WO2015019522A1 - 核酸増幅デバイス、核酸増幅装置及び核酸増幅方法 - Google Patents

核酸増幅デバイス、核酸増幅装置及び核酸増幅方法 Download PDF

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acid amplification
reaction solution
amplification device
reaction
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宏明 橘
辻　幸司
民谷　栄一
真人 齋藤
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パナソニック株式会社
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    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification device, a nucleic acid amplification apparatus using the same, and a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification device is a device for amplifying a target nucleic acid that is a sample.
  • the target nucleic acid is amplified by repeatedly applying a desired temperature change to a reaction solution (reaction fluid) containing the target nucleic acid.
  • a microfluidic device is a device capable of reacting a reaction solution containing a very small amount of sample or reagent, and includes a microreaction device (microreactor), an integrated DNA device, a microelectrophoresis device, and the like.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 a device is divided into a plurality of different temperature regions, and a meandering channel (meandering channel) is provided so that the reaction solution repeatedly passes through each temperature region. It is disclosed. With this configuration, the temperature change applied to the reaction solution in the flow path can be accelerated, so that when a solution containing nucleic acid is used as the reaction solution, nucleic acid amplification can be performed at high speed.
  • a meandering channel meandering channel
  • the present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a nucleic acid amplification device or the like that can cause a reaction solution to proceed into a flow path without using a pump.
  • an aspect of the nucleic acid amplification device includes an introduction part into which a reaction solution containing a target nucleic acid is introduced, and the target nucleic acid contained in the reaction solution introduced into the introduction part
  • a nucleic acid amplification reaction section for amplifying the nucleic acid and a flow path provided at least in the nucleic acid amplification reaction section and having a capillary force carrying mechanism for feeding the reaction solution by capillary force,
  • the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified while the reaction solution is fed by capillary force.
  • the nucleic acid amplification device further includes a discharge unit for discharging the reaction solution containing the target nucleic acid after amplification, and the flow path is in a liquid feeding direction of the reaction solution.
  • the entire circumference of the wall surface in the vertical cross section may be closed and connected to the external space only at the introduction part and the discharge part.
  • the flow path may have a hydrophilic surface wall having an acute contact angle as the capillary force carrying mechanism.
  • the entire circumference of the wall surface of the flow path in a cross section perpendicular to the liquid feeding direction of the reaction solution may be a hydrophilic surface.
  • At least two or more temperature regions having different temperatures may exist in the nucleic acid amplification reaction unit.
  • the flow path may be configured to pass through the two or more temperature regions in a reciprocating manner or periodically.
  • the temperature of each temperature region in the two or more temperature regions may be set by a heater.
  • the introduction section is provided in a plurality, and further includes a mixing section provided between the plurality of introduction sections and the nucleic acid amplification reaction section,
  • Each of the plurality of introduction sections is connected to one in the mixing section through an introduction flow path corresponding to each of the plurality of introduction sections, and is introduced from each of the plurality of introduction sections in the mixing section.
  • a plurality of solutions may be mixed to form the reaction solution.
  • the plurality of solutions introduced from each of the plurality of introduction units may be mixed by diffusion in the mixing unit.
  • the flow path in the mixing unit may be a meandering flow path.
  • a portion having a partially small cross-sectional area may exist in the flow path in the mixing portion.
  • the plurality of solutions introduced from each of the plurality of introduction units may be mixed in the mixing unit by a spiral flow.
  • the flow path in the mixing unit may be an annular flow path.
  • At least the flow path in the nucleic acid amplification reaction unit may include a region in which a cross-sectional area decreases along the liquid feeding direction.
  • the flow path in the region where the cross-sectional area decreases may have a tapered structure.
  • the flow path in the region where the cross-sectional area decreases includes a plurality of meandering lines, and the cross-sectional area of the flow path in the region where the cross-sectional area decreases is , It may decrease for each line along the liquid feeding direction.
  • the cross-sectional area of the flow channel in the region where the cross-sectional area decreases may be adjusted by a pillar provided in the flow channel.
  • a part of the flow path may be branched.
  • the depth of the flow path may be constant in the region where the cross-sectional area decreases.
  • nucleic acid amplification device comprising any one of the nucleic acid amplification devices described above, comprising a temperature control unit for controlling the temperature of the nucleic acid amplification reaction unit. It is characterized by.
  • a detection unit for detecting nucleic acid amplification of the target nucleic acid may be further provided.
  • the detection unit includes a light output unit that outputs light for irradiating the nucleic acid amplification device, and reflected light of the light irradiated to the nucleic acid amplification device. And a light receiving portion for receiving light.
  • the detection unit may further include an optical scanning unit for scanning the light on the flow path of the nucleic acid amplification device.
  • one aspect of the nucleic acid amplification method according to the present invention is a nucleic acid amplification method for amplifying a target nucleic acid using a nucleic acid amplification device, wherein the target nucleic acid and a reaction reagent for amplifying the target nucleic acid are used.
  • a solution obtained by mixing a solution containing the target nucleic acid and the reaction reagent in advance may be introduced into the nucleic acid amplification device as the reaction solution.
  • the introduction step in the introduction step, the first solution containing the target nucleic acid and the second solution containing the reaction reagent are separately introduced into the nucleic acid amplification device, and nucleic acid amplification is performed.
  • the target nucleic acid contained in the reaction solution may be amplified while a solution obtained by mixing the first solution and the second solution in the nucleic acid amplification device is fed by capillary force as the reaction solution.
  • a target nucleic acid contained in the reaction solution may be amplified by giving a periodic temperature change to the reaction solution.
  • the nucleic acid amplification device includes a discharge unit for discharging the reaction solution containing the target nucleic acid after amplification, and is fed by the capillary force.
  • a discharge unit for discharging the reaction solution containing the target nucleic acid after amplification, and is fed by the capillary force.
  • the introduction of the solution containing the target nucleic acid into the introduction part may be stopped.
  • the reaction solution can be advanced into the flow path without using a pump.
  • FIG. 1 is a perspective view of a nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining a temperature cycle in the nucleic acid amplification device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a perspective view of a nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of the nucleic acid amplification device according to
  • FIG. 6 is a flow cross-sectional view of the method for manufacturing the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 7 is a flowchart of the nucleic acid amplification method according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 8A is a plan view showing the configuration of the flow path of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 8B is a cross-sectional view of the flow path of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention at X-X ′ of FIG. 8A.
  • FIG. 8C is a cross-sectional view of the flow path of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention at Y-Y ′ in FIG. 8A.
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the time for the PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 ° C. and the displacement of the liquid tip.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of pressure loss for PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 ° C.
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the time for the PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 ° C.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of pressure loss for PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 °
  • FIG. 11 is a table showing viscosity and capillary force values calculated for PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C., and 95 ° C. and pure water at 25 ° C.
  • FIG. 12 is a diagram showing the relationship between the time and the displacement of the liquid front end for a PCR reagent that is self-delivered in the flow path by capillary force.
  • FIG. 13 is a diagram showing gel electrophoresis images showing standard DNA markers before and after PCR amplification.
  • FIG. 14 is a diagram showing a configuration of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the PCR cycle of the reaction solution and the amount of fluorescence (amplification amount).
  • FIG. 16 is a diagram showing the relationship between the concentration of the reaction sample (human genome) and the threshold cycle when starting up.
  • FIG. 17A is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 17B is an enlarged plan view of a mixing unit in the nucleic acid amplification device according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 18 is a flowchart of the nucleic acid amplification method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 19 is an enlarged plan view of a mixing unit in the nucleic acid amplification device according to Modification 1 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 17A is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 17B is an enlarged plan view of a mixing unit in the nucleic acid amplification device according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 20 is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Modification 2 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 21 is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Modification 3 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 22 is an enlarged plan view of a mixing unit in a nucleic acid amplification device according to Modification 4 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 23 is an enlarged plan view showing a flow path of the nucleic acid amplification device according to the first modification of the present invention.
  • FIG. 24 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 2 of the present invention.
  • FIG. 21 is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Modification 3 of Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 22 is an enlarged plan view of a mixing unit in a nucleic acid amplification device according to Modification
  • FIG. 25 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 3 of the present invention.
  • FIG. 26 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 4 of the present invention.
  • FIGS. 1 is a perspective view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of the nucleic acid amplification device
  • FIG. 3 is a plan view of the nucleic acid amplification device.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the nucleic acid amplification device.
  • the nucleic acid amplification device 1 is a device (device chip) for amplifying a target nucleic acid as a sample, and a reaction solution containing at least the target nucleic acid is introduced.
  • a device device chip
  • a reaction solution containing at least the target nucleic acid is introduced.
  • a discharge unit (drain) 130 for discharging the solution and a heater unit 140 for heating the reaction solution containing the target nucleic acid are provided.
  • the nucleic acid amplification reaction unit 110 further includes a flow channel 100 having a capillary force carrying mechanism for feeding the introduced reaction solution by capillary force.
  • the channel 100 is a reaction channel through which the reaction solution flows one-way, and is provided so as to pass through at least the nucleic acid amplification reaction unit 110.
  • the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified while the reaction solution is fed through the channel 100 by capillary force.
  • the reaction solution is a solution containing at least a target nucleic acid serving as a sample.
  • the reaction solution is an aqueous solution containing the target nucleic acid and a reaction reagent for amplifying the target nucleic acid.
  • the reaction solution may contain certain alcohols, surfactants, and the like.
  • the PCR method is a technique for amplifying target DNA by a temperature cycle.
  • the reaction solution contains a PCR primer, a polymerase enzyme, a buffer, and the like.
  • the target DNA can be amplified.
  • the amplification amount of the amplified DNA can be detected by a reaction detection mechanism.
  • the nucleic acid amplification device 1 includes a first substrate 10, a second substrate 20, and a heater unit 140.
  • the heater unit 140 includes a first heater block 141 and a second heater block 142 having different set temperatures.
  • the nucleic acid amplification device 1 in the present embodiment is a microfluidic device having a microchannel (channel 100).
  • the outer shape of the nucleic acid amplification device 1 is, for example, a substantially rectangular shape having a vertical length of 40 mm and a horizontal length of 20 mm.
  • the first substrate 10 includes a first recess 11 constituting a part of the introduction part 120, a second recess 12 constituting a part of the discharge part 130, and a groove part constituting the flow path 100. 13.
  • a silicon substrate can be used as the first substrate 10.
  • the groove 13 (channel 100) is formed so as to connect the first recess 11 and the second recess 12.
  • the reaction solution flows through the groove 13 (channel 100). Specifically, when the reaction solution is introduced into the first recess 11 (introduction portion 120), the reaction solution proceeds in the groove 13 (channel 100) toward the second recess 12 (discharge portion 130). To do.
  • the flow path 100 is a meandering flow path formed to meander, and includes a first heater block 141 (first temperature region) and a second heater block 142 (second temperature region). It is configured to pass alternately and repeatedly.
  • the flow channel 100 in the nucleic acid amplification reaction unit 110 is formed so as to be continuously folded (reciprocated) while bending the linear flow channel at predetermined intervals.
  • the number of times the channel 100 is folded in the nucleic acid amplification reaction unit 110 is, for example, about 20 to 70 cycles.
  • the length of the flow path 100 (main flow path 100a) per cycle can be 32 mm.
  • the flow channel 100 in the present embodiment includes a plurality of linear main flow channels 100a having a predetermined length, and a sub flow channel 100b that connects the ends of the main flow channels 100a in each row facing each other.
  • the main channel 100 a and the sub channel 100 b are provided in the nucleic acid amplification reaction unit 110.
