CN116847930A - 用于芯片再生的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开的各方面涉及用于再生传感器芯片表面的方法和系统，包括通过在连续采样周期之间再生传感器芯片的表面来在多个采样周期中重复使用单个传感器芯片的技术。提供了一种用于重复使用集成器件来处理样本的方法，该样本被分成多个等分试样，该方法包括：将多个等分试样中的第一等分试样装载到集成器件的多个腔室中的至少一些腔室中；当分析物存在于多个腔室的至少一些腔室中时，对第一等分试样的分析物进行采样；从集成器件的多个腔室中的至少一些腔室中移除第一等分试样；以及将多个等分试样的第二等分试样装载到集成器件的多个腔室的至少一些腔室中。

Description

用于芯片再生的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求享有于2020年12月15日提交的第63/125,847号美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及集成器件和相关仪器，其可以通过将较短光学脉冲同时提供到数万个或更多个反应腔室，并从反应腔室接收荧光信号以供样本分析来执行样本的大规模并行分析。该仪器可以适用于护理点基因定序和用于个人化医疗。
背景技术
光检测器用于在多种应用中检测光。已经研发出集成光检测器，其产生指示入射光的强度的电信号。用于成像应用的集成光检测器包括像素阵列以检测从跨越场景接收的光的强度。集成光检测器的示例包括电荷耦合器件(charge coupled device，CCD)和互补金属氧化物半导体(Complementary Metal Oxide Semiconductor，CMOS)图像传感器。
能够进行生物或化学样本的大规模并行分析的仪器由于若干因素而通常限于实验室设定，该因素可以包括仪器的较大尺寸、缺乏便携性、需要熟练技术员操作仪器、功率需求、对受控操作环境的需求和成本。在使用这种设备分析样本时，常见范式是在护理点处或现场中提取样本，将样本传送到实验室，并等待分析结果。结果的等待时间可以在数小时至数天范围内。
发明内容
本文公开的技术的各方面涉及确定包含多肽分子或核酸分子的样本的身份或序列的方法。其他方面涉及用于下一代样本定序的方法和器件，包括单分子定序。本公开的各方面涉及使用诸如发光标记物(例如，荧光团)的发光分子对多肽或核酸分子进行定序的方法和系统。
根据本公开的系统允许单分子分析。示例性系统包括集成器件(也被称为芯片)和被配置为与集成器件接口的仪器。集成器件可以包括像素阵列，其中各个像素包括样本井和至少一个光检测器。集成器件的样本井可以形成在集成器件的表面上或穿过集成器件的表面，并且被配置为接收放置在集成器件表面上的样本。总的来说，样本井可以形成为样本井的阵列。多个样本井可以具有合适的大小和形状，使得样本井的至少一部分接收单个样本(例如，包含单一类型的生物分子的样本)。在一些实施例中，样本井中的样本数量可以分布在集成器件的样本井中，使得一些样本井包含一个样本，而另一些样本井包含零个、两个或更多个样本。
本公开的一些实施例提供了一种用于重复使用集成器件来处理被分成多个等分试样的样本的方法。在各种实施例中，样本包括分析物，并且分析物包括生物分子，该生物分子包括一个或多个发光标记分子，该方法包括：将多个等分试样中的第一等分试样装载到集成器件的多个腔室中的至少一些腔室中；当分析物存在于多个腔室中的至少一些腔室中时，对第一等分试样的分析物进行采样，其中，采样步骤包括确定由一个或多个发光标记分子发射的信号的发光寿命、发光强度、波长、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间；从集成器件的多个腔室中的至少一些腔室移除第一等分试样；以及将多个等分试样中的第二等分试样装载到集成器件的多个腔室的至少一些腔室中。虽然在一些实施例中，术语等分试样可以指同一样本的部分，但在其他实施例中，第一等分试样和第二等分试样可以包括源自不同来源的第一样本和第二样本的部分。
一些实施例提供了一种用于重复使用集成器件来处理样本的方法，该样本包括分析物，该分析物包括生物分子，该生物分子包括一个或多个发光标记分子，该方法包括：将样本的至少一部分装载到集成器件的多个腔室中；当分析物存在于多个腔室中时，对样本的至少一部分的分析物进行采样，其中，采样步骤包括收集由一个或多个发光标记分子发射的信号，该信号指示发光寿命、发光强度、波长、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间；以及从多个腔室中移除样本的至少一部分，其中，该移除包括：破坏结合到多个腔室的表面的相应涂层分子与偶联部分之间的共价键，样本的至少一部分的分析物被结合到偶联部分。
一些实施例提供了一种用于确定样本是否存在于集成器件的一个或多个腔室中的方法，该方法包括：将样本的至少一部分装载到集成器件的一个或多个腔室中；从集成器件的一个或多个腔室移除样本的至少一部分；将激发光传递到集成器件的一个或多个腔室；在集成器件的光检测区处收集响应于激发光从多个腔室发射的信号；以及基于该信号确定样本的至少一部分中的至少一些是否存在于集成器件的一个或多个腔室中。
一些实施例提供了一种用于确定是否用集成器件继续处理样本的方法，该样本被分成多个等分试样，该方法包括：当分析物存在于集成器件的一个或多个腔室中时，对多个等分试样中的第一等分试样的分析物进行采样，所述采样包括：用从至少一个光源传递的激发光激发第一等分试样的分析物；以及在集成器件的光检测区处收集当被从至少一个光源传递的光激发时从第一等分试样的分析物发射的信号；以及基于从第一等分试样的分析物发射的信号，确定将多个等分试样中的第二等分试样装载到集成器件的一个或多个腔室中；以及将多个等分试样中的第二等分试样装载到集成器件的一个或多个腔室中。
一些实施例提供了一种用于处理样本的可重复使用的器件，样本被分成多个等分试样，该器件包括：多个反应腔室，用于接收多个等分试样中的第一等分试样，其中，多个反应腔室的表面涂覆有涂层分子，该涂层分子被配置为结合到与第一等分试样的分析物结合的偶联部分；光检测区，其被配置为接收响应于被传递到多个腔室的激发光而从多个腔室发射的信号；至少一个处理器，其被配置为基于由光检测区接收的信号来确定多个腔室是否包含第一等分试样的分析物的至少一部分。
