FR3035411A1 - Procede d'amplification d'acide nucleique a des fins d'analyse, machine d'amplification correspondante et cartouche pour cette machine - Google Patents

Abstract

Procédé d'amplification d'ADN par réaction en chaîne par polymérase, caractérisé en ce que : - le milieu réactionnel est soumis pendant les cycles à un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm et une densité optique du milieu réactionnel est mesurée, - la température est pilotée notamment en fonction de la densité optique du milieu réactionnel. Machine d'amplification correspondante et cartouche pour une telle machine.

Description

1 La présente invention concerne le domaine de l'analyse de matériel génétique contenant de l'acide nucléique et notamment de l'acide désoxyribonucléique (ADN).

ETAT DE LA TECHNIQUE Une analyse d'ADN consiste généralement à extraire l'information génétique contenu dans les brins d'ADN afin d'établir un profil génétique. Il est connu d'effectuer cette analyse par électrophorèse capillaire.

Pour que l'analyse soit efficace, le matériel gé- nétique doit comporter suffisamment de brins d'ADN. Pour cette raison, il est connu d'amplifier l'ADN contenu dans le matériel génétique avant de l'analyser. L'opération d'amplification consiste à mettre l'ADN contenu dans le matériel génétique avec des enzymes et des nucléotides pour synthétiser le brin complémen- taire de chaque brin d'ADN contenu dans le matériel génétique. Il existe une technique d'amplification ou de ré- action en chaîne par polymérase, dite PCR (de l'anglais « Polymerase Chain Reaction »), consistant à mettre le matériel génétique en contact avec des réactifs (amorces, polymérases...) et soumettre le milieu réactionnel ainsi obtenu à des cycles thermiques comprenant : - une phase initiale de dénaturation à une rela- tivement haute température (environ 95°C) qui provoque la séparation des doubles brins pour former des simples brins, - une phase intermédiaire d'hybridation à relati- vement basse température (entre 55°C et 64°C environ) durant laquelle les amorces s'apparient aux simples brins d'ADN, et - une phase finale d'élongation à une température intermédiaire (environ 70°C) pour provoquer la synthèse des brins complémentaires aux simples 3035411 2 brins pour reformer des doubles brins (les deux dernières phases pouvant être aussi réalisées simultanément à la température de 6000 environ).

5 On comprend que le nombre de doubles brins est théoriquement multiplié par deux à chaque cycle. L'activité des réactifs est contrôlée en faisant passer la température d'une température de phase à une autre.

10 Il existe des machines mettant en oeuvre cette technique de manière automatique en effectuant un nombre prédéterminé de cycles, généralement une trentaine. Un inconvénient de ces machines est qu'il arrive que 15 - le nombre de répétitions du cycle soit trop élevé de sorte que la quantité de brins d'ADN est trop importante et sature les capteurs lors de l'analyse, - le nombre de répétitions du cycle soit trop faible auquel cas la quantité de brins d'ADN est insuffi- 20 sante pour permettre la réalisation de l'analyse. Or, il n'est plus possible de réutiliser le matériel génétique ayant servi à l'analyse pour refaire une amplification et une analyse ultérieure. En outre, la durée de chaque cycle est prédéter- 25 minée et volontairement majorée pour s'assurer que chaque cycle est bien terminé avant d'en démarrer un nouveau. Il en résulte que l'opération d'amplification est globalement longue. OBJET DE L'INVENTION 30 Un but de l'invention est de fournir un moyen pour améliorer l'efficacité de l'amplification de l'ADN et son adaptation à un processus d'analyse. BREF EXPOSE DE L'INVENTION A cet effet, on prévoit, selon l'invention, un 35 procédé d'amplification d'ADN par réaction en chaîne par 3035411 3 polymerase, comprenant au moins une étape de soumettre un milieu réactionnel, comprenant du matériel génétique et des réactifs, à des cycles thermiques répétés comportant une phase initiale de séparation de doubles brins d'ADN 5 du milieu réactionnel pour former de simples brins et une phase finale de synthèse de brins d'ADN complémentaires aux simples brins pour reformer des doubles brins. La transition entre les phases est obtenue par contrôle de la température. Le procédé est caractérisé en ce que : 10 - le milieu réactionnel est soumis pendant les cycles à un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm et une densité optique du milieu réactionnel est mesurée, - la température est pilotée notamment en fonc- 15 tion de la densité optique du milieu réactionnel. Ainsi, on pilote le cycle d'amplification en fonction de la densité optique du milieu réactionnel dont on sait qu'elle varie en fonction du rapport entre le nombre de doubles brins et le nombre de simples brins du 20 matériel génétique : les simples brins d'ADN absorbent mieux la lumière à cette longueur d'onde que les doubles brins d'ADN. Selon une première application de la surveillance de la densité optique, le procédé comprend l'étape de pi- 25 loter la température de manière à interrompre la phase finale de chaque cycle lorsque la densité optique du milieu réactionnel est sensiblement constante. Selon une deuxième application de la surveillance de la densité optique, le procédé comprend l'étape de dé- 30 terminer une densité optique souhaitée après amplifica- tion d'un milieu réactionnel étalon sous le rayonnement électromagnétique et d'interrompre les cycles thermiques lorsque la densité optique du milieu réactionnel en cours d'amplification atteint la densité optique souhaitée.