  • the main flow path 100a is provided so as to be substantially orthogonal to the longitudinal direction of the first heater block 141 and the second heater block 142 so as to straddle the first heater block 141 and the second heater block 142.
  • the sub flow channel 100 b is provided so as to be substantially parallel to the longitudinal direction of the first heater block 141 and the second heater block 142.
  • the flow channel 100 further guides the reaction solution from the introduction unit 120 to the nucleic acid amplification reaction unit 110 and leads the reaction solution from the nucleic acid amplification reaction unit 110 to the discharge unit 130.
  • the starting end of the introduction channel 100c is the inlet of the entire channel 100, and the end of the introduction channel 100c is the inlet of the channel 100 in the nucleic acid amplification reaction section.
  • the starting end of the discharge channel 100d is an outlet of the channel 100 in the nucleic acid amplification reaction unit, and the end of the discharge channel 100d is an outlet of the entire channel 100.
  • a silicon oxide film 14 is formed on the inner surface of the groove 13 constituting the flow path 100.
  • the wall surface of the channel 100 can be hydrophilized.
  • the silicon oxide film 14 is formed as a capillary force carrying mechanism in all of the main flow channel 100a, the sub flow channel 100b, the introduction flow channel 100c, and the discharge flow channel 100d.
  • the flow path 100 configured in this way is a micro flow path, for example, the cross-sectional shape is rectangular.
  • the channel width (groove width) of the groove portion 13 constituting the channel 100 is, for example, about 20 to 300 ⁇ m, and the depth of the groove portion 13 is about 50 to 150 ⁇ m.
  • the cross-sectional shape of the groove 13 is not limited to a rectangle, but may be a semicircular shape or an inverted triangle.
  • the 1st recessed part 11 and the 2nd recessed part 12 can be made into the recessed part of circular opening, for example.
  • the material of the first substrate 10 is not limited to silicon, and may be resin or glass.
  • the second substrate 20 is a lid that covers the first substrate 10 and is disposed on the first substrate 10.
  • a glass substrate can be used as the second substrate 20.
  • the second substrate 20 is provided with a first through hole 21 penetrating the second substrate 20 as a part of the introduction part 120.
  • the second substrate 20 is provided with a second through hole 22 that penetrates the second substrate 20 as a part of the discharge unit 130.
  • the first through hole 21 and the second through hole 22 are, for example, through holes having a circular opening.
  • the flow path 100 in which the opening of the groove 13 is closed and all directions are sealed is configured.
  • the flow path 100 has a configuration in which the entire circumference of the wall surface in a cross section perpendicular to the liquid solution feeding direction (traveling direction) is closed, and is connected to the external space only at the introduction part 120 and the discharge part 130. Become.
  • the capillary force in the flow path 100 can be increased, and the reaction solution can be prevented from volatilizing during liquid feeding.
  • the material of the second substrate 20 is not limited to glass, but may be resin or silicon.
  • the heater unit 140 is disposed at least in the nucleic acid amplification reaction unit 110, and the reaction solution sent to the flow path 100 of the nucleic acid amplification reaction unit 110 is given a predetermined value by the heater unit 140. A temperature is applied.
  • the nucleic acid amplification reaction unit 110 is provided with a first heater block 141 and a second heater block 142 set as predetermined different temperatures as the heater unit 140. That is, the nucleic acid amplification reaction unit 110 has two temperature regions that are set to predetermined different temperatures by the two heater blocks, the first heater block 141 and the second heater block 142.
  • the first heater block 141 and the second heater block 142 are heaters using metal blocks made of a metal such as a rectangular parallelepiped aluminum or stainless steel, for example.
  • a metal thin film heater or the like in which a metal thin film is formed on a glass substrate by printing or the like can be used in addition to the heater block.
  • the region where the first heater block 141 set to the first temperature is arranged is the first temperature region.
  • the region where the second heater block 142 set to the second temperature is disposed is a second temperature region which is a temperature region different from the first temperature region.
  • the temperature of the first heater block 141 is set to be higher than the temperature of the second heater block 142. That is, the region where the first heater block 141 is disposed is a high temperature region, and the region where the second heater block 142 is disposed is a low temperature region.
  • the temperature of the first heater block 141 that is the high temperature region is, for example, 93 ° C. to 98 ° C., and in this embodiment, the temperature is about 95 ° C., which is the denaturation reaction temperature of the nucleic acid amplification reaction.
  • the temperature of the second heater block 142 which is a low temperature region is, for example, 50 ° C. to 75 ° C., and in this embodiment, the temperature is about 60 ° C. which is the annealing / elongation reaction temperature.
  • the heater unit 140 is connected to the temperature control unit 210. Thereby, each temperature of the first heater block 141 and the second heater block 142 can be controlled by the temperature control unit 210.
  • the first heater block 141 and the second heater block 142 are arranged with a predetermined gap.
  • the first substrate 10 is disposed on the first heater block 141 and the second heater block 142. Specifically, the first substrate 10 is placed on the heater unit 140 such that the main channel 100 a in the channel 100 straddles the first heater block 141 and the second heater block 142. Thereby, the flow path 100 is comprised so that two temperature areas may reciprocate in multiple cycles.
  • the reaction solution 300 when the reaction solution 300 is introduced from the introduction unit 120, the reaction solution 300 is divided into two temperature regions (the first heater block 141 and the second heater block) in the nucleic acid amplification reaction unit 110. 142) is alternately sent to the discharge unit 130 so as to pass through. That is, a heat cycle can be applied to the reaction solution 300 flowing through the flow path 100.
  • the reaction solution can be sent by the capillary force by the capillary force carrying mechanism of the flow channel 100, the reaction solution can be used without using an external pump such as a syringe pump. Can be advanced into the flow path. Therefore, nucleic acid amplification of the target nucleic acid can be easily performed at low cost.
  • FIG. 6 is a flow cross-sectional view of the method for manufacturing the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • a silicon substrate for example, a silicon wafer having a thickness of, for example, 525 ⁇ m is prepared as the first substrate 10, and a thermal oxide film serving as a hard mask in a subsequent etching process is formed on the entire surface of the silicon substrate.
  • the silicon oxide film 15 is formed with a film thickness of, for example, 650 nm.
  • the silicon oxide film 15 is patterned into a predetermined shape by performing photolithography and etching. Specifically, the portion of the silicon oxide film 15 that becomes the groove 13 (flow path 100) is selectively removed to expose the first substrate 10.
  • the exposed portion of the first substrate 10 is etched using the patterned silicon oxide film 15 as a hard mask, thereby forming a groove 13 having a predetermined depth.
  • the groove 13 can be formed by deep reactive ion etching (DRIE).
  • DRIE deep reactive ion etching
  • the groove 13 can be formed by anisotropic etching using TMAH (Tetra Methyl Ammonium Hydroxide).
  • a silicon oxide film 14 that is a thermal oxide film of about 100 nm is formed on the exposed surface of the first substrate 10.
  • the second substrate 20 which is a glass substrate provided with the first through holes 21 and the second through holes 22, is bonded to the first substrate 10.
  • the flow path 100 having a configuration in which the opening of the groove 13 is sealed with the second substrate 20 is formed.
  • FIG. 7 is a flowchart of the nucleic acid amplification method according to Embodiment 1 of the present invention.
  • 8A to 8C are diagrams showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention, in which FIG. 8A is a plan view, FIG. 8B is a cross-sectional view taken along the line XX ′ of FIG. 8A, and FIG. FIG. 8B is a cross-sectional view taken along line YY ′ of FIG. 8A.
  • the nucleic acid amplification method is a nucleic acid amplification method for amplifying a target nucleic acid using the nucleic acid amplification device 1 described above, and comprises a target nucleic acid as a sample and the target nucleic acid
  • An introduction step step S11 for introducing a reaction reagent for amplifying the reaction into the introduction part 120 of the nucleic acid amplification device 1, and a reaction solution containing the target nucleic acid and the reaction reagent are fed to the reaction solution by capillary force.
  • reaction solution can be fed by capillary force, the reaction solution can be easily fed without using an external pump such as a syringe pump. Therefore, nucleic acid amplification of the target nucleic acid can be performed at low cost.
  • a solution in which a reaction solution containing the target nucleic acid and a reaction reagent are mixed in advance is introduced into the introduction unit 120 of the nucleic acid amplification device 1 as a reaction solution.
  • the reaction solution 300 is injected into the introduction unit 120 using a pipette.
  • the reaction solution introduced into the introduction unit 120 is sent from the introduction unit 120 to the nucleic acid amplification reaction unit 110 through the channel 100 (introduction channel 100c).
  • the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified by giving a periodic temperature change to the reaction solution in the nucleic acid amplification step (step S12).
  • the reaction solution that has reached the nucleic acid amplification reaction unit 110 passes through the main channel 100a and the sub channel 100b so as to reciprocate between the first heater block 141 and the second heater block 142 repeatedly. That is, since the reaction solution is fed while reciprocating between the high temperature region (first heater block 141) and the low temperature region (second heater block 142) of the heater unit 140, heating and cooling are alternately repeated. become. Thereby, the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified by repeating the denaturation reaction in the high temperature region and the annealing / extension reaction in the low temperature region. As described above, since the reaction solution can be raised and lowered while the solution is fed, a very high-speed flow PCR can be realized. Therefore, the target nucleic acid contained in the reaction solution can be amplified at high speed.
  • the reaction solution is sent from the nucleic acid amplification reaction unit 110 to the discharge unit 130 through the discharge channel 100d.
  • the introduction of the solution containing the target nucleic acid (the reaction solution in this embodiment) into the introduction unit 120 is stopped.
  • the reaction solution is filled in the flow path 100. That is, in the present embodiment, the temperature of the reaction solution is changed while the reaction solution is fed by capillary force, and when the reaction solution reaches the discharge unit 130, the reaction of the reaction solution is completed.
  • the reaction solution that has reached the discharge unit 130 is discharged from the discharge unit 130 as needed.
  • the flow channel 100 is a capillary force carrying mechanism for feeding the reaction solution 300 by capillary force (capillary force), and the contact angle ⁇ is an acute angle. It has a wall with a certain hydrophilic surface.
  • silicon oxide films 14 are formed on three wall surfaces on the bottom and both sides of the groove 13 in a cross section perpendicular to the liquid feeding direction of the reaction solution 300. By forming the silicon oxide film 14, the surface of the groove 13 can be made hydrophilic, and the inner wall surface of the flow path 100 can be made a hydrophilic surface.
  • the reaction solution 300 is automatically fed through the flow channel 100 by the capillary force generated at the gas-liquid interface, and thus automatically proceeds in the flow channel 100. That is, the temperature of the reaction solution 300 is periodically changed in the nucleic acid amplification reaction unit 110 while being fed into the channel 100 by automatic conveyance.
  • the reaction solution introduced into the introduction unit 120 automatically proceeds through the introduction channel 100c and is sent to the nucleic acid amplification reaction unit 110.
  • the main channel 100a and the sub channel 100b is automatically advanced to reciprocate between the high temperature region and the low temperature region, and then automatically proceeds through the discharge channel 100d to be fed to the discharge unit 130.
  • a part of the wall surface of the channel 100 may be a hydrophilic surface, but it is preferable that the entire wall surface of the channel 100 in a cross section perpendicular to the liquid feeding direction is a hydrophilic surface.
  • the surface of the groove 13 of the first substrate 10 but also the surface (inner surface) of the second substrate 20 may be a hydrophilic surface.
