JP4127767B2

JP4127767B2 - 液状で保存可能な酵素サイクリングを用いた測定試薬

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Publication number: JP4127767B2
Application number: JP2002145176A
Authority: JP
Inventors: 雄二小口; 智之千室; 陽子永井
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc; Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc; Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2022-05-20
Also published as: JP2003334100A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液状で長期間保存が可能な酵素サイクリング法を用いた試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
検体中の成分を測定する技術は日々進歩しており、技術の進歩に伴い、検体は微量化し、検出感度は向上してきている。これらの技術の進歩は、少量しか入手できない貴重な試料の分析を可能とし、また、存在量の少ない微量成分の検出を可能としてきた。
これらの技術には、分析機器に関する技術や分析方法に関する技術、使用される試薬に関する技術など、様々な技術が含まれる。
【０００３】
このような技術の進歩により高感度分析を可能とした分析技術に、酵素反応を増幅して、対象物質を高感度に測定することができる酵素サイクリング法がある。この方法は、特公平２−３４５９９や、特公平３−５３９１９、特許第２５７９３１９号等に開示されている。基本となる反応原理の一例を図１に示す。図１に示すとおり、当該反応系では、アンモニアとデアミド−ＮＡＤ^＋からアデノシン５’−三リン酸（以下ＡＴＰ）の存在下でＮＡＤ^＋合成酵素（以下ＮＡＤＳ）を触媒として、ＮＡＤ^＋が生じ、さらにグルコースおよびグルコース脱水素酵素(以下ＧｌｕｃＤＨ)によりＮＡＤＨが生成する。この時、テトラゾリウム塩およびジアホラーゼの存在により、ＮＡＤＨは酸化され、再びＮＡＤ^＋となり、そこから、グルコースおよびグルコース脱水素酵素(以下ＧｌｕｃＤＨ)によりさらにＮＡＤＨが生成する、いわゆるサイクリング反応が行なわれる。この例では、反応生成物であるホルマザンの吸光度を測定するが、他の例では、酵素サイクリング反応の基質を測定してもよい。
【０００４】
この測定原理を使用して測定できる対象物質は、ＮＡＤＳの基質となるアンモニア、および酵素反応によってアンモニアを生じるクレアチニンや尿素等の物質、ＮＡＤＳの補酵素となるＡＴＰまたはその塩、および酵素反応によってＡＴＰが生じるクレアチンキナーゼ、ピルベートキナーゼなど種々の物質が挙げられる。これらの測定対象物質の中には、既に臨床検査の分野で日常的に測定されている物質もある。
一方、臨床検査の現場では、従来は不安定な成分を凍結乾燥し、必要時に緩衝液で溶解して使用する測定試薬が大半を占めていた。
【０００５】
しかし、凍結乾燥品を溶解した試薬は、溶解後の安定性に対して配慮が欠けており、溶解後に性能が劣化する場合があるという問題があった。
一方、予め必要成分が溶解された液状で供給される試薬は、そのまま分析機器に設置できるため取り扱いやすく、液状での安定性を考慮した開発がなされているため、性能面での安定性が確保されているという利点がある。
そのため、現在では新たに発売される試薬は、特別な場合を除き大半が液状供給試薬であり、市場では液状供給試薬が主流となってきている。
【０００６】
試薬の液状状態での安定性を保つ方法としては、防腐剤は別にして、全ての試薬に共通する方法はなく、測定対象物質に対する測定方法に応じて、個別に安定化の工夫がなされている。しかし、未だ液状での安定化が困難であり、凍結乾燥品として流通している試薬や、その測定原理は魅力があるものの、成分が不安定であり用時に試薬の調製が必要なため、その煩わしさから市場に普及していない測定方法による測定試薬がある。
【０００７】
それらの一つに酵素サイクリング法を利用した測定試薬がある。酵素サイクリング法は、生じる物質を酵素サイクリング反応により増幅するため、通常のＮＡＤＨの産生量をモニターする方法より、格段に高感度に測定が可能となる、利用価値の高い方法である。
