JPH03195499A - 尿素の定量方法及び尿素測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、尿素を含む試料に、ＡＴＰ　（アデノシン５
°−三リン酸）の存在下で尿素アミドリアーゼを作用さ
せることによる、尿素の定量方法及び尿素測定用試薬に
関する。

［従来の技術］ 生体内で尿素は蛋白質代謝の終産物として生成される。

主に肝臓内で生合成された尿素は、血液中に入り、腎臓
を通って尿中に排泄される。従って、生体試料、特に血
液中及び尿中の尿素濃度の変動は、青機能をチエツクす
る目的で重視され、代表的臨床化学検査項目として古く
から測定されてきた。

従来、尿素の測定法として数多くの方法が開発されてき
たが、主なものとしては、ウレアーゼを用いるウレアー
ゼ・インドフェノール比色法、ウレアーゼ・グルタミン
酸説水素酵素法などが挙げられる。ウレアーゼを用いる
方法は、尿素のウレアーゼによる酵素変換で生成したア
ンモニアを適当な試薬系で測定する方法であり、試料中
のアンモニアの量により影響を受け、特に測定する試料
が尿である場合には、尿中のアンモニアの濃度が高いた
めに、前処理によってアンモニアを除去するか検体ブラ
ンクを使用することが必要であり、筒便性、迅速性など
に欠けるという大きな問題点を有している。

更に、近年、臨床検査分野において自動分析装置が普及
してきており、自動分析装置の反応セルは、自動洗浄さ
れ繰り返し使用されることが多い。従って、上記装置の
動作停止中に反応セル内で細菌が繁殖し、動作開始直後
に尿素の定量測定を行なう際に、細菌が産生したアンモ
ニアにより尿素の測定値が影響を受けるという問題点が
指摘されている。

最近、アンモニアの影響を受けない尿素の測定法として
、尿素アミドリアーゼを用いる酵素測定法が開発され使
用されるようになっている。

尿素アミドリアーゼを用いる酵素測定法は、尿素とＡＴ
Ｐとを尿素アミドリアーゼの存在下に反応させて、尿素
を分解しＡＤＰ（アデノシン５゛ニリン酸）を生成し、
このＡＤＰの生成量を間接的に測定して尿素を定量する
ことを基本とする方法である。

例えば、特開昭６０−５４６９９号公報には、尿素アミ
ドリアーゼ （１）尿素＋ｌｌＣＯ３−＋ＡＴＰ ２価又は１価陽イオン ２ＮＨ３＋　Ｐ　ｉ　＋　２ＧＯ□＋ＡＤＰ（２）へ〇
Ｐ＋ホスホエノールピルベ−トピルビン ピルビン酸塩＋ＡＴＰ ２価陽イオン ピルビン酸オキシダーゼ アセチルホルフェート＋ＣＯ２＋１１２０２の反応で生
成した過酸化水素の量を、発色指示薬成分とペルオキシ
ダーゼとを含む発色指示薬系を使用して測定することに
より、尿素を定量する方法が記載されている。

また、上記（２）の反応で得られたピルビン酸塩を下記
のようにしてＮＡＤＨと反応させ、乳酸脱水素酵素 （４）ピルビン酸塩子ＮＡＤＨ＋Ｈ” 乳酸塩子ＮＡ［ｌ　” ＮＡＤＨの減少量を測定することにより、尿素を定量す
ることもできる。

上記の尿素アミドリアーゼを用いる酵素測定法は、試料
中に含まれるアンモニアに影響されず正確に尿素を定量
することができる優れた尿素定量法であるが、尿素アミ
ドリアーゼが非常に高価であるために試薬コストが高い
という問題点がある。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、尿素アミドリアーゼの使用量を減少させても
、高い感度で正確に且つ迅速に尿素を定量することがで
きる尿素の定量方法、及びこの尿素の定量方法に使用す
る尿素測定用試薬を提供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、尿素を含む試料に尿素アミドリアーゼ及びＡ
ＴＰを作用させ、生成するＡＤＰの量を間接的に測定す
ることによって、該試料中の尿素を定量する方法であっ
て、少なくとも尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰを
作用させる反応系に、アンモニウムイオンを存在させる
ことを特徴とする尿素の定量方法にある。

