CN115232707A - 用于核酸定量的微流体虹吸阵列 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本公开内容提供了用于扩增和定量核酸的方法。用于扩增和定量核酸的方法包括将包含核酸分子的样品分离到多个微室中、对所述多个微室执行聚合酶链反应、以及分析所述聚合酶链反应的结果。在一些方面，本公开内容提供了与本文方法一致的装置。

Description

用于核酸定量的微流体虹吸阵列

本申请是申请日为2017年04月04日、申请号为201780034680.0、发明名称为“用于核酸定量的微流体虹吸阵列”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2017年04月04日、申请号为PCT/US2017/025873)的分案申请。

交叉引用

本申请要求于2016年4月4日提交的美国临时专利申请序列号62/317,993和于2016年11月29日提交的美国专利申请序列号15/363,896的权益，这些申请中各自通过引用整体并入本文。

政府利益声明

本发明在国立卫生研究院授予的小企业创新研究资助号1R43OD023028-01下由政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定权利。

发明背景

微流体装置是含有小规模处理流体的结构的装置。通常，微流体装置以亚毫米级操作并处理微升、纳升或更少量的流体。在微流体装置中，主要的污染机制是微结构内残存的空气或气泡。当使用热塑性材料来产生微流体结构时，这可能特别成问题，因为热塑性塑料的透气性非常低。

为了避免残存空气的污染，先前的微流体结构使用具有热塑性材料的简单直通道或分支通道设计，或者使用高透气性材料如弹性体来制造装置。然而，简单的设计限制了微流体装置可能的功能，并且特别是在规模上，弹性体材料的制造困难且昂贵。

微流体结构的一个应用是数字聚合酶链反应(dPCR)。dPCR将核酸样品稀释为提供许多分区阵列的微流体结构的每个分区中的一个或更少核酸模板，并在整个阵列上执行PCR反应。通过计数模板被成功PCR扩增的分区并将泊松统计应用于结果来定量靶核酸。与流行的通过将未知样品的PCR扩增速率与一组已知qPCR标准物的速率进行比较来定量模板的定量实时PCR(qPCR)不同，dPCR已被证明具有更高的灵敏度、更高的精确度和更好的再现性。

对于基因组研究人员和临床医生而言，dPCR在稀有突变检测、拷贝数变体定量和下一代测序文库定量中特别有用。在无细胞DNA液体活检和病毒载量定量临床环境中的潜在用途进一步增加了dPCR技术的价值。现有的dPCR解决方案已经使用了弹性体阀阵列、硅通孔方法和在液滴油中的微流体包封。尽管可用的dPCR平台数目越来越多，但与依赖于计数PCR扩增循环数的旧qPCR技术相比，dPCR一直处于劣势。通量、易用性、表现和成本的组合是dPCR在市场上获得采用的主要障碍。

发明内容

本文提供了可用于扩增和定量核酸的方法和装置。本公开内容提供了可通过使用dPCR实现样品制备、样品扩增和样品分析的方法、系统和装置。与其他系统和方法相比，这可使核酸能够以降低的成本和复杂性被扩增和定量。

在一个方面，本公开内容提供了微流体装置，包含：至少一个微通道，其包含至少一个入口和至少一个出口；多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通；以及邻近所述微流体装置的表面安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜覆盖所述多个微室，其中所述热塑性薄膜在跨越所述热塑性薄膜施加的压差下至少部分透气。

在一些实施方案中，所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。在一些实施方案中，所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有约10微米(μm)至约20μ的深度。

在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有小于约25μm的深度。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。在一些实施方案中，多个微室包括约1,000至约20,000个微室。在一些实施方案中，所述多个微室为圆柱形形状。在一些实施方案中，所述多个微室的半球形形状。

在一些实施方案中，所述微流体装置通过注塑形成。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜通过注塑形成。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜通过热粘合施加于所述微流体装置。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

在一些实施方案中，跨越所述热塑性薄膜施加的所述压差为约8磅/平方英寸(psi)至约16psi。在一些实施方案中，气动泵与所述至少一个入口或所述至少一个出口流体连通。在一些实施方案中，所述微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。

在一个方面，本公开内容提供了用于形成微流体装置的方法，包括：注塑热塑性塑料以产生微流体结构，所述微流体结构包含至少一个微通道、多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通；形成与所述至少一个微通道流体连通的至少一个入口和至少一个出口；以及施加热塑性薄膜以覆盖所述多个微室，其中所述热塑性薄膜在跨越所述热塑性薄膜施加的压差下至少部分透气。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜通过注塑形成。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜通过热粘合施加于所述微流体结构。在一些实施方案中，所述至少一个入口和至少一个出口通过机械钻孔形成。

在一些实施方案中，所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。在一些实施方案中，所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有约10μm至约20μm的深度。在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有小于约25μm的深度。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

在一些实施方案中，所述多个微室为圆柱形形状。在一些实施方案中，所述多个微室为半球形形状。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。在一些实施方案中，跨越所述热塑性薄膜施加的所述压差为约8psi至约16psi。

在一些实施方案中，所述微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。在一些实施方案中，所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。

在一个方面，本公开内容提供了用于使用微流体装置的方法，包括：(a)提供包含至少一个微通道的所述微流体装置，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通的多个微室，以及邻近所述微流体装置的表面安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜覆盖所述多个微室；(b)在第一压差下将试剂从所述至少一个入口或所述至少一个出口引导至所述至少一个微通道；(c)在所述至少一个微通道与所述多个微室之间的第二压差下将所述试剂引导至所述多个微室中，其中在将所述试剂引导至所述多个微室中后，使所述多个微室中的气体流过覆盖所述多个微室的所述热塑性薄膜；以及(d)在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间的第三压差下将流体引导至所述至少一个微通道中，而不将所述流体引入所述多个微室中。

在一些实施方案中，使用单个集成机器执行(a)-(d)。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

在一些实施方案中，所述第二压差大于所述第一压差。在一些实施方案中，所述第三压差小于所述第二压差。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述多个微室中的每一个提供包含核酸分子的聚合酶链反应(PCR)试剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过使所述多个微室进行热循环来执行PCR。在一些实施方案中，所述方法进一步包括获取所述多个微室的图像。在一些实施方案中，所述方法进一步包括计数其中所述PCR成功扩增所述核酸分子的所述多个微室的数目。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将泊松统计应用于其中所述PCR成功扩增所述PCR试剂的所述多个微室的所述数目，以定量所述PCR试剂内的核酸。

在一些实施方案中，所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。在一些实施方案中，所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

在一些实施方案中，所述第三压差为约1psi至约4psi。在一些实施方案中，所述第二压差为约8psi至约16psi。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

在一些实施方案中，所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。在一些实施方案中，所述多个微室为圆柱形形状。在一些实施方案中，所述多个微室为半球形形状。在一些实施方案中，所述微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。

在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有约10μm至约20μm的深度。在一些实施方案中，所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。在一些实施方案中，所述多个微室具有小于约25μm的深度。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

在一些实施方案中，所述流体为空气、氮气、二氧化碳、惰性气体或其任意组合。

在一个方面，本公开内容提供了用于使用微流体装置的系统，包含：传送台，其被配置用于保持至少一个微流体装置，所述微流体装置包含(i)至少一个微通道，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，(ii)通过多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通的多个微室，和(ii)覆盖所述多个微室的热塑性薄膜；气动模块，其与所述至少一个微流体装置流体连通，其中所述气动模块被配置用于将试剂装载到所述微流体装置中以分区到所述多个微室中；热模块，其与所述多个微室热连通，其中所述热模块被配置用于控制所述多个微室的温度并使所述多个微室进行热循环；光学模块，其被配置用于对所述微流体装置的所述多个微室进行成像；以及一个或多个计算机处理器，其耦合至所述传送台、所述气动模块、所述热模块和所述光学模块，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地编程以(i)引导所述气动模块将所述试剂装载到所述微流体装置中以分区到所述多个微室中，(ii)引导所述热模块使所述多个微室进行热循环，和(iii)引导所述光学模块对所述多个微室进行成像。

在一些实施方案中，所述至少一个微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

在一些实施方案中，所述气动模块进一步被配置用于施加第一压差以将所述试剂装载到所述至少一个微通道中。在一些实施方案中，所述气动模块进一步被配置用于在所述至少一个微通道与所述多个微室之间施加第二压差，以将所述试剂分区到所述多个微室中。在一些实施方案中，所述气动模块进一步被配置用于在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间施加第三压差，以使流体流入所述至少一个微通道。在一些实施方案中，所述第二压差为约8psi至约16psi。在一些实施方案中，所述第三压差为约1psi至约4psi。

在一些实施方案中，所述光学模块被配置用于对至少两个不同波长范围进行成像。在一些实施方案中，使用所述至少两个不同波长范围中的第一个来验证所述试剂分区。在一些实施方案中，使用所述至少两个不同波长范围中的第二个来检测所述多个微室内的反应。

在一个方面，本公开内容提供了用于使用微流体装置的方法，包括：提供包含微通道的所述微流体装置，其中所述微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与所述微通道连接的多个微室，以及邻近所述微流体装置安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜封盖所述微通道、所述多个微室和所述多个虹吸孔；通过以第一压力将试剂施加至所述至少一个入口，用所述试剂填充所述微流体装置的所述多个微室；在至少一个入口处或在至少一个出口处以第二压力(例如，8psi至16psi)施加高压气体以推动所述多个微室、所述多个虹吸孔和所述微通道内的气体，其中所述第二压力大于所述第一压力；以及在所述至少一个入口处以第三压力(例如，1psi至4psi)施加低压气体(例如，压力低于高压气体)以将所述低压气体引入所述微通道而不将所述低压气体引入所述多个微室中，其中所述第三压力小于所述第二压力。

在一些实施方案中，使用单个集成机器执行方法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述多个微室中的每一个提供包含核酸分子的PCR试剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过使所述多个微室进行热循环来执行PCR。在一些实施方案中，所述方法进一步包括获取所述多个微室的图像。在一些实施方案中，所述方法进一步包括计数其中所述PCR成功扩增所述核酸分子的所述多个微室的数目。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将泊松统计应用于其中所述PCR成功扩增所述PCR试剂的所述多个微室的所述数目，以定量所述PCR试剂内的核酸。

