CN116134153A - 用于分析生物样品的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于核酸鉴定的方法和系统。核酸分子的鉴定可以包含在多个室中产生多个双链核酸分子，使所述双链核酸分子变性，以及检测所述变性的信号以产生一个或多个变性曲线。所述一个或多个变性曲线可以用于鉴定核酸分子。本文所描述的方法和系统可以提供从单个分析鉴定多个核酸分子。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年6月22日提交的美国临时专利申请第63/042,353号的权益，所述美国临时专利申请通过全文引用的方式并入本文。
政府权益声明
本发明是在国家癌症研究所(National Cancer Institute)授予的小企业创新研究(Small Business Innovation Research)授权号1R43CA221597-01A1的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有某些权利。
背景技术
微流体装置是包含小规模处理流体的结构的装置。通常，微流体装置以亚毫米级操作并处理微升、纳升或更少量的流体。微流体装置的一种应用是分析物分析，例如，数字聚合酶链式反应(dPCR)。具有多个分区的微流体装置可以用于dPCR。与定量实时PCR(qPCR)不同，其中通过将未知样品的PCR扩增速率与一组已知qPCR标准品的速率进行比较来定量模板，dPCR可以提供更高的灵敏度、更好的精度和更大的可再现性。
对于基因组研究人员和临床医生而言，dPCR在稀有突变检测、定量拷贝数变异和下一代测序文库定量中特别有效。具有细胞游离DNA和病毒载量定量的液体活检在临床环境中的潜在用途进一步提高了dPCR技术的价值。现有的dPCR解决方案已经使用了弹性体阀阵列、硅通孔方法和液滴在油中的微流体封装。尽管可用的dPCR平台的数目不断增加，但是当与依赖于对PCR扩增循环数目进行计数的旧qPCR技术相比时，dPCR一直处于劣势。吞吐量、易用性、性能和成本的组合是在dPCR市场上获得采用的主要障碍。
发明内容
本文提供了可以用于检测、鉴定或定量一种分析物或多种分析物的方法和系统。本公开提供了用于样品制备、核酸扩增、分析物分析、多重分析物分析或其任何组合的方法、系统和装置。与其它系统和方法相比，本文所描述的方法、系统和装置可以允许以降低的成本或复杂性检测、鉴定或定量分析物。
一方面，本公开提供了一种用于核酸鉴定的方法，所述方法包括：(a)使用多个核酸分子在多个室中产生多个双链核酸分子，其中：(i)所述多个双链核酸分子的第一子集包括第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列；并且(ii)所述多个双链核酸分子的第二子集包括第二双链核酸分子，所述第二双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第二核酸分子相对应的第二序列并且不包括所述添加的序列；(b)使所述多个双链核酸分子中的双链核酸分子变性；(c)检测指示所述变性的信号以产生多个变性曲线，其中：i.所述多个变性曲线中的第一变性曲线源自所述第一双链核酸分子的变性；ii.所述多个变性曲线中的第二变性曲线源自所述第二双链核酸分子的变性；并且iii.所述第一变性曲线和所述第二变性曲线不同；并且(d)处理所述多个变性曲线以鉴定所述多个核酸分子中的核酸分子。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在(a)之前向多个室提供所述多个核酸分子和多个正向引物。在一些实施例中，所述多个正向引物包括(i)第一正向引物，所述第一正向引物包括与所述第一核酸分子的至少一部分互补的第一区域和与所述第一核酸分子不互补且对应于所述添加的序列的第二区域，以及(ii)第二正向引物，所述第二正向引物与所述第二核酸分子的至少一部分互补。在一些实施例中，所述多个正向引物不是通用引物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(a)之前使所述多个正向引物经历引物延伸反应以产生多个第一延伸产物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(a)之前使所述多个第一延伸产物与多个反向引物接触。在一些实施例中，所述多个反向引物是通用引物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在(a)之前使所述多个反向引物经历引物延伸反应以产生多个第二延伸产物。在一些实施例中，所述多个第二延伸产物是所述多个双链核酸分子。
在一些实施例中，所述方法进一步包括对所述多个室的至少一部分进行成像以检测信号。在一些实施例中，所述方法进一步包括对所述多个室进行成像以检测信号。在一些实施例中，所述方法进一步包括使所述多个双链核酸分子经历受控加热以使所述双链核酸分子变性。在一些实施例中，所述双链核酸分子包括嵌入染料，所述信号源自所述嵌入染料。在一些实施例中，所述双链核酸分子包括多个不同的嵌入染料，所述信号源自所述嵌入染料。在一些实施例中，所述信号是光信号。在一些实施例中，所述多个室中的室具有小于或等于约500皮升的体积。在一些实施例中，所述室的体积小于或等于约250皮升。在一些实施例中，所述多个室包括大于或等于约1,000个室。在一些实施例中，所述多个室包括大于或等于约10,000个室。
另一方面，本公开提供了一种用于核酸鉴定的系统，所述系统包括：检测单元，所述检测单元被配置成收集并处理用于鉴定核酸分子的信号；以及操作性地耦接到所述检测单元的一个或多个处理器，其中所述一个或多个处理器被单独地或集体地编程或以其它方式被配置成：(i)使用多个核酸分子在多个室中产生多个双链核酸分子，其中：(i)所述多个双链核酸分子的第一子集包括第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列；以及(ii)所述多个双链核酸分子的第二子集包括第二双链核酸分子，所述第二双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第二核酸分子相对应的第二序列并且不包括所述添加的序列；(ii)使所述多个双链核酸分子中的双链核酸分子变性；(iii)检测指示所述变性的信号以产生多个变性曲线，其中(A)所述多个变性曲线中的第一变性曲线源自所述第一双链核酸分子的变性；(B)所述多个变性曲线中的第二变性曲线源自所述第二双链核酸分子的变性；并且(C)所述第一变性曲线和所述第二变性曲线不同；以及(iv)处理所述多个变性曲线以鉴定所述多个核酸分子中的核酸分子。
在一些实施例中，所述多个室中的室具有小于或等于约500皮升的体积。在一些实施例中，所述室的体积小于或等于约250皮升。在一些实施例中，所述多个室包括大于或等于约1,000个室。在一些实施例中，所述多个室包括大于或等于约10,000个室。在一些实施例中，所述检测单元被配置成对所述多个室的至少一部分进行成像。在一些实施例中，所述检测单元被配置成对所述多个室进行成像。在一些实施例中，所述检测单元包括具有大于或等于约15毫米(mm)×约15mm的视场的相机。在一些实施例中，所述视场大于或等于约50mm×约75mm。在一些实施例中，所述检测单元包括相机，所述相机包括互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。在一些实施例中，所述检测单元进一步包括安置在所述相机与所述多个室之间的远心透镜。在一些实施例中，所述检测单元包括被配置成收集光信号的光学单元。在一些实施例中，所述光学单元包括大于或等于四个通道，每个通道被配置成收集不同波长的光。
在一些实施例中，所述系统被配置成收纳包括多个室阵列的基材，并且其中所述多个室阵列的室阵列包括所述多个室。在一些实施例中，所述基材包括至少四个室阵列。在一些实施例中，所述室阵列与另一个室阵列流体隔离。在一些实施例中，所述系统被配置成收纳板，并且其中所述板被配置成保持包括所述基材的多个基材。在一些实施例中，所述系统进一步包括操作性地耦接到所述一个或多个处理器的热单元，其中所述热单元被配置成控制所述多个室的温度。在一些实施例中，所述一个或多个处理器引导所述热单元使所述多个室经历受控加热以使所述双链核酸分子变性。在一些实施例中，所述热单元包括热电温度控制单元。
根据以下具体实施方式，本领域的技术人员将显而易知本公开的额外方面和优势，在具体实施方式中仅示出和描述本公开的说明性实施例。如将认识到，本公开能够具有其它不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书本质上被视为是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请都在本文中通过引用并入，程度如同每一单独的公开、专利或专利申请被专门并且单独地指示以引用的方式并入一般。在通过引用的方式并入的公开和专利或专利申请与本说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书意欲替代和/或优先于任何这类矛盾材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在附图(在本文也称为“图(Figure/FIG.)”)中：
图1示出了聚合酶链式反应、定量聚合酶链式反应和数字聚合酶链式反应核酸分析的示例比较；
图2示出了使用示例集成数字聚合酶链式反应(dPCR)平台作为样品处理的示例工作流程；
图3A至3G示出了用于dPCR的示例耗材和从示例系统产生的示例数据；图3A示出了包括多个微流体阵列的示例微流体装置；图3B示出了示例耗材的扫描电子显微镜图像，图3C示出了样品数字化和跨微流体阵列的一致性的实例；图3D示出了示例耗材的四通道成像的实例；图3E示出了来自示例耗材和集成系统的示例测定结果；图3F示出了来自示例耗材和集成系统的另一示例测定结果；图3G示出了来自示例耗材和集成系统的另一示例测定结果；
图4A和4B示出了dPCR分区的实时分析的实例；图4A示出了阳性分区的示例实时PCR曲线；图4B示出了易于非特异性扩增的测定的阳性曲线的示例实时PCR曲线；
图5示意性地展示了用于核酸鉴定的示例过程
图6示出了用于确定方法和系统性能的工作流程的实例；
图7A至7C示出了证明系统性能的示例过程；图7A示出了用于定量和纯化样品内核酸分子的示例样品制备工作流程；图7B示出了样品分配和变性曲线的实例；图7C示出了用于鉴定样品内的分析物的熔融曲线的示例数据库比较；
图8示出了基于小图的呼吸道病原体的变性曲线的实例；
图9A至9C示出了示例集成系统的示例设计参数；图9A示出了全板成像器的示例目标参数；图9B示出了示例微流体阵列和视场；图9C示出了从示例集成系统产生的示例图像；
图10示出了用于成像的示例光学模块；
图11示出了用于dPCR的示例集成系统；
图12示出了被编程或以其它方式被配置成实施本文所提供的方法的计算机系统；
图13示出了在四种不同温度下获得的用于示例测定的示例荧光图像；
图14示出了三个不同样品靶标的示例熔融曲线；并且
图15A至15E示出了用于微生物物种鉴定的示例熔融曲线分析；图15A示出了细菌物种库的示例熔融曲线；图15B示出了选定数量的芽孢杆菌(Bacillus)细菌物种的示例熔融曲线；图15C示出了选定数量的葡萄球菌(Staphylococcus)物种的示例熔融曲线；图15D示出了按门组织的细菌物种的热图；并且图15E示出了另一示例热图。
具体实施方式
虽然本文中已经示出并描述了本发明的各种实施例，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施例仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到多种变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于所述一系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2、或大于或等于3。
每当术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”适用于所述一系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2、或小于或等于1。
如本文所使用的，术语“样品”通常是指含有或疑似含有分析物的任何样品。例如，样品可以是含有一种或多种分析物的生物样品。生物样品可以从血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液获得(例如，提取或分离)或包含以上各者。生物样品可以是流体或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些实例中，从无细胞体液如全血获得样品。在此类情况下，样品可以包含无细胞DNA、无细胞RNA、蛋白质、代谢物或其任何组合。在一些实例中，样品可以包含循环肿瘤细胞、癌症生物标志物或两者。在一些实例中，样品是环境样品(例如，土壤、废物、环境空气等)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)和食物样品(例如，乳制品、蔬菜制品和肉制品)。样品可以在上样到微流体装置中之前进行处理。例如，可以处理样品以裂解细胞、纯化蛋白质或包含试剂。可替代地或另外，在上样到微流体装置中之前可以不处理样品。
如本文所使用的，术语“流体”或“微流体”可以可互换使用，并且通常指是指包含与室阵列流体连通的至少一个通道的芯片、区域、装置、物品或系统。通道的横截面尺寸可以小于或等于约10毫米(mm)、小于或等于约5mm、小于或大于约4mm、小于或等于约3mm、小于等于约2mm、小于或等于约1.5mm、小于或等于约1mm、小于或等于约750微米(μm)、小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm或更小。室的体积可以小于或等于约100微升(μL)、50μL、25μL、10μL、5μL、1μL、500纳升(nL)、250nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、1nL、500皮升(pL)、250pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL或更小。