一些实施例提供了一种方法，包括：将第一样本装载到可重复使用芯片的多个腔室中，可重复使用的芯片具有多个波导，用于将从包括至少一个光源的仪器接收的激发光引导到多个腔室，以及多个光检测区，用于接收从第一样本发射的光；将激发光从仪器的至少一个光源传递到可重复使用芯片的多个腔室；对第一样本的分析物进行定序；从可重复使用芯片的多个腔室移除第一样本；以及将第二样本装载到可重复使用芯片的多个腔室中。
一些实施例提供了一种器件，包括：可重复使用的芯片，用于与包括至少一个光源的仪器一起使用，可重复使用芯片包括：用于接收第一样本的多个腔室；多个波导，用于将激发光从至少一个光源引导到多个腔室；以及多个光检测区，用于接收从第一样本发射的光，其中，可重复使用芯片被配置为使得第一样本能够从多个腔室移除，并且在第一样本被移除之后第二样本能够被接收在多个腔室中。
一些实施例提供了通过芯片表面再生来重复使用芯片的器件和方法，其中，该器件和方法适用于生物或化学样本的大规模并行分析。在一些实施例中，这些器件和方法进一步适用于自动化的、大规模并行的分析。
附图说明
本公开的特征和优点将从下文结合附图所阐述的实施方式而变得更显而易见。当参考附图描述实施例时，可以使用方向参考(“在……上方”、“在……下方”、“顶部”、“底部”、“左侧”、“右侧”、“水平”、“垂直”等)。这种参考仅旨在作为读者在正常定向上观看附图的辅助。这些方向参考不旨在描述所体现的器件的特征的优选或唯一定向。器件可以使用其他定向来体现。
图1A是根据一些实施例的集成器件和仪器的框图
图1B是根据一些实施例的集成器件的示意图
图1C是根据一些实施例的集成器件的像素的示意图。
图1D是根据一些实施例的图1C的像素的电路图。
图1E是根据一些实施例的图1C的像素的俯视图
图1F是根据一些实施例的图1C和图1D的像素的平面图。
图1G是根据一些实施例的集成器件的替代像素的示意图
图1H是根据一些实施例的图1G的像素的电路图
图1I是根据一些实施例的图1C和图1D的像素的平面图。
图2A是根据一些实施例的已经固定在集成器件的腔室中的分析物的示例图。
图2B是根据一些实施例的用于重复使用图1A的集成器件以处理多个样本的示例性过程。
图3A是根据一些实施例的用于再生图1A的示例性集成器件的腔室的表面的示例性过程。
图3B是根据一些实施例的用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的另一示例性过程。
图3C是根据一些实施例的用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的另一示例性过程。
图3D是根据一些实施例的用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的另一示例性过程。
图4A-4D示出了根据一些实施例的描绘在芯片装载和再生过程中获得的分析物的存在的示例图。
图4E示出了根据一些实施例在不同条件下浸泡在示例性再生溶液中的样本的光谱。
图4F示出了根据一些实施例的示出在再生和装载步骤之间从示例性集成器件的反应腔室获取的信号的示例曲线图。
图4G-4I示出了根据一些实施例的示出在再生和装载步骤之间从示例性集成器件的反应腔室获取的信号的附加示例曲线图。
图4J示出了示出根据一些实施例的示出在再生和装载步骤之间从示例性集成器件的反应腔室获取的信号的附加示例曲线图。
图5A是根据一些实施例的描绘用于确定样本是否存在于图1A的集成器件的腔室中的示例性过程的流程图。
图5B是根据一些实施例的描绘用于确定是否用图1A的集成器件继续处理样本的示例性过程的流程图。
图6A是根据一些实施例的包括紧凑型锁模激光模块的分析仪器的框图。
图6B是根据一些实施例的并入到分析仪器中的示例性紧凑型锁模激光模块。
图6C示出了根据一些实施例的可以由脉冲激光器经由一个或多个波导光学地激发的平行反应腔室的示例。
图6D示出了根据一些实施例的集成器件反应腔室、光波导和时间分格光检测器的进一步细节。
图7A和7B示出了根据本公开的一些实施例中的再生芯片的示例性方法评定DNA分析物的定序精确度的实验的结果。图7A是示出从再生和装载步骤之间的示例性集成器件上的三次连续运行(两次芯片再生)中获得的信号之中的平均读取长度的线图。图7B示出了描绘这三次运行中的每一次的平均精确度、最大精确度和“对准”的线图。
图8A-8H示出了根据本公开的一些实施例中的再生芯片的示例性方法评定肽分析物的三个读取长度上的定序准精确度的实验的信号读出结果。在两个CMOS芯片上重复该实验。
图9示出了根据一些实施例的用于使用光漂白信息校准包括集成器件的系统的示例过程。
图10-1示出了根据一些实施例的附着到表面的染料标记的样本。
图10-2示出了根据一些实施例的附着在反应腔室中的染料标记的样本。
图11示出了根据一些实施例的示出光源激发功率随时间变化的示例曲线图。
图12-1示出了根据一些实施例的示出来自参考染料的测量信号随时间变化的示例曲线图。
图12-2示出了根据一些实施例的反应腔室中单分子集合的测量漂白时间和染料强度的示例直方图。
图13示出了根据一些实施例的在反应腔室中的定序反应。
图14示出了根据一些实施例的用于量化一个或多个反应腔室的装载的示例过程。
图15-1示出了根据一些实施例的来自芯片装载过程的表示单个装载井的示例迹线。
图15-2示出了根据一些实施例的来自芯片装载过程的表示双装载井的示例迹线。
图15-3示出了根据一些实施例的来自芯片装载过程的表示多装载井的示例迹线。
图16示出了根据一些实施例的可逆地结合到生物分子的荧光分子的周期性脉冲模式。
图17示出了根据一些实施例的反应腔室的示例热图，其示出了百分比装载。
具体实施方式
I.引言
本公开的各方面涉及用于再生传感器芯片表面的方法和系统，传感器芯片形成集成器件的全部或一部分。特别地，根据一些实施例，提供了通过在连续采样周期之间再生传感器芯片的表面来在多个采样周期中重复使用单个传感器芯片的技术。