35 L'invention a également pour objet une machine 3035411 4 pour la mise en oeuvre de ce procédé. Cette machine comprend un logement de réception d'une cartouche contenant le milieu réactionnel, au moins un organe de chauffage du milieu réactionnel, au moins un organe d'illumination du 5 milieu réactionnel par un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm, au moins un capteur d'une grandeur représentative d'une densité optique du milieu réactionnel et une unité de commande agencée pour piloter l'organe de chauffage en 10 fonction de la grandeur mesurée par le capteur. L'invention a également pour objet une cartouche pour une telle machine. Cette cartouche comprend un boîtier délimitant au moins une chambre qui contient des réactifs et qui est destinée à recevoir du matériel géné- 15 tique, le boîtier étant en un matériau transparent au rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description 20 qui suit de modes de réalisation particuliers non limita- tifs de l'invention. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Il sera fait référence aux dessins annexés, parmi lesquels : 25 - la figure 1 est une vue schématique en coupe d'une machine d'amplification selon un premier mode de réalisation de l'invention ; - la figure 2 est une vue en perspective d'une cartouche pour cette machine ; 30 - la figure 3 est une vue schématique en coupe d'une machine selon un deuxième mode de réalisation de l'invention ; la figure 4 est un diagramme illustrant le déroulement du procédé de l'invention.

35 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 3035411 5 L'invention concerne un procédé d'amplification d'ADN par réaction en chaîne au moyen de polymérases. Ce procédé d'amplification d'ADN débute par l'étape de créer un milieu réactionnel en mettant en con- 5 tact du matériel génétique et des réactifs (polymérases, ainsi que des amorces et nucléotides...). Il est ensuite procédé à une phase d'homogénéisation du milieu réactionnel. Cette phase, notée A sur la figure 4, consiste à chauffer le milieu réactif à une température de 95°C de 10 manière à séparer les doubles brins du matériel génétique et à briser les structures secondaires du matériel génétique. Débute ensuite une opération de cyclage thermique au cours de laquelle le milieu réactionnel est soumis à 15 des cycles thermiques répétés comportant : - une phase initiale B de séparation des doubles brins d'ADN du matériel génétique pour former de simples brins, cette phase est réalisée en chauffant le milieu réactionnel à une température de 95°C, 20 - une phase finale C d'hybridation et de synthèse de brins d'ADN complémentaires aux simples brins pour reformer des doubles brins, cette phase est réalisée en chauffant le milieu réactionnel à une température d'environ 60°C.

25 L'interruption d'une phase et le passage à la suivante est commandée par contrôle de la température. La réaction en chaîne par polymérase étant connue en elle-même, elle ne sera pas décrite plus en détail ici.

30 Le procédé de l'invention prévoit en outre que pendant les cycles, le milieu réactionnel est soumis à un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde de 260 nm environ, et qu'une densité optique DO du milieu réactionnel est mesurée ici en continu sous 35 l'illumination à 260 nm.