如本文所使用的，术语“流体”通常指液体或气体。流体不能维持界定的形状，并且在可观察的时间帧期间流动以填充放置其的容器。因此，流体可以具有允许流动的任何合适的粘度。如果存在两种或更多种流体，则可以从任何流体(例如，液体、气体等)中独立地选择每种流体。
如本文所使用的，术语“分配”通常指分割或分配为部分或份额。例如，分配的样品是与其它样品分离的样品。能够进行样品分配的结构的实例包含孔、室、液滴或其任何组合。
如本文所使用的，术语“加压排气”或“加压脱气”可以互换使用，并且通常是指通过施加压差将气体(例如，空气、氮气、氧气等)从装置(例如，微流体装置)的通道或室去除或排出到通道或室外部的环境。压差可以施加在通道或室与通道或室外部的环境之间。压差可以通过将压力源施加到装置的一个或多个入口或将真空源施加到装置的一或多个表面来提供。可以允许通过覆盖通道或室的一个或多个侧面的薄膜或膜进行加压排气或加压脱气。
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于所述一系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2、或大于或等于3。
本文提供了可以用于检测、鉴定或定量一种分析物或多种分析物(例如，核酸分子)的方法和系统。本公开提供了用于样品制备、核酸扩增、分析物分析、多重分析物分析或其任何组合的方法、系统和装置。与其它系统和方法相比，本文所描述的方法、系统和装置可以允许以降低的成本或复杂性检测、鉴定或定量分析物。
聚合酶链反应(PCR)描述了在体外将样品中特定的少量核酸分子扩增到更大的量(例如，足够大以进行研究)。定量PCR(qPCR)可以用于对核酸样品进行相对定量。数字PCR(dPCR)可以用于多种平台中的稀有等位基因检测，从384孔板到使用油包水乳液的基于液滴的平台。数字PCR可以利用样品稀释产生大量分区，每个分区少于一个核酸模板。然后可以通过计数模板被成功扩增的分区的数量来定量模板的总数。为了说明具有多于一个模板的分区，可以应用泊松统计(Poisson statistics)。与qPCR不同，其中通过将未知样品的PCR扩增速率与一组已知标准品的速率进行比较来定量模板，通过dPCR定量可以具有更高的灵敏度、更好的精度和更大的可再现性。
在一些实例中，PCR平台可以与其它技术一起用于检测、鉴定或定量分析物(例如，核酸分子)。例如，熔融曲线分析(MCA)可以使用嵌入荧光染料来评估加热期间双链核酸分子(例如，PCR产物或扩增子)的变性特性。通过精确的温度控制，高分辨率熔融(HRM)可以检测核酸序列中的微小差异，例如甲基化分析、突变扫描和基因分型。基于探针的熔融技术可以进一步补充测序和改进多重化。与dPCR类似，通过将样品稀释到每个分区少于一个模板，可以在每个分区中清楚地区分不同扩增子的熔融曲线，避免了本体溶液中熔融曲线分析的平均效应。数字熔融曲线分析(dMCA)可以用于多种应用，例如，包含用于细菌脱氧核糖核酸(DNA)序列分析、用于癌症液体活检的分子异质性的简易分析和Kirsten Ras 1(KRAS)基因分型。如图1所示，通过利用双链核酸分子的温度依赖性解离，dMCA可以提供另一个维度(例如，温度)，以进一步提高核酸鉴定和定量的定量准确性和多重性。
实施MCA并将其与数字平台(例如，dPCR平台)集成可能存在许多挑战。例如，试剂数字化、有效且一致的热循环和成像的集成可能具有挑战性。有效实施dMCA耗材有许多考虑因素，如大量分区(例如，大于10,000)以提供高统计置信度的定量、通过与实验室自动化设备集成实现的高吞吐量、低成本和高度可扩展的制造以及防蒸发。基于熔融的化学物质与耗材的集成也可能具有挑战性。例如，选择的嵌入染料与选择的塑料组合使用可能导致染料对塑料材料的非特异性吸附。
目前的MCA方法可能无法解决dMCA的挑战。例如，用于同时热循环和成像的硅通孔阵列的使用可能具有有限的吞吐量(例如，每个实验可能限于一个样品)和在半导体处理成本方面的较差的可制造性。替代性方法可以使用至少部分由聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成的微流体装置。然而，由PDMS形成的微流体装置可能具有较差的制造可再现性，可能无法防止试剂蒸发(例如，大量试剂可能在热循环期间蒸发)，并且化学相容性有限。
本公开提供了解决dMCA挑战的方法和系统。本文所描述的方法和系统可以使用微流体阵列来分配样品。微流体阵列可以包含用半渗透膜或压力渗透膜密封的死端注射模制微室阵列，用于试剂分配。参见例如，于2017年4月4日提交的国际专利申请第PCT/US2017/025873号、于2017年11月16日提交的国际专利申请第PCT/US2017/062078号、于2019年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US2019/065287号，所述文献中的每个文献通过全文引用的方式并入本文。本文所描述的方法和系统可以提供具有与qPCR类似的易用性、每个数据点的低成本和高吞吐量的数字熔融曲线分析。
本文所描述的系统可以包含集成的dPCR平台。dPCR平台可以将用于dPCR的各种过程(例如，试剂的分配、反应混合物的热循环和数据的采集)集成到单个仪器中。这可以允许dPCR工作流程复制qPCR的工作流程，与qPCR仪器相比，仪器架构包括改进的可靠性和降低的成本。例如，所述过程可以是完全自动化的，使得用户将反应混合物上样到耗材板中，将板放置到仪器中，并且开始样品处理程序，如图2所示。例如，可以在溶液200中提供样品。样品可以包含多个核酸分子。溶液200可以通过包括气动模块或其它流体处理模块的流体流动系统提供给微流体装置210。微流体装置210可以是提供样品分配的微流体阵列。微流体装置210可以包含用于分配样品的单个阵列或用于分配样品的多个阵列。微流体装置210可以被上样到分析系统220中。分析系统220可以是被配置成处理和分析样品的完全集成的分析平台。可替代地或另外，分析系统220可以包含微流体装置210，并且可以将样品提供给分析系统以用于分配到流体装置210中。在样品处理之后，分析系统220可以分析样品(例如，通过使用检测单元收集源自样品的信号)并处理信号以产生一个或多个数据输出230。所述系统可以是台式系统(例如，具有约2英尺(ft)×2ft×2ft的壳体尺寸)。所述系统可以包含检测单元，所述检测单元包括光学模块，所述光学模块允许扫描通过包括多个分区阵列(例如，包括十六个分区阵列)的微流体装置。图3A示出了包括十六个微流体阵列的示例微流体装置，每个阵列具有20,000个分区(例如，室)。具有十六个阵列的微流体阵列可以允许同时处理十六个不同的样品。检测单元可以允许在样品处理和分析期间进行实时检测(例如，成像)。
与其它方法和系统相比，微流体阵列和集成分析平台的组合可以允许简单的样品处理和分析，并且提供增强的一致性。例如，与利用随机微流体液滴产生机制来分配本体反应或依赖于正流体置换的平台不同，微流体阵列耗材可以使用固定的、注射模制的微室阵列，其包含精确的体积和纳升体积分区的总数，如图3B中的SEM图像所示。使用装置几何图形来精确地限定分区可以允许平台对试剂变化具有更大的灵活性和稳健性。例如，图3C示出了用三种不同的主混合物测定组合进行的三个实验的总分析分区的实例。在九个板(总共144个阵列)上，每个样品的平均总分析的分区为20,412，变异系数为0.68％。主混合物、测定和运行中高度一致的分区数可以说明分配过程的稳定性和位点间的一致性。在一个实例中，仪器可以支持四个不同的光学通道，如图3D所示，这可以允许分析和定量样品内的四个不同的靶标。由于耗材可以由热塑性塑料(例如，环烯烃聚合物(Cyclo-Olefin-Polymer))制成，所述热塑性材料可以充当湿气屏障，因此在整个过程中可能很少或没有试剂蒸发。另外的示例数据在图3E至3G中示出。图3E示出了使用湿实验室验证数据的示例系统的实例，包含参考材料动态范围定量。图3F示出了使用示例系统用于从10,000个拷贝/微升(拷贝/μL)降低到0.1个拷贝/μL BCR-Abl EuroStandard定量的实例。图3G示出了使用示例系统用于低到0.1％的TaqMan dPCR液体活检稀有等位基因级分测定的实例。
本文所描述的方法和系统可以进一步提供允许在传统PCR热循环期间或在PCR后熔融期间的任何点处对dPCR分区进行荧光分析的dPCR平台。与当前的dPCR平台相比，这是一个很大的优势，其提供了dPCR液滴或分区的终点分析，而不是实时测量。例如，非特异性扩增和污染物可能导致假阳性分区。在使用终点分析的dPCR平台中，假阳性和真阳性无法区分。可替代地，在本文所描述的系统中，可以监测单个分区的实时PCR动态，以允许区分假真阳性。例如，如果阳性分区中的荧光不符合预期的PCR扩增动态，则此分区可以被认为是假阳性，并且被排除在分析之外。图4A示出了来自示例集成系统的示例SMA测定的扩增动态。在所述实例中，荧光图像是在PCR期间以预定循环而不是在每个循环采集的。通过减少拍摄的图像的数量，可以减少分析和分析的复杂性。图4A中的各条线表示跨循环的单个分区的荧光。图4B示出了具有有问题的非特异性扩增的示例测定。离散实时分析可以揭示具有后期循环扩增动态的分区。这些分区可以具有非特异性扩增，并且因此可以被认为是假阳性并从分析中去除。实时dPCR分析的使用也可用于消除对任意阈值的需要。例如，具有预期的PCR扩增动态的分区可以被认为是阳性的，并且所有其它分区可以被认为是阴性的。因此，dPCR动态的实时处理可以改进和自动化总体dPCR分析。
在一个实例中，本文所描述的方法和系统可以用于数字生物学(例如，单细胞、单蛋白和单核酸分析)。数字生物学显著提高了科学的分辨率。在数字基因组学中，分配试剂可以消除标准曲线的需要，从而大幅提高再现性。此外，还可以分配如抑制剂等背景材料，从而提高反应特异性和灵敏度。当前dPCR平台可以利用荧光探针获得多重性，但不支持数字熔融曲线分析。通过将熔融曲线分析能力添加到dPCR平台并利用双链核酸变性的温度依赖性，可以提高定量准确性，因为可以评估扩增子熔融特征以消除来自非特异性扩增的假阳性和信号。另外，另一种模式——熔融温度(Tm)——可以被添加以多重化不同的靶标，进一步降低每个数据点的成本，并允许以高准确性、精度、灵敏度和可再现性对一组基因组生物标志物进行定量。因此，本文所描述的方法和系统可以提供高性能、易于使用和价格适宜的数字生物学平台，这反过来可以加速数字基因组学的采用并对医疗保健产生积极影响。
用于核酸鉴定的方法
一方面，本公开提供了用于核酸鉴定的方法。所述方法可以包含使用多个核酸分子在多个室中产生多个双链核酸分子，使所述双链核酸分子变性，检测指示所述双链核酸分子的变性的信号以产生多个变性曲线，以及处理所述变性曲线以鉴定至少一种核酸分子。所述多个双链核酸分子可以包含双链核酸分子的第一子集和双链核酸分子的第二子集。双链核酸分子的第一子集可以包含第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列。所述多个双链核酸分子可以包含双链核酸分子的第二子集，所述双链核酸分子包括第二双链核酸分子。所述第二双链核酸分子可以包括与第二核酸分子相对应的第二序列，并且不包含添加的序列。所述第一双链核酸分子可以在变性时产生第一变性曲线，并且所述第二双链核酸分子可以在变性时产生第二变性曲线。第一和第二变性曲线可以是不同的和可区分的。添加的序列可以调节第一双链核酸分子的变性曲线，以允许或增强第一和第二变性曲线之间的分化。
用于核酸鉴定的示例方法在图5中示出。所述方法可以包含提供包括一个或多个靶核酸序列的样品。在一个实例中，样品可以包含第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。第一靶核酸序列和第二靶核酸序列可以是不同的等位基因、基因、序列等。在一个实例中，核酸靶标是等位基因(例如，等位基因‘A’和等位基因‘B’)，并且所述方法可以包含与样品一起提供用于引物扩增的正向引物、反向引物和试剂。正向引物可以是等位基因特异性引物。一个或多个正向引物可以包含不与其特异性的核酸序列退火(例如，不互补)的尾部或核酸序列。尾部或非互补核酸序列可以位于引物的5'端。所述方法可以包含经历引物延伸反应以延伸正向引物并扩增靶核酸序列(例如，对应于等位基因A和等位基因B)。包含尾部或不与靶序列退火的核酸序列的正向引物可以产生与靶核酸分子互补的核酸分子，并且包含尾部序列。没有尾部或另外的序列的正向引物可以产生与靶核酸序列互补的序列。延伸的正向引物可以包含一个或多个共有结构域。所述方法可以进一步包含使用能够退火到共有结构域的反向引物(例如，通用反向引物)以产生靶核酸序列的拷贝。可以进行第二引物延伸反应以产生作为靶核酸分子的拷贝的另外的扩增产物。对于包含尾部或添加的序列的等位基因特异性正向引物，靶核酸分子的拷贝还可以包含尾部或另外的序列区域。靶核酸分子的双链拷贝可以被变性(例如，通过热循环)，并且在变性期间由双链核酸分子的链的分离产生信号。变性信号可以用于产生靶核酸序列的变性曲线。特定变性曲线的存在或不存在可以用于鉴定样品中的存在或缺失或鉴定核酸分子。根据靶核酸序列之间的序列差异，变性曲线可以至少部分重叠或难以解析。因此，尾部序列的添加可以改变或更改一个或多个靶核酸分子的变性曲线，以允许或增强变性曲线之间的差异，使得变性曲线可以彼此区分。
双链核酸分子可以在多个室中产生。可替代地，双链核酸分子可以在本体溶液中产生，并且所述本体溶液可以被分为多个室。在一个实例中，将样品提供给包括多个室的微流体装置，并且将其分为多个室。样品可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、15个、20个或更多个靶核酸分子。在一个实例中，样品包含至少10个靶核酸分子。在另一个实例中，样品包含至少15个靶核酸分子。在另一个实例中，样品包含至少20个靶核酸分子。在一些实例中，靶核酸分子可以是单链或双链核酸分子。在一些情况下，靶核酸分子是圆形的。靶核酸分子可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。样品可以被稀释，使得向每个室提供约一个核酸分子。样品可与各种测定试剂和组分一起提供给室。例如，可以为样品提供用于聚合酶链式反应的多个正向引物、反向引物和试剂。