一种集成器件可以包括具有多个反应腔室的传感器芯片，每个反应腔室用于接收样本。可以通过用激发光激发设置在多个反应腔室中的样本的部分，并用光检测器收集响应于激发而从样本发射的信号来获得样本数据。为了进行采样，存在于反应腔室中的部分样本被固定。例如，每个反应腔室的表面可以用分子(诸如生物素)涂覆，并且样本部分可以用生物素结合蛋白(诸如链霉亲和素)功能化，以将样本部分固定在反应腔室中。通常，在执行采样之后设置传感器芯片。
在许多应用中，期望检测样本中的大量分析物物种。然而，执行采样的集成器件在像素的数量上是有限的，并且因此可以用于接收样本的分析物物种的反应腔室在数量上是有限的。集成器件上的反应腔室的数量通常小于期望采样的分析物物种的数量。此外，尽管样本可以被稀释以获得使接收单个分析物物种的反应腔室的数量最大化的滴定，但是许多反应腔室仍然不能产生有用的测量，因为它们要么不包含分析物，要么包含两种或更多种分析物物种，使得不可能获得期望的单个分析物测量。因此，单个集成器件通常无法处理包含大量物种的样本。
在单个样本中对大量分析物物种进行采样的一种技术是将样本分为若干部分，在本文中被称为等分试样，并将等分试样单独处理，作为单独的实验。例如，样本的每个等分试样可以由相应的集成器件单独处理。然而，这种技术是昂贵的，因为它需要使用多个集成器件。
发明人已经认识到，在设置集成器件之前，重复使用单个集成器件对单个样本和/或多个样本执行多个实验是有利的。这样，可以使用单个集成器件在连续的实验中处理包括被分成多个等分试样的大量分析物物种的样本。根据常规技术，样本可以通过以下方式处理：(1)用分子(诸如生物素)涂覆芯片表面；(2)装载样本的第一等分试样，该样本包含结合到用于结合到涂层的偶联部分的分析物，诸如链霉亲和素，并允许标记的分析物结合到芯片的表面；(3)冲洗未结合的物种；以及(4)执行测量(例如通过激发结合到反应腔室表面的分析物并收集从激发的分析物发射的信号)。如本文所述，将样本稀释到使仅接收单一种类分析物的反应腔室的数量最大化的滴定，也导致不包含分析物的多个反应腔室。因此，可以用第二等分试样重新装载集成器件，以便于在未被占用的反应腔室中的分析物的测量。然而，从第一等分试样的初始装载开始反应腔室的占用可能抑制或干扰第二等分试样中分析物的测量。
因此，发明人开发了用于再生先前使用的传感器芯片表面的技术。特别地，本文描述的技术涉及一种用于卸载分析物物种的方法，该分析物物种先前已经通过生物素-链霉亲和素键或其他相互作用被结合到传感器芯片的表面。例如，用于卸载传感器芯片的示例技术包括(a)破坏结合的锚定(例如，链霉亲和素和生物素)；(b)从传感器芯片的表面剥离分子(例如，生物素)涂层；(c)在占用的反应腔室中酶促消化样本分析物；以及(d)熔化样本分析物和偶联部分(例如链霉亲和素、生物素)之间的键。在再生传感器芯片表面之后，可以用样本的第二等分试样重新装载集成器件。这种技术允许处理包括多个等分试样的整个样本，尽管样本中存在大量的分析物物种。
发明人进一步认识到，在将集成器件重复用于多个实验时，集成器件的组件可能会随着传感器芯片的长期使用而退化。因此，本文描述的技术的一些方面涉及用于增加集成器件的使用寿命的技术。
在一些实施例中，本文描述的用于集成器件的传感器芯片表面的再生的技术可以与DNA/RNA和/或蛋白质定序应用结合使用。
应当理解，本文描述的集成器件可以单独或组合地采用本文描述的任何或所有技术。此外，除了本文描述的那些集成器件之外的其它集成器件可以采用所描述的方法和结构。
表面功能化或涂层
在某些实施例中，本文描述的技术可以用于将感兴趣的分子涂覆(或功能化或限制)到样本井(本文也被称为反应腔室)的期望区域。在一些实施例中，样本井占据由在集成器件的表面处形成的开口限定的体积或空间，该开口延伸穿过集成器件的第一层并进入集成器件的第二层直到开口远端的底表面。在一些实施例中，设置在样本井的开口和底表面之间的第一层和第二层的暴露表面可以被称为侧壁，其进一步限定了样本井占据的体积或空间。
在一个或多个分析物(例如，DNA分析物或肽分析物)被固定在底表面上时的实施例中，可能需要涂覆底表面以允许一种或多种分子或复合物的附着。在一些实施例中，底表面用涂层分子涂覆。在一些实施例中，涂层分子是抗生物素蛋白。抗生物素蛋白是生物素结合蛋白，通常在抗生物素蛋白的四个亚基中的每一个都具有生物素结合位点。抗生物素蛋白包括，例如，抗生物素、链霉亲和素(streptavidin)、曲他抗生物素(traptavidin)、他抗生物素(amavidin)、bradavidin、xenavidin及其同源物和变体。在一些实施例中，抗生物素蛋白是链霉亲和素。抗生物素蛋白的多价性可以允许各种连接配置，因为四个结合位点中的每一个都能够独立地结合生物素分子。
在某些实施例中，涂层分子是生物素、链霉亲和素和生物素-链霉亲和素复合物中的一种。在一些实施例中，涂层分子是生物素的类似物或链霉亲和素的类似体。在一些实施例中，涂层分子是双生物素。在一些实施例中，涂层分子参与与偶联部分(诸如链霉亲和素部分)的相互作用，诸如双生物素-链霉亲和素键。
在一些实施例中，涂层分子是包含烷基链的硅烷。在一些实施例中，涂层分子是包含任选取代的烷基链的硅烷。在一些实施例中，涂层分子是包含聚(乙二醇)链的硅烷。在一些实施例中，涂层分子是包含偶联部分的硅烷。例如，偶联部分可以包括化学部分，诸如胺基、羧基、羟基、巯基、金属、螯合剂等。可替选地，偶联部分可以包括特异性结合元件，诸如生物素、抗生物素、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、凝集素、(自标记蛋白质标签)、联合或结合肽或蛋白质、抗体或抗体片段、核酸或核酸类似物等。偶联部分可以包括甲基醚基团。附加地或可替选地，中间结合剂和/或共聚物可以用于偶联用于与感兴趣分子偶联或结合的附加基团，在某些情况下，附加基团可以包括化学官能团和特异性结合元素。例如，偶联部分，例如生物素，可以沉积在基底表面上，并在给定区域选择性地活化。然后可以将中间结合剂，例如链霉亲和素偶联到生物素偶联部分。感兴趣的分析物(在示例性工作流程中其本身可以是生物素化的)然后被偶联到链霉亲和素。
生物素的化学结构被重现如下：
链霉亲和素含有四个生物素结合位点。即使在将链霉亲和素涂覆到样本井的底表面上之后，仍保留三个额外的结合位点用于与生物素或生物素缀合的聚合物缀合。