在一些实施方案中，所述微通道包含经由交叉通道连接的多个子通道，并且其中所述多个微室与所述多个子通道连接。在一些实施方案中，所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

在一些实施方案中，所述第三压力在约1psi至4psi之间。在一些实施方案中，所述第二压力在约8psi至16psi之间。在一些实施方案中，所述高压气体包括空气、氮气、二氧化碳、惰性气体或其任意组合。在一些实施方案中，所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。在一些实施方案中，气动泵与所述至少一个入口或所述至少一个出口流体连通。

在一些实施方案中，所述多个微室包括1,000至20,000个微室。

在一些实施方案中，所述多个微室为圆柱形形状。在一些实施方案中，所述微流体装置通过注塑形成。

在一些实施方案中，所述热塑性薄膜通过注塑形成。

通过仅示出并描述了本公开内容的说明性实施方案的以下具体实施方式，本公开内容的其他方面和优点将会对本领域技术人员而言变得显而易见。应当理解，本公开内容能够具有其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上将会被视为是说明性而非限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地表明每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(在本文中也称为“图”)，将会获得对本发明特征和优点的更好理解，在这些附图中：

图1A和图1B图示了微流体结构的实例；图1A从俯视图示出了该结构，而图1B图示了该结构的横截面；

图2A和图2B示意性地图示了微流体装置内的微室、虹吸孔和微通道的示例性布置；图2A示出了其中使用平行的子通道和一个或多个交叉通道来形成微室网格的实施方案；图2B示出了其中蛇形图案的单个微通道形成六边形微室网格的实施方案；

图3A-图3D示出了使用示例性微流体装置的方法；图3A示出了在低压下施加试剂的步骤；图3B示出了在微流体装置上施加压差以促使分区和除气的步骤；图3C示出了在低压下施加流体以清除微通道的步骤；图3D示出了该方法完成后系统的状态；

图4示意性地图示了微流体装置的制造方法；

图5示意性地图示了与微流体装置一起采用的示例性数字PCR过程；

图6示意性地图示了用于在单个机器中执行核酸扩增和定量方法的机器；

图7示意性地图示了被编程或以其他方式配置用于实现本文提供的方法的示例性计算机控制系统；

图8A和图8B示出了微流体装置和样品分区；图8A示出了通过微模塑热塑性塑料而形成的微流体装置；图8B示出了样品分区过程的荧光图像；

图9示出了用于处理核酸样品的示例性系统；

图10A-图10D示出了平均含有约一个核酸模板拷贝的分区和含有零核酸模板拷贝的分区(无模板对照或NTC)的核酸扩增的双色(一种颜色代表样品信号，而另一种颜色代表标准化信号)荧光检测；图10A示出了扩增后每个分区零个拷贝(NTC)；图10B示出了每个分区含有约一个拷贝的分区的核酸扩增；图10C示出了两种荧光颜色的NTC荧光强度图；以及图10D示出了扩增样品的两种荧光颜色的荧光强度图。

具体实施方式

尽管本文中已经示出并描述了本发明的多个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以实例的方式提供。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

如本文所用的，术语“扩增(amplification)”和“扩增(amplify)”可互换使用，并且通常指生成核酸的一个或多个拷贝或“扩增产物”。例如，这样的扩增可使用聚合酶链反应(PCR)或等温扩增。

如本文所用的，术语“核酸”通常指任何长度的核苷酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、500或1000个核苷酸)的聚合形式，该核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。核酸可包含选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚基。核苷酸可包括A、C、G、T或U，或其变体。核苷酸可包括可掺入生长的核酸链中的任何亚基。这样的亚基可以是A、C、G、T或U，或者对一个或多个互补A、C、G、T或U具有特异性的任何其他亚基，或者与嘌呤(即A或G，或其变体)或嘧啶(即C、T、或U，或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，核酸可以是单链或双链的，在一些情况下，核酸分子是环状的。核酸的非限制性实例包括DNA和RNA。核酸可包括基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析界定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。

如本文所用的，术语“聚合酶链反应试剂”或“PCR试剂”可互换使用，并且通常是指包含完成核酸扩增反应(例如，DNA扩增)所必需的试剂的组合物，这样的试剂的非限制性实例包括对靶核酸具有特异性的引物组或引发位点(例如，切口)、聚合酶、合适的缓冲剂、辅因子(例如，二价和一价阳离子)、dNTP和其他酶。PCR试剂还可包括探针、指示物以及包含探针和指示物的分子。

如本文所用的，术语“探针”通常是指包含可检测部分的分子，该分子的存在与否可用于检测扩增产物是否存在。可检测部分的非限制性实例可包括放射性标记、稳定同位素标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。

如本文所用的，术语“延伸”通常是指以模板引导的方式将核苷酸掺入核酸。可经由酶帮助进行延伸。例如，可经由聚合酶帮助进行延伸。可发生延伸的条件包括“延伸温度”和“延伸持续时间”，前者通常是指实现延伸的温度，而后者通常是指为发生延伸分配的时间量。

如本文所用的，术语“指示物分子”通常是指包含可检测部分的分子，该分子的存在与否可用于指示样品分区。可检测部分的非限制性实例可包括放射性标记、稳定同位素标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。

如本文所用的，术语“样品”通常是指含有或疑似含有核酸分子的任何样品。例如，样品可以是含有一种或多种核酸分子的生物样品。该生物样品可从血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液中获得(例如，提取或分离)，或者包含上述列举项。生物样品可以是液体或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些实例中，从无细胞体液如全血获得样品。在这样的情况下，样品可包含无细胞DNA和/或无细胞RNA。在一些实例中，样品可包含循环肿瘤细胞。在一些实例中，样品为环境样品(例如，土壤、废物、环境空气等)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)和食物样品(例如，乳制品、蔬菜产品和肉制品)。

如本文所用的，术语“流体”通常是指液体或气体。流体不能维持确定的形状，并且在可观察的时间框架期间将会流动以填充其置于其中的容器。因此，流体可具有允许流动的任何合适的粘度。如果存在两种或更多种流体，本领域普通技术人员可从基本上任何流体(液体、气体等)中独立地选择每种流体。

如本文所用的，术语“分区”通常指划分或分配成部分或份额。例如，经分区的样品是与其他样品分离的样品。使样品能够进行分区的结构的实例包括孔和微室。

如本文所用的，术语“微流体”通常是指包含至少一个微通道、多个虹吸孔和微室阵列的芯片、区域、装置、物品或系统。微通道可具有小于或等于约10毫米(mm)、小于或等于约5mm、小于或等于约4mm、小于或等于约3mm、小于或等于约2mm、小于或等于约1.5mm、小于或等于约1mm、小于或等于约750微米(μm)、小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm或更小的横截面尺寸。

如本文所用的，术语“深度”通常使指从微通道、虹吸孔或微室的底部至封盖微通道、多个虹吸孔和微室阵列的薄膜所测量的距离。

如本文所用的，术语“横断面”或“横截面”可互换使用，并且通常是指基本上垂直于特征的较长尺寸的微通道或虹吸孔的尺寸或区域。

本公开内容描述了微流体装置，其由热塑性塑料形成，并且并入薄膜以允许加压除气同时在释放压力时充当气体屏障。使用热塑性塑料来形成微流体结构可允许使用廉价且高度可扩展的注塑过程，同时薄膜可提供经由加压来除气的能力，避免可能存在于不包含此类薄膜的一些微流体结构中的污染问题。

该结构的一种用途是微流体设计，该微流体设计并入由热塑性塑料形成的通过微通道连接的闭端微室阵列。该设计可用于dPCR应用，以将试剂分区到微室阵列中，从而用于在dPCR中定量核酸。用于分析核酸样品的微流体装置

在一个方面，本公开内容提供了用于分析核酸样品微流体装置。该装置可包含与入口和出口连接的微通道。微流体装置还可包含多个微室和多个虹吸孔。多个微室可通过多个虹吸孔与微通道连接。微流体装置可包含热塑性薄膜，该热塑性薄膜封盖并密封(例如，气密密封)微通道、微室和虹吸孔。当跨越热塑性薄膜施加压差时，热塑性薄膜可以至少部分透气。

图1A和图1B示出了根据本公开内容某些实施方案的微流体结构的实例。图1A从顶视图示出了示例性微流体装置。该微流体装置包含具有入口120和出口130的微通道110。微通道与多个虹吸孔101B-109B连接。多个虹吸孔将微通道与多个微室101A-109A连接。图1B示出了沿着标示为A-A'的虚线的单个微室的横截面图。单个微室101A通过虹吸孔101B与微通道110连接。微流体装置主体140可由刚性塑料材料形成。微流体装置的微结构可被薄膜150封盖并密封。当跨越膜施加较小压差时，薄膜可以是不透气的，而当跨越膜施加较大压差时，薄膜可以是透气的。这可允许在向微流体装置的内部结构施加压力时通过薄膜来除气。在替代实施方案中，在向微流体装置外部施加真空时，可发生除气。

可通过升高的压力诱导薄膜的透气性。在一些实施方案中，压力诱导的透气性薄膜可覆盖微室和微通道的阵列，并且虹吸孔可被非透气性薄膜覆盖。在一些实施方案中，压力诱导的透气性薄膜可覆盖微室和虹吸孔的阵列，并且微通道可被非透气性薄膜覆盖。备选地，压力诱导的透气性薄膜可覆盖微室、虹吸孔和微通道的阵列。在一些实施方案中，薄膜的厚度为小于或等于约500微米(μm)小于或等于约250μm、小于或等于约200μm、小于或等于约150μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约25μm或更小。在一些实施方案中，薄膜的厚度可为约0.1μm至约200μm或约0.5μm至约150μm。在一些实例中，薄膜的厚度可为约50μm至约200μm。在一些实例中，薄膜的厚度可为约100μm至约200μm。在一些实例中，薄膜的厚度为约100μm至约150μm。在一个实例中，薄膜的厚度为约100μm。薄膜的厚度可通过薄膜的可制造性、薄膜的透气性、每个待除气分区的体积、可用的压力和/或完成虹吸过程所需的时间来选择。