在一个实例中，用多个正向引物将样品提供给多个室。多个正向引物可以是通用引物或可以是靶标特异性引物。在一个实例中，多个正向引物不是通用引物，而是靶标特异性引物。靶标特异性引物可以具有与特定靶标互补的序列，使得靶标特异性引物退火不退火到非靶标序列。正向引物包含单个区域或可以包含多个区域。在一个实例中，正向引物包括与靶核酸分子具有序列互补性的单个区域。在另一个实例中，正向引物包括多个区域，至少一个与靶核酸分子具有序列互补性，并且至少另一个区域或尾部序列与靶核酸分子没有序列互补性(例如，非互补序列)。非互补序列可以不退火到靶核酸分子。尾部或非互补序列可以对应于添加的序列(例如，添加到双链核酸分子以改变或更改变性曲线的序列)。尾部或非互补序列可以是任何长度的核苷酸的聚合形式。例如，尾部或非互补序列可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、100个、500个、1000个或更多个核苷酸。添加的序列可以通过一个或多个引物延伸反应(例如，使用包含尾部或非互补序列的引物)或通过将对应于尾部或非互补序列的序列连接到靶核酸分子或其衍生物而添加到双链核酸分子。核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。尾部或非互补序列可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、桥核酸(BNA)或其任何组合。尾部或非互补序列可以包含一个或多个选自以下的亚基：腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(TO)和尿嘧啶(U)或其变体。核苷酸可包含A、C、G、T或U或其变体。核苷酸可包含可掺入到生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是A、C、G、T或U，或是对多个互补的A、C、G、T或U中的一个具有特异性的任何其它亚基，或是与嘌呤(即A或G，或其变体)或嘧啶(即C、T、或U，或其变体)互补的亚基。
正向引物可以退火到靶核酸分子。退火的正向引物可以经历引物延伸反应。引物延伸反应可以产生与靶核酸分子互补的正向引物的延伸产物(例如，第一延伸产物)。在一个实例中，正向引物包括尾部序列或非互补序列，并且延伸产物可以进一步包含尾部和非互补序列。
所述方法可以进一步包括使正向引物的延伸产物与多个反向引物接触。多个反向引物可以包含通用引物或靶核酸特异性引物。在一个实例中，多个反向引物包含通用引物。在另一个实例中，多个反向引物是通用引物，并且正向引物的延伸产物包含与通用引物互补的共有序列。在另一个实例中，多个反向引物对靶核酸分子具有特异性。反向引物可以退火到正向引物的延伸产物。反向引物可以经历引物延伸反应。引物延伸反应可以产生多个反向引物延伸产物(例如，第二延伸产物)。反向引物延伸产物可以是双链核酸分子，所述双链核酸分子变性以产生变性曲线。反向引物延伸产物(例如，第二延伸产物)可以包括靶核酸分子的拷贝。在一个实例中，正向引物包含尾部或非互补序列，并且由反向引物产生的靶核酸序列的拷贝可以包含与尾部或非互补序列互补的添加的序列。
所述方法可以包括提供本文别处所描述的任何微流体装置。微流体装置可以包括至少一个通道。通道可包括入口、出口或入口和出口两者。在一个实例中，通道包括单个入口或端口，并且不包含出口或二级端口。在另一个实例中，通道包括入口和出口端口。微流体装置可以进一步包括连接到通道的多个分区(例如，室)。室可以通过多个虹吸孔连接到通道。微流体装置可以由邻近微流体装置的表面安置的薄膜(例如，热塑性薄膜)密封，使得薄膜覆盖通道、多个室、多个虹吸孔或其任何组合。试剂、样品或两者均可应用于通道的入口。可以通过在试剂或样品与流体装置之间提供第一压差来填充流体装置，从而使试剂或样品流入流体装置。可以通过在通道与多个室之间施加第二压差以将试剂或样品移动到多个室中，并且迫使多个室内的气体穿过薄膜来分配试剂或样品，可替代地或另外，流体装置可以包含第二通道，所述第二通道被配置成允许脱气或排气。第二通道可以被安置成与多个室相邻。第二压差可以大于第一压差。可以在入口和出口之间施加第三压差以将流体引入微通道，而不将流体引入室。第三压差可以小于第二压差。可以在样品之前、之后或同时添加试剂。也可以通过另一种方法在装置的一个或多个分区中提供试剂。例如，在用薄膜覆盖一个或多个分区之前，试剂可以沉积在一个或更多个分区内。在另外的实例中，多个分区可以包含用分区干燥的试剂，并且提供可以溶解干燥的试剂的样品。
装置的入口或出口(如果存在)可以与气动泵或真空系统流体连通。气动泵或真空系统可以是本公开的系统的组件或与本公开的系统分离。试剂或样品的填充和分配可以通过在流体装置的各个特征上施加压差来进行。试剂或核酸分子的填充和分配可以在不使用室与通道之间的阀的情况下进行，以隔离试剂或核酸分子。例如，可以通过在待上样的试剂或样品与通道之间施加压差来进行通道的填充。此压差可以通过对试剂或核酸分子加压或通过对通道施加真空来实现。可以通过在通道与室之间施加压差来填充室。这可以通过对通道加压或对室施加真空来实现。可以通过在流体与通道之间施加压差来进行样品或试剂的分配。此压差可以通过对流体加压或通过对通道施加真空来实现。
微流体装置可以包含薄膜或第二通道(例如，排气通道)，所述第二通道在不同的施加的压差下可具有不同的渗透特性。例如，薄膜或第二通道可以防止在第一和第三压差(例如，低压)处的气体流动，所述第三压差可以是较小幅度的压差。薄膜或第二通道可以允许气体在第二压差(例如，高压)下流动，所述第二压差可以是更高幅度的压差。第一压差和第三压差可以相同或不同。第一压差可以是入口或出口中的试剂与微流体装置之间的压力差。在微流体装置的填充期间，试剂的压力可以高于微流体装置的压力。在流体装置的填充期间，试剂与流体装置之间的压差(例如，低压)可以小于或等于约8磅/平方英寸(psi)，小于或等于约6psi、小于或等于约4psi、小于或等于约2psi、小于或等于约1psi或更小。在一些实例中，在流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可以为约1psi至约8psi。在一些实例中，在流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可以为约1psi至约6psi。在一些实例中，在微流体装置的填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约4psi。可以通过在试剂与流体装置之间施加小于或等于约20分钟、小于或等于约15分钟、小于或等于约10分钟、小于等于约5分钟、小于或等于约3分钟、小于或等于约2分钟、小于或等于约1分钟或更小的压差来填充流体装置。
填充的微流体装置可以在通道、虹吸孔、室或其任何组合中具有样品或一种或多种试剂。将样品或一种或多种试剂回填到室中可以在填充流体装置时发生，或可以在施加第二压差期间发生。第二压差(例如，高压)可以对应于通道与多个室之间的压力差。在施加第二压差期间，高压结构域中的第一流体(例如，气体或液体)可以推动低压结构域中的第二流体(例如，气体)穿过薄膜并离开流体装置。第一流体和第二流体可以包括液体或气体。液体可包括水混合物或油混合物。第二压差可以通过对通道加压来实现。可替代地或另外，第二压差可以通过向室施加真空来实现。在施加第二压差期间，通道中的核酸分子或试剂可以流入室。另外，在施加虹吸孔、室和通道内捕获的第二压差气体的过程中，气体可通过薄膜或通过室的一个或多个壁排出并进入第二通道(例如，排气通道)。在室的回填和排气期间，室与通道之间的压差可以大于或等于约6psi、大于或等于约8psi、大于或等于约10psi、大于或等于约12psi、大于或等于约14psi、大于或等于约16psi、大于或等于约18psi、大于或等于约20psi或更大。在一些实例中，在室的回填期间，室与通道之间的压差为约8psi至约20psi。在一些实例中，在室的回填期间，室与通道之间的压差为约8psi至约18psi。在一些实例中，在室的回填期间，室与通道之间的压差为约8psi至约16psi。在一些实例中，在室的回填期间，室与微通道之间的压差为约8psi至约14psi。在一些实例中，在室的回填期间，室与通道之间的压差为约8psi至约12psi。在一些实例中，在室的回填期间，室与通道之间的压差为约8psi至约10psi。可以通过施加压差超过约5分钟、超过约10分钟、超过约15分钟、超过约20分钟、超过约25分钟、超过约30分钟或更长时间来回填室和使其排气。
多个室可具有大于或等于约1,000个室、5,000个室、10,000个室、20,000个室、30,000个室、40,000个室、50,000个室、100,000个室或更多个室。在一个实例中，微流体装置可以具有约10,000个室至30,000个室。在另一个实例中，微流体装置可以具有约15,000个室至25,000个室。在一个实例中，所述多个室包括大于或等于约1,000个室。在另一个实例中，所述多个室包括大于或等于约10,000个室。室可以是圆柱形、半球形或圆柱形和半球形的组合。可替代地或另外，室可以是立方体形。室的横截面尺寸可以小于或等于约500μm、250μm、100μm、80μm、60μm、30μm、15μm或更小。在一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约250μm。在另一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约100μm。在另一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约50μm。室可以具有任何体积。室可以具有相同的体积，或体积可以在微流体装置上变化。室的体积可以小于或等于约1000皮升(pL)、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、75pL、50pL、25pL或更小皮升。室的体积可为约25pL至50pL、25pL至75pL、25pL至100pL、25pL至200pL、25pL至300pL、25pL至400pL、25pL至500pL、25pL至600pL、25pL至700pL、25pL至800pL、25pL至900pL或25pL至1000pL。在一个实例中，室的体积小于或等于500pL。在另一个实例中，室的体积小于或等于约250pL。在另一个实例中，室的体积小于或等于约100pL。
样品的分配可以通过试剂中指示剂的存在来验证。指示剂可包含包括可检测部分的分子。可检测部分可包含放射性种类、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。放射性种类的非限制性实例包含3H、14C、22Na、32P、33P、35S、42K、45Ca、59Fe、123I、124I、125I、131I或203Hg。荧光标记的非限制性实例包含荧光蛋白、光学活性染料(例如荧光染料)、有机金属荧光团或其任意组合。化学发光标记的非限制性实例包含荧光素酶类的酶，例如海萤(Cypridina)萤光素酶、高斯(Gaussia)萤光素酶、海肾(Renilla)萤光素酶和萤火虫萤光素酶。酶标记的非限制性实例包含辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或其它标记。
指示剂分子可以是荧光分子。荧光分子可包含荧光蛋白、荧光染料和有机金属荧光团。指示剂分子可以是蛋白质荧光团。蛋白质荧光团可以包含：绿色荧光蛋白(GFP，在绿色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为500至550纳米的光)、青色荧光蛋白(CFP，在青色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为450至500纳米的光)、红色荧光蛋白(RFP，在红色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为600至650纳米的光)。蛋白质荧光团的非限制性实例包含AcGFP、AcGFP1、AmCyan、AmCyan1、AQ143、AsRed2、Azami Green、Azurite、BFP、Cerulean、CFP、CGFP、Citrine、copGFP、CyPet、dKeima-Tandem、DsRed、dsRed-Express、DsRed-Monomer、DsRed2、dTomato、dTomato-Tandem、EBFP、EBFP2、ECFP、EGFP、Emerald、EosFP、EYFP、GFP、HcRed-Tandem、HcRed1、JRed、Katuska、Kusabira Orange、KusabiraOrange2、mApple、mBanana、mCerulean、mCFP、mCherry、mCitrine、mECFP、mEmerald、mGrape1、mGrape2、mHoneydew、Midori-Ishi Cyan、mKeima、mKO、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mRuby、mStrawberry、mTagBFP、mTangerine、mTeal、mTomato、mTurquoise、mWasabi、PhiYFP、ReAsH、Sapphire、Superfolder GFP、T-Sapphire、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagRFP-T、TagYFP、tdTomato、Topaz、TurboGFP、Venus、YFP、YPet、ZsGreen和ZsYellow1的突变体和光谱变体。