他の本発明は、−個又は二個以上のユニットからなる尿
素測定用試薬であって、その何れかのユニットに少なく
とも尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰが含有され、且つそ
の何れかのユニットにアンモニウムイオン又は水溶性ア
ンモニウム塩が含有されていることを特徴とする尿素測
定用試薬にある。

本発明の好適な実施態様は、下記の通りである。

１。試薬として、少なくとも尿素アミドリアーゼ、ＡＴ
Ｐ、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、
−価若しくは二価の金属塩、重炭酸塩、乳酸脱水素酵素
、ＮＡＤＨ、及びアンモニウムイオン又は水溶性アンモ
ニウム塩を含有することを特徴とする前記尿素の定量方
法及び尿素測定用試薬。

２。試薬として、少なくとも尿素アミドリアーゼ、ＡＴ
Ｐ，ホスホエノールどルピン酸、とルビン酸キナーゼ、
−価若しくは二価の金属塩、重炭酸塩、ピルビン酸オキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びアンモニウムイオン
又は水溶性アンモニウム塩を含有することを特徴とする
前記尿素の定量方法及び尿素測定用試薬。

３゜少なくとも前記の尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡ
ＴＰを作用させる反応系に、１ミリモル濃度（ｍＭ）以
上のアンモニウムイオンを存在させることを特徴とする
尿素の定量方法。

４゜少なくとも前記の尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡ
ＴＰを作用させる反応系に存在させるアンモニウムイオ
ンを、アンモニア水、及び／又は、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、クエン
酸アンモニウム、酒石酸アンモニウムなどの水溶性アン
モニウム塩の形態で存在させることを特徴とする前記尿
素測定用試薬。

５゜尿素を含む試料、尿素アミドリアーゼを含有する尿
素測定用試薬のユニット、尿素アミドリアーゼを含有し
ない尿素測定用試薬のユニット、及び試料希釈剤の少な
くとも一つに、アンモニウムイオン又は水溶性アンモニ
ウム塩を含有させて、少なくとも前記の尿素に尿素アミ
ドリアーゼ及びＡＴＰを作用させる反応系に、アンモニ
ウムイオンを存在させることを特徴とする尿素の定量方
法。

６゜前記ユニットが、前記尿素測定用試薬中の合計量で
、前記試料中の尿素を測定する際の液中に、１ｍＭ以上
のアンモニウムイオンを存在させるに十分な量の、アン
モニウムイオン又は水溶性アンモニウム塩を含有してい
ることを特徴とする前記尿素測定用試薬。

７゜前記アンモニウムイオン又は水溶性アンモニウム塩
が、尿素アミドリアーゼを含有するユニット中に含有さ
れていることを特徴とする前記尿素測定用試薬。

８゜前記アンモニア水イ”（ン又は水溶性アンモニウム
塩が、尿素アミドリアーゼを含有しないユニット中に含
有されていることを特徴とする前記尿素測定用試薬。

９、、前記水溶性アンモニウム塩が、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、クエ
ン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウムであることを特
徴とする前記尿素測定用試薬。

本発明の尿素の定量方法は、前記のような尿素アミドリ
アーゼを用いる酵素測定法、即ち、尿素とＡＴＰとを尿
素アミドリアーゼの存在下に反応させて、尿素を分解し
ＡＤＰを生成し、このＡＤＰの生成量を間接的に測定し
て尿素を定量することを基本とする方法を基礎としてい
る。そして、尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰを作
用させる反応系にアンモニウムイオンを存在させて、上
記反応を行なわせることに、特に特徴を有する方法であ
る。