在一些实施方案中，微流体装置可包含单个微室阵列。在一些实施方案中，微流体装置可包含多个微室阵列，每个微室阵列与其他微室阵列分离。微室阵列可成排、以网格配置、以交替图案或以任何其他配置布置。在一些实施方案中，微流体装置可具有至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个或更多个微室阵列。在一些实施方案中，微室阵列是相同的。在一些实施方案中，微流体装置可包含多个不同的微室阵列。微室阵列可全部具有相同的外部尺寸(即，包含微室阵列所有特征的微室阵列的长度和宽度)，或者微室阵列可具有不同的外部尺寸。

在一些实施方案中，微室阵列可具有至多约100mm、约75mm、约50mm、约40mm、约30mm、约20mm、约10mm、约8mm、约6mm、约4mm、约2mm、约1mm或更小的宽度。微室阵列可具有至多约50mm、约40mm、约30mm、约20mm、约10mm、约8mm、约6mm、约4mm、约2mm、1mm或更小的长度。宽度可为约1mm至100mm或10mm至50mm。长度可为约1mm至50mm或5mm至20mm。

在一些实例中，微室阵列可具有约100mm的宽度和约40mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约80mm的宽度和约30mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约60mm的宽度和约25mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约40mm的宽度和约15mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约30mm的宽度和约10mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约20mm的宽度和约8mm的长度。在一些实例中，微室阵列可具有约10mm的宽度和约4mm的长度。外部尺寸可通过所需微室的总数目、每个微室的尺寸以及用于可制造性的每个微室之间的最小距离来确定。

在一些实施方案中，微通道基本上平行于微流体装置的较长尺寸。在一些实施方案中，微通道可基本上垂直于微流体装置的较长尺寸。在一些实施方案中，微通道既不基本上平行也不基本上垂直于微流体装置的较长尺寸。微通道与微流体装置的较长尺寸之间的角度可为至少约5°、至少约10°、至少约15°、至少约20°、至少约30°、至少约40°、至少约50°、至少约60°、至少约70°、至少约90°、至少约100°、至少约110°、至少约120°、至少约130°、至少约140°、至少约150°、至少约160°或至少约170°。在一些实施方案中，微通道可为单个长通道。在一些实施方案中，微通道可具有弯曲、曲线或角度。微通道可具有小于或等于100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm、小于或等于约2mm或更小的较长尺寸。微通道的长度可被微流体装置的外部长度或宽度限制。微通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的深度。微通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的横截面尺寸(例如，宽度)。

在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，微通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约10μm深。微通道的横截面形状可为任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。微通道的横截面积可以是沿微通道的长度恒定的。备选地或附加地，微通道的横截面积可沿微通道的长度变化。微通道的横截面积可在约50％至150％之间、约60％至125％之间、约70％至120％之间、约80％至115％之间、约90％至110％之间、约95％至100％之间或约98％至102％之间变化。微通道的横截面积可小于或等于约10,000平方微米(μm²)、小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。

在一些实施方案中，微通道可具有单个入口和单个出口。备选地，微通道可具有多个入口、多个出口、或者多个入口和多个出口。入口和出口可具有相同的直径，或者它们可具有不同的直径。入口和出口可具有小于或等于约2.5毫米(mm)、小于或等于约2mm、小于或等于约1.5mm、小于或等于约1mm、小于约0.5mm或更小的直径。

在一些实施方案中，微室阵列可具有至少约1,000个微室、至少约5,000个微室、至少约10,000个微室、至少约20,000个微室、至少约30,000个微室、至少约40,000个微室、至少约50,000个微室、至少约100,000个微室或更多。在一些实例中，微流体装置可具有约10,000至约30,000个微室。在一些实例中，微流体装置可具有约15,000至约25,000个微室。微室可为圆柱形形状、半球形状形、或者圆柱形和半球形状形的组合。微室可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的直径。微室的深度可为小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小。在一些实例中，微室可具有约30μm的直径和约100μm的深度。在一些实例中，微室可具有约35μm的直径和约80μm的深度。在一些实例中，微室可具有约40μm的直径和约70μm的深度。在一些实例中，微室可具有约50μm的直径和约60μm的深度。在一些实例中，微室可具有约60μm的直径和约40μm的深度。在一些实例中，微室可具有约80μm的直径和约35μm的深度。在一些实例中，微室可具有约100μm的直径和约30μm的深度。在一些实施方案中，微室和微通道具有相同的深度。在备选的实施方案中，微室和微通道具有不同的深度。

在一些实施方案中，虹吸孔的长度恒定。在一些实施方案中，虹吸孔的长度有所变化。虹吸孔可具有小于或等于约150μm、小于或等于约100μm、小于或等于约50μm、小于或等于约25μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小的较长尺寸。在一些实施方案中，虹吸孔的深度可为小于或等于约50μm、小于或等于约25μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小。虹吸孔可具有小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm、小于或等于约5μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约40μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约30μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约20μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约10μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约50μm宽×约5μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约40μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约30μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约20μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约10μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约5μm宽×约50μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约30μm宽×约30μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约10μm宽×约10μm深。在一些实例中，虹吸孔的横截面尺寸可为约5μm宽×约5μm深。虹吸孔的横截面形状可为任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施方案中，虹吸孔的横截面积可以是沿虹吸孔的长度恒定的。备选地或附加地，虹吸孔的横截面积可沿虹吸孔的长度变化。虹吸孔在与微通道连接处的横截面积可大于虹吸孔在与微室连接处的横截面积。备选地，虹吸孔在与微室连接处的横截面积可大于虹吸孔在与微通道连接处的横截面积。虹吸孔的横截面积可在约50％至150％之间、约60％至125％之间、约70％至120％之间、约80％至115％之间、约90％至110％之间、约95％至100％之间、或约98％至102％之间变化。虹吸孔的横截面积可为小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约250μm²、小于或等于约100μm²、小于或等于约75μm²、小于或等于约50μm²、小于或等于约25μm²或更小。虹吸孔在与微通道连接处的横截面积可小于或等于微通道的横截面积。虹吸孔在与微通道连接处的横截面积可以小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约10％、小于或等于约5％、小于或等于约1％、或者小于或等于约0.5％的微通道横截面积。

在一些实施方案中，虹吸孔基本上垂直于微通道。在一些实施方案中，虹吸孔不基本上垂直于微通道。在一些实施方案中，虹吸孔与微通道之间的角度可为至少约5°、至少约10°、至少约15°、至少约20°、至少约30°、至少约40°、至少约50°、至少约60°、至少约70°、至少约90°、至少约100°、至少约110°、至少约120°、至少约130°、至少约140°、至少约150°、至少约160°或至少约170°。

微室可以以各种图案布置。图2A和图2B图示了微室、虹吸孔和微通道布置的示例性图案。在一些实施方案中，采用多个微通道，而在一些实施方案中，可使用单个微通道。在一些实施方案中，微通道可包含一组子通道。该组子通道可通过一个或多个交叉通道连接。在这些实施方案中的一些实施方案中，子通道基本上彼此平行，使得微室阵列形成微室网格。图2A图示了其中使用平行子通道230和一个或多个交叉通道220形成微室网格的实施方案。

在一些实施方案中，构建微室以便形成微室六边形网格，其中弯曲或成角度的子通道连接微室。微室的六边形网格还可通过单个微通道形成并连接，如通过在微流体装置上形成蛇形图案240的微通道连接。图2B示出了其中处于蛇形图案的单个微通道形成微室的六边形网格的实施方案。

在一些实施方案中，子通道的长度恒定。在一些实施方案中，子通道的长度可有所变化。子通道可具有小于或等于100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm、小于或等于约2mm或更小的较长尺寸。子通道的长度可受到微流体装置的外部长度或宽度的限制。在一些实施方案中，子通道可与微通道具有相同的横截面尺寸。在一些实施方案中，子通道可与微通道具有不同的横截面尺寸。在一些实施方案中，子通道可与微通道具有相同的深度和不同的横截面尺寸。在一些实施方案中，子通道可与微通道具有相同的横截面尺寸和不同的深度。例如，子通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的深度。子通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，子通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约10μm深。子通道的横截面形状可为任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施方案中，子通道的横截面形状与微通道的横截面形状不同。在一些实施方案中，子通道的横截面形状与微通道的横截面形状相同。子通道的横截面积可以是沿子通道的长度恒定的。备选地或附加地，子通道的横截面积可沿微通道的长度变化。子通道的横截面积可在约50％至150％之间、约60％至125％之间、约70％至120％之间、约80％至115％之间、约90％至110％之间、约95％至100％之间、或约98％至102％之间变化。子通道的横截面积可小于或等于约10,000μm²、小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。在一些实施方案中，子通道的横截面积与微通道的横截面积相同。在一些实施方案中，子通道的横截面积可小于或等于微通道的横截面积。子通道的横截面积可为微通道横截面积的小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约20％或更小。

在一些实施方案中，交叉通道的长度恒定。在一些实施方案中，交叉通道的长度可有所变化。交叉通道可具有小于或等于约100mm、小于或等于约75mm、小于或等于约50mm、小于或等于约40mm、小于或等于约30mm、小于或等于约20mm、小于或等于约10mm、小于或等于约8mm、小于或等于约6mm、小于或等于约4mm、小于或等于约2mm或更小的较长尺寸。交叉通道的长度可受到微流体装置的外部长度或宽度的限制。在一些实施方案中，交叉通道可与微通道具有相同的横截面尺寸。在一些实施方案中，交叉通道可与微通道具有不同的横截面尺寸。在一些实施方案中，交叉通道可与微通道具有相同的深度和不同的横截面尺寸。在一些实施方案中，交叉通道可与微通道具有相同的横截面尺寸和不同的深度。例如，交叉通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约80μm、小于或等于约60μm、小于或等于约30μm、小于或等于约15μm或更小的深度。交叉通道可具有小于或等于约500μm、小于或等于约250μm、小于或等于约100μm、小于或等于约75μm、小于或等于约50μm、小于或等于约40μm、小于或等于约30μm、小于或等于约20μm、小于或等于约10μm或更小的横截面宽度。

在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约80μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约60μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约40μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约20μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约100μm宽×约10μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约100μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约80μm宽×约80μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约60μm宽×约60μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约40μm宽×约40μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约20μm宽×约20μm深。在一些实例中，交叉通道的横截面尺寸可为约10μm宽×约10μm深。