指示剂分子可以是荧光染料。荧光染料的非限制性实例包含SYBR绿；SYBR蓝；DAPI；碘化丙啶；赫斯特(Hoeste)；SYBR金；溴化乙锭；吖啶；普罗黄素；吖啶橙；吖啶黄；氟香豆素；玫瑰树碱；道诺霉素(daunomycin)；氯喹；偏端菌素D；色霉素(chromomycin)；乙菲啶(homidium)；光神霉素(mithramycin)；钌多吡啶；氨茴霉素(anthramycin)；菲啶和吖啶；碘化丙啶；碘化乙啶；二氢乙锭；叠氮溴乙锭；ACMA、赫斯特33258；赫斯特33342；赫斯特34580；DAPI；吖啶橙；7-AAD；放线菌素D；LDS751；羟脒芪(hydroxystilbamidine)；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；POPO-1；POPO-3；YOYO-1；YOYO-3；TOTO-1；TOTO-3；JOJO-1；LOLO-1；BOBO-1；BOBO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；BO-PRO-1；BO-PRO-3；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；JO-PRO-1；LO-PRO-1；YO-PRO-1；YO-PRO-3；PicoGreen；OliGreen；RiboGreen；SYBR金；SYBR绿I；SYBR绿II；SYBR DX；SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44和SYTO-45(蓝色)；SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14和SYTO-25(绿色)；SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84和SYTO-85(橙色)；SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60和SYTO-63(红色)；荧光素；荧光素异硫氰酸酯(FITC)；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；罗丹明；四甲基罗丹明；R-藻红蛋白；Cy-2；Cy-3；Cy-3.5；Cy-5；Cy5.5；Cy-7；德克萨斯红(Texas Red)；Phar-Red；别藻蓝蛋白(APC)；Sybr绿I；Sybr绿II；Sybr金；CellTracker绿；7-AAD；乙锭同源二聚体I；乙锭同源二聚体II；乙锭同源二聚体III；溴化乙锭；伞形酮；曙红；绿色荧光蛋白；赤藓红；香豆素；甲基香豆素；芘；孔雀石绿；二苯乙烯；萤光黄；级联蓝；二氯三锌胺荧光素；丹磺酰氯；荧光镧系元素复合物；如包含铕和铽的荧光镧系元素复合物；羧基四氯荧光素；5和/或6-羧基荧光素(FAM)；5-(或6-)碘乙酰胺荧光素；5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)；丽丝胺罗丹明B磺酰氯；5或6羧基罗丹明(ROX)；7-氨基-甲基-香豆素；7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)；BODIPY荧光团；8-甲氧基芘-1；3；6-三磺酸三钠盐；3；6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺；藻胆蛋白；AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料；DyLight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料；以及其它荧光团。
指示剂分子可以是有机金属荧光团。有机金属荧光团的非限制性实例包含镧系离子螯合物，其非限制性实例包含三(二苯甲酰基甲烷)单(1,10-菲咯啉)铕(lll)、三(二苯基甲烷)单(5-氨基-1,10-菲咯啉)铕(lll)和Lumi4-Tb穴状化合物。
微流体装置可以填充有一种或多种扩增试剂，如核酸分子、用于扩增反应的组分(例如，引物、聚合酶和脱氧核糖核苷酸)、指示剂分子和扩增探针。如本文所描述的，扩增反应可以涉及多个微室或其子集的热循环。核酸扩增的检测可以通过从微流体装置的多个室或其子集收集信号(例如，成像)来进行。核酸分子可以通过计数其中核酸分子被成功扩增的微室并应用泊松统计来定量。核酸分子可以被分配，使得分区包括一个或更少的核酸分子。可替代地或另外，分区可以包含多个核酸分子。核酸分子还可以通过处理在整个扩增反应的不同时间点收集的信号来定量。例如，可以在核酸扩增反应的每个热循环(例如，每个扩增循环)期间收集一个或多个信号，并且可以使用所述信号来确定例如实时或定量聚合酶链式反应(实时PCR或qPCR)中的扩增速率。核酸扩增和定量可以在单个集成单元中进行，例如，在装置的给定分区或多个分区的子集内。在一些实例中，可以实时检测和监测核酸扩增。
多种核酸扩增反应可用于扩增样品中的核酸分子以生成扩增产物。核酸靶的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。核酸扩增方法的非限制性实例包含引物延伸、聚合酶链反应、逆转录、等温扩增、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增。扩增反应的扩增产物可以是DNA或RNA。对于包含DNA分子的样品，可以采用任何DNA扩增方法。DNA扩增方法包含但不限于PCR、实时PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、小引物PCR、多重PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR、降落PCR和连接酶链反应。DNA扩增可以是线性的、指数的或其任何组合。DNA扩增也可以用数字PCR(dPCR)、实时定量PCR(qPCR)或定量数字PCR(qdPCR)实现，如本文所描述的。
用于核酸扩增的试剂可以包含聚合酶、反向引物、正向引物和扩增探针。聚合酶的实例包含但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶(即催化键形成的酶)。聚合酶可以是天然存在的或合成的。聚合酶的实例包含DNA聚合酶，和RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶、Φ29(phi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、Ex-Taq聚合酶、LA-Taw聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、铂Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、具有3'至5'外切核酸酶活性的Klenow片段聚合酶及其变体、修饰产物及衍生物。对于热启动聚合酶，可使用在约92℃至95℃的温度下变性约2分钟至10分钟的时间段。
核酸扩增反应可以涉及扩增探针。扩增探针可以是序列特异性寡核苷酸探针。当与扩增产物杂交时，扩增探针可以是光学活性的。随着核酸扩增的进行，扩增探针可以被检测到。从包含核酸分子的多个分区收集的信号(例如，光信号)的强度可以与分区中包含的扩增产物的量成比例。例如，从特定分区收集的信号可以与该特定分区中的扩增的产物的量成比例。探针可以连接至本文所述的任何光学活性可检测部分(例如，染料)，并且还可以包含能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作可检测部分的探针的非限制性实例包含TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、锁定核酸探针或分子信标。可用于阻断探针的光学活性的猝灭剂的非限制性实例包含黑洞猝灭剂(BHQ)、IowaBlack FQ和RQ猝灭剂，或内部ZEN猝灭剂。可替代地或另外，探针或淬灭剂可以是在本公开的方法的上下文中有用的任何探针。
扩增探针可以是双标记荧光探针。双标记探针可包含与核酸连接的荧光报道分子和荧光猝灭剂。荧光报道分子和荧光淬灭剂可以紧邻彼此定位。荧光报道分子和荧光猝灭剂的紧邻可以阻断荧光报道分子的光学活性。双标记探针可与待扩增的核酸分子结合。在扩增过程中，荧光报道分子和荧光猝灭剂可被聚合酶的外切核酸酶活性切割。从扩增探针切割荧光报道分子和猝灭剂可以使荧光报道分子恢复其光学活性并能够检测。双标记荧光探针可以包含5'荧光报道分子，其具有约450纳米(nm)、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高的激发波长最大值和约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高的发射波长最大值。双标记荧光探针还可以包含3'荧光猝灭剂。荧光淬灭剂可以淬灭约380nm至550nm、390nm至625nm、470nm至560nm、480nm至580nm、550nm至650nm、550nm至750nm，或620nm至730nm之间的荧光发射波长。
核酸扩增可以包含热循环的多个循环(例如，多个扩增循环)。可以执行任何合适数目的循环。所执行的循环数量可以是多于约5个循环、多于约10个循环、多于约15个循环、多于约20个循环、多于约30个循环、多于约40个循环、多于约50个循环、多于约60个循环、多于约70个循环、多于约80个循环、多于约90个循环、多于约100个循环或更多个循环。所执行的循环数量可以取决于获得可检测扩增产物的循环数量。例如，在PCR(例如，dPCR、qPCR或qdPCR)期间检测核酸扩增的循环数量可以小于或等于约100个循环、小于或等于约90个循环、小于或等于约80个循环、小于或等于约70个循环、小于或等于约60个循环、小于或等于约50个循环、小于或等于约40个循环、小于或等于约30个循环、小于或等于约20个循环、小于或等于约15个循环、小于等于约10个循环、小于或等于约5个循环或更少。可以实时监测核酸扩增。在一个实例中，核酸扩增作为所执行的循环数的函数而被监测。监测核酸扩增可以允许检测假阳性。例如，不遵循预期的扩增趋势的分区可以产生假阳性。假阳性可从另外的分析中排除。将核酸扩增作为扩增循环的数量的函数监测可以允许减少收集的数据量并提高分析速度。可以每2个、4个、6个、8个、10个、12个、15个、20个或更多个循环监测核酸扩增反应(例如，可以收集信号)。在一个实例中，至少每隔一个循环收集一次扩增信号。在另一个实例中，至少每4个循环收集一次扩增信号。在另一个实例中，至少每10个循环收集一次扩增信号。
所述方法可以进一步包括使双链核酸分子变性。双链核酸分子可以使用热能、酸或碱(例如，氢氧化钠处理)、有机溶剂、盐或其任何组合来变性。双链核酸分子的变性可以是可逆的(例如，通过热变性)或不可逆的(例如，通过盐或有机溶剂)。在一个实例中，双链核酸分子通过热能变性。变性温度可根据例如核酸分子、所用的试剂和反应条件而变化。
双链核酸分子可以通过核酸分子或其衍生物的受控加热来热变性。在一个实例中，双链核酸分子安置在多个分区中，并且分区经历受控加热。受控加热可以包含电阻加热、辐射加热、传导加热、对流加热、热电加热或其任何组合。热变性可以包含将双链核酸分子受控加热到约60℃至70℃、60℃至80℃、60℃至90℃、60℃至100℃、60℃至110℃、70℃至80℃、70℃至90℃、70℃至100℃、70℃至110℃、80℃至90℃、80℃至100℃、80℃至110℃、90℃至100℃、90℃至110℃或100℃至110℃的温度，持续给定的时间段。在一个实例中，双链核酸分子可以在给定时间内经历从约60℃至约90℃的受控加热。在另一个实例中，双链核酸分子可以在给定时间内经历从约65℃至约85℃的受控加热。热变性可以包含将双链核酸分子受控加热到大于或等于约60℃、65℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃或更高的温度，持续给定的时间段。
热变性的持续时间可根据例如特定核酸分子、所用的试剂和反应条件而变化。热变性的持续时间可以小于或等于约300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。可替代地，变性的持续时间可以不超过约120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。
装置的多个分区的子集的受控加热可以以任何有用的速率和在任何有用的温度范围内进行。例如，可以在至少约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃或约95℃或更高的较低温度下进行受控加热。可以将受控加热以至少约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃或约100℃或更高的上限温度进行。温度可以以任何有用的增量增加。例如，温度可以以至少约0.01℃、约0.05℃、约0.1℃、约0.2℃、约0.3℃、约0.4℃、约0.5℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃或约10℃或高的温度增加。受控加热也可以在均匀或均匀间隔的温度增量上发生。例如，在预期核酸分子显著熔融的范围内(例如，细粒测量)，温度可以升高约0.1℃，并且在预期核酸分子没有显著熔融的范围内(例如，粗粒测量)，温度可以升高约1℃。受控加热可以以任何有用的速率进行，如至少约0.0001℃/秒、约0.0002℃/秒、约0.0003℃/秒、约0.0004℃/秒、约0.0005℃/秒、约0.0006℃/秒、约0.0007℃/秒、约0.0008℃/秒、约0.0009℃/秒、约0.001℃/秒、约0.002℃/秒、约0.003℃/秒、约0.004℃/秒、约0.005℃/秒、约0.006℃/秒、约0.007℃/秒、约0.008℃/秒、约0.009℃/秒、约0.01℃/秒、约0.02℃/秒、约0.03℃/秒、约0.04℃/秒、约0.05℃/秒、约0.06℃/秒、约0.07℃/秒、约0.08℃/秒、约0.09℃/秒、约0.1℃/秒、约0.2℃/秒、约0.3℃/秒、约0.4℃/秒、约0.5℃/秒、约0.6℃/秒、约0.7℃/秒、约0.8℃/秒、约0.9℃/秒、约1℃/秒、约2℃/秒、约3℃/秒、约4℃/秒以及约5℃/秒或更高。执行受控加热过程的热单元(例如，加热器)可以在任何有用的持续时间内维持给定的温度。例如，给定温度可以维持至少约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约6秒、约7秒、约8秒、约9秒、约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约45秒、约60秒、约70秒、约80秒、约90秒、约100秒、约110秒、约120秒、约130秒、约140秒、约150秒、约160秒、约170秒、约180秒、约190秒、约200秒、约210秒、约220秒、约230秒、约240秒、约250秒或约300秒或更长。