  • the ratio of the hydrophilic surface of the wall surface in the cross section of the channel 100 is larger, the capillary force with respect to the reaction solution can be increased.
  • the solution delivery using the capillary force is determined by the balance between the capillary force as the driving force and the pressure loss as the resistance component.
  • the pressure loss P d can be expressed by the following (formula 1).
  • Equation 1 Q is the flow rate, ⁇ is the viscosity of the solution, and 1 is the channel length. Further, D h in Equation (1) is a hydraulic diameter which is defined by the following equation (2) is a parameter reflecting the passage size and shape.
  • S is the cross-sectional area of the flow path
  • U is the outer peripheral length of the cross-section of the flow path.
  • Equation 1 can be expressed by the following (Equation 3) by rewriting by introducing the pressure loss coefficient ⁇ using the liquid feeding speed v and the flow path cross-sectional area S.
  • P c / ⁇ is a constant determined by the size and shape of the flow path and the type of solution, and is defined here as a liquid feeding coefficient and used as an index of capillary force liquid feeding characteristics.
  • the liquid feeding speed v by the capillary force Pc is proportional to the liquid feeding coefficient, and is inversely proportional to the flow path length l, that is, the liquid feeding distance.
  • Equation 4 is a differential equation of time t and liquid feeding distance (channel length l)
  • Equation 5 is proportional to the square root of time t.
  • the capillary force Pc can be expressed by adding the interfacial tension at each side constituting the flow path cross section, and can be expressed by the following (formula 6).
  • ⁇ is the surface tension of the solution
  • S is the cross-sectional area of the flow path
  • ⁇ n and ⁇ n are the lengths and contact angles of the sides constituting the cross-section of the flow path, respectively.
  • the capillary force Pc when the cross-sectional shape of the flow path is rectangular is expressed by the following (formula 7).
  • w and d are the width and depth of the flow path, respectively, and ⁇ l , ⁇ r , ⁇ t , and ⁇ b are the left wall surface (left side surface), right wall surface (right side surface), It is a contact angle in an upper wall surface (upper surface) and a lower wall surface (bottom surface).
  • the reaction solution continuously flows through regions having different temperatures and regions having different shapes. Therefore, it is necessary to construct a liquid feeding theory that can handle any temperature and shape.
  • Equation 9 is the same as (Equation 4) except that the denominator on the right side is integral.
  • the inventors of the present application actually evaluated the pressure loss in a channel having a rectangular cross section having a width of 100 ⁇ m and a depth of 50 ⁇ m, and succeeded in actually measuring the temperature dependence of the viscosity largely related to the pressure loss.
  • the inventors of the present application focused on the liquid feeding coefficient P c / ⁇ and obtained the capillary force by actually measuring the liquid feeding coefficient. Specifically, the liquid feeding coefficient of the PCR reagent was measured at 25 ° C., 60 ° C., and 95 ° C. The capillary force was determined from the liquid feeding coefficient and the viscosity determined above.
  • an experiment for obtaining the liquid feeding coefficient and the viscosity will be described.
  • the channel 100 in the nucleic acid amplification device 1 has a width of 100 ⁇ m and a depth of 50 ⁇ m, and 25 ° C. pure water (DW: deionized water) and PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C., and 95 ° C. were used.
  • DW deionized water
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the time for the PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 ° C. and the displacement of the liquid tip. From this experimental result, it is understood that a certain approximate curve (capillary force feeding characteristic) related to the capillary force can be obtained according to the temperature of the reaction solution.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of pressure loss for PCR reagents at 25 ° C., 60 ° C. and 95 ° C. and pure water at 25 ° C.
  • the value of the pressure loss was calculated by the load cell force and the cross-sectional area of the syringe. All pressure losses are proportional to the delivery rate as shown in (Equation 1).
  • the viscosity and capillary force can be obtained from the capillary force feeding characteristics (approximate curve) and pressure loss shown in FIG. Thereby, liquid feeding in nucleic acid amplification can be predicted.
  • the nucleic acid amplification device 1 described above was used as a microfluidic device.
  • the contact angle ⁇ of pure water at 25 ° C. on the surface of the second substrate 20 which is the silicon oxide film (SiO 2 ) 14 formed in the groove 13 and the glass substrate is , Both were 49 °.
  • the temperature of the first heater block 141 is set to 95 ° C.
  • the temperature of the second heater block 142 is set to 60 ° C.
  • the reaction solution flowing through the flow path 100 is alternately cycled between two temperature regions of 95 ° C. and 60 ° C. To pass.
  • FIG. 12 is a diagram showing the relationship between the time and the displacement of the liquid front end for a PCR reagent that is self-delivered in the flow path by capillary force.
  • FIG. 12 shows the results of a rectangular flow path having a width w of 100 ⁇ m and a depth d of 100 ⁇ m, and a rectangular flow path having a width w of 150 ⁇ m and a depth d of 150 ⁇ m.
  • nucleic acid amplification in the case of using ⁇ -actin (beta actin) of human genome, complementary DNA prepared from influenza virus AH1pdm RNA, and 16S rDNA of E. coli genomic DNA as PCR reagents.
  • FIG. 13 shows the results of nucleic acid amplification using these PCR reagents with a self-feeding solution by capillary force.
  • FIG. 13 shows gel electrophoresis images showing standard DNA markers before and after PCR amplification.
  • A), (b), and (c) are human genome ⁇ -actin, influenza virus AH1pdm, and E. coli genomic DNA, respectively. The image about 16SrDNA is shown.
  • ⁇ -actin amplification of human genome is 295 bp
  • influenza virus AH1pdm amplification is 232 bp
  • 16S rDNA amplification of E. coli genomic DNA is 95 bp.
  • the target nucleic acid can be amplified by feeding the reaction solution containing the target nucleic acid by capillary force.
  • FIG. 14 is a diagram showing a configuration of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 1 of the present invention.
  • the nucleic acid amplification apparatus 200 includes the above-described nucleic acid amplification device 1 and a temperature control unit 210 for controlling the temperature of the nucleic acid amplification reaction unit 110 in the nucleic acid amplification device 1. .
  • diffusion amplification can be performed by a simple method.
  • the nucleic acid amplification apparatus 200 in the present embodiment further includes a detection unit 220 for detecting nucleic acid amplification of the target nucleic acid.
  • the detection unit 220 is an optical detection system, and includes a light output unit 221 that outputs light for irradiating the nucleic acid amplification device 1, a light reception unit 222 that receives reflected light of the light irradiated to the nucleic acid amplification device 1, and a nucleic acid. And an optical scanning unit 223 for scanning light on the flow path 100 of the amplification device 1.
  • the light output unit 221 includes a laser element that emits blue light, and outputs laser light having a central wavelength of 488 nm, for example.
  • the light receiving unit 222 is, for example, a photomultiplier tube (PMT).
  • the detection unit 220 includes optical elements such as an excitation cut filter 224 and a dichroic mirror 225.
  • the nucleic acid amplification device 200 is an integrated evaluation system of the heating / cooling system (temperature control unit 210) and the optical detection system (detection unit 220).
  • a simple detection device can be realized by integrating the detection system in this way.
  • the amount of nucleic acid amplified can be detected in a non-contact manner by using an optical detection system.
  • the direction intersecting the main channel 100a of the channel 100 as shown in FIG. The laser beam is scanned and the reflected light is received. Then, the amplification amount of the target nucleic acid in the reaction solution in the channel 100 is calculated based on the received reflected light. Thereby, a nucleic acid amplification curve corresponding to the cycle of the flow path 100 that reciprocates between the first heater block 141 and the second heater block 142 can be acquired.
  • the reaction solution is irradiated with blue laser light, so that green light that is fluorescently emitted with blue light as excitation light returns as reflected light.
  • the amount of fluorescence of this green light (reflected light) varies depending on the amount of nucleic acid amplification. Therefore, the amount of nucleic acid amplification can be calculated by measuring the amount of green light fluorescence.
  • FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the PCR cycle of the reaction solution and the amount of fluorescence (amplification amount).
  • FIG. 16 is a diagram showing the relationship between the concentration of the reaction sample (human genome) and the threshold cycle when starting up.
  • the amount of nucleic acid amplified for each cycle of the flow channel 100 is measured by scanning the surface of the flow channel 100 with laser light. Can be detected as
  • the threshold cycle at startup varies depending on the initial concentration of the reaction sample (human genome). Therefore, if the threshold cycle at the time of rising is defined as a cycle that is, for example, about 10% of the maximum value (saturation value), a calibration curve with very high linearity can be obtained as shown in FIG. The initial concentration can be quantified.
  • FIG. 17A is a plan view of the nucleic acid amplification device according to Embodiment 2 of the present invention
  • FIG. 17B is an enlarged plan view of a mixing unit in the nucleic acid amplification device.
  • the nucleic acid amplification device 2 in the present embodiment has a configuration in which a plurality of introduction parts 120 in the nucleic acid amplification device 1 in the first embodiment are provided.
  • the nucleic acid amplification device 2 includes a first introduction unit 120a and a second introduction unit 120b, and further, between the first introduction unit 120a and the second introduction unit 120b and the nucleic acid amplification reaction unit 110.
  • the mixing unit 150 is provided.
  • the introduction channel 100c in the present embodiment is formed in a Y shape so as to branch to the first introduction part 120a and the second introduction part 120b.
  • the first introduction part 120a and the second introduction part 120b are connected to one in the mixing part 150 through the introduction flow path 100c corresponding to each of the first introduction part 120a and the second introduction part 120b.
  • the mixing unit 150 is a part of the introduction channel 100c, and the mixing unit 150 mixes a plurality of solutions introduced from each of the first introduction unit 120a and the second introduction unit 120b. That is, the mixing unit 150 is a place where the first solution introduced from the first introduction unit 120a and the second solution inserted from the second introduction unit 120b are mixed.
  • a solution containing the target nucleic acid is introduced into the first introduction part 120a as the first solution.
  • a solution containing a reaction reagent is introduced into the second introduction unit 120b as the second solution.
  • the first solution introduced from the first introduction part 120a and the second solution introduced from the second introduction part 120b are mixed by diffusion in the mixing part 150. . Thereby, it can mix with a simple structure.
  • FIG. 18 is a flowchart of the nucleic acid amplification method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • the nucleic acid amplification method according to the present embodiment is a nucleic acid amplification method for amplifying a target nucleic acid using the nucleic acid amplification device 2 described above. Similar to the first embodiment, the target nucleic acid as a sample and the target An introduction step of introducing a reaction reagent for amplifying a nucleic acid into the introduction part 120 of the nucleic acid amplification device 2, and a target contained in the reaction solution while feeding the reaction solution containing the target nucleic acid and the reaction reagent by capillary force A nucleic acid amplification step for amplifying the nucleic acid.
  • the solution containing the target nucleic acid (first solution) and the solution containing the reaction reagent (second solution) are separately introduced into the nucleic acid amplification device 2, and in the nucleic acid amplification step, the target A solution containing the nucleic acid (first solution) and a solution containing the reaction reagent (second solution) are mixed in the nucleic acid amplification device 2 to obtain a reaction solution, and the reaction solution is periodically fed to the reaction solution by capillary force.
  • the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified by giving a typical temperature change.
  • a solution containing the target nucleic acid as the first solution is introduced into the first introduction part 120a, and a solution containing the reaction reagent as the second solution is introduced into the second introduction part 120b. Introduce (step S21).