交叉通道的横截面形状可为任何合适的横截面形状，包括但不限于圆形、椭圆形、三角形、正方形或矩形。在一些实施方案中，交叉通道的横截面形状与微通道的横截面形状不同。在一些实施方案中，交叉通道的横截面形状与微通道的横截面形状相同。交叉通道的横截面积可以是沿交叉通道的长度恒定的。备选地或附加地，交叉通道的横截面积可沿微通道的长度变化。交叉通道的横截面积可在约50％至150％之间、约60％至125％之间、约70％至120％之间、约80％至115％之间、约90％至110％之间、约95％至100％之间、或约98％至102％之间变化。交叉通道的横截面积可为小于或等于约10,000μm²、小于或等于约7,500μm²、小于或等于约5,000μm²、小于或等于约2,500μm²、小于或等于约1,000μm²、小于或等于约750μm²、小于或等于约500μm²、小于或等于约400μm²、小于或等于约300μm²、小于或等于约200μm²、小于或等于约100μm²或更小。在一些实施方案中，交叉通道的横截面积与微通道的横截面积相同。在一些实施方案中，交叉通道的横截面积小于微通道的横截面积。交叉通道的横截面积可为微通道横截面积的小于或等于约98％、小于或等于约95％、小于或等于约90％、小于或等于约85％、小于或等于约80％、小于或等于约75％、小于或等于约70％、小于或等于约60％、小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约20％或更小。

用于制造微流体装置的方法

在一个方面，本公开内容提供了用于制造微流体装置的方法。该方法可包括注塑热塑性塑料以产生微流体结构。微流体结构可包含微通道、多个微室和多个虹吸孔。多个微室可通过多个虹吸孔与微通道连接。微通道可包含入口和出口。可施加热塑性薄膜以封盖微流体结构。当跨越热塑性薄膜施加压差时，热塑性薄膜可至少部分透气。

在一些实施方案中，热塑性薄膜通过注塑形成。热塑性薄膜可通过热粘合施加于微流体结构。备选地或附加地，可通过化学键合来施加薄膜。在一些实施方案中，形成热塑性薄膜作为注塑过程的一部分，并在注塑过程中形成以形成微流体装置。

微流体装置的主体和薄膜可包含相同的材料。备选地，微流体装置的主体和薄膜可包含不同的材料。微流体装置的主体和薄膜可包含热塑性塑料。热塑性塑料的实例包括但不限于环烯烃聚合物、丙烯酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯、尼龙、聚乳酸、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚醚砜、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚乙烯、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酯、聚氨酯或其任何衍生物。微流体装置可包含均聚物、共聚物或其组合。微流体装置可由非弹性材料形成。备选地或附加地，微流体装置可由弹性材料形成。

在本公开内容的示例性实施方案中，热塑性塑料和薄膜均由环烯烃聚合物组成。一种合适的热塑性塑料是Zeonor 1430R(Zeon Chemical，Japan)，而一种合适的薄膜是Zeonox 1060R(Zeon Chemical，Japan)。在一些实施方案中，薄膜是在低压下不透气而在压力下至少部分透气的材料。

在一些实施方案中，入口和出口通过机械钻孔形成。在一些实施方案中，入口和出口通过熔化、溶解或蚀刻热塑性塑料而形成。

图4图示了制造本公开内容的实施方案的方法。在图4中，使用注塑过程401形成微流体结构。如图1A和图1B所示，微流体结构包含微室阵列，该微室阵列通过虹吸孔与至少一个微通道连接。微流体结构由薄膜封盖。在封盖过程中，微结构的至少一侧中的开口被从上覆盖，以便封闭和密封微结构。在本公开内容的一些实施方案中，通过将薄膜施加于注塑的微流体结构的过程402来执行封盖。在本公开内容的一些实施方案中，通过作为注塑过程401的一部分形成薄膜来执行封盖。

作为另一实例，虽然在经由注塑形成微结构的上下文中进行了描述，但是如上所述，通过其他微加工技术形成的微流体装置也可受益于使用这样的热塑性薄膜以允许除气。这样的技术包括微机械加工、微光刻和热压印以及其他微制造技术。

分析核酸样品的方法

在一个方面，本公开内容提供了用于使用微流体装置分析核酸样品的方法。该方法可包括提供包含微通道的微流体装置。微通道可包含入口和出口。微流体装置可进一步包含通过多个虹吸孔与微通道连接的多个微室。微流体装置可通过安置在邻近微流体装置表面的热塑性薄膜密封，使得热塑性薄膜封盖微通道、多个微室和多个虹吸孔。可将试剂施加至入口或出口。可通过在试剂与微流体装置之间提供第一压差来填充微流体装置，从而使试剂流入微流体装置。可通过在微通道与多个微室之间施加第二压差以将试剂移动到多个微室中并推动多个微室内的气体通过热塑性薄膜，从而使试剂分区到微室中。第二压差可大于第一压差。可施加入口与出口之间的第三压差以将流体引入微通道而不将流体引入微室中。第三压差可小于第二压差。

在一些实施方案中，入口和出口与气动泵流体连通。在一些实施方案中，微流体装置与真空系统接触。可通过在微流体装置的各个特征之间施加压差来执行样品的填充和分区。在一些实施方案中，可在不在微室与微通道之间使用阀的情况下执行样品的填充和分区以分离样品。例如，可通过在待装载的样品与微通道之间施加压差来执行微通道的填充。该压差可通过对样品加压或通过向微通道施加真空来实现。可通过在微通道与微室之间施加压差来执行微室的填充。这可以通过对微通道加压或通过对微室施加真空来实现。可通过在流体与微通道之间施加压差来执行样品的分区。该压差可通过对流体加压或通过向微通道施加真空来实现。

在不同的施加压差下，薄膜可采用不同的渗透性特性。例如，薄膜在第一压差和第三压差(例如，低压)下可以是不透气的，该第一压差和第三压差可为较小幅度的压差。薄膜在第二压差(例如，高压)下可以至少部分透气，该第二压差可为较大幅度的压差。第一压差和第三压差可以相同或者可以不同。第一压差可以是入口或出口中的试剂与微流体装置之间的压差。在微流体装置填充期间，试剂的压力可高于微流体装置的压力。在微流体装置填充期间，试剂与微流体装置之间的压差(例如，低压)可小于或等于约8磅/平方英寸(psi)、小于或等于约6psi、小于或等于约4psi、小于或等于约2psi、小于或等于约1psi或更小。在一些实例中，在微流体装置填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约8psi。在一些实例中，在微流体装置填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约6psi。在一些实例中，在微流体装置填充期间，试剂与微流体装置之间的压差可为约1psi至约4psi。可通过在试剂与微流体装置之间施加压差达小于或等于约20分钟、小于或等于约15分钟、小于或等于约10分钟、小于或等于约5分钟、小于或等于约3分钟、小于或等于约2分钟、小于或等于约1分钟或更短来填充微流体装置。

经填充的微流体装置可在微通道、虹吸孔、微室或其任意组合中具有试剂。试剂向微室中的回填可发生在微流体装置填充时或可发生在施加第二压差期间。第二压差(例如，高压)可对应于微通道与多个微室之间的压差。在施加第二压差期间，较高压力域中的第一流体可推动较低压力域中的第二流体通过薄膜并离开微流体装置。第一流体和第二流体可包括液体或气体。液体可包括水性混合物或油性混合物。可通过对微通道加压来实现第二压差。备选地或附加地。可通过对微室施加真空来实现第二压差。在施加第二压差期间，微通道中的试剂可流入微室中。另外，在施加第二压差期间，残存在虹吸孔、微室和微通道内的气体可通过薄膜除气。在微室的回填和除气期间，微室与微通道之间的压差可大于或等于约6psi、大于或等于约8psi、大于或等于约10psi、大于或等于约12psi、大于或等于约14psi、大于或等于约16psi、大于或等于约18psi、大于或等于约20psi或更大。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约20psi。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约18psi。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约16psi。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约14psi。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约12psi。在一些实例中，在微室的回填期间，微室与微通道之间的压差为约8psi至约10psi。可通过施加压差达超过约5分钟、超过约10分钟、超过约15分钟、超过约20分钟、超过约25分钟、超过约30分钟或更久来使微室回填和除气。

可通过从微通道中去除过量的样品来使样品分区。从微通道中去除多余的样品可防止一个微室中的试剂通过虹吸孔扩散到微通道中并进入其他微室。可通过将流体引入微通道的入口或出口来除去微通道内的过量样品。流体的压力可大于微通道的压力，从而在流体与微通道之间产生压差。流体可为氧气、氮气、二氧化碳、空气、惰性气体或其任意组合。在样品分区期间，流体与微通道之间的压差可小于或等于约8psi、小于或等于约6psi、小于或等于约4psi、小于或等于约2psi、小于或等于约1psi或更小。在一些实例中，在样品分区期间，流体与微通道之间的压差可为约1psi至约8psi。在一些实例中，在样品分区期间，流体与微通道之间的压差可为约1psi至约6psi。在一些实例中，在样品分区期间，流体与微通道之间的压差可为约1psi至约4psi。可通过在流体与微通道之间施加压差达小于或等于约20分钟、小于或等于约15分钟、小于或等于约10分钟、小于或等于约5分钟、小于或等于约3分钟、小于或等于约2分钟、小于或等于约1分钟或更短来使样品分区。

图3A-图3D图示了使用图1A中所示的微流体装置的方法。在图3A中，经由气动泵300将低压施加于入口120处的试剂，以推动试剂进入微通道110，从而经由虹吸孔填充微室。压力推动试剂流过微通道，从而经由虹吸孔流入微室。此时，诸如气泡301的气泡可保留在微室、虹吸孔或微通道内。可持续经由施加低压的填充直至微室、虹吸孔和微通道基本上充满试剂。试剂可以是用于聚合酶链反应的试剂。在一些实施方案中，稀释试剂使得微流体装置的每个微室中的试剂中不存在多于一个PCR模板。

在图3B中，将气动泵300与入口120和出口130连接，并施加高压。高压通过试剂传递并施加至诸如气泡301的气泡上。在该高压的影响下，薄膜150变得透气，并且气泡301可通过薄膜150除气。通过施加该高压，可使得微室、虹吸孔和微通道基本上无气泡，从而避免污染。