所述方法可以进一步包含在双链核酸分子变性期间收集信号。信号可以包含光信号、电信号或其任何组合。在一个实例中，收集的信号是光信号。光信号的收集可以包含微流体装置的成像分区或微流体装置分区的一部分。可以在任何选定的时间点从多个分区的子集收集信号。例如，可以以至少约每1秒、约每2秒、约每3秒、约每4秒、约每5秒、约每6秒、约每7秒、约每8秒、约每9秒、约每10秒、约每20秒、约每30秒、约每45秒、约每60秒、约每70秒、约每80秒、约每90秒、约每100秒、约每110秒、约每120秒、约每130秒、约每140秒、约每150秒、约每160秒、约每170秒、约每180秒、约每190秒、约每200秒、约每210秒、约每220秒、约每230秒，约每240秒，约每250秒或约每300秒或更长的时间收集信号。可替代地或另外，可以以选定的温度间隔收集信号。例如，可以以小于或等于约5℃、4℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃、1℃、0.5℃、0.25℃或更低的温度间隔收集信号。可以从微流体装置或其多个分区(例如，微室)的子集收集信号(例如，拍摄的图像)。收集信号可以包括拍摄装置或其多个分区的子集的图像。可以同时从单个微室、微室阵列或多个微室阵列收集信号(例如，图像)。可以通过微流体装置的主体，通过微流体装置的薄膜或两者来收集信号。微流体装置的主体可以是基本上光学透明的。可替代地，微流体装置的主体可以是基本上光学不透明的。类似地，薄膜可以是基本上光学透明的。可替代地，微流体装置的主体可以是基本上光学不透明的。
所述方法可以进一步包含使用嵌入染料。嵌入染料可以产生可检测信号。所述方法可以包含使用单一类型的嵌入染料(例如，具有第一发射波长的荧光染料)，或所述方法可以包含使用多种类型的嵌入染料(例如，多个发射波长的多种荧光染料)。由所述方法产生的可检测信号可以作为原始荧光单位、相对荧光单位、拷贝数(cp)、与体积相关的拷贝数(例如，cp/μL)、扩增临界阈值(Ct)、扩增循环、浓度、绝对数、导数报告、任意单位或其任何组合呈现或读取。嵌入染料可以在核酸分子扩增期间插入核酸分子中。嵌入染料可以非特异性地与双链核酸分子相互作用或结合。嵌入染料与双链核酸分子的缔合可以允许嵌入染料的可检测荧光。核酸分子的变性可以淬灭或以其它方式消除来自嵌入染料的荧光信号。嵌入染料的非限制性实例包含SYBR绿、EvaGreen、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、赫斯特、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、普罗黄素、吖啶橙、吖啶黄、氟香豆素、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端菌素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、钌多吡啶、氨茴霉素、菲啶、LCGReen或其任何组合。
所述方法可以进一步包含处理收集的信号以产生核酸分子的变性曲线。可替代地或另外，收集的信号可以被处理以产生包括一个或多个双链核酸分子的单个分区的变性曲线。处理收集的信号可以包括使用信号来产生变性曲线(例如，变性曲线)，如信号对温度曲线或信号对浓度曲线(例如，针对碱、盐或有机溶剂变性)。信号可以包含光信号(例如，荧光强度)或非光信号(例如，电信号)。处理信号可以进一步包含绘制变性曲线的负一阶导数以确定变性温度或变性剂浓度。处理信号可以进一步包含执行熔融曲线分析以确定核酸分子或多个核酸分子的变性曲线或解离特性(例如，熔融温度)。当与双链核酸分子缔合时，嵌入染料可以产生信号。当双链核酸分子变性并形成随机线圈时，嵌入染料可以与单链核酸分子分离，并且信号可能降低或变为零。
双链核酸分子可以具有与另一双链核酸分子不同的变性曲线。例如，第一双链核酸分子可以产生第一变性曲线，并且第二双链核酸分子可以产生第二变性曲线。第一变性曲线可以允许检测、鉴定或定量第一靶核酸分子，并且第二变性曲线可以允许检测、鉴定或定量第二靶核酸分子。在一些情况下，处理收集的信号可以包含产生1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个双链核酸分子的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个变性曲线，所述变性曲线对应于1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种不同的靶核酸分子。在一些情况下，在单个样品或多个样品中提供靶核酸分子。双链核酸分子的变性曲线可以取决于组成核酸分子的核碱基、核酸分子的长度(例如，碱基的数量)、组成核酸分子(例如，PNA、DNA、BNA、LNA等)的核苷酸类型、核酸分子的浓度或其任何组合。双链核酸分子可以不同于另一个双链核酸分子。第一双链核酸分子的变性曲线可以使用具有尾部或非互补序列的正向引物来调节或改变。尾部或非互补序列可以向双链核酸添加另外的核碱基，其可通过改变尾部或非互补序列中的长度或存在的核碱基来改变双链核酸分子的变性曲线。双链核酸分子与另一个双链核酸分子之间的差异可以允许通过变性曲线将双链核酸分子与另一个双链核酸分子区分开来。双链核酸分子的变性曲线的特征(例如，熔融温度、变性浓度等)可以与另一个双链核酸分子的变性曲线相差至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、15％、20％、30％、40％或更多。例如，双链核酸分子的熔融温度可以与另一个双链核酸分子的熔融温度相差至少约0.5％。在另一个实例中，双链核酸分子的熔融温度可以与另一个双链核酸分子的熔融温度相差至少约1％。在另一个实例中，双链核酸分子的熔融温度可以与另一个双链核酸分子的熔融温度相差至少约2％。在另一个实例中，双链核酸分子的熔融温度可以与另一个双链核酸分子的熔融温度相差至少约5％。
在一个实例中，双链核酸分子的变性曲线包含双链核酸分子的熔点，并且不同于另一个双链核酸分子的变性曲线(例如，熔点)。双链核酸分子的熔点可与另一个双链核酸分子的熔点相差至少约0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.8℃、1℃、1.5℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、8℃、10℃或更多度。在一个实例中，双链核酸分子的熔点可以与另一个双链核酸分子的熔点至少相差0.25℃。在另一个实例中，双链核酸的熔点可以与另一个双链核酸分子的熔点至少相差0.5℃。熔点可以从核酸分子的一阶导数图导出。可替代地或另外，熔融曲线减法可以用于区分核酸分子与另一个核酸分子的熔点，并且从而区分一种分析物与另一种分析物的同一性。
本文所描述的方法和系统可以使用各种测定来评估。在一个实例中，脊髓性肌萎缩症(SMA)测定可以用于评估方法和集成系统。图6示出了用于验证仪器性能的示例软件工作流程。在此实例中，在熔融曲线分析期间，温度可以在60℃至90℃之间以0.05℃/秒的速度上升。在每个温度步骤，可以获取含有所有数字反应室的图像。原始熔融曲线可以通过Savitzky-Golay平滑滤光器使用用户定义的参数进行平滑，然后通过温度调整进行内插，以使内部校准器的熔融温度(Tm)在从所有室获得的曲线上对齐。在校准室与室变化(例如，对于光学信号和温度)和曲线平滑之后，熔融曲线可以被归一化，以将温度相关背景荧光变化的贡献与DNA熔融相关的真实荧光信号解耦。可以基于多种参数评估集成系统，包含检测灵敏度、定量和基于空白检测限、检测限和定量限的可再现性。空白检测限可以使用无模板对照或没有DNA模板的PCR试剂来确定，并且可以作为从空白样品观察到的平均信号来确定。可以使用连续稀释的DNA样品的基因组拷贝数来确定检测限。基因组拷贝的最低可靠定量数量可以取决于在重复中测量的标准偏差。定量限可以通过定量基因组DNA的0.001/分区至1/分区(例如，四十年)来确定。
本文所描述的方法可以用于各种实验过程。例如，可以使用纯化的DNA样品来证明方法和系统性能。可以评估DNA样品以确定样品的粗DNA浓度。DNA样品可以与主混合物测定、用于广泛PCR测定的试剂和嵌入染料结合。图7A至7C示出了证明系统性能的示例过程。图7A示出了用于定量和纯化样品内DNA的示例样品制备工作流程。样品分配、靶扩增和变性可以如本文别处所描述的进行。示例分配和变性曲线在图7B中示出。对于熔体曲线匹配，可以从软件获取校准的归一化熔融曲线，并且将其传递到已知样品的熔融曲线数据库中，以匹配和鉴定未知样品，如图7C所示。分类器(例如，朴素贝叶斯分类器(
-Bayesclassifier))可以用于输出每个可能类别的后验概率。在此实例中，类别可以是与其相应的熔融曲线相对应的已知生物标签，并且后验概率可以是属于该类别的样品的概率。分类器可以应用贝叶斯定理(Bayes theorem)，并且是类P(C)的先验概率和似然函数的乘积，所述似然函数可以是给定类P(X|C)的观测概率。这里，似然函数可以描述为熔融曲线之间的相似性度量。为了进一步说明形状的相似性，模型可以使用希尔伯特变换(Hilberttransformation)来卷积曲线。然后可以将曲线与原始值以及来自样品和类曲线的变换的复值进行比较，以确定其之间的距离。最高后验概率可以表明样品最有可能是该生物体。
本文所描述的方法和集成平台可以用于基于探针的变性曲线生成。基于探针的变性曲线可以用于提高多重性。图8示出了基于探针的技术用于基于小图的呼吸道病原体检测的实例。基于探针的多重化可以用于确定熔融温度，然而，可能无法准确地定量靶标，因为本体反应中的多重化可能会影响靶标之间的PCR扩增效率，使得与标准曲线相关非常具有挑战性。通过在集成的dPCR平台上运行测定，可以使用熔融曲线实现多重定量。此外，与dPCR平台集成的基于探针的变性曲线生成可以提供成本效益高、敏感的多基因患者纵向监测应用，这可以影响传染病和肿瘤患者护理。
用于核酸鉴定的系统和装置
另一方面，本公开提供了用于核酸鉴定的系统。所述系统可以包含检测单元和一个或多个处理器。检测单元可以被配置成收集或可以收集和处理用于鉴定核酸分子的信号。一个或多个处理器可以操作性地耦接到检测单元，并且可以单独地或集体地编程或以其它方式被配置成执行本文别处描述的方法。例如，处理器可以被编程或被配置成在多个室中从多个核酸分子产生多个双链核酸分子，使所述双链核酸分子变性，检测指示所述双链核酸分子的变性的信号以产生多个变性曲线，以及处理所述变性曲线以鉴定至少一种核酸分子。所述多个双链核酸分子可以包含双链核酸分子的第一子集和双链核酸分子的第二子集。双链核酸分子的第一子集可以包含第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列。所述多个双链核酸分子可以包含双链核酸分子的第二子集，所述双链核酸分子包括第二双链核酸分子。所述第二双链核酸分子可以包括与第二核酸分子相对应的第二序列，并且不包含添加的序列。所述第一双链核酸分子可以在变性时产生第一变性曲线，并且所述第二双链核酸分子可以在变性时产生第二变性曲线。第一和第二变性曲线可以是不同的和可区分的。添加的序列可以调节第一双链核酸分子的变性曲线，以允许或增强第一和第二变性曲线之间的分化。
所述系统可以被配置成实施或可以实施本文别处描述的任何方法。所述系统可以使用本文别处描述的任何装置、试剂或组分。
所述系统可以进一步包含微流体装置。微流体装置可以包含多个分区(例如，分区阵列)。核酸分子可以是多个核酸分子中的一个，并且系统可以为所述多个核酸分子提供用于分配的微流体装置。系统可以进一步被配置成扩增核酸分子并使核酸分子经历分区中的变性条件。
本公开的微流体装置可以是耗材装置(例如，设计用于单次使用，如分析或处理单个样品)或可重复使用装置(例如，设计用于多次使用，如分析或处理多个样品)。用于包含在装置中的材料的选择可以反映装置是否可以使用一次或多次。例如，耗材装置可以包括比可重复使用装置便宜的材料。类似地，制造过程可以根据装置的使用而定制。例如，用于耗材装置的制造过程可以涉及较少废物的产生或涉及较低成本的制造。可重复使用的装置可以是可清洁的或可消毒的，以便于使用同一装置分析或处理多个样品。例如，可重复使用的装置可以包括能够承受适合于灭菌的高温的材料。耗材装置可以包括或可以不包括此类材料。
微流体装置可以包含流体流动路径。流体流动路径可以包含一个通道或多个通道。流体流动路径可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个通道。每个通道可以彼此流体隔离。可替代地或另外，多个通道可以彼此流体连通。通道可以包含第一端和第二端。第一端和第二端可以连接到单个入口端口。具有连接到单个入口端口的第一端和第二端的通道可以是圆形或环形构造，使得通过入口端口进入通道的流体可以同时被引导通过通道的第一端和第二端。可替代地，第一端和第二端可以连接到不同的入口端口。可替代地，第一端可以连接到入口端口，并且第二端可以连接到出口端口。可替代地，第一端可以连接到入口端口，并且第二端可以是封闭端或死端。流体流动路径可以包含多个分区(例如，室)。流体流动路径或室可以不包含用于停止或阻碍流体流动或隔离室的阀。