涂层分子的示例包括但不限于反式环辛烯(TCO)部分、四嗪部分、叠氮化物部分、炔烃部分、醛部分、甲基醚部分、异氰酸酯部分、N-羟基琥珀酰亚胺部分、硫醇部分、烯烃部分、二苯并环辛烯部分、双环壬基部分和焦磷酸硫胺素部分。包含共价偶联部分的涂层分子的示例包括但不限于叠氮化物-硅烷和叠氮化物-有机硅烷，诸如叠氮化物-PEG-硅烷(例如叠氮化物-PEG3-硅烷、叠氮化物-PEG 5-硅烷)和叠氮化物-烷基硅烷(例如，叠氮化物-C11-硅烷)。在一些实施例中，偶联部分是非共价偶联部分。
偶联部分的示例包括但不限于生物素部分、抗生物素蛋白、链霉亲和素蛋白、凝集素蛋白、SNAP标签、甲基醚和生物素-链霉亲和素复合物(例如，双-生物素-链霉亲和素复合物)。示例性的生物素部分包括单生物素(游离生物素)和双生物素。在一些实施理中，偶联部分包括抗生物素蛋白。
在一些实施例中，该方法还包括用多种涂层分子涂覆样本井的底表面，诸如第一涂层分子和第二涂层分子。第二涂层分子可以包括生物素部分、抗生物素蛋白、链霉亲和素蛋白、叠氮化物部分、炔烃部分、酮部分、羟胺部分。在一些实施例中，第二涂层分子是生物素部分或链霉亲和素蛋白。在一些实施例中，第一涂层分子和第二涂层分子是相同的。在一些实施例中，第一涂层分子和第二涂层分子是不同的。在一些实施例中，第一涂层分子和第二涂层分子都是生物素。在一些实施例中，第一涂层分子和第二涂层分子都是链霉亲和素。在一些实施例中，第二涂层分子是叠氮化物部分。在一些实施例中，将分析物固定到包括生物素部分的第一涂层剂上，而包含叠氮化物部分的第二偶联部分是非结合的。
如本文所用，在一些实施例中，“表面”是指含有一个或多个样本井的基板或固体支撑体的表面。在一些实施例中，固体支撑体是指具有表面(诸如接收表面)的材料、层或其他结构，其能够支撑沉积的材料，诸如本文描述的功能化肽或DNA聚合酶。在一些实施例中，基板的接收表面可以可选地具有一个或多个特征，包括纳米级或微尺度的凹陷特征，诸如样本井阵列。在一些实施例中，阵列是诸如传感器或样本井的元件的平面布置。阵列可以是一维的，也可以是二维的。一维阵列是在第一维度中具有一行或一列元素并且在第二维度中具有多行或多列元素的阵列。第一维度和第二维度中的行或列的数量可以相同，也可以不相同。在一些实施例中，阵列可以包括例如102、103、104、105、106或107个样本井。
II.集成器件概述
本文所述的技术可以用于再生集成器件的传感器芯片的表面。集成器件可以有助于将来自位于仪器内的一个示例性实施例中的一个或多个激发源的激发光提供给包含集成器件内的样本的反应腔室。激发光可以至少部分地由诸如集成器件的波导的元件导向包含反应腔室的一个或多个像素，以照射反应腔室内的照明区域。设置在反应腔室中的样本，或附着在样本上的反应组分(例如，诸如荧光标记物)，当位于反应腔室的照明区域内时，响应于被激发光照射可以发射出发射光。在一些实施例中，一个或多个激发源位于仪器内，集成器件插入到该仪器中并进行协作，这两者都是整个系统的一部分。
尽管集成器件重复使用概念是针对示例性系统实施例进行描述的，其中集成器件插入并协作的仪器包括至少一个激光光源，并且集成器件包括用于引导光的波导和具有反应腔室和检测区域的像素，但创新并不限于此。设想了其他仪器设计和集成器件设计，包括光源不位于仪器内的设计和/或附加光学组件位于仪器内(例如，“芯片外”)而非集成器件内的设计。
从一个或多个反应腔室(例如，在一些实施例中，至少两个反应腔室)发射的发射光可以由集成器件的像素内的一个或多个光检测器检测。如本文所述，集成器件可以被配置为具有多个像素(例如，像素阵列)，并且因此可以具有多个反应腔室和对应的光检测器。检测到的发射光的特性可以提供用于识别与发射光相关联的标签的指示。这种特性可以包括任何合适类型的特性，包括由光检测器检测到的光子的到达时间、由光检测器随时间积累的光子的量、和/或光子在两个或更多个光检测器上的分布。在一些实施例中，光检测器可以具有允许检测与发射光相关联的一个或多个特性的配置，诸如定时特性(例如，发光寿命、脉冲持续时间、脉冲间持续时间)、波长和/或强度。作为一个示例，在激发光的脉冲传播通过集成器件之后，一个或多个光检测器可以检测光子到达时间的分布，并且到达时间的分布可以提供发射光的定时特性的指示(例如，发光寿命、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间的代理)。这种信息可以被用于检测和/或识别样本中分子的技术，例如，包括于2019年11月15日以代理人案卷号R0708.70042US02提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS FORPROTEIN SEQUENCING”的第16/686028号美国专利申请、2019月15日以代理人案卷号R0708.70042WO00提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTEIN SEQUENCING”的第PCT/US19/61831号PCT申请、2021年3月2日以代理人案卷号R0708.70090US01提交的题为“INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SIGNAL ANALYSIS”的第17/190331号美国专利申请、2017年5月22日以代理人案卷号R0708.70018US02提交的题为“LABELEDNUCLEOTIDE COMBINATIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING”的第15/600979号美国专利申请，以及2016年5月20日以代理人案卷号R0708.70020US00提交的题为“METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING”的第15/161125号美国专利申请描述的那些，每个申请的全部内容均通过引用并入本文。在一些实施例中，一个或多个光检测器提供由荧光标记物发射的发射光的概率的指示(例如，发光强度)。在一些实施例中，一个或多个光检测器可以被设定尺寸和布置为捕获发射光的空间分布(例如，波长)。来自一个或多个光检测器的输出信号可以被用于将荧光标记从多个标记中区分开来，其中多个标记可以被用于识别样本或其结构，如本文所述。