本発明の尿素の定量方法においては、前記の（１）、（
２）及び（３）の反応により生成した過酸化水素の量を
測定することによって尿素を定量することもでき、また
、前記のく１）、（２）及び（４）の反応により消費さ
れたＮＡＤＨの量を測定することによって尿素を定量す
ることもできる。前者の場合は、生成した過酸化水素を
、例えば、ペルオキシダーゼを含む発色指示薬系を使用
してキノン色素を生成させ、キノン色素を吸光度の増加
量として求め、基準尿素含有液との対比から尿素の量を
定量する。また、後者の場合は、ＮＡＤＨの消費量をＮ
ＡＤＨによる吸光度の減少量として求め基準尿素含有液
との対比から尿素の量を定量する。

従って、本発明の尿素の定量方法においては、過酸化水
素の増加量により尿素を定量する場合には、定量方法の
反応系内に前記の（１）、（２）及び（３）の反応に必
要な試薬、例えば、尿素アミドリアーゼ、ＡＴＰ、ホス
ホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、−価若し
くは二価の金属塩、重炭酸塩、ピルビン酸オキシダーゼ
及びペルオキシダーゼを含有させ°（定量を行なう。ま
たＮＡＤ）Ｉの減少量により尿素を定量する場合には、
定量方法の反応系内に前記の（１）、（２）及び（４）
の反応に必要な試薬、例えば、尿素アミドリアーゼ、Ａ
ＴＰ、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ
、−価若しくは二価の金属塩、重炭酸塩、乳酸脱水素酵
素及びＮＡＤＨを含有させて定量を行なう。

本発明の尿素の定量方法においては、少なくとも前記の
尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰを作用させる反応
系、即ち前記（１）の反応系に、アンモニウムイオンを
存在させるのであるが、アンモニウムイオンを存在させ
ることにより、尿素アミドリアーゼの使用量を低減させ
ると共に、ト記反応系の反応速度を増大させることがで
きる。

この反応系に於るアンモニウムイオンの量は、１ミリモ
ル濃度（ｍＭ）以上であることが好ましく、特に１０ｍ
Ｍ以トであることが好ましく、更に特に２０ｍＭ以上で
あることが好ましい。この反応系に於るアンモニウムイ
オンの量を増加させるにつれて上記効果が増大するが、
アンモニライオンを１００ｍＭ以上存在させても効果の
それ以上の増大は期待されず、上記アンモニライオンの
量の−Ｌ限は特に限定されないが、一般に２００ｍＭ程
度で十分である。

上記の反応系にアンモニウムイオンを存在させる方法と
しては、アンモニア水を反応系に添加する方法、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、シュウ酸アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウムなど
の水溶性アンモニウム塩を、そのまま又は水溶液の形で
添加する方法、又は両者の方法を併用する方法などの何
れであってもよい。また、上記アンモニウムイオン源は
、単独で一ト記反応系に添加してもよく、前記のような
本発明の尿素の定量方法に使用される試薬の何れかと共
に上記反応系に添加してもよく、更に、定量すべき尿素
含有試料中に含有させて（例えば、尿素含有試料を調製
するために使用される試料希釈剤に含有させて）上記反
応系に添加してもよい。本発明の尿ぷの定量方法に使用
される試薬の何れかと共に上記反応系に添加する場合に
は、尿素アミドリアーゼを含有する尿素測定用試薬のユ
ニット、及び尿素アミドリアーゼを含有しない尿素測定
用試薬のユニットの何れに含有させてもよく、勿論、こ
れらのユニットの両方に含有させてもよい。