  • the first solution and the second solution separately introduced into the first introduction part 120a and the second introduction part 120b are mixed in the mixing part 150 through the separate introduction flow paths 100c to become a reaction solution, and the nucleic acid amplification reaction part As in Embodiment 1, the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified by giving a periodic temperature change to the reaction solution (step S22).
  • reaction solution is sent from the nucleic acid amplification reaction unit 110 to the discharge unit 130 through the discharge channel 100d and discharged from the discharge unit 130.
  • the reaction solution can be fed by capillary force as in the first embodiment, the reaction solution can be placed in the flow path without using an external pump. Can be advanced. Therefore, nucleic acid amplification of the target nucleic acid can be easily performed at low cost.
  • nucleic acid amplification of the target nucleic acid can be performed more simply.
  • FIG. 19 is an enlarged plan view of a mixing unit in the nucleic acid amplification device according to Modification 1 of Embodiment 2 of the present invention.
  • the first solution and the second solution introduced from the first introduction unit 120a and the second introduction unit 120b are mixed by the spiral flow in the mixing unit 150.
  • The for example, by cutting a thread groove on the inner wall of the flow channel 100, the first solution and the second solution are mixed in a spiral flow.
  • FIG. 20 is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Modification 2 of Embodiment 2 of the present invention.
  • the flow path (mixing section flow path) 100 in the mixing section 150 is a meandering flow path.
  • the distance necessary for diffusing and mixing a plurality of solutions can be increased. Therefore, even when a plurality of solutions are mixed on the device to prepare a reaction solution, the nucleic acid amplification reaction unit 110 can be reached. It becomes possible to mix evenly.
  • FIG. 21 is a plan view of a nucleic acid amplification device according to Modification 3 of Embodiment 2 of the present invention.
  • the flow path (mixing section flow path) 100 in the mixing section 150 is an annular flow path. Specifically, a plurality of C-shaped annular channels are connected while being alternately inverted.
  • This configuration makes it possible to easily generate a spiral flow, so that a plurality of solutions can be easily and uniformly mixed.
  • FIG. 22 is an enlarged plan view of a mixing unit in a nucleic acid amplification device according to Modification 4 of Embodiment 2 of the present invention.
  • the flow path (mixing section flow path) 100 in the mixing section 150 has a portion with a partially small cross-sectional area.
  • the channel cross-sectional area can be partially reduced by narrowing the width of a part of the channel in the mixing unit 150.
  • This configuration allows a plurality of solutions to be mixed in a short time at a location where the cross-sectional area is small, so that the distance for diffusing the plurality of solutions can be shortened. Thereby, a small nucleic acid amplification device can be realized.
  • FIG. 23 is an enlarged plan view showing a flow path of the nucleic acid amplification device according to the first modification of the present invention.
  • At least the flow path 100 in the nucleic acid amplification reaction unit 110 includes a region where the cross-sectional area decreases along the liquid feeding direction. With this configuration, the liquid feeding speed of the reaction solution 300 can be made constant.
  • the channel 100 has a tapered structure in which the depth is constant and the width gradually decreases so that the cross-sectional area of the channel 100 decreases monotonously.
  • the channel 100 may have a taper structure in which the width is constant and the depth gradually decreases.
  • the flow channel 100 by making the depth of the flow channel 100 constant, the flow channel 100 can be easily manufactured collectively by etching or the like. Furthermore, by making the depth of the flow path 100 constant, the optical path length of the measurement light can be kept constant when performing optical measurement by scanning the laser light from above the flow path 100 as described above. Thereby, measurement accuracy can be improved. For example, the amount of nucleic acid amplification can be calculated with high accuracy.
  • FIG. 24 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 2 of the present invention.
  • At least the flow path 100 in the nucleic acid amplification reaction unit 110 includes a region where the cross-sectional area decreases along the liquid feeding direction. Thereby, the liquid feeding speed of the reaction solution can be made constant.
  • This modification is different from Modification 1 in that the flow path 100 in the region where the cross-sectional area decreases is constituted by a plurality of meandering main flow paths 100a, and the cross-sectional area of the main flow path 100a is It is the point which decreases for every line along a liquid feeding direction.
  • the cross-sectional area of the flow channel 100 is reduced by narrowing the main flow channel 100a for each line along the liquid feeding direction (narrowing the width). Note that the width and depth of the main channel 100a in each line are constant.
  • This configuration makes it possible to make the flow channel 100 linear, so that the design and production of the flow channel 100 are easier than in the first modification.
  • the flow channel 100 can be easily manufactured collectively by etching or the like, and optical measurement is performed by scanning laser light from above the flow channel 100. At this time, since the optical path length of the measurement light can be kept constant, the measurement accuracy can be improved.
  • FIG. 25 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 3 of the present invention.
  • At least the flow path 100 in the nucleic acid amplification reaction unit 110 includes a region where the cross-sectional area decreases along the liquid feeding direction. Thereby, the liquid feeding speed of the reaction solution can be made constant.
  • This modification is different from Modification 1 in that the cross-sectional area of the flow channel 100 in the region where the cross-sectional area decreases is adjusted by a pillar 160 provided in the flow channel 100 as shown in FIG. is there.
  • the cross-sectional area of the flow channel 100 can be partially reduced along the liquid feeding direction.
  • the liquid feeding speed of the reaction solution can be adjusted. Further, by providing the pillar 160, the diffusibility of the sample and the reagent in the reaction solution can be improved.
  • FIG. 26 is an enlarged plan view showing the flow path of the nucleic acid amplification device according to Modification 4 of the present invention.
  • a part of the flow channel 100 is branched. Specifically, as shown in FIG. 26, the tip of the flow path 100 having a tapered structure is branched into three.
  • nucleic acid amplification device and the nucleic acid amplification method according to the present invention have been described based on the embodiments and modifications, the present invention is not limited to the above embodiments and modifications.
  • the flow PCR in the nucleic acid amplification reaction unit 110 is the meandering flow channel, and the flow PCR is used to repeatedly change the temperature of the reaction solution containing the target nucleic acid. It is good also as PCR which repeatedly gives a temperature change to the reaction solution containing.
  • PCR can be carried out more efficiently by using the flow as in the above embodiment.
  • the flow path 100 is a meandering flow path, but is not limited thereto.
  • a plurality of high-temperature regions (95 ° C.) and a plurality of low-temperature regions (60 ° C.) are alternately arranged in a line, and a substrate on which a linear flow path is formed is arranged on the substrate, thereby allowing flow.