如本文所用，“集成器件”是指能够与基础仪器接口的器件。在一些实施例中，集成器件可以包括一个或多个样本井和/或传感器。在一些实施例中，集成器件可能能够与发射或检测光的基础仪器接口。在这种实施例中，集成器件可以包括一个或多个样本井，每个样本井包括波导。“集成器件”在本文中可以被称为微芯片(或“芯片”)，诸如CMOS芯片。示例性集成器件是包含像素阵列的CMOS芯片，其中各个像素包括样本井和光检测器。
在一些方面，本公开提供了一种集成器件，该集成器件包括基板，该基板包括具有金属氧化物表面和二氧化硅表面的样本井。在一些实施例中，集成器件还包括由两亲试剂形成的金属氧化物表面上的涂层，该两亲试剂包括亲水性头基和疏水性尾基。在一些实施例中，集成器件还包括结合到二氧化硅表面的官能化剂，其中官能化剂包括偶联部分。在一些实施例中，基板包括样本井阵列，每个样本井具有金属氧化物表面和二氧化硅表面。在一些实施例中，阵列是微制造的微阵列。在一些实施例中，基板包含128,000个样本井。在一些实施例中，样本井包括形成在基板表面处的顶部孔隙和远离基板表面的底表面。在一些实施例中，底表面由二氧化硅表面构成。
在一些实施例中，样本井包括固定化区域，该固定化区域可以是结合感兴趣的分析物的基板表面的离散区域，诸如具有多肽或核酸偶联到该表面的样本井的底表面。在一些实施例中，样本井包括被制造成基板或器件的具有限定形状和体积的中空部或井。样本井可以使用本领域中描述的技术来制造，例如，如美国申请第16/555,902号中所公开的，该申请全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，样本井由包括非金属层的底表面和包括金属层的侧壁表面形成。在一些实施例中，非金属层包括透明层(例如，玻璃、二氧化硅)。在一些实施例中，金属层包括金属氧化物表面(例如，二氧化钛)。在一些实施例中，金属层包括钝化涂层(例如，含磷层，诸如有机膦酸酯层)。底表面可以包括非金属层，该非金属层包括功能部分。在一些实施例中，样本井包括包含铝膜、氮化钛(tinite)膜或两者的顶表面。顶表面还可以包括选择性表面化学涂层，诸如本领域已知的涂层。在一些实施例中，集成器件被配置为与下一代定序仪器接口，诸如台式下一代定序(NGS)仪器。
本文所述类型的集成器件可以包括一个或多个样本井，其被配置为在其中接收感兴趣的分子。在一些实施例中，样本井接收感兴趣的分子，该感兴趣分子可以设置在样本井的表面上，诸如底表面。在一些实施例中，样本井形成在集成器件内，其中，样本井的底表面远离其形成的集成器件的表面。在一些实施例中，感兴趣的分子将被设置在其上的底表面可以与波导具有一定距离，该波导被配置为用期望水平的激发能量来激发感兴趣的分子。在一些实施例中，样本井可以相对于波导定位，使得沿着波导传播的光学模式的倏逝场与感兴趣的分子重叠。
例如，示例性系统1-100的示意图如图1A所示。该系统包括与仪器1-104接口的集成器件1-102。在一些实施例中，仪器1-104可以包括集成为仪器1-104的一部分的一个或多个激发源1-116。在一些实施例中，激发源可以在仪器1-104和集成器件1-102的外部，并且仪器1-104可以被配置为接收来自激发源的激发光并将激发光引导到集成器件。集成器件可以使用任何合适的插座与仪器接口，用于接收集成器件并将其保持与激发源精确光学对准。激发源1-116可以被配置为向集成器件1-102提供激发光。如图1A中示意性所示，集成器件1-102具有多个像素1-112，其中至少一部分像素可以对感兴趣的样本执行独立分析。这种像素1-112可以被称为“无源源像素”，因为像素从与像素分离的源1-116接收激发光，其中来自该源的激发光激发像素1-112中的一些或全部。激发源1-116可以是任何合适的光源。合适的激发源的示例在2015年8月7日以代理人案卷号R0708.70004US02提交的题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING AND ANALYZING MOLECULES”的第14/821688号美国专利申请中被描述，该申请的全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，激发源1-116包括多个激发源，这些激发源被组合以将激发光传递到集成器件1-102。多个激发源可以被配置为产生多个激发能量或波长。
参考图1B，像素1-112具有被配置为接收至少一个感兴趣的样本的反应腔室1-108和用于检测响应于用激发源1-116提供的激发光照射样本和反应腔室1-108的至少一部分而从反应腔室发射的发射光的光检测器1-110。在一些实施例中，反应腔室1-108可以将样本保持在集成器件1-102的表面附近，这可以容易地将激发光传递到样本并且检测来自样本或反应组分(例如，发光标记物)的发射光。如图1B所示的实施例所示，反应腔室1-108和光检测器1-110具有一一对应关系。在一些实施例中，如本文所述，每个像素可以包括每个光检测器的多个反应腔室。
用于将激发光从激发光源1-116耦合到集成器件1-102和将激发光引导到反应腔室1-108的光学元件可以位于集成器件1-102和仪器1-104中的一个或两个上。源至腔室光学元件可以包括位于集成器件1-102上的用于将激发光耦合到集成器件的一个或多个光栅耦合器，以及用于将激发光从仪器1-104传递到像素1-112中的反应腔室的波导。一个或多个分光器元件可以被定位在光栅耦合器和波导之间。分光器可以耦合来自光栅耦合器的激发光，并将激发光传递到波导中的至少一个。在一些实施例中，分光器可以具有允许将基本上均一的激发光传递穿过全部波导以使得波导中的每一个接收基本上相似量的激发光的配置。这种实施例可以通过提高集成器件的反应腔室接收的激发光的均一性来提高集成器件的性能。