上記反応系における定量すべき尿素の濃度は、般に０．
５〜１００ｍＭであることが好ましい。

本発明の尿素の定量方法において、尿素に尿素アミドリ
アーゼ及びＡＴＰを作用させる反応以降の反応、即ち、
前記（２）、（３）及び（４）の反応においては、アン
モニウムイオンを存在させることにより反応か影響を受
けないので（後記の参考側参照）、本発明の尿素の定量
方法においては、尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰ
を作用させる反応系にアンモニウムイオンを存在させれ
ば十分であり、また、そのことによってそれ以降の反応
に何等悪影響を及ぼすことがなく、尿素の定量に支障は
全くない。

本発明の尿素の定量方法は、尿素に尿素アミドリアーゼ
及びＡＴＰを作用させる反応系にアンモニウムイオンを
存在させること以外は、従来の尿素アミドリアーゼを利
用する尿素の定量方法に使用されている、試薬、条件、
手順等をそのまま利用することにより実施することがで
きる。

但し、上記条件において、反応系にアンモニウムイオン
を存在させない従来の方法に比較して、尿素アミドリア
ーゼの使用量を著しく低減させ（後記の実施例４参照）
、また尿素と尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰとの反応時
間を短縮させる（後記の実施例１及び５参照）という顕
著に有利な条件の変更の下に実施することができる。

本発明において、尿素と尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰ
との反応系における、尿素アミドリアーゼの濃度は０．
１単位／　ｍ　１以上、特に０．２〜２．０単位／　ｍ
　ｊ！であることが好ましく、ＡＴＰの濃度は０１１〜
５ｍＭであることが好ましい。

また、上記反応系における、ホスホエノールピルビン酸
の濃度は０．１〜５ｍＭ％ζ°ルピン酸キナーゼの濃度
は０．４〜２０単位／　ｍ　Ｉｔ、乳酸脱水素酵素の濃
度は０．２〜１０単位／ｍＪ２．ＮＡＤＨの濃度は０．
１〜５ｍＭ、ピルビン酸オキシダーセの濃度は０．２〜
１０単位／　ｍ　Ｉｔ、ペルオキシダーゼの濃度は０．
２〜１０単位／　ｍ　１であることが好ましい。

上記反応系のｐＨは、一般に６．５〜９．５、特に６．
８〜８．０であることが好ましい。

また、反応時間は１〜３０分間で十分である。

本発明の尿素の定量方法において、尿素アミドリアーゼ
を含有する尿素測定用試薬のユニット、及び／又は尿素
アミドリアーゼを含有しない尿素測定用試薬のユニット
の何れかにアンモニウムイオン又は水溶性アンモニウム
塩を含有させることによって、尿素に尿素アミドリアー
ゼ及びＡＴＰを作用させる反応系にアンモニウムイオン
を存在させることができる。

従って、他の本発明は、前記のような新規な尿素測定用
試薬にある。

従来公知の尿素アミドリアーゼを使用する尿素測定用試
薬キットは、尿素の定量に必要な種々の試薬の全部を一
緒に含有する一個のユニットから構成されたものと、上
記様々の試薬を適宜分割して含有する二個又は三個以上
のユニットから構成されたものとがある。

本発明の尿素測定用試薬は、上記のようなユニットの一
個又は二個以上にアンモニウムイオン又は水溶性アンモ
ニウム塩が含有されている。即ち、本発明の尿素測定用
試薬においては、アンモニウムイオン又は水溶性アンモ
ニウム塩が、尿素アミドリアーゼを含有するユニット中
に、又は尿素アミドリアーゼを含有しないユニット中に
、又はその両者に含有されている。

更に、アンモニウムイオン又は水溶性アンモニウム塩を
単独でユニットにしてもよい。

本発明の尿素測定用試薬中のアンモニウムイオン又は水
溶性アンモニウム塩の含有量は、尿素測定用試薬中の合
計量で、前記試料中の尿素を測定する際の液中に、１ｍ
Ｍ以上、特に１０ｍＭ以上、更に特に２０ｍＭ以上での
アンモニウムイオンを存在させるに十分な量であること
が好ましい。二個以上のユニットに含有させる場合、各
ユニット中のアンモニウムイオン又は水溶性アンモニウ
ム塩の含有量は、尿素測定用試薬中の合計量が上記のも
のであれば特に限定されない。−数的には、尿素測定用
試薬中に、５００ｍＭ以下のアンモニウムイオンを含有
させることが好ましい。