在图3C中，通过经由气动泵300向入口120处的气体施加低压来重新引入流体。气压可能不足以允许气体通过薄膜除气，或可能足够高以推动气泡进入虹吸孔和微室。替代地，气体可清除微通道的试剂，从而使试剂分离在每个微室和虹吸孔中。在一些实施方案中，该气体为空气。在一些实施方案中，该气体可为惰性气体，如氮气、二氧化碳或惰性气体。这样的气体可用于避免试剂与空气的组分气体之间的反应。

图3D图示了图3C中已施加低压后系统的状态。在施加低压气体后，微室和虹吸孔可仍然充满试剂，而微通道可被清除试剂。由于虹吸孔产生的毛细力和高表面张力，试剂可在微室内保持静止。毛细力和高表面张力可防止试剂流入微通道并使试剂蒸发最小化。

可通过试剂内指示物的存在来验证样品的分区。指示物可包括含有可检测部分的分子。可检测部分可包括放射性物质、荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记或其任意组合。放射性物质的非限制性实例包括³H、¹⁴C、²²Na、³²P、³³P、³⁵S、⁴²K、⁴⁵Ca、⁵⁹Fe、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I或²⁰³Hg。荧光标记的非限制性实例包括荧光蛋白、光学活性染料(例如，荧光染料)、有机金属荧光团或其任意组合。化学发光标记的非限制性实例包括萤光素酶类的酶，如海萤(Cypridina)萤光素酶、高斯(Gaussia)萤光素酶、海肾(Renilla)萤光素酶和萤火虫萤光素酶。酶标记的非限制性实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或其他公知的标记。

在一些实施方案中，指示物分子为荧光分子。荧光分子可包括荧光蛋白、荧光染料和有机金属荧光团。在一些实施方案中，指示物分子为蛋白质荧光团。蛋白质荧光团可包括绿色荧光蛋白(GFP，在绿色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为500-550纳米的光)、青色荧光蛋白(CFP，在青色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为450-500纳米的光)、红色荧光蛋白(RFP，在红色光谱区发荧光的荧光蛋白，通常发射波长为600-650纳米的光)。蛋白质荧光团的非限制性实例包括AcGFP、AcGFP1、AmCyan、AmCyan1、AQ143、AsRed2、AzamiGreen、Azurite、BFP、Cerulean、CFP、CGFP、Citrine、copGFP、CyPet、dKeima-Tandem、DsRed、dsRed-Express、DsRed-Monomer、DsRed2、dTomato、dTomato-Tandem、EBFP、EBFP2、ECFP、EGFP、Emerald、EosFP、EYFP、GFP、HcRed-Tandem、HcRed1、JRed、Katuska、Kusabira Orange、Kusabira Orange2、mApple、mBanana、mCerulean、mCFP、mCherry、mCitrine、mECFP、mEmerald、mGrape1、mGrape2、mHoneydew、Midori-Ishi Cyan、mKeima、mKO、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mRuby、mStrawberry、mTagBFP、mTangerine、mTeal、mTomato、mTurquoise、mWasabi、PhiYFP、ReAsH、Sapphire、Superfolder GFP、T-Sapphire、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagRFP-T、TagYFP、tdTomato、Topaz、TurboGFP、Venus、YFP、YPet、ZsGreen和ZsYellow1的突变体和光谱变体。

在一些实施方案中，指示物分子为荧光染料。荧光染料的非限制性实例包括SYBRgreen、SYBR blue、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR gold、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、荧光香豆素(fluorcoumanin)、椭圆玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶(homidium)、光神霉素、多吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2、单叠氮化乙锭和ACMA、Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟

脒(hydroxystilbamidine)、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45(蓝)、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14、SYTO-25(绿)、SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85(橙)、SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60、SYTO-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、德克萨斯红(Texas Red)、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、Sybr Green I、Sybr GreenII、Sybr Gold、CellTracker Green、7-AAD、乙锭同型二聚体I、乙锭同型二聚体II、乙锭同型二聚体III、溴化乙锭、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、茋、萤光黄、级联蓝(cascade blue)、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、荧光镧系络合物(如包含铕和铽的那些络合物)、羧基四氯荧光素、5-羧基荧光素和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-碘乙酰胺基荧光素或6-碘乙酰胺基荧光素、5-{[2-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素和5-{[3-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5-羧基罗丹明和/或6-羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 635、AlexaFluor 647、AlexaFluor660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700、AlexaFluor 750和AlexaFluor 790染料、DyLight350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 755和DyLight 800染料、或其他荧光团。

在一些实施方案中，指示物分子为有机金属荧光团。有机金属荧光团的非限制性实例包括镧系离子螯合物，该镧系离子螯合物的非限制性实例包括三(二苯甲酰基甲烷)单(1,10-菲咯啉)铕(III)、三(二苯甲酰基甲烷)单(5-氨基-1,10-菲咯啉)铕(III)和Lumi4-Tb穴状化合物。

在一些实施方案中，拍摄微流体装置的图像。可同时拍摄单个微室、微室阵列或多个微室阵列的图像。在一些实施方案中，通过微流体装置的主体拍摄图像。在一些实施方案中，通过微流体装置的薄膜拍摄图像。在一些实施方案中，通过微流体装置的主体以及通过薄膜拍摄图像。在一些实施方案中，微流体装置的主体是基本上光学透明的。在一些实施方案中，微流体装置的主体是基本上光学不透明的。在一些实施方案中，薄膜是基本上光学透明的。在一些实施方案中，可在用试剂填充微流体装置之前拍摄图像。在一些实施方案中，可在用试剂填充微流体装置之后拍摄图像。在一些实施方案中，可在用试剂填充微流体装置期间拍摄图像。在一些实施方案中，拍摄图像以验证试剂的分区。在一些实施方案中，在反应期间拍摄图像以监测反应产物。在一些实施方案中，反应产物包括扩增产物。在一些实施方案中，以指定间隔拍摄图像。备选地或附加地。可拍摄微流体装置的视频。指定间隔可包括在反应期间至少每300秒1次、至少每240秒1次、至少每180秒1次、至少每120秒1次、至少每90秒1次、至少每60秒1次、至少每30秒1次、至少每15秒1次、至少每10秒1次、至少每5秒1次、至少每4秒1次、至少每3秒1次、至少每2秒1次、至少每1秒1次或更频繁地拍摄图像。

在一些实施方案中，使用微流体装置的方法可进一步包括扩增核酸样品。可用包含核酸分子、扩增反应所必需的组分、指示物分子和扩增探针的扩增试剂填充微流体装置。可通过对多个微室进行热循环来执行扩增。可通过对微流体装置的微室进行成像来执行核酸扩增的检测。可通过计数其中核酸分子成功扩增的微室并应用泊松统计来定量核酸分子。在一些实施方案中，核酸扩增和定量可在单个集成单元中执行。

可使用多种核酸扩增反应来扩增样品中的核酸分子以生产扩增产物。核酸靶标的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。核酸扩增方法的非限制性实例包括引物延伸、聚合酶链反应、逆转录、等温扩增、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增。在一些实施方案中，扩增产物为DNA或RNA。对于引导进行DNA扩增的实施方案，可采用任何DNA扩增方法。DNA扩增方法包括但不限于PCR、实时PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、嵌套式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR、多重PCR、重叠-延伸PCR、热不对称交错PCR、递降PCR和连接酶链反应。在一些实施方案中，DNA扩增是线性的、指数式的或其任意组合。在一些实施方案中，用数字PCR(dPCR)实现DNA扩增。

核酸扩增所必需的试剂可包含聚合酶、反向引物、正向引物和扩增探针。聚合酶的实例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶(即，催化键形成的酶)。聚合酶可以是天然存在的或合成的。聚合酶的实例包括DNA聚合酶和RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、噬菌体T4DNA聚合酶Φ29(phi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、Ex-Taq聚合酶、LA-Taw聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、具有3’至5’外切核酸酶活性的Klenow片段聚合酶、及其变体、修饰产物和衍生物。对于热启动聚合酶，可能需要在约92℃至95℃的温度下进行约2分钟至10分钟的变性步骤。

在一些实施方案中，扩增探针为序列特异性寡核苷酸探针。当与扩增产物杂交时，扩增探针可为光学活性的。在一些实施方案中，扩增探针仅在核酸扩增进行时可检测。光信号的强度可与扩增产物的量成比例。探针可与本文所述的任何光学活性可检测部分(例如，染料)连接，并且还可包括能够阻断相关染料的光学活性的猝灭物。可用作可检测部分的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、锁定核酸探针或分子信标。可用于阻断探针的光学活性的猝灭物的非限制性实例包括BlackHole猝灭物(BHQ)、Iowa Black FQ和RQ猝灭物、或者Internal ZEN猝灭物。备选地或附加地，探针或猝灭物可以是可用于本公开内容的方法的上下文中的任何已知探针。

在一些实施方案中，扩增探是为双标记荧光探针。双标记探针可包含与核酸连接的荧光报道分子和荧光猝灭物。荧光报道分子和荧光猝灭物可紧邻彼此定位。紧邻的荧光报道分子和荧光猝灭物可阻断荧光报道分子的光学活性。双标记探针可与待扩增的核酸分子结合。在扩增期间，荧光报道分子和荧光猝灭物可被聚合酶的外切核酸酶活性切割。从扩增探针切割荧光报道分子和猝灭物可使荧光报道分子重新获得其光学活性并能够被检测。双标记荧光探针可包括激发波长最大值为约450纳米(nm)、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高且发射波长最大值为约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或更高的5’荧光报道分子。双标记荧光探针还可包含3’荧光猝灭物。荧光猝灭物可淬灭约380nm至550nm之间、390nm至625nm之间、470nm至560nm之间、480nm至580nm之间、550nm至650nm之间、550nm至750nm之间或620nm至730nm之间的荧光发射波长。

在一些实施方案中，通过使微流体装置的微室进行热循环来执行核酸扩增。热循环可包括通过对微流体装置施加加热或冷却来控制微流体装置的温度。加热或冷却方法可包括电阻加热或冷却、辐射加热或冷却、传导加热或冷却、对流加热或冷却或其任意组合。热循环可包括使微室在足够高的温度下温育以使核酸分子变性一段时间，然后将微室在延伸温度下温育延伸时间的循环。变性温度可根据例如特定的核酸样品、所用的试剂和所需的反应条件而变化。在一些实施方案中，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实施方案中，变形温度可为约85℃至约105℃。在一些实施方案中，变形温度可为约90℃至约100℃。在一些实施方案中，变形温度可为约90℃至约98℃。在一些实施方案中，变形温度可为约92℃至约95℃。在一些实施方案中，变性温度可为至少约80℃、至少约81℃、至少约82℃、至少约83℃、至少约84℃、至少约85℃、至少约86℃、至少约87℃、至少约88℃、至少约89℃、至少约90℃、至少约91℃、至少约92℃、至少约93℃、至少约94℃、至少约95℃、至少约96℃、至少约97℃、至少约98℃、至少约99℃、至少约100℃或更高。