酵素を利用した測定方法では、経時的な測定値の安定性を確保する目的で、使用する酵素などの成分の劣化を考慮し、それらを過剰量添加するのが一般的である。しかし、酵素サイクリング反応では、該成分を過剰量加えると反応が急速に進行し、分析機器の有効測定範囲を超過してしまうことが多い。これを防ぐために各成分の濃度を最適な組成のまま減少させることが一般的に行なわれるが、各酵素の劣化速度が一様でないため、長期にわたり測定値の安定性を確保することが難しかった。また、酵素サイクリング法は試薬中に様々な成分が必要であり、成分同士の干渉を抑え難く、その感度および各成分を安定に保ったまま液状状態で試薬を保管するのが困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、上記問題を解決し、酵素サイクリング反応を用いた検体中の成分の測定において、正確な測定が好適に行なえるように該反応を簡便に調節できる測定試薬を提供することにある。また、本発明は、該試薬を安定化し、長期保存可能な液体として供給することも目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、酵素サイクリング反応を利用した測定試薬、特にＮＡＤ^＋合成酵素、ジアホラーゼ、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素を含む該反応を用いた測定試薬において、律速酵素以外の酵素を過剰量添加する一方、律速酵素を、酵素サイクリング反応の反応開始後分析機器の測定範囲を超過しない時間内において、検体成分の濃度に依存して変化する反応生成物または基質の吸光度または透過率が時間とともに比例的に増加または減少する様子が確認できる量添加することで、該反応を良好に調節できることを見出した。また、測定試薬を、ジアホラーゼを含むｐＨが７．５以上の第１の液状試薬と、ジアホラーゼの基質を含むｐＨが７．５未満の第２の液状試薬とを含み、ジアホラーゼおよびジアホラーゼの基質以外の測定に必要な成分は、該成分にとって安定なｐＨの前記第１または第２の試薬のいずれかに夫々含まれるように構成し、さらに律速酵素を安定化する処置を施すことにより、酵素サイクリング法を用いた試薬の感度が液状でも長期間変化しないことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、酵素サイクリング反応を用いて検体中の成分を、該成分の濃度に依存して変化する単位時間当たりの反応生成物または基質の吸光度または透過率の変化量により測定する測定試薬であって、測定試薬中の律速酵素の含有量が、該反応の反応開始後分析機器の測定範囲を超過しない時間内において、反応生成物または基質の吸光度または透過率が時間とともに比例的に増加または減少する様子が確認できる量であり、律速酵素以外の酵素の含有量が過剰量である試薬に関する。
また本発明は、検体中の成分がアンモニア、ＡＴＰまたは酵素反応によりアンモニアもしくはＡＴＰを生じる物質である前記試薬に関する。
【００１１】
本発明はさらに、ＮＡＤ^＋合成酵素、ジアホラーゼ、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素を含む前記試薬に関する。
本発明はまた、律速酵素が、ＮＡＤ^＋を補酵素とするグルコース脱水素酵素である前記試薬、および、該酵素を安定化するために塩化ナトリウムをさらに含む前記試薬に関する。
さらに本発明は、ジアホラーゼを含むｐＨが７．５以上の第１の液状試薬と、ジアホラーゼの基質を含むｐＨが７．５未満の第２の液状試薬とを含み、ジアホラーゼおよびジアホラーゼの基質以外の測定に必要な成分は、該成分にとって安定なｐＨの前記第１または第２の試薬のいずれかに夫々含まれる前記試薬に関する。
【００１２】
また本発明は、ジアホラーゼの基質がテトラゾリウム塩である前記試薬に関する。
本発明はさらに、テトラゾリウム塩が２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウムである前記試薬に関する。
本発明はまた、酵素サイクリング反応を用いて検体中の成分を、該成分の濃度に依存して変化する単位時間当たりの反応生成物または基質の吸光度または透過率の変化量により測定する方法であって、測定試薬中の律速酵素以外の酵素を過剰量添加する一方、律速酵素を、酵素サイクリング反応の反応開始後分析機器の測定範囲を超過しない時間内において、反応生成物または基質の吸光度または透過率が時間とともに比例的に増加または減少する様子が確認できる量添加して調節することを含む方法にも関する。