本発明の尿素測定用試薬中に含有させるアンモニウムイ
オンの形態としては、アンモニア水であってもよく、前
記のような水溶性アンモニウム塩であってもよい。

また、本発明の尿素測定用試薬には、尿素を含む試料を
希釈するための試料希釈剤が含まれていてもよく、その
場合にこの試料希釈剤に上記のようなアンモニウムイオ
ン又は水溶性アンモニウム塩を含有させてもよく、その
際前記のような試薬ユニットにアンモニウムイオン又は
水溶性アンモニウム塩を含有させても、成るいは含有さ
せなくてもよい。

本発明の尿素の定量方法及び尿素測定用試薬は、血液や
尿のような生体試料中の尿素を定量するだめに適用でき
るのみならず、微量の尿素を含有する食品その他の広範
囲の種々の試料中の尿素を定量するため虹も適用するこ
とができる。

次に、本発明を更に詳細に説明するために実施例及び参
考例を示す。

［実施例１］ 尿素を含む試料として、４３０　ｍ　ｇ　／　ｄ　Ｉｔ
濃度の尿素水溶液を使用した。

試薬原液として、下記組成を有する組成物を使用した。

０ｍＭ Ｎ、Ｎ−ビス（２−とドロキシ エチル）−２−アミノエタンス ルホン酸 尿素アミドリアーゼ ピルビン酸キナーゼ 乳酸説水素酵素 ＡＴＰ ホスホエノールピルビン酸 ＡＤＨ Ｍｇ（１！２ ０．４単位／ＩＩＩＬ ５．０単位／ｒｒｒ１ ５．０単位／ａｈｆＬ １．０ｍＭ １．０ｍＭ ０．　９ｍＭ ４、　０ｍＭ ３、　０ｍＭ　　　　　にＨＣＯ３ ｐＨ７，５ 上記試薬原液に反応液中のアンモニウムイオン濃度が１
００ｍＭになる量の硫酸アンモニウムを添加して、試薬
を調製した。

尿素水溶液１２μ２に試薬２ｍｆｆ１を加え、３７℃に
維持し、波長３７６ｎｍでＮＡＤＨに基く吸光度を測定
した。尿素水溶液の代わりに精製水１２μＵを用いて、
上記と同様にして吸光度を測定することにより試薬盲検
とし、尿素水溶液の場合の吸光度から比較１検の吸光度
を差し引いて、真吸光度とした。

方、比較のために、上記試薬の代わりに上記試薬原液を
そのまま使用しく即ち、アンモニウムイオンを含有させ
ず）、上記と同様にして真吸光度を求めた。

反応時間の経過と共に、本発明及び比較の真吸光度を測
定し、その結果を第１表に示す。

第１表 第１表の結果から、アンモニウムイオンを添加させない
比較の場合に比べて、アンモニウムイオンを添加した本
発明の場合は、短い反応時間で真吸光度の絶対値が増大
しており、迅速に反応が進行することが明らかである。

［実施例２］ 尿素水溶液と試薬原液は実施例１で使用したものと同じ
ものを使用した。

試薬原液に反応液中のアンモニウムイオン濃度か第２表
に記載の種々の濃度になる量の塩化アンモニウムを添加
して、試薬を調製した。

尿素水溶液１２μｍに試薬２ｍ１ｌを加え、３７℃に５
分間維持し、実施例１におけると同様にして真吸光度を
求めた。

なお、尿素水溶液の代わりに精製水１２μ皇を用いて、
上記と同様にして吸光度を測定し、アンモニウムイオン
濃度の異なる液についての試験盲検の吸光度とした。

アンモニウムイオン濃度と、それに対応する本発明の真
吸光度及び試験盲検の吸光度を第２表に示す。なお、第
２表には、比較としてアンモニウムイオンを含有させな
いものについても示す。