反应腔室1-108、激发源至腔室光学件的一部分以及反应腔室至光检测器光学件位于集成器件1-102上。激发源1-116和源至腔室组件的一部分位于仪器1-104中。在一些实施例中，单个组件可以在将激发光耦合到反应腔室1-108以及将发射光从反应腔室1-1108传递到光检测器1-110时发挥作用。用于将激发光耦合到反应腔室和/或将发射光导向到光检测器的合适的组件的示例包括在描述于以下中的集成器件中：2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING，DETECTING AND ANALYZING MOLECULES”的第14/821,688号美国专利申请和2014年11月17日提交的标题为“INTEGRATED DEVICE WITHEXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING，DETECTING，AND ANALYZING MOLECULES”的第14/543,865号美国专利申请，这两个专利申请均以全文引用的方式并入。
像素1-112与其自身的单独反应腔室1-108和至少一个光检测器1-110相关联。集成器件1-102的多个像素可以被布置为具有任何合适的形状、大小和/或尺寸。集成器件1-102可以具有任何合适数量的像素。集成器件1-102中的像素的数量可以在大约100,000个像素到64,000,000个像素的范围内，或者在该范围内的任何值或值范围。在一些实施例中，像素可以被布置为1024像素乘2048像素的阵列。集成器件1-102可以以任何合适的方式与仪器1-104接口。在一些实施例中，仪器1-104可以具有接口，该接口可拆卸地耦合到集成器件1-102，使得用户可以将集成器件1-1102附接到仪器1-104，以供集成器件1-102使用于分析悬浮液中的至少一个感兴趣的样本，并且从仪器1-104移除集成器件1-102以允许另一个集成器件附接。仪器1-104的接口可以将集成器件1-102定位为与仪器1-104的电路耦合，以允许将来自一个或多个光检测器的读取信号传输到仪器1-104。集成器件1-102和仪器1-104可以包括用于处置与大像素阵列(例如，超过10,000个像素)相关联的数据的多通道、高速通信链路。
仪器1-104可以包括用于控制仪器1-104和/或集成器件1-102的操作的用户界面。用户界面可以被配置为允许用户将用于控制仪器的运作的信息输入到仪器中，该信息诸如命令和/或设定。在一些实施例中，用户界面可以包括按钮、开关、拨号盘和用于语音命令的麦克风。用户界面可以允许用户接收关于仪器和/或集成器件的执行的反馈(诸如恰当对准)，和/或通过来自集成器件上的光检测器的读取信号获得的信息。在一些实施例中，用户界面可以使用提供听觉反馈的扬声器来提供反馈。在一些实施例中，用户界面可以包括用于向用户提供视觉反馈的指示灯和/或显示屏幕。
在一些实施例中，仪器1-104可以包括被配置为与计算设备连接的计算机接口。计算机接口可以是USB接口、FireWire接口或任何其他合适的计算机接口。计算设备可以是任何通用计算机，诸如膝上型计算机或台式计算机。在一些实施例中，计算设备可以是经由合适的计算机接口通过无线网络可存取的服务器(例如，基于云端的服务器)。计算机接口可以有助于传达仪器1-104和计算设备之间的信息。可以将用于对仪器1-104进行控制和/或配置的输入信息提供给计算设备，并且经由计算机接口传输到仪器1-104。由仪器5-104生成的输出信息可以由计算设备经由计算机接口接收。输出信息可以包括关于仪器1-104的执行、集成器件1-102的执行的反馈，和/或从光检测器1-110的读取信号生成的数据。
在一些实施例中，仪器1-104可以包括处理设备，该处理设备被配置为分析从集成器件1-102的一个或多个光检测器接收到的数据，和/或将控制信号传输到激发源1-116。在一些实施例中，处理设备可以包括通用处理器、专门调适的处理器(例如中央处理单元(CPU)，诸如一个或多个微处理器或微控制器核心、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、定制集成电路、数字信号处理器(DSP)或其组合)。在一些实施例中，对来自一个或多个光检测器的数据的处理可以通过仪器1-104的处理设备和外部计算设备来执行。在其他实施例中，可以省略外部计算设备，并且对来自一个或多个光检测器的数据的处理可以仅通过集成器件1-102的处理设备来执行。
示出像素1-112的列的集成器件1-102的横截面示意图显示于图1B中。集成器件1-102可以包括耦合区1-201、布线区1-202和像素区1-203。像素区1-203可以包括具有定位在与耦合区1-201分离的位置处的表面上的反应腔室1-108的多个像素1-112，该位置为激发光(显示为虚线箭头)耦合到集成器件1-102的地方。反应腔室1-108可以通过金属层1-106形成。由点线矩形示出的一个像素1-112是包括反应腔室1-108和具有一个或多个光检测器1-110的光检测区的集成器件1-102的区。在所示的实施例中，像素包括单个反应腔室1-108。在一些实施例中，每个像素可以包括两个或更多个反应腔室。
图1B示出了通过将激发光束耦合到耦合区1-201并且耦合到反应腔室1-108来进行激发(以虚线显示)的路径。图1B中所示的反应腔室1-108的列可以被定位以与波导1-220光学耦合。激发光可以照射位于反应腔室内的样本。样本或反应组分(例如荧光标记物)可以响应于被激发光照射而达到激发状态。当样本或反应组分处于激发状态时，样本或反应组分可以发射出发射光，该发射光可以由与反应腔室相关联的一个或多个光检测器检测到。图1B示意性地示出从反应腔室1-108到像素1-112的光检测器1-110的发射光的光轴(显示为实线)。像素1-112的光检测器1-110可以被配置和定位为检测来自反应腔室1-108的发射光。合适的光检测器的示例被描述在2015年8月7日提交的标题为“INTEGRATED DEVICEFOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的第14/821,656号美国专利申请中，该专利申请以全文引用的方式并入。对于单个像素1-112，反应腔室1-108及其相应的光检测器1-110可以沿着公共轴(沿着图1A中所示的y方向)对准。以此方式，光检测器可以与像素1-112内的反应腔室重叠。