  • You may comprise so that a path may pass through a high temperature field and a low temperature field by turns.
  • the heater unit 140 has two temperature regions, but may have three or more temperature regions having different temperatures.
  • the flow path should just be comprised so that the reaction solution may periodically pass through the several temperature area
  • each temperature in the plurality of temperature regions is set by the heater block.
  • the temperature may be set by using another temperature control member such as a Peltier element.
  • Nucleic acid amplification device 10 First substrate 11 First recess 12 Second recess 13 Groove 14, 15 Silicon oxide film 20 Second substrate 21 First through hole 22 Second through hole 100 Flow Path 100a Main flow path 100b Sub flow path 100c Introduction flow path 100d Discharge flow path 110 Nucleic acid amplification reaction section 120 Introduction section 120a First introduction section 120b Second introduction section 130 Discharge section 140 Heater section 141 First heater block 142 Second heater block DESCRIPTION OF SYMBOLS 150 Mixing part 160 Pillar 200 Nucleic acid amplifier 210 Temperature control part 220 Detection part 221 Light output part 222 Light receiving part 223 Optical scanning part 224 Excitation cut filter 225 Dichroic mirror 300 Reaction solution

Abstract

　核酸増幅デバイス（１）は、標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部（１２０）と、導入部（１２０）に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部（１１０）と、少なくとも核酸増幅反応部（１１０）に設けられ、かつ、反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路（１００）とを備え、核酸増幅反応部（１１０）では、反応溶液が毛管力により送液されながら反応溶液に含まれる前記標的核酸が増幅する。

Description

核酸増幅デバイス、核酸増幅装置及び核酸増幅方法
　本発明は、核酸増幅デバイス、これを用いた核酸増幅装置及び核酸増幅方法に関する。
　核酸増幅デバイスは、試料である標的核酸を増幅させるためのデバイスであり、例えば、標的核酸を含む反応溶液（反応流体）に所望の温度変化を繰り返し与えることによって標的核酸を増幅させる。
　また、反応溶液に与える温度変化を高速にする方法として、マイクロ流体デバイスを用いることが知られている。マイクロ流体デバイスは、極めて少量の試料や試薬を含む反応溶液を反応させることが可能なデバイスであり、微小反応デバイス（マイクロリアクタ）や集積型ＤＮＡデバイス、微小電気泳動デバイス等がある。
　例えば、特許文献１及び非特許文献１には、デバイスを複数の異なる温度領域に分割しておき、反応溶液が各温度領域を繰り返して通過するように蛇行した流路（蛇行流路）を設けることが開示されている。この構成により、流路内の反応溶液に与える温度変化を高速化できるので、反応溶液として核酸を含む溶液を用いた場合に、高速に核酸増幅を行うことができる。
特開２００２－１８２７１号公報
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８２，ｐｐ．４８４（１９９８）
　しかしながら、上記従来のマイクロ流体デバイスでは、反応溶液を流路内に進行させるためにシリンジポンプ等の外部ポンプを用いる必要がある。外部ポンプを用いると、ポンプと流路とをつなぎこむための手作業が生じたり、システムが大型化したり、コスト高になったりするという課題がある。
　本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる核酸増幅デバイス等を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様は、標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部と、前記導入部に導入された前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、少なくとも前記核酸増幅反応部に設けられ、かつ、前記反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路とを備え、前記核酸増幅反応部では、前記反応溶液が毛管力により送液されながら前記反応溶液に含まれる前記標的核酸が増幅することを特徴とする。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、さらに、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、前記流路は、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における壁面全周が閉じられており、かつ、前記導入部及び前記排出部においてのみ外部空間と繋がっていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路は、前記毛管力運搬機構として、接触角が鋭角である親水性表面の壁面を有していてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における前記流路の壁面全周が親水性表面であってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記核酸増幅反応部には、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在していてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路は、前記２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記２つ以上の温度領域における各温度領域の温度は、ヒータによって設定されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記導入部は、複数設けられており、さらに、前記複数の導入部と前記核酸増幅反応部との間に設けられた混合部を備え、前記複数の導入部の各々は、前記複数の導入部の各々に対応する導入流路を通じて前記混合部において１つに接続されており、前記混合部では、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液が混合されて前記反応溶液となってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液は、前記混合部において拡散により混合されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路は、蛇行流路であってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路には、断面積が部分的に小さい箇所が存在していてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液は、前記混合部において螺旋流により混合されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記混合部における流路は、環状流路であってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、少なくとも前記核酸増幅反応部における前記流路には、前記送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路は、先細りテーパ構造であってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路は、蛇行する複数のラインからなり、前記断面積が減少する領域における前記流路の断面積は、前記送液方向に沿って前記ラインごとに減少していてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域における前記流路の断面積は、前記流路内に設けられたピラーにより調整されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記流路の一部が分岐されていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅デバイスの一態様において、前記断面積が減少する領域において、前記流路の深さは一定であってもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様は、上記いずれかに記載の核酸増幅デバイスを備える核酸増幅装置であって、前記核酸増幅反応部の温度を制御するための温度制御部を備えることを特徴とする。
　また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、さらに、前記標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部を備えていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、前記検出部は、前記核酸増幅デバイスに照射するための光を出力する光出力部と、前記核酸増幅デバイスに照射した前記光の反射光を受光する受光部とを備えていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅装置の一態様において、前記検出部は、さらに、前記光を前記核酸増幅デバイスの前記流路上を走査するための光学走査部を備えていてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様は、核酸増幅デバイスを用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、前記標的核酸と前記標的核酸を増幅させるための反応試薬とを前記核酸増幅デバイスに導入する導入ステップと、前記標的核酸と前記反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含むことを特徴とする。
　また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む溶液と前記反応試薬とを予め混合した溶液を前記反応溶液として前記核酸増幅デバイスに導入してもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む第１溶液と前記反応試薬を含む第２溶液とを前記核酸増幅デバイスに別々に導入し、核酸増幅ステップでは、前記第１溶液と前記第２溶液とを前記核酸増幅デバイスにおいて混合した溶液を前記反応溶液として毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記核酸増幅ステップでは、前記反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させてもよい。
　また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様において、前記核酸増幅デバイスは、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、前記毛管力によって送液される前記反応溶液の先端が前記排出部に到達したときに、標的核酸を含む溶液の前記導入部への導入を停止してもよい。
　本発明によれば、ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。
図１は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図である。 図２は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの分解斜視図である。 図３は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図４は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの断面図である。 図５は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスにおける温度サイクルを説明するための図である。 図６は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの製造方法のフロー断面図である。 図７は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法のフローチャートである。 図８Ａは、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の構成を示す平面図である。 図８Ｂは、図８ＡのＸ－Ｘ’における本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の断面図である。 図８Ｃは、図８ＡのＹ－Ｙ’における本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路の断面図である。 図９は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての時間と液先端の変位との関係を示す図である。 図１０は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての圧力損失の結果を示す図である。 図１１は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とに関して算出した粘度とキャピラリ力との値を示す表である。 図１２は、キャピラリ力で流路内を自送液するＰＣＲ試薬についての時間と液先端の変位との関係を示す図である。 図１３は、ＰＣＲ増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示す図である。 図１４は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。 図１５は、反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。 図１６は、反応試料（ヒトゲノム）の濃度と立ち上げる時のしきいサイクルとの関係を示す図である。 図１７Ａは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図１７Ｂは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図１８は、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法のフローチャートである。 図１９は、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図２０は、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図２１は、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイスの平面図である。 図２２は、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。 図２３は、本発明の変形例１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図２４は、本発明の変形例２に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図２５は、本発明の変形例３に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。 図２６は、本発明の変形例４に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。
　（実施の形態１）
　まず、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイス１の構成について、図１～図４を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図であり、図２は、同核酸増幅デバイスの分解斜視図であり、図３は、同核酸増幅デバイスの平面図であり、図４は、同核酸増幅デバイスの断面図である。