第２表 ［実施例３］ 尿素水溶液は実施例１で使用したものと同じものを使用
した。

試薬原液は、下記の組成を有する原液■と原液■とに分
けて調製した。

原液■：尿素アミドリアーゼを含まない試薬４０ｍＭ　
　　　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ７．０単位／ｒｎ
ｌ。

７．０単位／１ａ１ １、　５ｍＭ １、　５ｍＭ １、　３ｍＭ ６、　０ｍＭ ０９１　％ ｐＨ７，５ 原液■：尿素アミ ０ｍＭ １．５単位／ｍ１ ０ｍＭ ０、１　％ エチル）−２−アミノエタンス ルホン酸 ピルビン酸キナーゼ 乳酸脱水素酵素 ＴＰ ホスホエノールピルビン酸 ＡＤＨ Ｍ　ｇ　ＣＩＩ　２ ａＮ３ トリアーゼを含む試薬 Ｎ、Ｎ−ビス（２−とドロキシ エチル）−２−アミノエタンス ルホン酸 尿素アミドリアーゼ ＨＣＯ３ ａＮ３ ｐＨ７，５ 原液■に反応液中のアンモニウムイオン濃度が第３表に
記載の種々の濃度になる量の硫酸アンモニウムを添加し
て、試薬■を調製し、原液■を試薬■として用いた。

尿素水溶液１２μ２に試薬■を１．４ｍｊ２加え３７℃
で５分間維持し、次いで試薬■を０．６ｍ２加え３７℃
で５分間維持した後、実施例１におけると同様にして真
吸光度を求めた。

なお、尿素水溶液の代わりに精製水１２μｍを用いて、
上記と同様にして吸光度を測定し、アンモニウムイオン
濃度の異なる液についての試験盲検の吸光度とした。

アンモニウムイオン濃度と、それに対応する本発明の真
吸光度及び試験盲検の吸光度を第３表に示す。なお、第
３表には、比較としてアンモニウムイオンを含有させな
いものについても示す。

以下余白 第３表 発明の真吸光度及び試験１検の吸光度を第４表に示す。

なお、第４表には、比較としてアンモニウムイオンを含
有させないものについても示す。

第４表 ［実施例４］ 原液■をそのまま試薬■として用い、原液■に反応液中
のアンモニウムイオン濃度が第４表に記載の種々の濃度
になる量の硫酸アンモニウムを添加して、試薬■として
用いた他は、実施例３に於ると同様にして、尿素水溶液
を定量した。

アンモニウムイオン濃度と、それに対応する本［実施例
５］ 尿素水溶液は実施例１で使用したものと同しものを使用
した。

試薬原液は、下記の組成を有する原液■と原液■とに分
けて調製した。

原液■：尿素アミドリアーゼを含まない試薬４０ｍＭ　
　　　Ｎ、Ｎ−ビス（２−とドロキシエチル）−２−ア
ミノエタンス ルホン酸 硫酸アンモニウム ピルビン酸キナーゼ 乳酸脱水素酵素 ＴＰ ホスホエノールピルビン酸 ＡＤＨ ｇＣＪ２２ ＮａＮ３ ０ｍＭ ７．０単位／ｍ１１ ７．０単位／１ＩＩＩＬ １、　５ｍＭ １、　５ｍＭ １、　３ｍＭ ６、　０ｍＭ ０．　１　　％ ｐＨ７，５ 原液■：尿素アミ ０ｍＭ 濃度変更 ０ｍＭ トリアーゼを含む試薬 Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ エチル）−２−アミノエタンス ルホン酸 尿素アミドリアーゼ ＨＣＯ３ ０、１％　　　　　ＮａＮ３ ｐＨ７，５ （注）尿素アミドリアーゼの濃度は、第４表に示す種々
の濃度にした。