【００１３】
酵素サイクリング法は多くの測定対象物質に使用できるとともに、高感度な測定を可能とし、検体の微量化が図れ、さらに、微量物質に関しては正確かつ精密な測定を可能とすることができる。しかしこれまで、酵素サイクリング反応を正確に測定が可能な様式に調節することの困難性、成分の種類の多さ、ならびに試薬の液状での安定化における困難性から、酵素サイクリング法を用いた試薬は普及していなかった。
本発明は、律速酵素以外の酵素を過剰量添加する一方、律速酵素の添加量を調節することにより、酵素サイクリング反応を適切なレベル、つまり、酵素サイクリング反応の反応開始後分析機器の測定範囲を超過しない時間内において、検体成分の濃度に依存して変化する反応生成物または基質の吸光度または透過率が時間とともに比例的に増加または減少する様子が確認できるレベルに制御し、また、各成分同士の干渉を抑え、律速酵素を安定化することにより、試薬の安定性および使用の簡便化を可能にするものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、以上のとおりの特徴を持つものであるが、以下に詳しくその実施の形態について説明する。本発明の１つの態様においては、ＮＡＤＳ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素を使用した酵素サイクリング反応を利用し、反応生成物であるホルマザンの吸光度を測定することにより、測定対象物質の濃度を評価する。試薬中には測定に必要な成分として、ＮＡＤＳおよびＮＡＤＳの基質であるデアミド−ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＳの活性化剤であるマグネシウムまたはマンガンなどの金属塩、ジアホラーゼおよびジアホラーゼの基質となるテトラゾリウム塩、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素およびＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素の基質が共通に必要である。
【００１５】
上記態様で測定することができる対象物質は、アンモニア、ＡＴＰなどが挙げられる。さらに、酵素反応によってアンモニアまたはＡＴＰを生じる物質であれば特に限定はない。たとえば、アンモニアを生じる物質としては、クレアチニン、尿素、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミニル−ペプチド、Ｌ−アルギニン、グアニン、アデノシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−メチオニンなどがあり、これらの物質からアンモニアを生じさせる酵素もその対象となる。ＡＴＰを生じる物質としてはアデノシン５’−二リン酸（以下ＡＤＰ）、アデノシン５’−一リン酸（以下ＡＭＰ）などがあり、酵素としては、クレアチンキナーゼ、ピルベートキナーゼ、アセテートキナーゼ、カルバメートキナーゼ、アスパルテートキナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼまたはアルギニンキナーゼなどが挙げられ、これらの基質もまた測定対象となる。
【００１６】
本発明の１つの態様で用いる酵素サイクリング法には、対象物質別に以下のような物質の添加が必要になる。
（1）アンモニアの測定に際しては、ＮＡＤＳの補酵素となるＡＴＰまたはその塩が必要となる。ＡＴＰの塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩、マンガンなどの金属塩をいい、その入手しやすさからナトリウム塩が好適に用いられる。
（2）ＡＴＰまたはその塩の測定の際には、ＮＡＤＳの基質となるアンモニアまたはその塩が必要となる。アンモニアの塩は、水溶性のアンモニウム塩が好ましく、塩化アンモニウム、アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、クエン酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩が例示される。十分な純度を持つ上、低価格である硫酸アンモニウムが好適に用いられる。
【００１７】
（3）酵素反応によってアンモニアを生じるクレアチニン、尿素等の前記物質またはそれらの物質と反応しアンモニアを生じさせる酵素の測定には、ＡＴＰに加え、測定対象物質がアンモニアを生じる反応に必要な酵素、補酵素、活性化剤、基質等が必要となる。