　図１～図４に示すように、本実施の形態に係る核酸増幅デバイス１は、試料となる標的核酸を増幅させるためのデバイス（デバイスチップ）であって、少なくとも標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部（インレット）１２０と、導入部１２０に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部１１０と、核酸増幅反応部１１０で増幅された標的核酸を含む反応溶液を排出するための排出部（ドレイン）１３０と、標的核酸を含む反応溶液を加熱するためのヒータ部１４０とを備える。
　核酸増幅反応部１１０は、さらに、導入された反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路１００を有する。流路１００は、反応溶液が一方通行的に流れる反応流路であって、少なくとも核酸増幅反応部１１０を通るように設けられている。
　核酸増幅反応部１１０では、反応溶液が流路１００内を毛管力により送液されながら反応溶液に含まれる標的核酸が増幅する。反応溶液は、少なくとも試料となる標的核酸を含む溶液であり、本実施の形態では、標的核酸と標的核酸を増幅させるための反応試薬とを含む水溶液である。なお、反応溶液には、ある種のアルコールや界面活性剤等が含まれていてもよい。
　本実施の形態では、核酸増幅デバイス１を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を実施する場合について説明する。ＰＣＲ法は、ターゲットＤＮＡを温度サイクルにより増幅させる技術である。反応溶液（反応流体）には、ターゲットＤＮＡの他に、ＰＣＲプライマやポリメラーゼ酵素、バッファー等が含まれている。このような反応溶液に温度サイクルを付与することで、ターゲットＤＮＡを増幅することができる。増幅したＤＮＡの増幅量は、反応検出機構によって検出することができる。
　具体的には、核酸増幅デバイス１は、第１基板１０と、第２基板２０と、ヒータ部１４０とによって構成されている。また、ヒータ部１４０は、設定温度が異なる第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを備える。
　本実施の形態における核酸増幅デバイス１は、マイクロ流路（流路１００）を有するマイクロ流体デバイスである。核酸増幅デバイス１の外形は、例えば縦の長さが４０ｍｍで横の長さが２０ｍｍの略矩形状である。
　以下、核酸増幅デバイス１の各構成部材の詳細構成について、図１～図４を用いて詳述する。
　［第１基板］
　図２に示すように、第１基板１０は、導入部１２０の一部を構成する第１凹部１１と、排出部１３０の一部を構成する第２凹部１２と、流路１００を構成する溝部１３とを備える。第１基板１０としては、例えばシリコン基板を用いることができる。
　溝部１３（流路１００）は、第１凹部１１と第２凹部１２とをつなぐように形成されている。溝部１３（流路１００）には反応溶液が流れる。具体的には、第１凹部１１（導入部１２０）に反応溶液が導入されると、当該反応溶液は、第２凹部１２（排出部１３０）に向かって溝部１３（流路１００）内を進行する。
　図３に示すように、流路１００は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第１ヒータブロック１４１（第１温度領域）と第２ヒータブロック１４２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。
　具体的に、核酸増幅反応部１１０における流路１００は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。核酸増幅反応部１１０における流路１００の折り返し回数は、例えば２０～７０サイクル程度である。一例として、１サイクルあたりの流路１００（主流路１００ａ）の長さは３２ｍｍとすることができる。
　本実施の形態における流路１００は、所定長さのライン状の複数の主流路１００ａと、対向する各行の主流路１００ａの端部同士を接続する副流路１００ｂとを有する。主流路１００ａ及び副流路１００ｂは、核酸増幅反応部１１０に設けられる。
　主流路１００ａは、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐように、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略直交させて設けられている。副流路１００ｂは、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略平行するように設けられている。
　なお、流路１００は、さらに、反応溶液を導入部１２０から核酸増幅反応部１１０に導くための流路である導入流路１００ｃと、反応溶液を核酸増幅反応部１１０から排出部１３０までに導くための排出流路１００ｄとを有する。
　導入流路１００ｃの始端は、流路１００全体としての入口であり、導入流路１００ｃの終端は、核酸増幅反応部における流路１００の入り口である。また、排出流路１００ｄの始端は、核酸増幅反応部における流路１００の出口であり、排出流路１００ｄの終端は、流路１００全体としての出口である。
　図４に示すように、流路１００を構成する溝部１３の内表面には、シリコン酸化膜１４が形成されている。シリコン酸化膜を形成することによって、流路１００（溝部１３）の壁面を親水化することができる。本実施の形態では、主流路１００ａ、副流路１００ｂ、導入流路１００ｃ及び排出流路１００ｄの全てに、毛管力運搬機構としてシリコン酸化膜１４が形成されている。
　このように構成される流路１００はマイクロ流路であり、例えば断面形状は矩形状である。この場合、流路１００を構成する溝部１３の流路幅（溝幅）は、例えば２０～３００μｍ程度であり、溝部１３の深さは５０～１５０μｍ程度である。
　なお、溝部１３の断面形状は、矩形に限らず、半円形又は逆三角形とすることができる。また、第１凹部１１及び第２凹部１２は、例えば円形開口の凹部とすることができる。また、第１基板１０の材料はシリコンに限らず、樹脂又はガラスであってもよい。
　［第２基板］
　図１に示すように、第２基板２０は、第１基板１０を覆う蓋部であり、第１基板１０上に配置される。第２基板２０としては、例えばガラス基板を用いることができる。
　図２に示すように、第２基板２０には、導入部１２０の一部として、第２基板２０を貫通する第１貫通孔２１が設けられている。また、第２基板２０には、排出部１３０の一部として、第２基板２０を貫通する第２貫通孔２２が設けられている。第１貫通孔２１及び第２貫通孔２２は、例えば円形開口を有する貫通孔である。
　図４に示すように、第１基板１０上に第２基板２０を載置することによって、溝部１３の開口部分が塞がれて全方位が密閉された流路１００が構成される。これにより、流路１００は、反応溶液の送液方向（進行方向）に垂直な断面における壁面全周が閉じられた構成となり、かつ、導入部１２０及び排出部１３０においてのみ外部空間と繋がる構成となる。このように、流路１００の全方位を閉じることによって、流路１００における毛管力を増強させることができるとともに、送液中に反応溶液が揮発することを抑制できる。
　なお、第２基板２０の材料はガラスに限らず、樹脂又はシリコンであってもよい。
　［ヒータ部］
　図１～図３に示すように、ヒータ部１４０は少なくとも核酸増幅反応部１１０に配置されており、核酸増幅反応部１１０の流路１００に送液される反応溶液は、ヒータ部１４０によって所定の温度が付与される。
　本実施の形態において、核酸増幅反応部１１０には、ヒータ部１４０として、所定の異なる温度に設定された第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２が配置される。つまり、核酸増幅反応部１１０には、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の２つのヒータブロックによって所定の異なる温度に設定された２つの温度領域が存在する。
　なお、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２は、例えば直方体のアルミニウムやステンレス等の金属からなる金属ブロックを用いたヒータである。ヒータ部１４０としては、ヒータブロック以外に、ガラス基板上に金属薄膜を印刷等により形成した金属薄膜ヒータ等を用いることもできる。
　第１温度に設定された第１ヒータブロック１４１が配置された領域は、第１温度領域である。また、第２温度に設定された第２ヒータブロック１４２が配置された領域は、第１温度領域とは異なる温度領域である第２温度領域である。
　本実施の形態では、第１ヒータブロック１４１の温度が第２ヒータブロック１４２の温度よりも高くなるように設定されている。つまり、第１ヒータブロック１４１が配置された領域は高温領域であり、第２ヒータブロック１４２が配置された領域は低温領域である。
　高温領域である第１ヒータブロック１４１の温度は、例えば９３℃～９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。一方、低温領域である第２ヒータブロック１４２の温度は、例えば５０℃～７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。
　図３に示すように、ヒータ部１４０は温度制御部２１０に接続されている。これにより、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の各温度は、温度制御部２１０によって制御することができる。
　第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２は所定の隙間をあけて並べられている。第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の上には第１基板１０が配置される。具体的には、流路１００における主流路１００ａが第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐようにして第１基板１０がヒータ部１４０に載置される。これにより、流路１００は、２つの温度領域を複数サイクルで往復するように構成される。
　この構成により、図５に示すように、導入部１２０から反応溶液３００を導入したときに、反応溶液３００は、核酸増幅反応部１１０における２つの温度領域（第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２）を交互に繰り返して通過するように排出部１３０に送液される。つまり、流路１００を流れる反応溶液３００に対してヒートサイクルを付与することができる。
　以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス１によれば、流路１００の毛管力運搬機構による毛管力によって反応溶液を送液することができるので、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。したがって、標的核酸の核酸増幅を低コストかつ簡便に行うことができる。
　［核酸増幅デバイスの製造方法］
　次に、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイス１の製造方法について、図６を用いて説明する。図６は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの製造方法のフロー断面図である。
　図６（ａ）に示すように、第１基板１０として例えば厚み５２５μｍのシリコン基板（例えばシリコンウェハ）を用意し、このシリコン基板の全面に、後のエッチング工程においてハードマスクとなる熱酸化膜としてシリコン酸化膜１５を例えば６５０ｎｍの膜厚で形成する。
　次に、図６（ｂ）に示すように、フォトリソグラフィ及びエッチングを行うことにより、シリコン酸化膜１５を所定形状にパターニングする。具体的には、溝部１３（流路１００）となる部分のシリコン酸化膜１５を選択的に除去して第１基板１０を露出させる。
　次に、図６（ｃ）に示すように、パターニングされたシリコン酸化膜１５をハードマスクとして第１基板１０の露出させた部分をエッチングすることによって、所定の深さの溝部１３を形成する。
　このとき、溝部１３の断面形状を矩形又は半円形とする場合は、深堀り反応性イオンエッチング（Ｄｅｅｐ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｉｏｎ　Ｅｔｃｈｉｎｇ；ＤＲＩＥ）により溝部１３を形成することができる。また、溝部１３の断面形状を逆三角とする場合は、ＴＭＡＨ（Ｔｅｔｒａ　Ｍｅｔｈｙｌ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を用いた異方性エッチングにより溝部１３を形成することができる。
　次に、フッ酸によるウェットエッチングによってハードマスクのシリコン酸化膜１５を除去した後（つまり、第１基板１０の表面のシリコン酸化膜を一旦全て除去した後）、図６（ｄ）に示すように、溝部１３（流路１００）の表面を親水化するために、第１基板１０の露出面に１００ｎｍ程度の熱酸化膜であるシリコン酸化膜１４を形成する。
　最後に、図６（ｅ）に示すように、第１貫通孔２１及び第２貫通孔２２が設けられたガラス基板である第２基板２０を、第１基板１０に接合する。これにより、溝部１３の開口部分が第２基板２０で封止された構成の流路１００が形成される。
　［核酸増幅方法と核酸増幅デバイスの特徴構成］
　次に、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法と核酸増幅デバイスの特徴構成について、図１～図５を参照しながら、図７及び図８Ａ～図８Ｃを用いて説明する。図７は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅方法のフローチャートである。図８Ａ～図８Ｃは、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す図であり、図８Ａは平面図、図８Ｂは図８ＡのＸ－Ｘ’における断面図、図８Ｃは図８ＡのＹ－Ｙ’における断面図である。
　図７に示すように、本実施の形態に係る核酸増幅方法は、上記の核酸増幅デバイス１を用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス１の導入部１２０に導入する導入ステップ（ステップＳ１１）と、標的核酸と反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップ（ステップＳ１２）とを含む。
　これにより、反応溶液を毛管力により送液することができるので、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく、簡便に反応溶液を送液することができる。したがって、低コストで標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
　また、本実施の形態では、上記導入ステップ（ステップＳ１１）において、標的核酸を含む反応溶液と反応試薬とを予め混合しておいた溶液を反応溶液として核酸増幅デバイス１の導入部１２０に導入している。例えば、図４に示すように、ピペットを用いて反応溶液３００を導入部１２０に注入する。
　導入部１２０に導入された反応溶液は、流路１００（導入流路１００ｃ）を通って導入部１２０から核酸増幅反応部１１０に送液される。
　また、本実施の形態では、上記核酸増幅ステップ（ステップＳ１２）において、反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させている。
　具体的には、核酸増幅反応部１１０に到達した反応溶液は、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを繰り返して往復するように主流路１００ａ及び副流路１００ｂを通ることになる。つまり、反応溶液は、ヒータ部１４０の高温領域（第１ヒータブロック１４１）と低温領域（第２ヒータブロック１４２）とを往復しながら送液されるので、加熱と冷却とが交互に繰り返されることになる。これにより、反応溶液に含まれる標的核酸は、高温領域での変性反応と低温領域でのアニール・伸長反応との繰り返しにより増幅する。このように、送液しながら反応溶液を昇降温させることができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。
　その後、反応溶液は、排出流路１００ｄを通って核酸増幅反応部１１０から排出部１３０へと送液される。本実施の形態では、導入部１２０に導入された反応溶液の先端が排出部１３０に到達したときに、標的核酸を含む溶液（本実施形態では反応溶液）の導入部１２０への導入を停止させており、このときに流路１００内に反応溶液が充填されることになる。つまり、本実施の形態では、反応溶液を毛管力によって送液しながら反応溶液に温度変化を与えており、反応溶液が排出部１３０に到達すると、反応溶液の反応が終了する。なお、排出部１３０に到達した反応溶液は排出部１３０から随時排出される。
　このようにして反応溶液は流路１００内を進行する。このとき、本実施の形態では、図８Ａ～図８Ｃに示すように、流路１００は、反応溶液３００を毛管力（キャピラリ力）により送液する毛管力運搬機構として、接触角θが鋭角である親水性表面の壁面を有する。具体的には、図８Ｃに示すように、反応溶液３００の送液方向に垂直な断面における溝部１３の底部及び両側部の３つの壁面にシリコン酸化膜１４が形成されている。シリコン酸化膜１４を形成することによって溝部１３の表面を親水化することができ、流路１００の内壁面を親水性表面とすることができる。
　これにより、反応溶液３００は、気液界面に生じる毛管力によって流路１００内を自送液（Ｓｅｌｆ－ｐｒｏｐｅｌｌｅｄ　ｆｌｏｗ）されるので、流路１００内の自動的に進行する。つまり、反応溶液３００は、自動搬送によって流路１００内に送液されながら核酸増幅反応部１１０において周期的な温度変化が与えられる。