3035411 6 La température de chauffage du milieu réactionnel est pilotée ici en fonction de la densité optique DO du milieu réactionnel. Plus particulièrement ici, la densité optique DO 5 est utilisée pour interrompre la phase initiale A et la phase finale B de chaque cycle. En effet, comme la densi- té optique du milieu réactionnel dépend du rapport entre le nombre de doubles brins et le nombre de simples brins d'ADN, la densité optique DO va évoluer lors de la phase 10 initiale A et lors de la phase finale B pour se stabili- ser lorsque ces phases doivent être interrompues. Le chauffage de la phase initiale est ainsi interrompu lorsqu'il n'y a plus de doubles brins et le chauffage de l'étape finale est ainsi interrompu lorsqu'il n'y a plus 15 de simples brins. En outre, la densité optique DO est également utilisée ici pour interrompre la répétition des cycles thermiques. A cette fin, le procédé comprend l'étape de déterminer une densité optique souhaitée après amplifica- 20 tion d'un milieu réactionnel étalon sous le rayonnement électromagnétique et d'interrompre les cycles thermiques lorsque la densité optique DO du milieu réactionnel en cours d'amplification atteint la densité optique souhaitée. La densité optique souhaitée, appelée « valeur 25 cible » sur la figure 4, est mémorisée et la densité op- tique DO mesurée en continu, ou périodiquement, est comparée périodiquement à la densité optique souhaitée pour commander l'interruption de la répétition des cycles lorsque la densité optique mesurée est égale à la densité 30 optique souhaitée. Le milieu réactionnel étalon comprend des réactifs et une quantité d'ADN suffisante pour réaliser une analyse de cet ADN dans des conditions optimales. Le milieu réactionnel étalon est, par exemple, fourni par les 35 fabricants de machines d'analyse ou d'amplification d'ADN 3035411 7 et/ou les fabricants de consommables pour machines d'analyse ou d'amplification d'ADN. Un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention va maintenant être décrit plus en détail.

5 Il procédé au préalable à l'homogénéisation du milieu réactionnel (phase A) qui comprend les étapes sui- vantes : - pilotage de la température de chauffage pour l'amener à 95°C et lancer la séparation des 10 doubles brins d'ADN (étape Al) ; - vérification immédiate que la densité optique DO évolue (étape A2) ; si la densité optique n'évolue pas, cela signi- fie qu'il n'y a pas de matériel génétique dans 15 le milieu réactionnel de sorte que le chauffage est arrêté (étape A3) arrêtant le déroulement du procédé ; - si au contraire la densité optique évolue, la température est maintenue (étape A4) ; 20 - vérification périodique que la densité optique évolue (étape A5) ; - si la densité optique n'évolue plus et qu'un temps d'activation prédéterminé a été respecté (l'écoulement de cette durée est vérifiée à 25 l'étape A6), on enchaîne directement sur la phase d'hybridation et de synthèse du cyclage thermique B pour lancer celui-ci (étape B3) ; - tant que la densité optique évolue ou que le temps d'activation prédéterminé n'a pas été at- 30 teint, la température est maintenue (étape A4). L'opération de cyclage thermique comprend les étapes suivantes : - chauffage à la température de 95°C pour lancer la phase initiale (étape B1) ; 35 vérification que la densité optique DO évolue 3035411 8 (étape B2) ; - tant que la densité optique évolue, la température du milieu réactionnel est maintenue à 95°C ; 5 - si la densité optique n'évolue plus, cela si- gnifie que la séparation est terminée de sorte que le chauffage est arrêté pour amener la température du milieu réactionnel à 60°C et débuter la phase d'hybridation et de synthèse 10 (étape B3) ; - nouvelle vérification que la densité optique évolue (étape B4) ; - tant que la densité optique évolue, la température du milieu réactionnel est maintenue à 60°C 15 (poursuite de l'étape B3) ; - si au contraire la densité optique n'évolue plus, cela signifie que la synthèse est théoriquement terminée ; - dans ce cas, la densité optique DO atteinte est 20 comparée à la valeur cible (étape B5) ; - si la densité optique atteinte est sensiblement égale à la valeur cible, le chauffage est arrêté et l'amplification est terminée (étape B6) ; - si au contraire la densité optique atteinte est 25 différente de la valeur cible, un nouveau cycle thermique est amorcé en pilotant le chauffage pour augmenter la température du milieu réactionnel jusqu'à 95°C et lancer l'étape initiale d'un nouveau cycle (étape B1).

30 Au lancement du cyclage thermique après l'homogénéisation toutefois, les étapes B1 et B2 ne sont pas nécessaires puisque tous les brins d'ADN ont été séparés. On passe alors directement de l'étape A6 à l'étape B3. Hors ce cas, les étapes B1 et B2 sont effectuées à 35 chaque cycle.

3035411 9 L'invention concerne également une machine d'amplification pour la mise en oeuvre de ce procédé. En référence à la figure 1 et selon un premier mode de réalisation, la machine comporte un bâti 1 défi- 5 mitant un logement 2 de réception d'une cartouche 10 con- tenant le milieu réactionnel. Un organe de chauffage 3 est monté sur le bâti 1 au voisinage du logement 2 pour chauffer le milieu réactionnel qui se trouve dans la cartouche 10.