（4）酵素反応によってＡＴＰを生じさせるＡＤＰ、ＡＭＰ等の物質または基質と反応してＡＴＰを生じさせるクレアチンキナーゼ、ピルベートキナーゼ等の基質または酵素の測定には、測定対象物質がＡＴＰを生じる反応に必要な酵素、補酵素、活性化剤、基質等が必要となる。
【００１８】
（3）、（4）における反応に必要な酵素、補酵素、活性化剤および基質は、対象物質によって異なる。例えばクレアチニンを測定する場合には、クレアチニンよりアンモニアを生じさせる酵素としてクレアチニンデイミナーゼが必要であり、尿素を測定する場合には、尿素よりアンモニアを生じさせるウレアーゼが必要となる。また、クレアチンキナーゼを測定するには、基質としてクレアチンリン酸、およびＡＤＰ、活性化剤としてＮ−アセチルシステインなどのチオール化合物、マグネシウム、カルシウム、マンガンなどの金属イオンが必要となり、ピルベートキナーゼを測定する場合には、基質となるホスホエノールピルビン酸およびＡＤＰ、活性化剤としてマグネシウムなどの金属イオンが必要となる。
【００１９】
本発明のこの態様において、ＮＡＤＳは律速酵素ではないため反応速度が最大になればよく、必要以上の量が含まれていればよい。試薬保存期間中の酵素活性の失活を考慮して、反応最終濃度として５００〜１０，０００Ｕ／Ｌの添加が好ましい。特に好ましくは１,０００〜５，０００Ｕ／Ｌであり、最も好ましくは、１，５００〜２，５００Ｕ／Ｌである。
ＮＡＤＳの基質には、デアミド−ＮＡＤ^＋、デアミド−ＮＡＤＰ^＋などが用いられる。デアミド−ＮＡＤ^＋を用いた場合、反応最終濃度として、０．０５〜１０．０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０６〜２．０ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましい。
【００２０】
ＮＡＤＳの活性化剤は、カリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、マンガンなどの金属塩をいい、ＮＡＤＳをより活性化させるマグネシウム塩またはマンガン塩が好ましい。活性化剤の濃度は、反応最終濃度として０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．２〜５０ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．５〜５ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましい。
【００２１】
本態様においては、ジアホラーゼおよびＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素はいずれかが律速酵素になり得るが、酵素の安定性を考慮すると、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素を律速酵素とした方が良い。その場合、ジアホラーゼは必要量以上の量が添加されていれば良く、試薬保存期間中の酵素活性の失活を考慮して、反応最終濃度として１００〜５，０００Ｕ／Ｌの添加が好ましい。特に好ましくは２００〜３，０００Ｕ／Ｌであり、最も好ましくは、５００〜２，０００Ｕ／Ｌである。
【００２２】
ジアホラーゼの基質となるテトラゾリウム塩は、生成物の溶解性や分析機器の汚染を考慮し、水溶性ホルマザンとなるものが好ましく、より好ましくは２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム(以下ＷＳＴ−８)、２−(４−インドフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム、２−(４−インドフェニル)−３−(２,４−ジニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウムであり、さらに好ましくはＷＳＴ−８である。テトラゾリウム塩は反応最終濃度として０．０１〜５．０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜２．０ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましい。
【００２３】
ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素としては、ＮＡＤ^＋を補酵素として反応する酵素であればいずれでも良いが、グルコース脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等、入手が容易で安価なものが好ましく、特に好ましくは、酵素自身が安定性に優れており、容易な安定化方法が報告されているグルコース脱水素酵素である。