　具体的には、導入部１２０に導入された反応溶液は、導入流路１００ｃを自動的に進行して核酸増幅反応部１１０に送液され、核酸増幅反応部１１０において主流路１００ａ及び副流路１００ｂを自動的に進行して高温領域と低温領域とを往復し、その後、排出流路１００ｄを自動的に進行して排出部１３０に送液される。
　なお、流路１００の壁面の一部が親水性表面であればよいが、送液方向に垂直な断面における流路１００の壁面全周が親水性表面である方がよい。この場合、第１基板１０の溝部１３の表面だけでなく、第２基板２０の表面（内面）も親水性表面にすればよい。流路１００の断面における壁面の親水性表面の割合が大きいほど、反応溶液に対する毛管力を大きくすることができる。
　ここで、本実施の形態における核酸増幅デバイス１の流路１００について、好ましい流路サイズ、溶液粘性及び毛管力（キャピラリ力）について詳細に説明する。
　まず、流路１００におけるキャピラリ力を用いた送液の理論について説明する。
　キャピラリ力を用いた溶液の送液は、駆動力であるキャピラリ力と、抵抗成分である圧力損失とのつりあいにより決定される。ここで、圧力損失Ｐｄは、以下の（式１）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　（式１）において、Ｑは流量、ηは溶液の粘性、ｌは流路長である。また、（式１）におけるＤｈは、以下の（式２）で定義される水力直径であり、流路サイズや形状を反映するパラメータである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　（式２）において、Ｓは流路断面積であり、Ｕは流路断面の外周長である。
　（式１）を、送液速度ｖ及び流路断面積Ｓを用いて、さらに圧力損失係数αを導入して書き換えると、以下の（式３）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　この（式３）は、ある流路に溶液を送液した場合、その圧力損失Ｐｄは、流路長ｌ及び送液速度ｖに比例することを表している。
　ここで、圧力損失Ｐｄを示す式（３）とキャピラリ力Ｐｃとの力のつりあい（Ｐｄ＝Ｐｃ）より、キャピラリ力Ｐｃによる送液速度ｖは、以下の（式４）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　（式４）において、Ｐｃ／αは、流路のサイズや形状及び溶液種により決まる定数であり、ここで送液係数と定義して、キャピラリ力送液特性の指標として用いる。
　キャピラリ力Ｐｃによる送液速度ｖは、この送液係数を比例定数とし、流路長ｌ、つまり送液距離に反比例することになる。
　また、（式４）は、時間ｔと送液距離（流路長ｌ）の微分方程式であるので、これを解くことにより、時間ｔに対する送液距離ｌは、以下の（式５）で表され、時間ｔの平方根に比例することになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　この送液特性を決定づける（式５）において、圧力損失係数αは、非常に大きな意味を持つパラメータである。
　ここで、キャピラリ力Ｐｃについて詳述する。キャピラリ力Ｐｃは、流路断面を構成する各辺における界面張力の足し合わせにより表現ですることができ、以下の（式６）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　（式６）において、σは溶液の表面張力、Ｓは流路断面積、αｎ及びθｎはそれぞれ、流路断面を構成する辺の長さ及び接触角である。例えば、流路の断面形状が矩形である場合のキャピラリ力Ｐｃは、以下の（式７）となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　ここで、ｗ及びｄは、それぞれ流路の幅及び深さであり、θｌ、θｒ、θｔ、θｂは、それぞれ流路の左側壁面（左側面）、右側壁面（右側面）、上側壁面（上面）、下側壁面（底面）における接触角である。
　本実施の形態における核酸増幅デバイス１のように、フローＰＣＲによる流路の場合、反応溶液が、温度の異なる領域及び形状の異なる領域を連続的に流れる。そのため、任意の温度や形状に対応できる送液理論を構築する必要がある。
　そこで、溶液（流体）が、ある流路をキャピラリ力Ｐｃによって送液されるとし、液先端がｘ＝ｌの地点にある場合を考える。キャピラリ力Ｐｃは、送液される溶液の液先端のみが関与するので（式６）により表され、ｘ＝ｌにおける流路形状や温度により決定される。
　一方の圧力損失Ｐｄは、ｘ＝０の地点からからｘ＝ｌまでの地点の全ての領域が関与するので、（式３）を拡張し、以下の（式８）として考える必要がある。（式８）において、圧力損失係数αは、任意の地点ｘにおける温度や形状により決まる定数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　ここで、圧力損失Ｐｄを示す（式８）とキャピラリ力Ｐｃとの力のつりあい（Ｐｄ＝Ｐｃ）より、フローＰＣＲによる流路における送液速度ｖは、以下の（式９）により決定されると考えることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　この（式９）は、右辺の分母が積分になっていることを除けば、（式４）と同じである。
　以上により、（式９）よって送液速度ｖ（流速）を求めるためには、キャピラリ力Ｐｃ及び圧力損失係数αの形状・温度依存性が重要となる。
　まず、圧力損失係数αの形状依存性及び温度依存性について見当する。
　圧力損失Ｐｄは、上記のとおり（式３）で表されるので、圧力損失係数αは、以下の（式１０）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　形状の因子は、Ｓ及びＤｈに集約されているので、圧力損失係数αが形状に依存することが明らかである。
　一方、圧力損失係数αの温度依存性は、（式１０）の粘性ηの温度依存性そのものであり、表面張力や接触角がキーパラメータであるが、これまで、ＰＣＲ試薬における粘性の温度依存性については不明であった。
　そこで、本願発明者らは、断面形状が幅１００μｍで深さ５０μｍの矩形である流路における圧力損失を実際に評価して、圧力損失に大きく関わる粘性の温度依存性の実測に成功した。また、本願発明者らは、送液係数Ｐｃ／αに着目し、送液係数を実測することによりキャピラリ力を求めた。具体的には、ＰＣＲ試薬の送液係数を２５℃、６０℃、９５℃で実測した。この送液係数と上記で求めた粘性とからキャピラリ力を求めた。以下、送液係数と粘性を求める実験について説明する。
　これらのデータと（式６）及び（式１０）を用いることによって、任意の流路における送液特性を設計することができる。
　まず、流路における毛管力送液特性についての実験を行ったので、その実験について説明する。
　この実験では、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬における粘性及びキャピラリ力を得るために、キャピラリ力による送液（つまり、時間と圧力損失に関するマイクロ流路の液先端の変位）を測定した。なお、核酸増幅デバイス１における流路１００は、幅１００μｍで深さ５０μｍであり、２５℃の純水（ＤＷ：ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ　ｗａｔｅｒ）と、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬を用いた。
　この実験結果を図９に示す。図９は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての時間と液先端の変位との関係を示す図である。この実験結果により、反応溶液の温度に応じて、キャピラリ力に関する一定の近似曲線（毛管力送液特性）が得られることが分かる。
　次に、流路における圧力損失評価についての実験を行ったので、その実験について説明する。
　キャピラリ力による送液では、流路による圧力損失は、送液速度を決定する主要因のうちの１つである。図１０は、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とについての圧力損失の結果を示す図である。なお、圧力損失の値は、ロードセル力及びシリンジの断面積によって算出した。全ての圧力損失は、（式１）の中で示されるような送液速度に比例する。
　図１０に示されるように、送液速度に対する圧力の割合（傾き＝圧力／送液速度）によってＰＣＲ試薬の粘度を算出することができる。
　これらの実験結果を踏まえると、図９に示す毛管力送液特性（近似曲線）と圧力損失とにより、粘度とキャピラリ力を求めることができる。これにより、核酸増幅における送液を予測することができる。
　以上の実験より、図１１に示すように、２５℃、６０℃及び９５℃のＰＣＲ試薬と２５℃の純水とに関して、粘度（粘性）とキャピラリ力とを算出した。この場合、２５℃の純水の粘度は、η＝０．０００８９Ｐａ・ｓであることが広く知られているので、今回の実験による２５℃の純水の粘度の値がη＝０．０００９９Ｐａ・ｓであることを考えると、今回の実験が妥当であることが裏付けられる。また、２５°Ｃの純水の表面張力はσ＝０．０７３Ｎ／ｍであることが広く知られており、この値から算出される２５℃の純水のキャピラリ力が４．３ｋＰａであるので、今回の実験による２５℃の純水のキャピラリ力の値が４．４ｋＰａであることを考えると、この点からも今回の実験が妥当であることが裏付けられる。
　次に、反応試薬としてＰＣＲ試薬を用いた核酸増幅について実験を行ったので、その実験結果について説明する。
　この実験では、マイクロ流体デバイスとして上記の核酸増幅デバイス１を用いた。この場合、図８Ａ～図８Ｃに示されるように、溝部１３に形成されたシリコン酸化膜（ＳｉＯ２）１４及びガラス基板である第２基板２０の表面における２５℃の純水の接触角θは、いずれも４９°であった。また、第１ヒータブロック１４１の温度を９５℃とし、第２ヒータブロック１４２の温度を６０℃とし、流路１００を流れる反応溶液が９５℃と６０℃との２つの温度領域を交互に周期的に通るようにした。
　また、図９の実験に対して流路１００のサイズを変更した場合の毛管力送液特性について、図１２を用いて説明する。図１２は、キャピラリ力で流路内を自送液するＰＣＲ試薬についての時間と液先端の変位との関係を示す図である。なお、図１２では、幅ｗが１００μｍで深さｄが１００μの矩形の流路の場合と、幅ｗが１５０μｍで深さｄが１５０μの矩形の流路の場合との結果を示している。
　このように、流路１００のサイズを変更することで、所望の毛管力送液特性が得られることが分かる。
　次に、ＰＣＲ試薬として、ヒトゲノムのβ－ａｃｔｉｎ（ベータアクチン）、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍのＲＮＡから作製した相補的ＤＮＡ、及び、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡを用いた場合の核酸増幅について説明する。
　これらのＰＣＲ試薬を用いて、キャピラリ力による自送液で核酸増幅したときの結果を図１３に示す。図１３は、ＰＣＲ増幅前後における標準ＤＮＡマーカーを示すゲル電気泳動の画像を示しており、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ、ヒトゲノムのβ－ａｃｔｉｎ、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍ、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡについての画像を示している。
　図１３に示すように、ヒトゲノムのβ－ａｃｔｉｎの増幅は２９５ｂｐであり、インフルエンザウイルスＡＨ１ｐｄｍの増幅は２３２ｂｐであり、大腸菌ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＤＮＡの増幅は９５ｂｐであることが分かる。
　このように、本実施の形態における核酸増幅デバイス１によれば、キャピラリ力によって標的核酸を含む反応溶液を送液して標的核酸の核酸増幅を行うことができる。
　［核酸増幅装置］
　次に、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置２００について、図３及び図１４を用いて説明する。図１４は、本発明の実施の形態１に係る核酸増幅装置の構成を示す図である。
　本実施の形態における核酸増幅装置２００は、図３に示すように、上記の核酸増幅デバイス１と、核酸増幅デバイス１における核酸増幅反応部１１０の温度を制御するための温度制御部２１０とを備える。この構成により、簡便な方法で拡散増幅が可能となる。
　図１４（ａ）に示すように、本実施の形態における核酸増幅装置２００は、さらに、標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部２２０を備える。
　検出部２２０は、光学検出系であり、核酸増幅デバイス１に照射するための光を出力する光出力部２２１と、核酸増幅デバイス１に照射した光の反射光を受光する受光部２２２と、核酸増幅デバイス１の流路１００上に光を走査させるための光学走査部２２３とを備える。
　光出力部２２１は、青色光を発するレーザ素子を備えており、例えば中心波長が４８８ｎｍのレーザ光を出力する。受光部２２２は、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。なお、検出部２２０は、その他に、励起カットフィルタ２２４及びダイクロイックミラー２２５等の光学素子を備える。
　このように、本実施の形態に係る核酸増幅装置２００は、加熱・冷却系（温度制御部２１０）と光学検出系（検出部２２０）との一体評価系としている。このように検出系を一体化することで、簡便な検出装置を実現できる。また、光学検出系とすることにより非接触で核酸の増幅量を検出することができる。
　そして、核酸増幅デバイス１に導入した反応溶液（反応試料、反応試薬）における標的核酸の増幅量を検出する場合、図１４（ｂ）に示すように、流路１００の主流路１００ａと交差する方向にレーザ光をスキャンするとともに反射光を受光する。そして、受光した反射光に基づいて流路１００内の反応溶液中における標的核酸の増幅量を算出する。これにより、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを往復する流路１００のサイクルに応じた核酸の増幅曲線を取得することができる。
　本実施の形態では、青色光のレーザ光を反応溶液に照射することによって、青色光を励起光として蛍光発光した緑色光が反射光として戻ってくるように構成されている。この緑色光（反射光）の蛍光量は、核酸の増幅量に応じて変化する。したがって、緑色光の蛍光量を測定することで核酸の増幅量を算出することができる。
　ここで、反応試料としてヒトゲノムのβ－ａｃｔｉｎを含む反応溶液を用いた場合の光学検出結果の一例を、図１５及び図１６を用いて説明する。図１５は、反応溶液のＰＣＲサイクルと蛍光量（増幅量）との関係を示す図である。図１６は、反応試料（ヒトゲノム）の濃度と立ち上げる時のしきいサイクルとの関係を示す図である。
　図１４（ａ）及び図１４（ｂ）に示すように、流路１００上をレーザ光でスキャンすることによって、流路１００のサイクル毎（主流路１００ａ毎）の核酸の増幅量を、増幅曲線として検出することができる。
　この結果、図１５に示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の増幅量が増加することが分かる。また、反応試料（ヒトゲノム）の初期濃度に依存して、立ち上がる時のしきいサイクルが異なることも分かる。そこで、立ち上がる時のしきいサイクルを、最大値（飽和値）の例えば１０％程度となるサイクルと定義すれば、図１６に示すように、非常に線形性の高い検量線を得ることができ、初期濃度の定量が可能となる。
　（実施の形態２）
　次に、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイス２の構成について、図１７Ａ及び図１７Ｂを用いて説明する。図１７Ａは、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図であり、図１７Ｂは、同核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
　本実施の形態における核酸増幅デバイス２は、実施の形態１における核酸増幅デバイス１における導入部１２０が複数設けられた構成である。
　具体的には、核酸増幅デバイス２は、第１導入部１２０ａと第２導入部１２０ｂとを備えており、さらに、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂと核酸増幅反応部１１０との間に設けられた混合部１５０を備える。
　本実施の形態における導入流路１００ｃは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂに分岐するようにＹ字状形成されている。第１導入部１２０ａと第２導入部１２０ｂとは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂの各々に対応する導入流路１００ｃを通じて混合部１５０において１つに接続される。
　このように、混合部１５０は、導入流路１００ｃの一部であり、混合部１５０では、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂの各々から導入された複数の溶液が混合される。つまり、混合部１５０は、第１導入部１２０ａから導入された第１溶液と第２導入部１２０ｂから挿入された第２溶液とが混合される箇所である。
　なお、第１導入部１２０ａには、第１溶液として、例えば標的核酸を含む溶液が導入される。また、第２導入部１２０ｂには、第２溶液として、例えば反応試薬を含む溶液が導入される。
　図１７Ｂに示すように、本実施の形態では、第１導入部１２０ａから導入された第１溶液と第２導入部１２０ｂから導入された第２溶液とは、混合部１５０において拡散により混合される。これにより、簡単な構成で混合することができる。
　次に、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法について、図１８を用いて説明する。図１８は、本発明の実施の形態２に係る核酸増幅方法のフローチャートである。