原液■に反応液中のアンモニウムイオン濃度が１００ｍ
Ｍになる量の硫酸アンモニウムを添加して、試薬■を調
製し、原液■を試薬■として用いた。

尿素水溶液１２μｍに試薬■を１．４ｍ１Ｌ加え３７℃
で５分間維持し、次いで試薬■を０．６ｍＪ２加え３７
℃で５分間維持した後、実施例１におけると同様にして
真吸光度を求めた。

なお、尿素水溶液の代わりに精製水１２μ２を用いて、
上記と同様にして吸光度を測定し試験盲検の吸光度とし
た。

−・方、比較のために、上記試薬■の代わりに上記原液
■をそのまま使用しく即ち、アンモニウムイオンを含有
させず）、上記と同様にして真吸光度を求めた。

尿素アミドリアーゼ濃度（試薬■中、及び反応液中）と
、それに対応する本発明の真吸光度及び比較の真吸光度
を第５表に示す。

第５表 第５表の結果から、 尿素アミ トリアーゼの至適 濃度は、アンモニウムイオンを添加しない比較の場合は
反応液中の濃度で１．８単位７１１Ｉｊ２以上であるの
に対して、本発明の場合は反応液中の濃度で０．６単位
／ｍ１以上であることがわかる。従って本発明によれば
従来公知の方法に比較して、尿素アミドリアーゼの使用
量を約３分の１に減少できる。

［実施例６］ 尿素を含む試料として、２００　ｍ　ｇ　／　ｄ　１濃
度の尿素水溶液を使用した。

試薬原液として、下記組成を有する組成物を使用した。

０ｍＭ Ｎ、Ｎ−ビス（２−とドロキシ エチル）−２−アミノエタンス ルホン酸 尿素アミドリアーゼ ピルビン酸キナーゼ ピルビン酸オキシダーゼ ベルオへ一シダーゼ ＴＰ ０．６単位／ｍｊ２ ５．０単位／ｍ１ ２．５単位／１ｎ１ ２．５単位／１ｓ１ １、ＯｍＭ １．０ｍＭ　　　ホスホエノールピルビン酸１．０ｍＭ
　　　チアミンピロリン酸 １．０ｍＭＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−３，５−ジメ トキシアニリン １．０ｍＭ　　　４−アミノアンチピリン５　、　Ｏｍ
Ｍ　　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２３．０ｍＭ　　　ＫＨＣＯ。

ｐＨ７，０ 上記試薬原液に、反応液中のアンモニウムイオン濃度が
６０ｍＭになる量の硫酸アンモニウムを添加して試薬Ａ
を調製し、上記試薬原液に、反応液中のアンモニウムイ
オン濃度が６０ｍＭになる量の塩化アンモニウムを添加
して試薬Ｂを調製した。

尿素水溶液１２μｔに試薬Ａ又は試薬Ｂを２ｍ１ｌ加え
、３７℃に維持し、波長６００ｎｍでキノン色素に基く
吸光度を測定した。尿素水溶液の代わりに精製水１２μ
Ｕを用いて、上記と同様にして吸光度を測定することに
より試薬盲検し、尿素水溶液の場合の吸光度から比較盲
検の吸光度を差し引いて、真吸光度とした。

一方、比較のために、上記試薬の代わりに上記試薬原液
をそのまま使用しく即ち、アンモニウムイオンを含有さ
せず）、上記と同様にして真吸光度を求めた。

反応時間の経過と共に、本発明及び比較の真吸光度（ｍ
ＡＢｓ）を測定し、その結果を第６表に示す。

第６表 第６表の結果から、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオ
キシダーゼを作用させ、生ずるキノン色素の吸光度の増
加量を測定する方法においても、アンモニウムイオンを
添加させない比較の場合に比べて、アンモニウムイオン
を添加した本発明の場合は、短い反応時間で真吸光度が
増大しており、迅速に反応が進行することが明らかであ
る。