因为金属层1-106可以用于反射发射光，所以来自反应腔室1-108的发射光的方向性可以取决于样本在反应腔室1-108中相对于金属层1-106的定位。以此方式，金属层1-106和定位在反应腔室1-108中的荧光标记物之间的距离可以影响与反应腔室处于相同像素中的光检测器1-110检测由荧光标记物发射的光的效率。金属层1-106和反应腔室1-108的底部表面之间的距离可以在100nm至500nm的范围内，或为在该范围内的任何值或值范围。在一些实施例中，金属层1-106与反应腔室1-108的底部表面之间的距离为大约300nm。
样本与光检测器之间的距离也可以影响检测发射光的效率。通过缩减光必须在样本与光检测器之间行进的距离，可以提高发射光的检测效率。此外，样本与光检测器之间的较小距离可以允许像素占据集成器件的较小占用面积，这可以允许将较高数量的像素包括在集成器件中。反应腔室1-108的底部表面与光检测器之间的距离可以在1μm至15μm的范围内，或者在该范围内的任何值或值范围。应当理解，在一些实施例中，发射光可以通过除了激发光源和反应腔室之外的其他方式来提供。因此，一些实施例可以不包括反应腔室1-108。
光子结构1-230可以定位在反应腔室1-108与光检测器1-110之间，并且被配置为减少或防止激发光到达光检测器1-10，否则其会在检测发射光时造成信号噪声。如图1B所示，一个或多个光子结构1-230可以定位在波导1-220与光检测器1-110之间。光子结构1-230可以包括一个或多个光学排异光子结构，该一个或多个光学排异光子结构包括光谱滤波器、偏振滤波器和空间滤波器。光子结构1-230可以被定位以沿着公共轴与单个反应腔室1-108和它们相应的光检测器1-110对准。根据一些实施例，可以充当集成器件1-102的电路的金属层1-240还可以充当空间滤波器或偏振滤波器。在这种实施例中，一个或多个金属层1-240可以被定位以阻止一些或全部激发光到达光检测器1-110。
耦合区1-201可以包括被配置为耦合来自外部激发源的激发光的一个或多个光学组件，例如图1A中所示的激发源1-116。耦合区1-201可以包括被定位以接收激发光束中的一些或全部的光栅耦合器1-216。合适的光栅耦合器的示例被描述在2017年12月15日以代理人案卷号R0708.70021US01提交的题为“OPTICAL COUPLER AND WAVEGUIDE SYSTEM”的第15/844403号美国专利申请，以及2020年4月29日以代理人案卷号R0708.70071US01提交的题为“SLICED GRATING COUPLER WITH INCREASED BEAM ALIGNMENT SENSITIVITY”的第16/861399号美国专利申请中，每个申请的全部内容均通过引用并入本文。光栅耦合器1-216可以将激发光耦合到波导1-220，波导1-220可以被配置为将激发光传播到一个或多个反应腔室1-108附近。可替选地，耦合区1-201可以包括用于将光耦合到波导中的其他熟知结构。
位于集成器件之外的组件可被用于将激发源1-116定位和对准集成器件。这种组件可以包括光学组件，该光学组件包括透镜、反射镜、棱镜、窗、孔径、衰减器和/或光纤。附加机械组件可以被包括在仪器中，以允许对一个或多个对准组件的控制。这种机械组件可以包括致动器、步进电机和/或旋钮。合适的激发源和对准机构的示例被描述在2016年5月20日以代理人案卷号R0708.70010US02提交的题为“PULSED LASER AND SYSTEM”的第15/161088号美国专利申请中，该申请的全部内容通过引用并入本文。光束转向模块的另一个示例被描述在2017年12月14日以代理人案卷号R0708.70024US01提交的题为“COMPACTBEAM SHAPING AND STEERING ASSEMBLY”的第15/842720号美国专利申请，该申请通过引用并入本文。
可以将待分析的样本引入到像素1-112的反应腔室1-108中。样本可以是生物样本或任何其他合适的样本，诸如化学样本。样本可以包括多个分子，并且反应腔室可以被配置为隔离单个分子。在一些情况下，反应腔室的尺寸可以用于将单个分子约束在反应腔室内，从而允许对单个分子执行测量。激发光可以被传递到反应腔室1-108中，以便当样本处于反应腔室1-108内的照明区域内时激发样本或附着到样本或以其他方式与样本相关联的至少一个荧光标记物。
在操作中，通过使用激发光激发井内的部分或全部样本，并用光检测器检测样本发射的信号来进行对反应腔室内的样本的并行分析。来自样本的发射光可以由相应的光检测器检测，并被转换为至少一种电信号。如本文所述，可以收集关于发射光的各种特性(例如，波长、发光寿命、强度、脉冲持续时间和/或任何其他合适的特性)的信息，并将其用于后续分析。电信号可以沿着集成器件的电路中的导电线(例如，金属层1-240)传输，该导电线可以连接到与集成器件接口的仪器。可以随后处理和/或分析电信号。电信号的处理或分析可以在位于仪器上或仪器外的合适的计算设备上进行。
图1C示出了根据一些实施例的集成器件1-102的像素1-112的截面图。图1D示出了像素1-112的电路图。图1E示出了根据一些实施例的像素1-112和处理电路1-114的示例性阵列，其可以被包括在集成器件1-102中。
在图1C和图1D中，像素1-112包括：光检测区，其可以是钉扎光电二极管(pinnedphotodiode；PPD)；两个电荷储存区，其可以是储存二极管(SD0和SD1)；以及读出区，其可以是浮动扩散(floating diffusion；FD)区。同样如图所示，像素1-112还包括漏极区D以及转移闸ST0、TX0、TX1和REJ。
在一些实施例中，光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD可以通过掺杂集成电路基板的部分而形成在该基板上。例如，基板可以被轻度掺杂，并且光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD可以被更重度掺杂。在该示例中，基板可以是轻度p-型掺杂的，并且光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD可以是n-型掺杂的。可替选地，基板可以是轻度n-型掺杂的，并且光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD可以是p-型掺杂的，这是由于本文中描述的实施例不限于此。