变性的持续时间可根据例如特定的核酸样品、所用的试剂和所需的反应条件而变化。在一些实施方案中，变性的持续时间可为小于或等于约300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。在备选的实施方案中，变性的持续时间可不大于约120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸温度可根据例如特定的核酸样品、所用的试剂和所需的反应条件而变化。在一些实施方案中，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实施方案中，延伸温度可为约35℃至约75℃。在一些实施方案中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实施方案中，延伸温度可为约55℃至约65℃。在一些实施方案中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实施方案中，延伸温度可为至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃、至少约71℃、至少约72℃、至少约73℃、至少约74℃、至少约75℃、至少约76℃、至少约77℃、至少约78℃、至少约79℃或至少约80℃。

延伸时间可根据例如特定的核酸样品、所用的试剂和所需的反应条件而变化。在一些实施方案中，延伸的持续时间可为小于或等于约300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。在备选的实施方案中，延伸的持续时间可不大于约120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

核酸扩增可包含热循环的多个循环。可执行任何合适数目的循环。在一些实施方案中，执行的循环数目可为大于约5、大于约10、大于约15、大于约20、大于约30、大于约40、大于约50、大于约60、大于约70、大于约80、大于约90、大于约100个循环或更多。执行的循环数目可取决于获得可检测的扩增产物所必需的循环数目。例如，在dPCR期间检测核酸扩增所必需的循环数目可为小于或等于约100、小于或等于约90、小于或等于约80、小于或等于约70、小于或等于约60、小于或等于约50、小于或等于约40、小于或等于约30、小于或等于约20、小于或等于约15、小于或等于约10、小于或等于约5个循环或更少。

达到可检测量的扩增产物的时间可根据特定的核酸样品、所用的试剂、所用的扩增反应、所用的扩增循环数目和所需的反应条件而变化。在一些实施方案中，达到可检测量的扩增产物的时间可为约120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、40分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短、10分钟或更短或者5分钟或更短。

在一些实施方案中，变温速率(即，微室从一个温度转变成另一温度的速率)对于扩增是重要的。例如，扩增反应产生可检测量的扩增产物的温度和时间可根据变温速率而变化。变温速率可影响扩增期间所用的时间、温度或者时间和温度。在一些实施方案中，变温速率在循环之间是恒定的。在一些实施方案中，变温速率在循环之间有所变化。可基于正在处理的样品来调整变温速率。例如，可选择最佳变温速率以提供稳健且有效的扩增方法。

图5图示了使用上述微流体装置采用的数字PCR过程。在步骤501中，如图3A-图3D所示，使试剂分区。在步骤502中，使试剂经受热循环以对微室中的试剂运行PCR反应。例如，可使用平板热循环仪来执行该步骤。在步骤503中，执行图像采集以确定哪些微室已成功运行PCR反应。例如，可使用三色探针检测单元来执行图像采集。在步骤504中，将泊松统计应用于计数步骤503中确定的微室，以将阳性室的原始数目转换成核酸浓度。

用于分析核酸样品的系统

在一个方面，本公开内容提供了用于使用微流体装置来分析核酸样品的设备。该设备可包含被配置用于保持一个或多个微流体装置的传送台。该微流体装置可包含具有入口和出口的微通道、通过多个虹吸孔与微通道连接的多个微室以及封盖或覆盖微流体装置的薄膜。设备可包含与微流体装置流体连通的气动模块。该气动模块可将试剂装载到微流体装置中并将试剂分区到微室中。设备可包含与多个微室热连通的热模块。该热模块可控制微室的温度和微室的热循环。设备可包含能够对多个微室进行成像的光学模块。设备还可包含耦合至传送台、气动模块、热模块和光学模块的计算机处理器。计算机处理器可被编程用于(i)引导气动模块将试剂装载到微流体装置中并将试剂分区到多个微室中，(ii)引导热模块使多个微室进行热循环，和(iii)引导光学模块对多个微室进行成像。

传送台可被配置用于输入微流体装置、保持微流体装置和输出微流体装置。传送台可在一个或多个坐标中静止。备选地或附加地，传送台可以能够在X方向、Y方向、Z方向或其任意组合中移动。传送台可以能够保持单个微流体装置。备选地或附加地，传送台可以能够保持至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个微流体装置。

气动模块可被配置成与微流体装置的入口和出口流体连通。气动模块可具有能够与多个入口和多个出口连接的多个连接点。气动模块可以能够一次对单个微室阵列进行填充、回填和使分区，或者串联地对多个微室阵列进行填充、回填和分区。气动模块可进一步包含真空模块。气动模块可向微流体装置提供增加的压力或者向微流体装置提供真空。

热模块可被配置成与微流体装置的微室热连通。热模块可被配置用于控制单个微室阵列的温度或控制多个微室阵列的温度。热控制模块可在所有微室阵列上执行相同的热程序，或者可对不同的微室阵列执行不同的热程序。

光学模块可被配置用于发射和检测多个波长的光。发射波长可对应于所用指示物和扩增探针的激发波长。发射光可包含具有在约450nm、500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合附近的最大强度的波长。检测到的光可包含具有在约500nm、525nm、550nm、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm或其任意组合附近的最大强度的波长。光学模块可被配置用于发射一种、两种、三种、四种或更多种波长的光。光学模块可被配置用于检测一种、两种、三种、四种或更多种波长的光。一种发射光波长可对应于指示物分子的激发波长。另一种发射光波长可对应于扩增探针的激发波长。一种检测到的光波长可对应于指示物分子的发射波长。另一种检测到的光波长可对应于用于检测微室内反应的扩增探针。光学模块可被配置用于对微室阵列的部分进行成像。备选地或附加地，光学模块可在单个图像中对整个微室阵列进行成像。

图6图示了用于在单个机器中执行图5的过程的机器600。机器600包含气动模块601，该气动模块601含有泵和歧管，并且可在Z方向上移动，可操作以执行如图3A-图3D所述的压力施加。机器600还包含热模块602，如平板热循环仪，以使微流体装置进行热循环，从而使聚合酶链反应运行。机器600进一步包含光学模块603，如落射荧光光学模块，光学模块603可光学地确定微流体装置中的哪些微室已成功运行PCR反应。光学模块603可将该信息馈送到处理器604，处理器604使用泊松统计将成功微室的原始计数转换成核酸浓度。传送台605可用于在各个模块之间移动给定的微流体装置以同时处理多个微流体装置。上述微流体装置与将该功能并入单个机器相结合，相对于其他dPCR的实现降低了dPCR的成本、工作流程复杂性和空间需求。

本公开内容不限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的实施方案之外，本公开内容的其他各个实施方案和修改从前述描述和附图中对于本领域普通技术人员而言将会显而易见。

例如，虽然在dPCR应用的上下文中描述，但是可能需要填充有经由气体或其他流体分离的液体的许多分离微室的其他微流体装置可受益于使用热塑性薄膜来允许除气从而避免气体污染，同时还提供了关于可制造性和成本方面的优势。根据本公开内容的实施方案，除了PCR之外，其他核酸扩增方法如环介导等温扩增可适于执行特定核酸序列的数字检测。微室也可用于分离单个细胞，其中虹吸孔被设计成接近待分离细胞的直径。在一些实施方案中，当虹吸孔远小于血细胞的大小时，本公开内容的实施方案可用于从全血中分离血浆。

用于分析核酸样品的计算机系统

本公开内容提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图7示出了计算机系统701，其可被编程或以其他方式被配置用于核酸样品处理和分析，包括样品分区、扩增和检测。计算机系统701可调节本公开内容的方法和系统的各个方面。计算机系统701可以是用户的电子设备或是可相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可为移动电子设备。

计算机系统701包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)705，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统701还包括存储器或存储位置710(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元715(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口720(例如，网络适配器)以及外围设备725，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器710、存储单元715、接口720和外围设备725通过诸如主板等通信总线(实线)与CPU 705相通信。存储单元715可为用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统701可借助于通信接口720可操作地耦合至计算机网络(“网络”)730。网络730可为因特网、互联网和/或外联网，或可与因特网相通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络730可为电信和/或数据网络。网络730可包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络730可借助于计算机系统701实现对等网络，这可使与计算机系统701耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。

CPU 705可执行一系列机器可读指令，该计算机可读指令可体现在程序或软件中。该指令可存储在诸如存储器710等存储位置中。指令可针对CPU 705，该指令随后可编程或以其他方式配置CPU 705以实现本公开内容的方法。由CPU 705执行的操作的实例可包括提取、解码、执行和回写。

CPU 705可以是诸如集成电路等电路的一部分。系统701的一个或多个其他组件可包含在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。

存储单元715可存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元715可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统701可包括一个或多个附加数据存储单元，所述附加数据存储单元位于计算机系统701外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统701相通信的远程服务器上。

计算机系统701可通过网络730与一个或多个远程计算机系统相通信。例如，计算机系统701可与用户(例如，服务提供商)的远程计算机系统相通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，

iPad、

Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，

iPhone、支持Android的设备、

)或个人数字助理。用户可经由网络730访问计算机系统701。

如本文所述的方法可通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统701的电子存储位置上，例如存储器710或电子存储单元715上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器705执行。在一些情况下，可从存储单元715检索该代码并将其存储于存储器710上以备处理器705迅速存取。在一些情况下，可排除电子存储单元715，而将机器可执行指令存储于存储器710上。

所述代码可被预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可在运行期间被编译。该代码可以以编程语言提供，可选择编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。

在一个方面，本公开内容提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现用于形成微流体装置以扩增和定量核酸样品的方法。该方法可包括：注塑热塑性塑料以产生微流体结构，该微流体结构包含至少一个微通道、多个微室和多个虹吸孔，其中该多个微室通过多个虹吸孔与至少一个微通道连接；形成至少一个入口和至少一个出口，其中该至少一个入口和该至少一个出口与至少一个微通道流体连通；以及施加热塑性薄膜以封盖微流体结构，其中热塑性薄膜对于跨越热塑性薄膜施加的压差至少部分透气。