装置可以包括长尺寸和短尺寸。长尺寸可以小于或等于约20厘米(cm)、15cm、10cm、8cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm或更小。装置的短尺寸可以小于或等于约10cm、8cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm、0.5cm或更小。在一个实例中，装置(例如，微流体装置)的尺寸为约7.5cm×2.5cm。通道可以基本上平行于微流体装置的长尺寸。可替代地或另外，通道可以基本上垂直于微流体装置的长尺寸(例如，平行于装置的短尺寸)。可替代地或另外，通道可以既不基本平行也不基本垂直于微流体装置的长尺寸。通道与微流体装置的长尺寸之间的角度可以是至少约5°、10°、15°、20°、30°、40°、50°、60°、70°或90。在一个实例中，通道是单个长通道。可替代地或另外，通道可以具有弯曲、曲线或角度。通道可以具有小于或等于约100毫米(mm)、75mm、50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、8mm、6mm、4mm、2mm或更小的长尺寸。通道的长度可以由微流体装置的外部长度或宽度限定。通道的深度可小于或等于约为500微米(μm)、250μm、100μm、80μm、60μm、30μm、20μm、10μm或更小。通道的横截面尺寸(例如，宽度或直径)可以小于或等于约500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm或更小。
在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，通道的横截面尺寸可以为约10μm宽×约10μm深。
通道的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包含但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。通道的横截面积可以沿着通道的长度是恒定的。可替代地或另外，通道的横截面积可以沿着通道的长度变化。通道的横截面积可以从约50％至150％、60％至125％、70％至120％、80％至115％、90％至110％、95％至100％或98％至102％变化。通道的横截面积可以小于或等于约10,000平方微米(μm2)、7,500μm2、5,000μm2、2,500μm2、1,000μm2、750μm2、500μm2、400μm2、300μm2、200μm2、100μm2或更小。
通道可以具有单个入口或多个入口。入口可以具有相同的直径，或其可以具有不同的直径。入口的直径可小于或等于约2.5毫米(mm)、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm或更小。
装置可以包含多个室。多个室可以是室阵列。装置可以包含室的单个阵列或室的多个阵列，其中每个室阵列与其它阵列流体隔离。室阵列可以布置成行、成网格配置、成交替模式或成任何其它配置。微流体装置在基材上产生，并且所述基材可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个或更多个室阵列。在一个实例中，基材可以包含至少4个室阵列。基材可以设置在耗材板中。耗材板可被配置成保持或可以保持至少1个、2个、3个、4个、6个、8个、10个、12个、15个、20个或更多个基材。在一个实例中，耗材板保持至少4个基材。室阵列可以相同或室阵列可以不同(例如，具有不同数量或配置的室)。室阵列可以全部具有相同的外部尺寸(即涵盖室阵列的所有特征的室阵列的长度和宽度)或室阵列可以具有不同的外部尺寸。室阵列的宽度可以小于或等于约100mm、75mm、50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、8mm、6mm、4mm、2mm、1mm或更小。室阵列的长度可以大于或等于约50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、8mm、6mm、4mm、2mm、1mm或更小。在一个实例中，阵列的宽度可以为约1mm至100mm或约10mm至50mm。在一个实例中，阵列的长度可以为约1mm至50mm或约5mm至20mm。
室阵列可具有大于或等于约1,000个室、5,000个室、10,000个室、20,000个室、30,000个室、40,000个室、50,000个室、100,000个室或更多个室。在一个实例中，微流体装置可以具有约10,000个室至30,000个室。在另一个实例中，微流体装置可以具有约15,000个室至25,000个室。室可以是圆柱形、半球形或圆柱形和半球形的组合。可替代地或另外，室可以是立方体形。室的横截面尺寸可以小于或等于约500μm、250μm、100μm、80μm、60μm、30μm、15μm或更小。在一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约250μm。在另一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约100μm。在另一个实例中，室的横截面尺寸(例如，直径或边长)小于或等于约50μm。
室的深度可以小于或等于约500μm、250μm、100μm、80μm、60μm、30μm、15μm或更小。在一个实例中，室可以具有约30μm的横截面尺寸和约100μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约35μm的横截面尺寸和约80μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约40μm的横截面尺寸和约70μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约50μm的横截面尺寸和约60μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约60μm的横截面尺寸和约40μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约80μm的横截面尺寸和约35μm的深度。在另一个实例中，室可以具有约100μm的横截面尺寸和约30μm的深度。在另一个实例中，室和通道具有相同的深度。在替代性实施例中，室和通道具有不同的深度。
室可以具有任何体积。室可以具有相同的体积，或体积可以在微流体装置上变化。室的体积可以小于或等于约1000皮升(pL)、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、75pL、50pL、25pL或更小皮升。室的体积可为约25pL至50pL、25pL至75pL、25pL至100pL、25pL至200pL、25pL至300pL、25pL至400pL、25pL至500pL、25pL至600pL、25pL至700pL、25pL至800pL、25pL至900pL或25pL至1000pL。在一个实例中，室的体积小于或等于500pL。在另一个实例中，室的体积小于或等于约250pL。在另一个实例中，室的体积小于或等于约100pL。
通道的体积可以小于、等于或大于室的总体积。在一个实例中，通道的体积小于室的总体积。通道的体积可以小于或等于室的总体积的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小。
装置可以进一步包含安置在通道与室之间的虹吸孔。虹吸孔可以是将通道连接到多个室的多个虹吸孔中的一个。虹吸孔可被配置成提供通道与室之间的流体连通。虹吸孔的长度可以在整个装置(例如，微流体装置)上恒定或可以变化。虹吸孔的长尺寸可以小于或等于约150μm、100μm、50μm、25μm、10μm、5μm或更小。虹吸孔的深度可以小于或等于约50μm、25μm、10μm、5μm或更小。虹吸孔的横截面尺寸可以小于或等于约50μm、40μm、30μm、20μm、10μm、5μm或更小。
虹吸孔的横截面形状可以是任何合适的横截面形状，包含但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。虹吸孔的横截面积可以沿着虹吸孔的长度是恒定的。可替代地或附加地，虹吸孔的横截面积可以沿着虹吸孔的长度变化。虹吸孔在与通道的连接处的横截面积可以大于虹吸孔在与室的连接处的横截面积。可替代地，虹吸孔在与室的连接处的横截面积可以大于虹吸孔在与通道的连接处的横截面积。虹吸孔的横截面积可以从约50％至150％、60％至125％、70％至120％、80％至115％、90％至110％、95％至100％或98％至102％变化。虹吸孔的横截面积可以小于或等于约2,500μm2、1,000μm2、750μm2、500μm2、250μm2、100μm2、75μm2、50μm2、25μm2或更小。虹吸孔在与通道的连接处的横截面积可以小于或等于通道的横截面积。虹吸孔在与通道的连接处的横截面积可以小于或等于通道横截面积的约98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％或更小。虹吸孔可以基本上垂直于通道。可替代地或另外，虹吸孔基本上不垂直于通道。虹吸孔与通道之间的角度可以为至少约为5°、10°、15°、20°、30°、40°、50°、60°、70°或90°。
微流体装置可以被配置成允许对通道、室、虹吸孔或其任何组合进行加压排气或脱气。加压排气或脱气可以由被配置成允许加压排气或脱气的薄膜或膜提供。可替代地或另外，加压排气或脱气可以由与室、通道或两者相邻安置的第二通道(例如，排气通道)提供。第二通道可以允许高于压力阈值的加压排气或脱气。薄膜或膜可以渗透高于压力阈值的气体。薄膜或膜可以不可渗透(例如，不可渗透或基本不可渗透)液体，如但不限于水性流体、油或其它溶剂。通道、室、虹吸孔或其任何组合可以包括薄膜或膜。在一个实例中，室包括透气薄膜或膜，并且通道或虹吸孔不包括透气薄膜或膜。在另一个实例中，室和虹吸孔包括透气薄膜或膜，并且通道不包括透气薄膜或膜。在另一个实例中，室、通道和虹吸孔包括透气薄膜或膜。
薄膜或膜可以是薄膜。薄膜或膜可以是聚合物。薄膜可以是热塑性薄膜或膜。薄膜或膜可以不包括弹性材料。透气薄膜或膜可以覆盖流体流动路径、通道、室或其任何组合。在一个实例中，透气薄膜或膜覆盖室。在另一个实例中，透气薄膜或膜覆盖室和通道。薄膜的透气性可以由升高的压力诱导。薄膜或膜的厚度可以小于或等于约500微米(μm)、250μm、200μm、150μm、100μm、75μm、50μm、25μm或更小。在一个实例中，薄膜或膜的厚度小于或等于约100μm。在另一个实例中，薄膜或膜的厚度小于或等于约50μm。在另一个实例中，薄膜或膜的厚度小于或等于约25μm。薄膜或膜的厚度可以为约0.1μm至约200μm、0.5μm至150μm或25μm至100μm。在一个实例中，薄膜或膜的厚度为约25μm至100μm。薄膜的厚度可以通过薄膜的可制造性、薄膜的透气性、要排出气体的每个室或分区的体积、可用压力或完成分配或数字化过程的时间来选择。
薄膜或第二通道可以被配置成在不同的施加的压差下具有不同的渗透特性。例如，薄膜或第二通道可以在第一压差(例如，低压)下不透气，并且在第二压差(例如，高压)下至少部分透气。第一压差(例如，低压差)可以小于或等于约8磅/平方英寸(psi)、6psi、4psi、2psi、1psi或更小。在一个实例中，薄膜或膜在小于4psi的压差下基本上不透气。第二压差(例如，高压差)可以大于或等于约1psi、2psi、4psi、6psi、8psi、10psi、12psi、14psi、16psi、20psi或更大。在一个实例中，薄膜或膜在大于或等于4psi的压力下基本上是透气的。
系统可以包含被配置成收纳或保持微流体装置的保持器。保持器可以是用于保持装置的架子、收纳器或平台。在一个实例中，保持器是传送台。传送台可以被配置成输入微流体装置，保持微流体装置，和输出微流体装置。微流体装置可以是本文别处描述的任何装置。传送台在一个或多个坐标中可以是静止的。可替代地或附加地，传送台可能够在X方向、Y方向、Z方向或其任意组合上移动。传送台能够保持单个微流体装置。可替代地或另外，传送台可以能够保持至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个微流体装置。
系统可以包含处理单元。处理单元可以包含气动模块、真空模块或其任何组合。处理单元可以被配置成扩增多个分区或室中的核酸分子。处理单元可以被配置成与微流体装置的入口端口流体连通。处理单元可以具有能够连接到多个入口端口的多个连接点。处理单元可以一次填充、回填和分配室的单个阵列或串联的室的多个阵列。处理单元可以是与真空模块组合的气动模块。处理单元可以向微流体装置提供增加的压力或向微流体装置提供真空以用于加压排气或脱气。
系统可以进一步包括热单元。热单元操作性地耦接到一个或多个处理器。热单元可以被配置成提供电阻加热、辐射加热、传导加热、对流加热、热电加热或其任何组合。在一个实例中，热单元包括热电温度控制单元。热单元可以被配置成与微流体装置的室热连通。热单元可以被配置成控制室的单个阵列的温度或控制室的多个阵列的温度，以允许核酸分子的热变性。室阵列可以被热单元单独寻址。例如，热单元可以跨所有室阵列执行相同的热程序或可以对不同的室阵列执行不同的热程序。热单元可以与微流体装置或微流体装置的室热连通。热单元可以加热或冷却微流体装置。微流体装置的一个或多个表面可以与热单元直接接触。可替代地或另外，导热材料可以安置在热模块与微流体装置之间。热单元可以维持微流体装置表面上的温度，使得变化小于或等于约2℃、1.5℃、1℃、0.9℃、0.8℃、0.7℃、0.6℃、0.5℃、0.4℃、0.3℃、0.2℃、0.1℃或更小。热单元可以将微流体装置表面的温度维持在约正负0.5℃、0.4℃、0.3℃、0.2℃、0.1℃、0.05℃或更接近温度设定点的范围内。
系统可以进一步包含检测单元。检测模块可以提供电子或光学检测。在一个实例中，检测单元是提供光学检测的光学单元。光学单元可以被配置成发射和检测多个波长的光。发射波长可以对应于所使用的指示剂和扩增探针的激发波长。所发射的光可包含最大强度为约450nm、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合的波长。检测到的光可包含最大强度为约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合的波长。光学单元可以被配置成发射多于一个、两个、三个、四个或更多个波长的光。光学单元可以被配置成检测多于一个、两个、三个、四个或更多个波长的光。光的一个发射波长可以对应于指示剂分子的激发波长。光的另一发射波长可以对应于扩增探针的激发波长。一种检测到的光波长可以对应于指示剂分子的发射波长。另一种检测到的光波长可以对应于用于检测室内的反应的扩增探针。光学单元可以被配置成对室阵列的部分进行成像。可替代地或另外，光学单元可以在单个图像中对整个室阵列进行成像。在一个实例中，光学单元被配置成拍摄装置的视频。