　本実施の形態に係る核酸増幅方法は、上記の核酸増幅デバイス２を用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、実施の形態１と同様に、試料となる標的核酸と当該標的核酸を増幅させるための反応試薬とを核酸増幅デバイス２の導入部１２０に導入する導入ステップと、標的核酸と反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含む。
　本実施の形態では、上記導入ステップにおいて、標的核酸を含む溶液（第１溶液）と反応試薬を含む溶液（第２溶液）とを核酸増幅デバイス２に別々に導入し、核酸増幅ステップでは、標的核酸を含む溶液（第１溶液）と反応試薬を含む溶液（第２溶液）とを核酸増幅デバイス２において混合して反応溶液とし、当該反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる。
　具体的には、図１８に示すように、まず、第１溶液として標的核酸を含む溶液を第１導入部１２０ａに導入するとともに、第２溶液として反応試薬を含む溶液を第２導入部１２０ｂに導入する（ステップＳ２１）。
　第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂに別々に導入された第１溶液及び第２溶液は別々の導入流路１００ｃを通って混合部１５０で混合されて反応溶液となって核酸増幅反応部１１０に送液され、実施の形態１と同様に、当該反応溶液に周期的な温度変化を与えることで反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる（ステップＳ２２）。
　その後、反応溶液は、排出流路１００ｄを通って核酸増幅反応部１１０から排出部１３０に送液され、排出部１３０で排出される。
　以上、本実施の形態における核酸増幅デバイス２によれば、実施の形態１と同様に、キャピラリ力によって反応溶液を送液することができるので、外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。したがって、標的核酸の核酸増幅を低コストかつ簡便に行うことができる。
　さらに、本実施の形態によれば、標的核酸と反応試薬とをデバイス上で混合することができるので、標的核酸の核酸増幅をさらに簡便に行うことができる。
　（実施の形態２の変形例１）
　次に、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイス２Ａの構成について、図１９を用いて説明する。図１９は、本発明の実施の形態２の変形例１に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
　図１９に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ａでは、第１導入部１２０ａ及び第２導入部１２０ｂから導入された第１溶液及び第２溶液は、混合部１５０において螺旋流により混合される。例えば、流路１００の内壁にネジ溝を切っておくことで、第１溶液及び第２溶液は螺旋流となって混合される。
　このように、混合部１５０で螺旋流を発生させることによって撹拌による混合が可能となり、複数の溶液を素早く均一に混合することができる。
　（実施の形態２の変形例２）
　次に、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイス２Ｂの構成について、図２０を用いて説明する。図２０は、本発明の実施の形態２の変形例２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
　図２０に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｂでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００が蛇行流路となっている。
　この構成により、複数の溶液を拡散して混合するのに必要な距離をかせぐことができるので、デバイス上で複数の溶液を混合して反応溶液を作製する場合でも、核酸増幅反応部１１０までに均等に混合させることが可能となる。
　（実施の形態２の変形例３）
　次に、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイス２Ｃの構成について、図２１を用いて説明する。図２１は、本発明の実施の形態２の変形例３に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
　図２１に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｃでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００が環状流路となっている。具体的には、複数のＣ字状の環状流路を交互に反転させながら繋いだ構成としている。
　この構成により、螺旋流を簡単に発生させることができるので、複数の溶液を容易に均一に混合することができる。
　（実施の形態２の変形例４）
　次に、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイス２Ｄの構成について、図２２を用いて説明する。図２２は、本発明の実施の形態２の変形例４に係る核酸増幅デバイスにおける混合部の拡大平面図である。
　図２２に示すように、本変形例における核酸増幅デバイス２Ｄでは、混合部１５０における流路（混合部流路）１００には、断面積が部分的に小さい箇所が存在する。例えば、混合部１５０における流路の一部の幅を狭くすることで、流路断面積を部分的に小さくすることができる。
　この構成により、断面積が小さい箇所で複数の溶液を短時間で混合させることができるので、複数の溶液を拡散させる距離を短くすることができる。これにより、小型の核酸増幅デバイスを実現することができる。
　（その他の変形例）
　以下、上記実施の形態における核酸増幅デバイスの変形例について説明する。
　（変形例１）
　図２３は、本発明の変形例１に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
　本変形例における核酸増幅デバイスでは、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。この構成により、反応溶液３００の送液速度を一定にすることができる。
　具体的には、図２３に示すように、流路１００は、流路１００の断面積が単調減少するように、深さが一定で幅が漸次減少するような先細りテーパ構造である。なお、流路１００は、幅が一定で深さが漸次浅くなるようなテーパ構造としてもよい。
　この構成により、圧力損失及びキャピラリ力を連続的に変化させることができるので、反応溶液の送液速度をより一定に保つことができる。
　また、本変形例のように、流路１００の深さを一定にすることによって、エッチング等によって流路１００を一括して容易に作製することができる。さらに、流路１００の深さを一定にすることによって、上述のように流路１００の上方からレーザ光をスキャンして光学測定を行う際に測定光の光路長を一定に保つことができる。これにより、測定精度を向上させることができる。例えば、核酸の増幅量を精度よく算出することができる。
　（変形例２）
　図２４は、本発明の変形例２に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
　本変形例における核酸増幅デバイスは、変形例１と同様に、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。これにより、反応溶液の送液速度を一定にすることができる。
　本変形例が変形例１と異なる点は、断面積が減少する領域における流路１００が、蛇行する複数のライン状の主流路１００ａによって構成されており、さらに、この主流路１００ａの断面積が送液方向に沿ってラインごとに減少している点である。本変形例では、送液方向に沿ってラインごとに主流路１００ａを細く（幅を狭く）することで、流路１００の断面積を減少させている。なお、各ラインにおける主流路１００ａの幅及び深さは一定である。
　この構成より、流路１００を直線状とすることができるので、変形例１と比べて、流路１００の設計及び作製が容易である。また、流路１００の深さを一定にすることによって、エッチング等によって流路１００を一括して容易に作製することができるとともに、流路１００の上方からレーザ光をスキャンして光学測定を行う際に測定光の光路長を一定に保つことができるので、測定精度を向上させることができる。
　（変形例３）
　図２５は、本発明の変形例３に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
　本変形例における核酸増幅デバイスは、変形例１と同様に、少なくとも核酸増幅反応部１１０における流路１００に、送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている。これにより、反応溶液の送液速度を一定にすることができる。
　本変形例が変形例１と異なる点は、図２５に示すように、断面積が減少する領域における流路１００の断面積が流路１００内に設けられたピラー１６０により調整されている点である。
　具体的には、流路１００内に円柱状のピラー１６０を所定の間隔で複数本立てることによって、送液方向に沿って流路１００の断面積を部分的に減少させることができる。
　この構成により、反応溶液の送液速度を調整することができる。また、ピラー１６０を設けることによって反応溶液中の試料及び試薬の拡散性を向上させることもできる。
　（変形例４）
　図２６は、本発明の変形例４に係る核酸増幅デバイスの流路を示す拡大平面図である。
　本変形例における核酸増幅デバイスは、流路１００の一部が分岐されている。具体的には、図２６に示すように、先細りテーパ構造の流路１００の先端が３つに分岐されている。
　このように流路１００の一部を分岐させることによって、反応溶液３００の液先端（先頭部分）の送液速度を制御するだけではなく、反応溶液３００の液内部の送液速度も制御することができる。
　（その他）
　以上、本発明に係る核酸増幅デバイス及び核酸増幅方法等について、実施の形態及び変形例に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態及び変形例に限定されるものではない。
　例えば、上記実施の形態及び変形例では、核酸増幅反応部１１０における流路１００を蛇行流路として標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるフローＰＣＲとしたが、フローＰＣＲとせずに標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるようなＰＣＲとしてもよい。但し、上記実施の形態のようにフローとした方が効率良くＰＣＲを実施することができる。
　また、上記実施の形態及び変形例では、流路１００を蛇行流路としたが、これに限らない。例えば、複数の高温領域（９５℃）と複数の低温領域（６０℃）とを交互にライン状に配列して、その上に直線状の流路が形成された基板を配置することによって、流路が高温領域と低温領域とを交互に通過するように構成してもよい。
　また、上記実施の形態及び変形例では、ヒータ部１４０は２つの温度領域としたが、互いに温度が異なる３つ以上の温度領域としてもよい。この場合、流路は、反応溶液が異なる複数の温度領域を周期的に通過するように構成されていればよい。
　また、上記実施の形態及び変形例では、複数の温度領域の各温度の設定は、ヒータブロックで行ったが、ペルチェ素子等の他の温度制御部材を用いて温度設定してもよい。
　その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
　１、２、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ　核酸増幅デバイス
　１０　第１基板
　１１　第１凹部
　１２　第２凹部
　１３　溝部
　１４、１５　シリコン酸化膜
　２０　第２基板
　２１　第１貫通孔
　２２　第２貫通孔
　１００　流路
　１００ａ　主流路
　１００ｂ　副流路
　１００ｃ　導入流路
　１００ｄ　排出流路
　１１０　核酸増幅反応部
　１２０　導入部
　１２０ａ　第１導入部
　１２０ｂ　第２導入部
　１３０　排出部
　１４０　ヒータ部
　１４１　第１ヒータブロック
　１４２　第２ヒータブロック
　１５０　混合部
　１６０　ピラー
　２００　核酸増幅装置
　２１０　温度制御部
　２２０　検出部
　２２１　光出力部
　２２２　受光部
　２２３　光学走査部
　２２４　励起カットフィルタ
　２２５　ダイクロイックミラー
　３００　反応溶液

Claims (17)

  1. 　標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部と、
    　前記導入部に導入された前記反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部と、
    　少なくとも前記核酸増幅反応部に設けられ、かつ、前記反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路とを備え、
    　前記核酸増幅反応部では、前記反応溶液が毛管力により送液されながら前記反応溶液に含まれる前記標的核酸が増幅する
    　核酸増幅デバイス。
  2. 　さらに、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、
    　前記流路は、前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における壁面全周が閉じられており、かつ、前記導入部及び前記排出部においてのみ外部空間と繋がっている
    　請求項１に記載の核酸増幅デバイス。
  3. 　前記流路は、前記毛管力運搬機構として、接触角が鋭角である親水性表面の壁面を有する
    　請求項１又は２に記載の核酸増幅デバイス。
  4. 　前記反応溶液の送液方向に垂直な断面における前記流路の壁面全周が親水性表面である
    　請求項３に記載の核酸増幅デバイス。
  5. 　前記核酸増幅反応部には、温度が異なる少なくとも２つ以上の温度領域が存在する
    　請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  6. 　前記流路は、前記２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成される
    　請求項５に記載の核酸増幅デバイス。
  7. 　前記導入部は、複数設けられており、
    　さらに、前記複数の導入部と前記核酸増幅反応部との間に設けられた混合部を備え、
    　前記複数の導入部の各々は、前記複数の導入部の各々に対応する導入流路を通じて前記混合部において１つに接続されており、
    　前記混合部では、前記複数の導入部の各々から導入された複数の溶液が混合されて前記反応溶液となる
    　請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  8. 　少なくとも前記核酸増幅反応部における前記流路には、前記送液方向に沿って断面積が減少する領域が含まれている
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイス。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸増幅デバイスを備える核酸増幅装置であって、
    　前記核酸増幅反応部の温度を制御するための温度制御部を備える
    　核酸増幅装置。
  10. 　さらに、前記標的核酸の核酸増幅を検出するための検出部を備える
    　請求項９に記載の核酸増幅装置。
  11. 　前記検出部は、
    　前記核酸増幅デバイスに照射するための光を出力する光出力部と、
    　前記核酸増幅デバイスに照射した前記光の反射光を受光する受光部とを備える
    　請求項１０に記載の核酸増幅装置。
  12. 　前記検出部は、さらに、前記光を前記核酸増幅デバイスの前記流路上を走査するための光学走査部を備える
    　請求項１１に記載の核酸増幅装置。
  13. 　核酸増幅デバイスを用いて標的核酸を増幅させるための核酸増幅方法であって、
    　前記標的核酸と前記標的核酸を増幅させるための反応試薬とを前記核酸増幅デバイスに導入する導入ステップと、
    　前記標的核酸と前記反応試薬とを含む反応溶液を毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる核酸増幅ステップとを含む
    　核酸増幅方法。
  14. 　前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む溶液と前記反応試薬とを予め混合した溶液を前記反応溶液として前記核酸増幅デバイスに導入する
    　請求項１３に記載の核酸増幅方法。
  15. 　前記導入ステップにおいて、前記標的核酸を含む第１溶液と前記反応試薬を含む第２溶液とを前記核酸増幅デバイスに別々に導入し、
    　核酸増幅ステップでは、前記第１溶液と前記第２溶液とを前記核酸増幅デバイスにおいて混合した溶液を前記反応溶液として毛管力により送液しながら当該反応溶液に含まれる前記標的核酸を増幅させる
    　請求項１３に記載の核酸増幅方法。
  16. 　前記核酸増幅ステップでは、前記反応溶液に周期的な温度変化を与えることにより前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる
    　請求項１３～１５のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
  17. 　前記核酸増幅デバイスは、増幅後の前記標的核酸を含む前記反応溶液を排出するための排出部を備え、
    　前記毛管力によって送液される前記反応溶液の先端が前記排出部に到達したときに、標的核酸を含む溶液の前記導入部への導入を停止する
    　請求項１３～１６のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
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