在一个方面，本公开内容提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现用于分析和定量核酸样品的方法。该方法可包括：提供包含至少一个微通道的微流体装置，其中该至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中该微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与微通道连接的多个微室，以及邻近微流体装置的表面安置的热塑性薄膜，使得热塑性薄膜封盖微通道、多个微室和多个虹吸孔；向至少一个入口或至少一个出口提供试剂；通过在试剂与微流体装置之间提供第一压差来填充微流体装置，其中第一压差使试剂流入微流体装置；在微通道与多个微室之间施加第二压差以使试剂移动到多个微室中，并推动多个微室内的气体通过封盖或覆盖多个微室、多个虹吸孔和微通道的热塑性薄膜，其中第二压差大于第一压差；以及在至少一个入口与至少一个出口之间施加第三压差以将流体引入微通道而不将流体引入微室中，其中第三压差小于第二压差。

本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统701，可在编程中体现。本技术的各个方面可被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘等电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的。携载这类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码等机器可读介质可采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴缆线；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送此类载波的电缆或链路、或者计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。

计算机系统701可包括电子显示器735或与之通信，电子显示器735包含用于提供例如上皮组织的深度轮廓的用户界面(UI)740。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开内容的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。算法可在由中央处理单元705执行时通过软件实现。算法可例如调控系统或实现本文提供的方法。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言将会显而易见的是，此类实施方案仅以实例的方式提供。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

本发明提供了包括但不限于以下实施方式：

1.一种微流体装置，包含：

至少一个微通道，其包含至少一个入口和至少一个出口；

多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通；以及

热塑性薄膜，该热塑性薄膜邻近所述微流体装置的表面安置，使得所述热塑性薄膜覆盖所述多个微室，其中所述热塑性薄膜在跨越所述热塑性薄膜施加的压差下至少部分透气。

2.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。

3.根据实施方式2所述的微流体装置，其中所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

4.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

5.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个虹吸孔具有约10μm至约20μm的深度。

6.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。

7.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。

8.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个微室具有小于约25μm的深度。

9.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

10.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。

11.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个微室为圆柱形形状。

12.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述多个微室为半球形形状。

13.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述微流体装置通过注塑形成。

14.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜通过注塑形成。

15.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜通过热粘合施加于所述微流体装置。

16.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

17.根据实施方式1所述的微流体装置，其中跨越所述热塑性薄膜施加的所述压差为约8磅/平方英寸(psi)至约16psi。

18.根据实施方式1所述的微流体装置，进一步包含与所述至少一个入口或所述至少一个出口流体连通的气动泵。

19.根据实施方式1所述的微流体装置，其中所述微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。

20.一种用于形成微流体装置的方法，包括：

注塑热塑性塑料以产生微流体结构，所述微流体结构包含至少一个微通道、多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通；

形成与所述至少一个微通道流体连通的至少一个入口和至少一个出口；以及

施加热塑性薄膜以覆盖所述多个微室，其中所述热塑性薄膜在跨越所述热塑性薄膜施加的压差下至少部分透气。

21.根据实施方式20所述的方法，其中所述热塑性薄膜通过注塑形成。

22.根据实施方式20所述的方法，其中所述热塑性薄膜通过热粘合施加于所述微流体结构。

23.根据实施方式20所述的方法，其中所述至少一个入口和至少一个出口通过机械钻孔形成。

24.根据实施方式20所述的方法，其中所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。

25.根据实施方式24所述的方法，其中所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

26.根据实施方式20所述的方法，其中所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

27.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个虹吸孔具有约10μm至约20μm的深度。

28.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。

29.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。

30.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个微室具有小于约25μm的深度。

31.根据实施方式20所述的微流体装置，其中所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

32.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个微室为圆柱形形状。

33.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个微室为半球形形状。

34.根据实施方式20所述的方法，其中所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

35.根据实施方式20所述的方法，其中跨越所述热塑性薄膜施加的所述压差为约8磅/平方英寸(psi)至约16psi。

36.根据实施方式20所述的方法，其中所述微流体装置不包含所述至少一个微通道与所述多个微室之间的阀。

37.根据实施方式20所述的方法，其中所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。

38.一种使用微流体装置的方法，包括：

(a)提供包含至少一个微通道的所述微流体装置，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通的多个微室，以及邻近所述微流体装置的表面安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜覆盖所述多个微室；

(b)在第一压差下将试剂从所述至少一个入口或所述至少一个出口引导至所述至少一个微通道；

(c)在所述至少一个微通道与所述多个微室之间的第二压差下将所述试剂引导至所述多个微室中，其中在将所述试剂引导至所述多个微室中后，使所述多个微室中的气体流过覆盖所述多个微室的所述热塑性薄膜；以及

(d)在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间的第三压差下将流体引导至所述至少一个微通道中，而不将所述流体引入所述多个微室中。

39.根据实施方式38所述的方法，其中使用单个集成机器执行(a)-(d)。

40.根据实施方式38所述的方法，其中所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

41.根据实施方式38所述的方法，其中所述第二压差大于所述第一压差。

42.根据实施方式38所述的方法，其中所述第三压差小于所述第二压差。

43.根据实施方式38所述的方法，进一步包括向所述多个微室中的每一个提供包含核酸分子的聚合酶链反应(PCR)试剂。

44.根据实施方式43所述的方法，进一步包括通过使所述多个微室进行热循环来执行PCR。

45.根据实施方式43所述的方法，进一步包括获取所述多个微室的图像。

46.根据实施方式44所述的方法，进一步包括计数其中所述PCR成功扩增所述核酸分子的所述多个微室的数目。

47.根据实施方式46所述的方法，进一步包括将泊松统计应用于其中所述PCR成功扩增所述PCR试剂的所述多个微室的所述数目，以定量所述PCR试剂内的核酸。

48.根据实施方式38所述的方法，其中所述至少一个微通道进一步包含与交叉通道流体连通的多个子通道，并且其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述多个子通道流体连通。

49.根据实施方式48所述的方法，其中所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

50.根据实施方式38所述的方法，其中所述第三压差为约1磅/平方英寸(psi)至约4psi。

51.根据实施方式38所述的方法，其中所述第二压差为约8psi至约16psi。

52.根据实施方式38所述的方法，其中所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

53.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。

54.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个微室为圆柱形形状。

55.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个微室为半球形形状。

56.根据实施方式38所述的方法，其中所述微流体装置在所述至少一个微通道与所述多个微室之间不包含阀。

57.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个虹吸孔具有约10μm至约20μm的深度。

58.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个虹吸孔具有小于约10μm的深度。

59.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个微室具有约25μm至约75μm的深度。

60.根据实施方式38所述的方法，其中所述多个微室具有小于约25μm的深度。

61.根据实施方式38所述的方法，其中所述热塑性薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

62.根据实施方式38所述的方法，其中所述流体为空气、氮气、二氧化碳、惰性气体或其任意组合。

63.一种用于使用微流体装置的系统，包含：

传送台，其被配置用于保持至少一个微流体装置，所述微流体装置包含(i)至少一个微通道，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，(ii)多个微室，该多个微室通过多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通，和(ii)覆盖所述多个微室的热塑性薄膜；

气动模块，其与所述至少一个微流体装置流体连通，其中所述气动模块被配置用于将试剂装载到所述微流体装置中以分区到所述多个微室中；

热模块，其与所述多个微室热连通，其中所述热模块被配置用于控制所述多个微室的温度并使所述多个微室进行热循环；

光学模块，其被配置用于对所述微流体装置的所述多个微室进行成像；以及

一个或多个计算机处理器，其耦合至所述传送台、所述气动模块、所述热模块和所述光学模块，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同地编程以(i)引导所述气动模块将所述试剂装载到所述微流体装置中以分区到所述多个微室中，(ii)引导所述热模块使所述多个微室进行热循环，和(iii)引导所述光学模块对所述多个微室进行成像。

64.根据实施方式63所述的系统，其中所述至少一个微流体装置在所述至少一个微通道与所述多个微室之间不包含阀。

65.根据实施方式63所述的系统，其中所述热塑性薄膜覆盖所述至少一个微通道和/或所述多个虹吸孔。

66.根据实施方式63所述的系统，其中所述气动模块进一步被配置用于施加第一压差以将所述试剂装载到所述至少一个微通道中。

67.根据实施方式63所述的系统，其中所述气动模块进一步被配置用于在所述至少一个微通道与所述多个微室之间施加第二压差，以将所述试剂分区到所述多个微室中。

68.根据实施方式63所述的系统，其中所述气动模块进一步被配置用于在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间施加第三压差，以使流体流入所述至少一个微通道。

69.根据实施方式67所述的系统，其中所述第二压差为约8磅/平方英寸(psi)至约16psi。

70.根据实施方式68所述的系统，其中所述第三压差为约1psi至约4psi。

71.根据实施方式63所述的系统，其中所述光学模块被配置用于对至少两个不同波长范围进行成像。

72.根据实施方式71所述的系统，其中使用所述至少两个不同波长范围中的第一个来验证所述试剂分区。

73.根据实施方式71所述的系统，其中使用所述至少两个不同波长范围中的第二个来检测所述多个微室内的反应。

74.一种使用微流体装置的方法，包括：

提供包含微通道的所述微流体装置，其中所述微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与所述微通道连接的多个微室，以及邻近所述微流体装置安置的热塑性薄膜，使得所述热塑性薄膜封盖所述微通道、所述多个微室和所述多个虹吸孔；