检测单元可以包含静止成像单元，所述静止成像单元被配置成从耗材板捕获数据。图9A示出了成像单元的示例设计参数。成像单元可以被配置成对多个室(例如，耗材装置)的至少一部分或整个耗材装置进行成像。由成像单元成像的耗材装置的量可以由成像装置的视场确定。成像单元的视场可以大于或等于15毫米(mm)×15mm、15mm×20mm、15mm×25mm、15mm×50mm、15mm×75mm、15mm×100mm、20mm×20mm、20mm×25mm、20mm×50mm、20mm×75mm、20mm×100mm、25mm×25mm、25mm×50mm、25mm×75mm、25mm×100mm、50mm×50mm、50mm×75mm、50mm×100mm、75mm×75mm、75mm×100mm或100mm×100mm。在一个实例中，成像单元的视场大于或等于约15mm×15mm。在另一个实例中，成像单元的视场大于或等于约50mm×75mm。在另一个实例中，成像单元的视场大于或等于约75mm×100mm。成像模块可以包含具有大视场的固定相机，所述固定相机可以用单个图像从整个耗材板捕获数据。图9B示出了用于对整个示例耗材板成像的示例视场，并且图9C示出了从示例成像单元拍摄的示例图像。为了考虑机械公差和最小化球面像差，视场可以是100mm×75mm，这可以为耗材的十六个分区单元提供足够的成像余量。其它工程化努力可以包含最小化移动部件以获得更好的稳定性和重复性，以及优化成本。
成像单元可以包含透镜和传感器。对于100mm×75mm视场，许多透镜可能无法提供足以进行dPCR的图像质量和均匀性。透镜可以是远心透镜。使用远心透镜可以消除或减少视差误差。例如，零角度视场可以使图像失真最小化并提高均匀性，并且呈现出清晰的焦点过渡以允许分区查找。在传感器方面，为了在100mm×75mm视场内实现10μm/像素的分辨率，可以使用大于一英寸对角线并超过1亿像素的大面积互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。例如，Canon 120MP CMOS传感器可以是实现分辨率和检测限的可行选择。为了均匀激发，可以使用两种方法，从板的侧面倾斜照射，或通过远心透镜垂直落射照射。例如，可以通过高功率密度发光二极管(LED)提供倾斜照射。可以使用两种不同的LED激发策略：高亮度白光LED和特定颜色LED。为了支持五种最常见的PCR染料FAM、VIC、TAMRA、ROX和Cy5，可以使用激发和发射滤光器以及二向色镜(除非选择了倾斜照射结构)。图10示出了示例成像单元。成像单元可以包含高功率LED阵列、具有CMOS传感器的相机、一个或多个激发和发射滤光器或远心透镜。激发和发射滤光器可以安置在相机与远心透镜之间。远心透镜可以安置在相机与耗材板之间。为了证实光学模块满足目标规格，可以将各种浓度的染料(例如，150毫摩尔(nM)、100nM、50nM和0nM作为阴性对照)上样到板中。板可以是具有试验板(breadboard)的图像，并且可以基于ASTM E579标准(荧光检测限)计算信噪比。
图11A和11B示出了用于dPCR的集成系统的示例示意图。图11A示出了用于dPCR的集成系统的示例侧视图。集成系统可以包含用于PCR的热控制模块、用于试剂数字化的气动控制模块和用于整个板的四色扫描的光学模块。系统的组件可以垂直集成。可以由具有四个通道的光学引擎提供四色扫描，每个通道被配置成收集不同波长的光。仪器可以是模块化的(例如，所有单元可以在物理上彼此独立)，这允许在不影响其它子系统的情况下替换或更换单元。模块化设计可以减少仪器开发的时间和风险。图11B示出了整个板成像单元的实例。与具有扫描成像单元的类似仪器相比，使用具有长工作距离的成像单元可以消除扫描运动，并且可以减小系统的总宽度。
系统可以进一步包含机器人臂。机器人臂可以移动、改变或布置微流体装置的位置。可替代地或另外，机器人臂可以布置或移动系统的其它组件(例如，处理单元或检测单元)。检测单元可以包含相机(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)相机)和滤光器立方体。滤光器立方体可以改变或修改激发光的波长或相机检测到的光的波长。处理单元可以包括歧管(例如，气动歧管)或一个或多个泵。歧管可以处于直立位置，使得歧管不接触微流体装置。当对微流体装置进行上样或成像时，可以使用直立位置。歧管可以处于向下位置，使得歧管接触微流体装置。歧管可以用于将流体(例如，样品和试剂)上样到微流体装置中。歧管可以向微流体装置施加压力，以在使用期间将装置保持在位或防止翘曲、弯曲或其它应力。在一个实例中，歧管施加向下的压力并保持微流体装置抵靠热单元。
系统可以进一步包含一个或多个计算机处理器。一个或多个计算机处理器操作性地耦接到处理单元、保持器、热单元、检测单元、机器人臂或其任何组合。在一个实例中，一个或多个计算机处理器操作性地耦接到处理单元。一个或多个计算机处理器可以单独地或集体地被编程以引导处理单元分配核酸分子、扩增核酸分子、使核酸分子变性或其任何组合。一个或多个计算机处理器可以单独地或集体地被编程或以其它方式被配置成引导检测单元收集指示核酸分子的变性的信号。一个或多个计算机处理器可以单独地或集体地被编程或以其它方式被配置成产生核酸分子的变性曲线，使用变性曲线来鉴定或定量分析物或其任何组合。
一个或多个处理器可以被配置成实施一个或更多个软件程序。软件可以是基于网络的用户界面。基于网络的用户界面可以允许实现持续改进以及促进远程服务和支持。可以使用三个用户界面模块，即协议引擎、图像处理和数字熔融曲线分析。协议引擎可以提供前端过程(例如，dPCR)和后端过程(例如，dMCA)中的可变性。协议引擎可以允许用户改变试剂数字化协议(例如，压力和时间)、热循环协议(例如，循环数量、温度和时间)，要采集的图像数量、熔融过程协议(例如，温度开始和结束点、斜变速率和间隔)以及成像协议(例如，LED功率、滤光器组和曝光时间)。协议可以被编译并加载到仪器上，使得仪器独立于活动的和连接的外部计算机运行。对于图像处理，可以优化原始图像以进行分析和显示。用户可以能够使用各种工具，如图像堆叠(例如，多色叠加)、图像算术(例如，减法)、阵列鉴定分配和自动化阵列模板化。输出可以是可解释的.txt或.csv文件，其中具有每个分区的参数：索引、单位、行、列、总强度和质量控制(QC)标志。成像软件可以用于320,000个室(每个单元16个单元×20k个室)的自动化分割，裁剪出未使用的传感器区域，以及由视场中潜在的不均匀加热或照射引起的室与室信号变化的归一化。数字熔融曲线分析可以提供分区计数、泊松统计模型、稀释因子考虑、实时曲线、熔融曲线或熔融曲线的导数，以及以报告形式导出的实验注释。可以实现如分区审查(例如，原始图像的检查)和特征标记等的质量控制工具，使得用户可以手动排除已知的虚假特征(例如，由本地背景或报道分子通道强度的离群值识别)。机器学习算法t-SNE(例如，t-分布式随机邻域嵌入)可以用于聚类相似的熔融曲线。由于每个板可以提供超过300,000个熔融曲线，通过运行四个具有相同实验的板，可以向仪器提供超过一百万个训练数据集，以大幅提高调用准确性。另外，基于网络的应用程序可以允许数据分析和算法开发持续进行、连续审查，并且使用最新的特征和应用工具进行更新。
计算机系统
本公开提供了被编程为实施本公开的方法的计算机系统。图12示出了计算机系统1201，所述计算机系统被编程或以其它方式被配置成实施本文别处描述的用于分析和鉴定分析物的方法。计算机系统1201可以调节分析物(例如，核酸分子)的处理和分析的各种方面，例如，分配样品(例如，到室中)、扩增样品、使样品变性以及在变性期间检测信号。计算机系统1201可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统1201包含中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1205，所述中央处理单元可以是单核或多核处理器或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1201还包含存储器或存储器位置1210(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1215(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口1220(例如，网络适配器)以及外围装置1225，如高速缓存、其它存储器、数据存储设备和/或电子显示适配器。存储器1210、存储单元1215、接口1220和外围装置1225通过如母板等通信总线(实线)与CPU 1205通信。存储单元1215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1201可以借助于通信接口1220可操作地耦接到计算机网络(“网络”)1230。网络1230可以是英特网、互联网和/或外联网或与英特网通信的内联网和/或外联网。网络1230在一些情况下是电信网络和/或数据网络。网络1230可以包含一个或多个计算机服务器，所述一个或多个计算机服务器可以实现如云计算等分布式计算。在一些情况下，网络1230借助于计算机系统1201可以实施对等网络，所述对等网络可以实现将装置耦接到计算机系统1201以充当客户端或服务器。
CPU 1205可以执行一系列机器可读指令，所述一系列机器可读指令可以体现在程序或软件中。指令可以存储在如存储器1210等存储器位置中。指令可以涉及CPU 1205，所述指令可以随后编程或以其它方式配置CPU 1205以实施本公开的方法。由CPU 1205执行的操作的实例可以包含取得、解码、执行和回写。
CPU 1205可以是如集成电路等电路的一部分。系统1201的一个或多个其它组件可以包含在电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1215可以存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1215可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。计算机系统1201在一些情况下可以包含一个或多个另外的数据存储单元，所述一个或多个另外的数据存储单元位于计算机系统1201外部，如定位在通过内联网或因特网与计算机系统1201通信的远程服务器上。
计算机系统1201可以通过网络1230与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1201可以与用户的远程计算机系统(例如，手机、膝上型计算机、台式计算机或其它用户装置)通信。远程计算机系统的实例包含个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，
iPad、
Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，
iPhone、支持Android的装置、
)或个人数字助理。用户可以通过网络1230访问计算机系统1201。
可以通过存储在计算机系统1201的电子存储位置上(例如存储器1210或电子存储单元1215上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码实施如本文所描述的方法。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器1205执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1215中检索并且存储在存储器1210上以供由处理器1205随时访问。在一些情形下，可以排除电子存储单元1215，并且在存储器1210上存储机器可执行指令。
该代码可以被预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间被编译。可以用编程语言来提供代码，可以选择编程语言来使代码能够以预编译或即时编译的方式执行。
本文提供的如计算机系统1201等系统和方法的各方面可以体现在编程中。该技术的各个方面可以被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关联的数据的形式的“产品”或“制品”，该机器可执行代码和/或相关联的数据被承载在或体现在一种类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘等电子存储单元上。“存储”型介质可包含计算机的任何或所有有形存储器、处理器等，或其相关联的模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其它电信网络进行通信。例如，这种通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包含光波、电波和电磁波，诸如通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路在本地装置之间的物理接口上使用的光波、电波和电磁波。承载这种波的物理元件，例如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非限定为非临时性有形“存储”介质，否则例如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，例如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采取多种形式，包含但不限于有形存储介质，载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包含例如光盘或磁盘，诸如任何计算机等中任何存储设备，诸如可以用于实现在附图中示出的数据库等。易失性存储介质包含动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包含同轴电缆；铜线和光纤，包含计算机系统内包括总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号，或声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，常见形式的计算机可读介质包含：例如，软盘，可折叠磁盘，硬盘，磁带，任何其它磁介质，CD-ROM，DVD或DVD-ROM，任何其它光学介质，穿孔卡纸磁带，具有孔图案的任何其它物理存储介质，RAM，ROM，PROM和EPROM，FLASH-EPROM，任何其它存储芯片或盒式磁带，载波传输数据或指令，传输此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。多种这些形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以便执行。