10 Un organe d'illumination 4 est monté sur le bâti 1 au voisinage du logement 2 pour projeter, dans le logement 2 et la cartouche 10, un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde d'environ 260 nm. Un capteur 5 est monté dans le logement 2 pour détecter le 15 rayonnement après que celui-ci a traversé la cartouche 10 et fournir un signal représentatif d'une densité optique du milieu réactionnel sous le rayonnement précité. La machine comprend une unité de commande 6 re- liée à l'organe de chauffage 3, à l'organe d'illumination 20 4 et au capteur 5. L'unité de commande 6 comprend un pro- cesseur et des mémoires agencés pour exécuter un programme informatique mettant en oeuvre le procédé de l'invention de manière à piloter l'organe de chauffage 3 en fonction de la grandeur mesurée par le capteur 5.

25 En référence à la figure 2, la cartouche 10 uti- lisée en relation avec cette machine comprend ici un boîtier 11 délimitant une chambre 12 qui contient des réactifs, et qui est destinée à recevoir du matériel génétique pour former dans la chambre 12 un milieu réaction- 30 nel. Le boîtier 11 a ici une forme parallélépipédique et la chambre 12 est ouverte sur une des faces principales du boîtier 11, ici la face supérieure, sur laquelle s'adapte un couvercle 13 de fermeture de la chambre 12. Le boîtier 11 et le couvercle 13 sont en un maté- 35 riau transparent au rayonnement électromagnétique ayant 3035411 10 une longueur d'onde sensiblement égale à 260 nia. Le matériau est par exemple du verre ou du quartz traité pour présenter une absorbance réduite des rayonnements électromagnétiques ayant une longueur d'onde sensiblement 5 égale à 260 nia. Les éléments identiques ou analogues à ceux précédemment décrits porteront des références numériques identiques à ces derniers dans la description qui suit du deuxième mode de réalisation représenté sur la figure 3.

10 Dans ce deuxième mode de réalisation, le disposi- tif d'illumination et le capteur sont portés par la cartouche 10. La cartouche 10 comprend comme précédemment un boîtier 11, délimitant une chambre 12, et un couvercle 15 13. Le boîtier 11 et le couvercle 13 sont en un matériau transparent au rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde sensiblement égale à 260 nia. Sur le couvercle 13 est monté un dispositif d'émission 14 du rayonnement. Lorsque le couvercle 13 est 20 en place sur la face supérieure du boîtier 11, le dispo- sitif d'émission 14 est en regard de la chambre 12. Le dispositif d'émission 14 comprend ici des diodes électroluminescentes reliées à un connecteur électrique 24 porté par le couvercle 13. Le nombre de diodes est déterminé 25 pour assurer une illumination homogène de la chambre 12. Sur la face inférieure du boîtier 1 formant le fond de celui-ci, est monté un capteur 15 en regard de la chambre 12. Le capteur 15 est agencé pour détecter le rayonnement émis par les diodes et est relié a un connec- 30 teur 25 porté par le boîtier 11. La machine selon le deuxième mode de réalisation comporte un bâti 1 délimitant un logement 2 de réception d'une cartouche 10 telle que décrite ci-dessus. Un organe de chauffage 3 est monté sur le bâti 1 35 au voisinage du logement 2 pour chauffer le milieu réac- 3035411 11 tionnel dans la cartouche 10. Dans le logement 2 débouchent également un premier connecteur 21 et un deuxième connecteur 22 montés en regard de l'entrée 7 du logement 1. Le connecteur 21 est 5 agencé pour coopérer avec le connecteur 24 et le connec- teur 22 est agencé pour coopérer avec le connecteur 25. La machine comprend une unité de commande 6 reliée à l'organe de chauffage 3 et aux connecteurs 21, 22. L'unité de commande comprend un processeur et des mé- 10 moires agencés pour exécuter un programme informatique mettant en oeuvre le procédé de l'invention de manière à piloter l'organe de chauffage 3 en fonction de la grandeur mesurée par le capteur 15. Lors de l'introduction de la cartouche 10 dans le 15 logement 2 par l'entrée 7, les connecteurs 24, 25 s'engagent sur les connecteurs 21, 22 respectivement assurant la connexion électrique du dispositif 14 et du capteur 15 à l'unité de commande 6. L'unité de commande 6 peut alors piloter le processus d'amplification.

20 Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits mais englobe toute variante entrant dans le champ de l'invention telle que définie par les revendications. En particulier, la cartouche peut avoir une autre 25 forme que celle décrite. Le rayonnement électromagnétique peut avoir une longueur d'onde différente de 260 nm mais comprise entre 250 nm et 270 nm environ, ou entre 257 nm et 263 nm environ.

