塩類の共存下においても、
長期間安定なクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を提供
せんとするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】このような実情におい
て、本発明者は、斯かる課題を解決せんと、鋭意研究を
行った結果、ＣＫ活性測定用試薬中に二酸化イオウ誘導
体を添加すれば、チオール化合物とマグネシウム塩類の
共存下においても、ＣＫ活性測定用試薬を長期間安定に
保持することができることを見出し、本発明を完成し
た。
て、本発明者は、斯かる課題を解決せんと、鋭意研究を
行った結果、ＣＫ活性測定用試薬中に二酸化イオウ誘導
体を添加すれば、チオール化合物とマグネシウム塩類の
共存下においても、ＣＫ活性測定用試薬を長期間安定に
保持することができることを見出し、本発明を完成し
た。
【００１５】すなわち、本発明は、次の反応式（１）
【００１６】
【化４】
【００１７】（式中、ＣＫ、ＡＤＰ及びＡＴＰは前記と
同じものを示す）に基づいてクレアチンキナーゼ活性を
測定するための、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、チオール
化合物及びマグネシウム塩類を含有する測定試薬におい
て、安定化剤として二酸化イオウ誘導体を添加したこと
を特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を提供
するものである。
同じものを示す）に基づいてクレアチンキナーゼ活性を
測定するための、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、チオール
化合物及びマグネシウム塩類を含有する測定試薬におい
て、安定化剤として二酸化イオウ誘導体を添加したこと
を特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を提供
するものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明で安定化剤としての二酸化
イオウ誘導体を添加する試薬は、少なくとも、反応式
（１）にかかわる、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、チオー
ル化合物及びマグネシウム塩類を含むものであればよ
く、その他に、反応式（２）及び（３）等にかかわる成
分を含んでいてもよい。斯かる試薬としては、公知のＣ
Ｋ活性測定用薬が何れも使用できる。
イオウ誘導体を添加する試薬は、少なくとも、反応式
（１）にかかわる、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、チオー
ル化合物及びマグネシウム塩類を含むものであればよ
く、その他に、反応式（２）及び（３）等にかかわる成
分を含んでいてもよい。斯かる試薬としては、公知のＣ
Ｋ活性測定用薬が何れも使用できる。
【００１９】二酸化イオウ誘導体としては、重亜硫酸
塩、亜硫酸塩、二亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜二チオン酸
塩が挙げられる。塩としてはアルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩又はアンモニウム塩等が挙げられるが、その
中でもナトリウム塩が好ましい。二酸化イオウ誘導体の
添加量は、０．０５〜５０mM、好ましくは０．１〜３０
mM、特に好ましくは０．５〜２０mMである。
塩、亜硫酸塩、二亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜二チオン酸
塩が挙げられる。塩としてはアルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩又はアンモニウム塩等が挙げられるが、その
中でもナトリウム塩が好ましい。二酸化イオウ誘導体の
添加量は、０．０５〜５０mM、好ましくは０．１〜３０
mM、特に好ましくは０．５〜２０mMである。
【００２０】本発明のクレアチンキナーゼ活性測定用試
薬は、二酸化イオウ誘導体を添加する以外は、公知の方
法によって調製される。
薬は、二酸化イオウ誘導体を添加する以外は、公知の方
法によって調製される。
【００２１】
【実施例】次に、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明する。
説明する。
【００２２】実施例１ ＮＡＣ２５．７mM、ＥＤＴＡ２．６mM、ＡＤＰ−Ｋ２．
６mM、ＡＭＰ６．４mM、Ｐ1，Ｐ5−ジ（アデノシン−
５’）ペンタリン酸３リチウム塩１２．８μＭ、グルコ
ース２０．５mM、β−ＮＡＤＰ２．６mM、酢酸マグネシ
ウム１２．８mM、ＨＫ３８５０Ｕ／ｌ、Ｇ６ＰＤＨ１９
２５Ｕ／ｌ、各安定化剤２mM、イミダゾール１２８mM
（pH６．６）より成る第一試薬、及びグルコース２０．
５mM、クレアチンリン酸二ナトリウム１５４mMより成る
第二試薬を調製した。
６mM、ＡＭＰ６．４mM、Ｐ1，Ｐ5−ジ（アデノシン−
５’）ペンタリン酸３リチウム塩１２．８μＭ、グルコ
ース２０．５mM、β−ＮＡＤＰ２．６mM、酢酸マグネシ