【００２４】
ＮＡＤ^＋を補酵素とする酵素がグルコース脱水素酵素の場合、その必要量は、反応最終濃度として５０〜５，０００Ｕ／Ｌの添加が好ましい。特に好ましくは１００〜３，０００Ｕ／Ｌであり、最も好ましくは、２５０〜２，０００Ｕ／Ｌである。
【００２５】
グルコース脱水素酵素は比較的安定であるものの、さらに充分な安定化のために、その存在する試薬に塩化ナトリウムを添加することが好ましい。その添加濃度としては、２５ｍｍｏｌ／ｌ以上であれば特に限定されないが、５０〜２，０００ｍｍｏｌ／ｌの範囲が好ましく、１００〜５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲が特に好ましい。
ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素の基質は、脱水素酵素の種類により異なり、グルコース脱水素酵素を用いた場合はグルコースが、乳酸脱水素酵素を用いた場合は乳酸が、アルコール脱水素酵素を用いた場合はエチルアルコールがそれぞれ好適に用いられる。グルコース脱水素酵素を用いた場合、グルコース濃度は反応最終濃度として、５〜１，０００ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌがさらに好ましい。
【００２６】
本態様では、ジアホラーゼはＮＡＤＨの存在がなくとも、わずかではあるがテトラゾリウム塩と反応するという経験から、ジアホラーゼを含む試薬とジアホラーゼの基質を含む試薬とに分割して試薬の安定化を図っている。
ジアホラーゼを含む試薬のｐＨはその安定性を考慮し、ｐＨ７．５〜９．０が好ましく、特に好ましくはｐＨ７．５〜８．５である。
一方、ジアホラーゼの基質を含む試薬のｐＨは５．０〜７．４が好ましく、特に好ましくはｐＨ６．０〜７．４である。
【００２７】
これらの試薬への各成分の分配は、各成分のｐＨに対する安定性、共存する物質との反応性を考慮する必要があり、基本的には、基質と酵素は分別して存在させるべきである。
ジアホラーゼを含む試薬へは前記成分の内、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素の基質、ＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤ^＋を含有させ、ジアホラーゼの基質を含む試薬へはＮＡＤＳ、ＮＡＤ^＋を補酵素とする脱水素酵素、マグネシウムまたはマンガンの塩を含有させるのが好ましい。
【００２８】
したがって、本態様の測定試薬は、たとえば、ジアホラーゼを含む試薬には、リン酸塩、グルコース、マグネシウム塩、ＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤ^＋が含まれ、ジアホラーゼの基質を含む試薬には、リン酸塩、マグネシウム塩、ＡＴＰ、ＮＡＤ^＋合成酵素、グルコース脱水酵素が含まれる。
かかる測定試薬は、ジアホラーゼおよびジアホラーゼの基質が異なる試薬中に存在すれば、他の成分が安定である限り、２試薬系以上の多試薬系においても適用することができる。自動分析装置で測定を行なうことを考慮すると、２試薬系が最も好ましい。
【００２９】
本発明による測定試薬の保存温度は、液状で保存可能で、試薬の安定性に影響を与えない温度であればよく、好ましくは０℃〜２５℃であり、より好ましくは１℃〜１５℃であり、さらに好ましくは２℃〜８℃である。
以下に実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の方法は、吸光度又は透過率の変化を測定できるものであればいずれの機器でもよく、自動分析装置、分光光度計、色彩計、比色計などを用いることができる。正確かつ簡便に測定するためには自動分析装置が好適である。
【００３０】
【実施例】
〔実施例１〕
表１、表２に示す本発明による試薬、グルコース脱水素酵素を律速酵素とした場合にグルコース脱水素酵素を安定化する処置を施していない比較試薬Ａ、および第２試薬にジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させた比較試薬Ｂを用いて、３７℃保存における相対感度の経時変化を比較した。
測定には日立７１７０S型自動分析装置を使用し、表３に示す測定条件にて測定を行った。ＫＦａｃｔｏｒには１００００を入力し、測定結果には１分間当たりの吸光度変化量(ｍＡｂｓ．／ｍｉｎ)を出力させた。