通过以第一压力将试剂施加至所述至少一个入口，用所述试剂填充所述微流体装置的所述多个微室；

在所述至少一个入口处或在所述至少一个出口处以第二压力施加高压气体以推动所述多个微室、所述多个虹吸孔和所述微通道内的气体，其中所述第二压力大于所述第一压力；以及

在所述至少一个入口处以第三压力施加低压气体以将所述低压气体引入所述微通道而不将所述低压气体引入所述多个微室中，其中所述第三压力小于所述第二压力。

75.根据实施方式74所述的方法，其中使用单个集成机器执行所述方法。

76.根据实施方式74所述的方法，进一步包括向所述多个微室中的每一个提供包含核酸分子的聚合酶链反应(PCR)试剂。

77.根据实施方式76所述的方法，进一步包括通过使所述多个微室进行热循环来执行PCR。

78.根据实施方式76所述的方法，进一步包括获取所述多个微室的图像。

79.根据实施方式78所述的方法，进一步包括计数其中所述PCR成功扩增所述核酸分子的所述多个微室的数目。

80.根据实施方式79所述的方法，进一步包括将泊松统计应用于其中所述PCR成功扩增所述PCR试剂的所述多个微室的所述数目，以定量所述PCR试剂内的核酸。

81.根据实施方式74所述的方法，其中所述微通道包含经由交叉通道连接的多个子通道，并且其中所述多个微室与所述多个子通道连接。

82.根据实施方式81所述的方法，其中所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室处于网格配置。

83.根据实施方式74所述的方法，其中所述第三压力在约1磅/平方英寸(psi)至4psi之间。

84.根据实施方式74所述的方法，其中所述第二压力在约8psi至16psi之间。

85.根据实施方式74所述的方法，其中所述高压气体包括空气、氮气、二氧化碳、惰性气体或其任意组合。

86.根据实施方式74所述的方法，其中所述热塑性薄膜包含环烯烃聚合物。

87.根据实施方式74所述的方法，进一步包含与所述至少一个入口或所述至少一个出口流体连通的气动泵。

88.根据实施方式74所述的方法，其中所述多个微室包括约1,000至约20,000个微室。

89.根据实施方式74所述的方法，其中所述多个微室为圆柱形形状。

90.根据实施方式74所述的方法，其中所述微流体装置通过注塑形成。

91.根据实施方式74所述的方法，其中所述热塑性薄膜通过注塑形成。

实施例1：试剂分区的证明

使用以标准显微镜载玻片尺寸制造的微流体装置来证明试剂分区。微流体装置的总尺寸为1英寸宽，3英寸长和0.6英寸厚。该装置含有四种不同的微室阵列设计和共八个不同的微室阵列。图8A示出了八单元装置和四种阵列设计之一的放大透视图。微流体装置由环烯烃聚合物(COP)、Zeonor 790R(Zeon Chemicals，Japan)模塑，并用100μm COP薄膜、Zeonox ZF14(Zeon Chemicals，Japan)通过热粘合来密封。所示的放大的微流体区段具有通过虹吸孔与微室连接的蛇形微通道。微室处于网格配置。微室和微通道具有40μm的深度，虹吸孔具有10μm的深度。每个分离的微流体区段都具有入口通道和出口通道。在将薄膜热粘合到微流体装置的基部之前，对入口通道和出口通道机械钻孔。入口通道和出口通道的直径为1.6mm。

图8B示出了试剂装载、微室回填和分区的荧光图像。在装载微流体装置之前，将2微升(μL)的4千道尔顿(kDa)荧光素缀合的葡聚糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)移液到入口中。然后使微流体装置与气动控制器接触。气动控制器通过向入口施加4psi的压力达3分钟来装载微流体装置的微通道。通过将入口和出口加压至10psi达20分钟来填充微室。然后通过在4psi下使空气从微流体装置的入口流动来使试剂分区，以从微通道中清除试剂。

实施例2：dPCR的单一仪器工作流程

用于在微流体装置中扩增和定量核酸的方法可在单一仪器中执行。该仪器能够进行试剂分区、热循环、图像采集和数据分析。图9示出了能够进行单一仪器工作流程的原型仪器。该仪器被设计为一次容纳最多四个装置并实现同时图像采集和热循环。该仪器含有用于试剂分区的气动模块、用于温度控制和热循环的热模块、用于成像的光学模块、以及扫描模块。光学模块具有两种荧光成像能力，并能检测大约520nm和600nm的荧光发射，该荧光发射分别对应于FAM和ROX荧光团的发射波长。光学模块具有25mm×25mm的视场和0.14的数值孔径(NA)。

可使用成熟的qPCR测定，利用TaqMan探针作为报道分子来测试单一仪器工作流程。简言之，将核酸样品与PCR试剂混合。PCR试剂包含正向引物、反向引物、TaqMan探针和ROX指示物。正向引物的序列为5’-GCC TCA ATA AAG CTT GCC TTG A-3’。反向引物的序列为5’-GGG GCG CAC TGC TAG AGA-3’。TaqMan探针的序列为5’-[FAM]-CCA GAG TCA CACAAC AGA CGG GCA CA-[BHQ1]-3’。按照上述方案，将核酸样品和PCR试剂装载到微流体装置内并分区。将微室的温度升高至95℃并保持温度10分钟，然后进行40个以下循环：将微室的温度以每秒2.4℃的速率从95℃变温至59℃，在59℃下保持1分钟，然后将温度恢复到95℃，从而进行PCR扩增。图10A-图10D示出了在PCR扩增后每个分区含有约一个核酸模板拷贝的样品的荧光图像和每个分区含有零个核酸模板拷贝(无模板对照或NTC)的分区，以及PCR扩增后每个分区含有约一个核酸拷贝和NTC分区的样品的荧光强度图。图10A示出了不含核酸模板的分区样品的荧光图像，每个灰点代表含有PCR试剂的单个微室。通过以约575nm的光激发每个微室内的ROX指示物并对发射光谱进行成像来获取该图像，该发射光谱具有约600nm的最大发射。图10B示出了在PCR扩增后每个分区含有约一个核酸模板拷贝的分区样品。在PCR扩增后，成像示出了含有ROX指示物的微室和同时含有ROX指示物和FAM探针发射的微室。FAM探针具有约495 nm的激发波长和约520 nm的最大发射波长。单个微室含有ROX指示物、FAM探针和BHQ-1猝灭物。与图10A相同，每个灰点代表包含无核酸模板的分区样品的微室。白点代表含有已成功扩增的核酸样品的微室。在成功PCR扩增后，可从TaqMan探针切割FAM荧光团和BHQ-1猝灭物，从而产生可检测的荧光信号。图10C和图10D分别示出了FAM荧光强度随着经分区的和扩增的微流体装置的每个微室的ROX荧光强度的2维散点图。图10C示出了每个分区含有零个核酸模板的样品，从而导致FAM荧光强度在ROX荧光强度范围内主要恒定。图10D示出了每个分区含有约一个核酸模板拷贝的样品，从而导致FAM荧光强度由于分区内存在扩增信号而随着ROX荧光强度变化。

SEQ	序列	描述
			1	gcctcaataa agcttgcctt ga	合成引物
2	ggggcgcact gctagaga	合成引物
			3	ccagagtcac acaacagacg ggcaca	合成探针

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言将会显而易见的是，这些实施方案仅以实例的方式提供。说明书中提供的具体实例并非旨在限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但对本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制性的意义来解释。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多个条件和变量。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实践本发明。因此，本发明还考虑到应当涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下述权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (22)

1.一种使用微流体装置的方法，包括：

(a)提供一种微流体装置，所述微流体装置包括：(i)微通道；(ii)多个与所述微通道流体连通的隔室；(iii)覆盖所述多个隔室的至少一个透气膜或薄膜；

(b)通过以第一压力向所述微通道施加一试剂，用所述试剂填充所述微流体装置的所述多个隔室；和

(c)通过以第二压力向所述微通道施加第二气体，将在所述多个隔室中的第一气体输送穿过覆盖所述多个隔室的所述透气膜或薄膜，其中所述第二压力大于所述第一压力。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用单个集成机器执行所述方法。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂是聚合酶链反应(PCR)试剂。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括通过使所述多个隔室经受热循环而在所述多个隔室中的隔室中进行PCR。

5.根据权利要求3所述的方法，进一步包括获取所述多个隔室的图像。

6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括计数其中发生PCR的所述多个隔室中的隔室的数目。

7.根据权利要求6所述的方法，进一步包括将泊松统计应用于所述多个隔室中的隔室的所述数目，以定量进行PCR之前所述隔室中的核酸分子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微通道包含经由交叉通道连接的多个子通道，并且其中所述多个微室与所述多个子通道连接。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个子通道基本上彼此平行，使得所述多个微室中的微室处于网格配置。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一压力在约1磅/平方英寸(psi)至4psi之间。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二压力在约8psi至16psi之间。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二气体包括空气、氮气、二氧化碳、惰性气体或其任意组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个透气膜或薄膜包含环烯烃聚合物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个透气膜或薄膜是非弹性的。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体装置与气动泵流体连通，并且所述方法还包括借助于所述气动泵执行(b)或(c)。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个隔室包括1,000至20,000个隔室。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个隔室为圆柱形形状或半球形形状。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个隔室中的隔室具有小于或等于约500微米(μm)的深度。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个透气膜或薄膜具有约50μm至约200μm的厚度。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一压力不足以将气体输送通过所述透气膜或薄膜。

21.一种用于形成微流体装置的方法，包括：

注塑聚合物以产生微流体结构，所述微流体结构包含至少一个微通道、多个微室和多个虹吸孔，其中所述多个微室通过所述多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通；

形成与所述至少一个微通道流体连通的至少一个入口和至少一个出口；以及

施加薄膜以覆盖所述多个微室中的微室，其中所述薄膜至少部分透气，并且其中当所述气体在所述微室中时，所述薄膜被配置为允许所述气体在跨所述薄膜施加的压力差下从所述微室流到所述微室外部的环境中。

22.一种使用微流体装置的方法，包括：

(a)提供包含至少一个微通道的所述微流体装置，其中所述至少一个微通道包含至少一个入口和至少一个出口，并且其中所述微流体装置进一步包含通过多个虹吸孔与所述至少一个微通道流体连通的多个微室，以及邻近所述微流体装置的表面安置的薄膜，使得所述薄膜覆盖所述多个微室中的微室；

(b)在第一压差下将试剂从所述至少一个入口或所述至少一个出口引导至所述至少一个微通道；

(c)在所述至少一个微通道与所述微室之间的第二压差下将所述试剂引导至所述微室中，其中在将所述试剂引导至所述多个微室中后，使所述微室中的气体流过覆盖所述微室的所述薄膜到所述微室外部的环境中；以及

(d)在所述至少一个入口与所述至少一个出口之间的第三压差下将流体引导至所述至少一个微通道中，而不将所述流体引入所述微室中。

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