ウム１２．８mM、ＨＫ３８５０Ｕ／ｌ、Ｇ６ＰＤＨ１９
２５Ｕ／ｌ、各安定化剤２mM、イミダゾール１２８mM
（pH６．６）より成る第一試薬、及びグルコース２０．
５mM、クレアチンリン酸二ナトリウム１５４mMより成る
第二試薬を調製した。
【００２３】かくして得た調製直後の試薬、及びこれを
１０℃で７カ月保存した後の試薬を用いて、市販コント
ロール血清デシジョン２及びデシジョン３（何れもベッ
クマン社製）のＣＫ活性を測定した。ＣＫ活性の測定
は、上記各試薬を用い、日立７１５０形自動分析装置に
て３４０nmの吸光度変化より求めることにより行った
（試料：第一試薬：第二試薬＝１０：３００：７５μ
ｌ）。その結果を表１に示す。尚数値は、調製直後の試
薬の測定値を１００％としたときの相対％で示した。表
１から明らかなように、比較例１では測定値の低下が認
められたのに対し、実施例１のものでは殆んど測定値の
低下は認められなかった。
１０℃で７カ月保存した後の試薬を用いて、市販コント
ロール血清デシジョン２及びデシジョン３（何れもベッ
クマン社製）のＣＫ活性を測定した。ＣＫ活性の測定
は、上記各試薬を用い、日立７１５０形自動分析装置に
て３４０nmの吸光度変化より求めることにより行った
（試料：第一試薬：第二試薬＝１０：３００：７５μ
ｌ）。その結果を表１に示す。尚数値は、調製直後の試
薬の測定値を１００％としたときの相対％で示した。表
１から明らかなように、比較例１では測定値の低下が認
められたのに対し、実施例１のものでは殆んど測定値の
低下は認められなかった。
【００２４】
【表１】
【００２５】実施例２ 測定試薬は実施例１と同様に調製し、安定化剤として二
亜硫酸ナトリウム２mMを用いた。測定試料は、市販の兎
・筋肉由来ＣＫを約２０００Ｕ／ｌとなるよう調製し、
−８０℃で凍結保存したものを、使用時に、精製水で５
段階に希釈し用いた。比較例２は、二亜硫酸ナトリウム
を含まない以外は、すべて実施例２と同様とした。その
結果を表２に示す。表２より、比較例２では７カ月後に
感度の低下が認められるのに対し、実施例２では感度の
低下は殆んど認められず、二亜硫酸ナトリウムによる試
薬安定化効果が大きいことがわかる。
亜硫酸ナトリウム２mMを用いた。測定試料は、市販の兎
・筋肉由来ＣＫを約２０００Ｕ／ｌとなるよう調製し、
−８０℃で凍結保存したものを、使用時に、精製水で５
段階に希釈し用いた。比較例２は、二亜硫酸ナトリウム
を含まない以外は、すべて実施例２と同様とした。その
結果を表２に示す。表２より、比較例２では７カ月後に
感度の低下が認められるのに対し、実施例２では感度の
低下は殆んど認められず、二亜硫酸ナトリウムによる試
薬安定化効果が大きいことがわかる。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【発明の効果】本発明のクレアチンキナーゼ活性測定用
試薬は、溶液状態でも安定で、長期間にわたり測定値の
低下を防ぐことが出来るので一度に大量の試薬を調製し
て、保存することが可能となり、緊急検査への対応を容
易にできるとともに、測定値の信頼性を向上させること
ができる。
試薬は、溶液状態でも安定で、長期間にわたり測定値の
低下を防ぐことが出来るので一度に大量の試薬を調製し
て、保存することが可能となり、緊急検査への対応を容
易にできるとともに、測定値の信頼性を向上させること
ができる。
Claims (1)
- 【請求項１】 次の反応式（１） 【化１】 （式中、ＣＫはクレアチンキナーゼ、ＡＤＰはアデノシ
ン二リン酸、ＡＴＰはアデノシン三リン酸を示す）に基
づいてクレアチンキナーゼ活性を測定するための、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰ、チオール化合物及びマグネシウ
ム塩類を含有する測定試薬において、安定化剤として二
酸化イオウ誘導体を添加したことを特徴とするクレアチ
ンキナーゼ活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5737396A JPH09248199A (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5737396A JPH09248199A (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09248199A true JPH09248199A (ja) | 1997-09-22 |
Family
ID=13053799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5737396A Pending JPH09248199A (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09248199A (ja) |
-
1996
- 1996-03-14 JP JP5737396A patent/JPH09248199A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050614 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051018 |