［参考例コ 試薬原液として、実施例１で使用した試薬原液から尿素
アミドリアーゼ、ＡＴＰ及びＫＨＣＯ３を除いたＦ記組
成を有する組成物を使用した。

４０ｍＭ　　　　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル
）−２−アミノエタンス ルホン酸 ピルビン酸キナーゼ 乳酸脱水素酵素 ホスホエノールピルビン酸 ＮＡＤＨ Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　２ ５．０単位７ｍ１ ５．０単位／１ｓｌＬ １．０ｍＭ ０、　９ｍＭ ４、　０ｍＭ ｐＨ７，５ 上記試薬原液に反応液中のアンモニウムイオン濃度が１
００ｍＭになる量の硫酸アンモニウムを添加して、試薬
を調製した。

試料としてＡＤＰを７．１７ｍＭ含有する水溶液を使用
し、試料１２μ２に試薬２ｍｌ１を加え、３７℃に維持
し、波長３７６ｎｍでＮＡＤＨに基く吸光度を測定した
。試料の代わりに精製水１２μｍを用いて、上記と同様
にして吸光度を測定することにより試薬盲検とし、試料
の場合の吸光度から比較盲検の吸光度を差し引いて、真
吸光度とした。

方、比較のために、上記試薬の代わりに上記試薬原液を
そのまま使用しく即ち、アンモニウムイオンを含有させ
ず）、上記と同様にして真吸光度を求めた。

反応時間の経過と共に、本発明及び比較の真吸光度を測
定し、その結果を第７表に示す。

以下余白 第７表 第７表の結果から、ＡＤＰを試料とした場合の反応速度
は、反応系にアンモニウムイオンが存在していても、ま
た存在していなくても、極めて速く、何れも反応は約５
０秒で終了している。

このことから、本発明の尿素の定量方法において、ＡＤ
Ｐ以降の反応に対するアンモニウムイオン添加の影響は
認められず、アンモニウムイオンは尿素と尿素アミドリ
アーゼ及びＡＴＰとの反応に対してその効果を有するこ
とがわかる。

［発明の効果］ 本発明の尿素の定量方法は、面記のように、尿素アミド
リアーゼを用いる酵素測定法を基礎にしており、先ず尿
素と尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰとを反応させるので
あるが、この反応の際に前記反応式（１）に示したよう
にアンモニアが生成する。従って、前記（１）式の反応
を促進するためには、この反応系からアンモニアを何等
かの形で除去することが考えられる。にもかかわらず、
本発明のように前記（１）式の反応系にアンモニウムイ
オンを存在させることにより前記（１）式の反応が促進
され、しかも尿素アミドリアーゼの必要量を減少させる
ことができることは、全く予想外のことである。

本発明の尿素の定量方法及びこの方法の実施に使用する
ための本発明の尿素測定用試薬は、尿素アミドリアーゼ
の使用量を減少させても、高い感度で正確に且つ迅速に
尿素を定量することができるという、顕著に優れた効果
を奏するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、尿素を含む試料に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰを
   作用させ、生成するＡＤＰの量を間接的に測定すること
   によって、該試料中の尿素を定量する方法であって、少
   なくとも尿素に尿素アミドリアーゼ及びＡＴＰを作用さ
   せる反応系に、アンモニウムイオンを存在させることを
   特徴とする尿素の定量方法。 ２、一個又は二個以上のユニットからなる尿素測定用試
   薬であって、その何れかのユニットに少なくとも尿素ア
   ミドリアーゼ及びＡＴＰが含有され、且つその何れかの
   ユニットにアンモニウムイオン又は水溶性アンモニウム
   塩が含有されていることを特徴とする尿素測定用試薬。