【００３１】
検体として、試薬ブランク測定用には精製水を、標準液には硫酸アンモニウム(ＪＩＳ特級品)をアンモニア濃度が２００μg／ｄｌとなるように精製水に溶解したものを使用した。
測定初日の感度を１００%として、各測定日の初日に対する相対感度(%)を図２に示す。
【００３２】
【表１】

【００３３】
【表２】

【００３４】
【表３】

【００３５】
グルコース脱水素酵素を律速酵素として作製した試薬において、グルコース脱水素酵素を安定化する処置を施していない比較試薬Aにおいては、グルコース脱水素酵素の失活に伴い、急激な相対感度の低下が確認された。さらに、第２試薬にジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させた比較試薬Bでは、極端に試薬吸光度が上昇した結果、相対感度の低下が確認された。本発明では比較試薬と比較して明らかに安定であることが確認できる。
【００３６】
〔実施例２〕
表４、表５に示す組成でアンモニア測定用の試薬１、試薬２を調製し、４℃〜８℃の温度範囲で保存し、試薬の吸光度、ブランク反応の変化、標準液の測定感度の確認を行った。
測定には日立７１７０Ｓ型自動分析装置を使用し、表３に示す測定条件にて測定を行った。Ｋｆａｃｔｏｒには１００００を入力し、測定結果には１分間当たりの吸光度変化量(ｍＡｂｓ．／ｍｉｎ)を出力させた。
検体として、試薬ブランク測定用には精製水を、標準液には硫酸アンモニウム(ＪＩＳ特級品)をアンモニア濃度が２００μg／ｄｌとなるように精製水に溶解したものを使用した。
【００３７】
【表４】

【００３８】
【表５】

【００３９】
測定結果を図３および図４に示す。図３は１０ヶ月間冷蔵保存した本発明によるアンモニア測定試薬自体の吸光度変化を表した図であり、図４は当該試薬の１０ヶ月の冷蔵保存期間におけるブランクおよび標準液を用いた単位時間当たりの吸光度変化量の変化を表した図である。
本実施例では、アンモニア測定用試薬で保存安定性の確認を行ったが、図3、４に示すとおり、アンモニア測定試薬自体の吸光度、ブランク反応、標準液の測定感度いずれにおいても、１０ヶ月保存後においても変化が認められず、非常に安定であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上のように本発明は、酵素サイクリング反応を用いた測定試薬を冷蔵で長期間安定に保存することを可能とするものである。診断精度の向上、臨床検査の迅速化および簡便化は、医療および獣医療の分野において絶えず要求される課題である。本発明は、その解決の一助となるとともに、当該分野の発展に貢献するところ大であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素サイクリングを用いた測定方法を模式的に示した図である。
【図２】熱負荷試験における相対感度の変化を示したグラフである。
【図３】保存期間中の試薬吸光度の変動を示したグラフである。
【図４】保存期間中のブランク反応、標準液の測定感度の変動を示したグラフである。

Claims

酵素サイクリング反応を用いて検体中の成分を、該成分の濃度に依存して変化する単位時間当たりの反応生成物または基質の吸光度または透過率の変化量により測定する、液状で保存可能な測定試薬であって、ＮＡＤ ^＋合成酵素、ジアホラーゼおよび塩化ナトリウムにより安定化されたグルコース脱水素酵素を含有し、ジアホラーゼを含むｐＨが７．５以上の第１の液状試薬と、ジアホラーゼの基質であるテトラゾリウム塩を含むｐＨが７．５未満の第２の液状試薬とを含み、ジアホラーゼおよびジアホラーゼの基質以外の測定に必要な成分は、該成分にとって安定なｐＨの前記第１または第２の試薬のいずれかに夫々含まれ、測定試薬中の１つの酵素の含有量が、前記反応の反応開始後分析機器の測定範囲を超過しない時間内において、反応生成物または基質の吸光度または透過率が時間とともに比例的に増加または減少する様子が確認できる量であり、他の酵素の含有量が過剰量であり、前記第１および前記第２の試薬が別々に保管できる、前記試薬。
検体中の成分がアンモニア、ＡＴＰまたは酵素反応によりアンモニアもしくはＡＴＰを生じる物質である、請求項１に記載の試薬。
テトラゾリウム塩が２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウムである、請求項１または２に記載の試薬。
請求項１〜３のいずれかに記載の試薬を用いて、検体中の成分を測定する方法。