计算机系统1201可以包含电子显示器1235或与其通信，所述电子显示器包括用户界面(UI)1240，用于提供例如系统操作参数、系统、子系统或各种单元(例如，检测单元、流动单元等)中的一个或多个的状态或分析参数和结果。UI的实例包含但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一个或多个算法来实施。算法可以在由中央处理单元1205执行时通过软件实施。算法可以例如处理变性信号以提供分析物(例如，核酸分子)的鉴定或定量。
实例
实例1：多重化测定
微流体阵列耗材和集成系统用于脊髓性肌萎缩症(SMA)新生儿筛查的概念验证多重化分析，将SMN1拷贝数量(例如，在90％以上的SMA病例中发现的基因)、SMN2拷贝数量(例如，在预后中具有重要意义的基因)和RPPH1(参考基因)集成到单个测定中。dMCA测定使用靶向SMN1、SMN2和RPPH2的三个扩增子，范围从50个至75个碱基对，并且由五个引物产生。由于SMN1与SMN2之间的高度同源序列，使用靶向Exon7中剪接位点的等位基因特异性引物来区分这两个基因。SMN1在核苷酸804处包含腺嘌呤，而SMN2在相同位置包含胸腺嘧啶。SMN1“A”等位基因特异性引物不从SMN2模板扩增PCR产物，并且反之亦然，SMN2“T”等位蛋白特异性引物也是如此。位于正向引物的5'端的另外的可变长度的尾部可以增加熔融温度分离，以进一步区分两个靶标。使用两个引物扩增高度保守的RPPH1基因，所述基因具有两个拷贝作为内部拷贝数量控制。设计通过犹他大学(University of Utah)开发的μMelt软件进行了验证，其中预测了三个不同的熔融峰值(71℃、76℃和81℃)。另外，还使用NCBI Primer-Blast和UCSC In-Silico PCR工具进行了引物特异性。
引物组包含EvaGreen双链DNA嵌入染料和来自Biotium公司(Biotium)的2xMasterMix。来自密理博西格玛公司(MilliporeSigma)的人基因组DNA(gDNA)是靶标。dMCA试剂混合物以每个分区约一个拷贝的最终gDNA浓度制备。在59℃与95℃之间进行热循环的40个循环后，以每秒0.2℃的斜变速率从59℃到95℃进行扩增子熔融。图13示出了在四种不同温度下采集的示例荧光图像，演示了三种扩增子从65℃至85℃的熔融。来自200个随机选择的分区的示例熔融曲线(荧光信号的导数)在图14中示出。示例熔融曲线示出了代表三个不同靶标SMN1 1401、SMN2 1402和RPPH1 1403的多个熔融温度。
实例2：大规模物种鉴定
使用单对保守引物的广泛PCR可以实现所关注的潜在序列变体的无偏扩增。将其与熔融曲线分析(MCA)相结合，可以基于扩增子序列的熔融曲线同时对其进行“指纹识别”。尽管源自十六个碱基长扩增子(16S)的熔融曲线比源自较短扩增子的熔融曲线具有更多的双相曲线轮廓，但窄熔融温度范围和有限的轮廓多样性可能会限制用于大规模物种水平鉴定。在MCA中，熔融温度和曲线形状是序列、GC含量百分比、长度、熔融结构域和序列互补性的函数。16S-23S rDNA之间的细菌内部转录间隔区(ITS)序列可以比其侧接基因在进化上受到更少的限制，并且能够增强物种水平的系统发育辨别。此外，其具有多个熔融结构域的独特基因组内序列异质性导致了复杂的熔融曲线形状，使其非常适合作为单个系统发育基因座来简化测定格式。使用89种不同的细菌物种的存档库来执行qPCR-HRM，证明了ITS扩增子与16S扩增子相比产生丰富的熔融曲线轮廓，具有多个峰和更宽的熔融温度范围，如图15A所示，用于增强物种鉴定。同一属的近成员可能难以通过其16S曲线区分，并且可能基于ITS曲线在视觉上不同，参见图15B和15C，其分别示出了芽孢杆菌物种和葡萄球菌物种的实例。ITS rDNA的初步序列分析表明靶标物种具有足够的辨别力，如图15D中的热图所示。相同的分析应用于16S，如图15E所示，可以实现显著更低的辨别力。还开发了用于熔融曲线数据的统计解释的方法(例如，朴素贝叶斯(nB)曲线分类算法)，并且可以使用留一法交叉验证来区分库中的89个细菌物种，达到95％以上的准确性。使用ITS区域的广泛PCR，然后进行熔融曲线分析，含有从斯坦福医院(Stanford Hospital)的患者获得的超过2,000个“分子指纹”的开发数据库可以用于衡量dMCA平台的性能。
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员将显而易见的是，这些实施例仅以实例的方式提供。本发明不旨在受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已参考前述说明书描述本发明，但本文实施例的描述和说明不打算以限制性意义进行。在不脱离本发明的情况下，所属领域的技术人员现在将意识到许多变型、变化和替代物。此外，应当理解，本发明的全部方面不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。因此，经考虑本发明应同样涵盖任何这类替代方案、修改、变型或等效物。所附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
Claims (39)
1.一种用于核酸鉴定的方法，所述方法包括：
(a)使用多个核酸分子在多个室中产生多个双链核酸分子，其中：(i)所述多个双链核酸分子的第一子集包括第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列；并且(ii)所述多个双链核酸分子的第二子集包括第二双链核酸分子，所述第二双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第二核酸分子相对应的第二序列并且不包括所述添加的序列；
(b)使所述多个双链核酸分子中的双链核酸分子变性；
(c)检测指示所述变性的信号以产生多个变性曲线，其中：
i.所述多个变性曲线中的第一变性曲线源自所述第一双链核酸分子的变性；
ii.所述多个变性曲线中的第二变性曲线源自所述第二双链核酸分子的变性；并且
iii.所述第一变性曲线和所述第二变性曲线不同；并且
(d)处理所述多个变性曲线以鉴定所述多个核酸分子中的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在(a)之前向所述多个室提供所述多个核酸分子和多个正向引物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个正向引物包括(i)第一正向引物，所述第一正向引物包括与所述第一核酸分子的至少一部分互补的第一区域和与所述第一核酸分子不互补且对应于所述添加的序列的第二区域，以及(ii)第二正向引物，所述第二正向引物与所述第二核酸分子的至少一部分互补。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多个正向引物不是通用引物。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其进一步包括在(a)之前使所述多个正向引物经历引物延伸反应以产生多个第一延伸产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括在(a)之前使所述多个第一延伸产物与多个反向引物接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个反向引物是通用引物。
8.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括在(a)之前使所述多个反向引物经历引物延伸反应以产生多个第二延伸产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个第二延伸产物是所述多个双链核酸分子。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括对所述多个室的至少一部分进行成像以检测所述信号。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括对所述多个室进行成像以检测所述信号。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述多个双链核酸分子经历受控加热以使所述双链核酸分子变性。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸分子包括嵌入染料，所述信号源自所述嵌入染料。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述双链核酸分子包括多个不同的嵌入染料，所述信号源自所述嵌入染料。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号是光信号。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个室中的室具有小于或等于约500皮升的体积。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述室的所述体积小于或等于约250皮升。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个室包括大于或等于约1,000个室。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述多个室包括大于或等于约10,000个室。
20.一种用于核酸鉴定的系统，所述系统包括：
检测单元，所述检测单元被配置成收集和处理用于鉴定核酸分子的信号；以及
操作性地耦接到所述检测单元的一个或多个处理器，其中所述一个或多个处理器被单独地或集体地编程或以其它方式被配置成：
(i)使用多个核酸分子在多个室中产生多个双链核酸分子，其中：(i)所述多个双链核酸分子的第一子集包括第一双链核酸分子，所述第一双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第一核酸分子相对应的第一序列和添加的序列；并且(ii)所述多个双链核酸分子的第二子集包括第二双链核酸分子，所述第二双链核酸分子包括与所述多个核酸分子中的第二核酸分子相对应的第二序列并且不包括所述添加的序列；
(ii)使所述多个双链核酸分子中的双链核酸分子变性；
(iii)检测指示所述变性的信号以产生多个变性曲线，其中：
(A)所述多个变性曲线中的第一变性曲线源自所述第一双链核酸分子的变性；
(B)所述多个变性曲线中的第二变性曲线源自所述第二双链核酸分子的变性；并且
(C)所述第一变性曲线和所述第二变性曲线不同；并且
(iv)处理所述多个变性曲线以鉴定所述多个核酸分子中的核酸分子。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述多个室中的室具有小于或等于约500皮升的体积。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述室的所述体积小于或等于约250皮升。
23.根据权利要求20所述的系统，其中所述多个室包括大于或等于约1,000个室。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述多个室包括大于或等于约10,000个室。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述检测单元被配置成对所述多个室的至少一部分进行成像。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述检测单元被配置成对所述多个室进行成像。
27.根据权利要求25所述的系统，其中所述检测单元包括具有大于或等于约15毫米(mm)×约15mm的视场的相机。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述视场大于或等于约50mm×约75mm。
29.根据权利要求20所述的系统，其中所述检测单元包括相机，所述相机包括互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。
30.根据权利要求29所述的系统，其中所述检测单元进一步包括安置在所述相机与所述多个室之间的远心透镜。
31.根据权利要求20所述的系统，其中所述检测单元包括被配置成收集光信号的光学单元。
32.根据权利要求31所述的系统，其中所述光学单元包括大于或等于四个通道，每个通道被配置成收集不同波长的光。
33.根据权利要求20所述的系统，其中所述系统被配置成收纳包括多个室阵列的基材，并且其中所述多个室阵列中的室阵列包括所述多个室。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述基材包括至少四个室阵列。
35.根据权利要求33所述的系统，其中所述室阵列与另一个室阵列流体隔离。
36.根据权利要求33所述的系统，其中所述系统被配置成收纳板，并且其中所述板被配置成保持包括所述基材的多个基材。
37.根据权利要求20所述的系统，其进一步包括操作性地耦接到所述一个或多个处理器的热单元，其中所述热单元被配置成控制所述多个室的温度。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述一个或多个处理器引导所述热单元使所述多个室经历受控加热以使所述双链核酸分子变性。
39.根据权利要求37所述的系统，其中所述热单元包括热电温度控制单元。
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