30 En variante, le procédé d'amplification peut com- prendre : une phase initiale de séparation des doubles brins d'ADN du matériel génétique pour former de simples brins, cette phase est réalisée en chauffant le milieu 35 réactionnel à une température de 95°C environ, 3035411 12 - une phase intermédiaire d'hybridation dans laquelle la température est ramenée par exemple entre 55°C et 64°C, et une phase finale de synthèse de brins d'ADN 5 complémentaires aux simples brins pour reformer des doubles brins, cette phase est réalisée en chauffant le milieu réactionnel à une température d'environ 70°C. La cartouche peut avoir une structure différente de celle décrite et par exemple être d'une seule pièce 10 et/ou ne comprendre qu'un boîtier dépourvu de couvercle. La cartouche peut en outre comprendre plusieurs chambres. Dans ce cas, la machine ou la cartouche (selon le mode de réalisation envisagé) comprend de préférence, pour chaque chambre, un organe d'illumination, un capteur 15 et un dispositif de chauffage localisé. En variante, il est possible d'avoir un dispositif d'illumination commun pour toutes les chambres et un capteur par chambre. Il est aussi possible d'avoir un dispositif capturant une image de l'ensemble des chambres, l'image ayant une qua- 20 lité suffisante pour qu'il soit possible de déterminer par traitement optique une densité optique au niveau de chaque chambre. Dans l'hypothèse où est prévu un dispositif de chauffage par chambre, le dispositif de chauffage sera commandé en fonction de la densité optique corres- 25 pondant à la chambre en question. En variante encore, si un seul dispositif de chauffage commun est prévu pour toutes les chambres, le dispositif de chauffage sera commandé pour, selon le cas : favoriser l'atteinte de la densité optique cible dans un maximum de chambres, main- 30 tenir inférieur à un seuil prédéterminé le nombre de chambres arrivant à saturation...

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. Procédé d'amplification d'ADN par réaction en chaîne par polymérase, comprenant au moins une étape de soumettre un milieu réactionnel, comprenant du matériel génétique et des réactifs, à des cycles thermiques répétés, lesdits cycles thermiques comportant une phase initiale de séparation de doubles brins d'ADN du milieu réactionnel pour former de simples brins et une phase fi- nale de synthèse de brins d'ADN complémentaires aux simples brins pour reformer des doubles brins, la transition entre les phases étant obtenue par contrôle de la température, le procédé étant caractérisé en ce que : - le milieu réactionnel est soumis pendant les cycles à un rayonnement électromagnétique ayant une lon- gueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm et une densité optique du milieu réactionnel est mesurée, - la température est pilotée notamment en fonction de la densité optique du milieu réactionnel.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant l'étape de piloter la température de manière à interrompre la phase finale de chaque cycle thermique lorsque la densité optique du milieu réactionnel est sensiblement constante.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la reven- dication 2, comprenant l'étape de déterminer une densité optique souhaitée après amplification d'un milieu réactionnel étalon sous le rayonnement électromagnétique et d'interrompre les cycles thermiques lorsque la densité optique du milieu réactionnel en cours d'amplification atteint la densité optique souhaitée.
4. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le rayonnement a une longueur d'onde comprise entre 257 nm et 263 nm environ.
5. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel 3035411 14 le rayonnement a une longueur d'onde de 260 nm environ.
6. 6. Machine d'amplification pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, la machine comportant un logement de réception 5 d'une cartouche contenant le milieu réactionnel, au moins un organe de chauffage du milieu réactionnel, au moins un organe d'illumination du milieu réactionnel par un rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 nm et 270 nm, au moins un capteur d'une 10 grandeur représentative d'une densité optique du milieu réactionnel et une unité de commande agencée pour piloter l'organe de chauffage en fonction de la grandeur mesurée par le capteur.
7. 7. Cartouche pour machine d'amplification selon 15 la revendication 6, comprenant un boîtier délimitant au moins une chambre qui contient des réactifs et qui est destinée à recevoir du matériel génétique, le boîtier étant en un matériau transparent au rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre 250 20 nm et 270 nm.
8. 8. Cartouche selon la revendication 7, comprenant au moins un dispositif d'émission du rayonnement monté sur une première face principale du boîtier en regard de la chambre et, à l'opposé, et au moins un capteur du 25 rayonnement monté en regard de la chambre sur une deu- xième face principale du boîtier.