在一些实施例中，光检测区PPD可以被配置为在入射光子接收在其中时产生电荷载子(例如，光电子)。在一些实施例中，电荷储存区SD0和SD1可以电耦合到光检测区PPD和/或彼此。例如，像素1-112可以包括将电荷储存区SD0和SD1电耦合到光检测区PPD和/或彼此的一个或多个转移通道。在一些实施例中，转移通道可以通过掺杂设置在该区之间的集成电路基板的部分而形成。例如，该部分可以掺杂有与该区相同的导电性类型(例如，设置在n-型掺杂的PPD与SD0之间的n-型掺杂通道)。参考图1D，例如，耦合在光检测区PPD与电荷储存区SD0之间的晶体管的通道是将光检测区PPD电耦合到电荷储存区SD0的转移通道。类似地，耦合在电荷储存区SD0与电荷储存区SD1之间的晶体管的通道是将电荷储存区SD0电耦合到电荷储存区SD1的转移通道，耦合在电荷储存区SD1与读出区FD之间的晶体管的通道为将电荷储存区SD1电耦合到读出区FD的转移通道。耦合在光检测区PPD与漏极区D之间的晶体管的通道是光检测区PPD与漏极区D之间的转移通道。
在一些实施例中，转移闸ST0、TX0、TX1和REJ可以被配置为控制电荷载子从光检测区PPD到储存区SD0和SD1、在电荷储存区SD0与电荷储存区SD1之间和/或在电荷储存区SD0和SD1与读出区FD之间的转移。例如，转移闸ST0、TX0、TX1和REJ可以被电耦合到转移通道并且被配置为使转移通道偏压，该转移通道电耦合像素1-112的区，以在适当控制信号施加到转移闸时在该区之间转移电荷载子。根据各种实施例，转移闸可以导电地(例如，物理地)耦合到转移通道，和/或可以足够接近转移通道而定位，和/或由足够薄的绝缘体分离以电容耦合到转移通道。在一些实施例中，本文中描述的转移闸可以使用诸如金属的导电材料而形成。可替选地或附加地，在一些实施例中，本文中描述的转移闸可以使用诸如多晶硅的半导体材料而形成。在一些实施例中，用于形成本文中描述的转移闸的材料可以至少部分地不透明。
在一些实施例中，当在转移闸处接收控制信号时，转移闸可以将控制信号电耦合到转移通道并且使转移通道偏压，由此提高转移通道的电导率。在一些实施例中，转移通道可以掺杂有相同的导电性类型，但掺杂剂浓度比通过转移通道电耦合的像素1-112的区更低，从而在该区之间产生固有电位障壁。固有电位障壁即使在无外部电场施加到转移闸或转移通道时也可以存在于该区之间。例如，光检测区PPD与电荷储存区SD0之间的转移通道的掺杂剂浓度可以在光检测区PPD与电荷储存区SD0之间产生固有电位障壁。在一些实施例中，控制信号可以被施加到转移闸，该控制信号被配置为降低通过转移通道电耦合的该区之间的固有电位障壁，从而提高转移通道的电导率，并且引起电荷载子在该区之间的转移。例如，对于n-型掺杂转移通道，控制信号可以具有比该区中的一个处(例如，在转移通道的源极端子处)的电压大至少转移通道的阈值电压的电压，该阈值电压取决于转移通道的大小、接近转移通道的集成器件1-102的基板电压及其他此类参数。类似地，对于p-型掺杂转移通道，控制信号可以具有比该区中的一个处的电压低至少阈值电压的电压。在一些实施例中，集成器件1-102的控制电路可以被配置为产生这种控制信号并且将这种控制信号提供到转移闸，如本文中进一步描述。
在图1C中，像素1-112被示出为配置为在光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD与转移闸REJ、ST0、TX0和TX1间隔开的方向上接收入射光子的配置(例如，前侧照明)。然而，应当理解，在一些实施例中，光检测区PPD可以被配置为在转移闸REJ、ST0、TX0和TX1与光检测区PPD、电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD间隔开的方向上接收入射光子(例如，背侧照明)。在一些实施例中，这样的配置可以改善转移闸的电特性，因为转移闸的光学特性对入射光子的影响减小。
在图1D中，像素1-112进一步包括耦合到读出区FD并且被配置用于耦合到高电压VDDP的重置(RST)转移闸，以及耦合在读出区FD与位线之间的列选择(row select；RS)转移闸。当集成器件1-102耦合到电源(例如，至少DC电源)时，转移闸RST可以被耦合到高电压VDDP，该高电压VDDP由电源供应和/或由集成器件1-102的电压调节器调节。
在一些实施例中，转移闸RST可以被配置为重置读出区FD的电压。例如，当重置信号施加到转移闸RST时，转移闸RST可以使将读出区FD电耦合到高电压VDDP的转移通道偏压，从而提高转移通道的电导率并且将电荷载子从读出区FD转移到高电压VDDP。在一些实施例中，重置转移闸RST可以进一步被配置为重置电荷储存区SD0和/或SD1的电压。例如，当重置信号施加到重置转移闸RST并且控制信号施加到转移闸TX1时，转移闸TX1可以将电荷储存区SD1中的电荷载子转移到读出区FD并且转移闸RST可以将电荷载子转移到高电压VDDP。类似地，当重置信号被施加到重置转移闸RST并且控制信号施加到转移闸TX1和TX0时，转移闸TX0可以将电荷储存区SD0中的电荷载子转移到SD1，转移闸TX1可以将电荷储存区SD1中的电荷载子转移到读出区FD，并且转移闸RST可以将电荷载子转移到高电压VDDP。在一些实施例中，集成器件1-102可以被配置为在收集和读出电荷载子之前重置读出区FD以及电荷储存区SD0和SD1。例如，集成器件1-102可以被配置为在收集和读出电荷载子之前重置读出区FD，然后重置电荷储存区SD1，并且然后重置电荷储存区SD0。
在一些实施例中，位线可以耦合到集成器件1-102上的处理电路和/或外部电路，该外部电路被配置为接收指示读出到读出区FD的电荷载子的电压水平。在一些实施例中，处理电路1-114可以包括模数转换器(ADC)。在一些实施例中，集成器件1-102可以被配置为在读出电荷载子之前重置每个像素的读出区FD的电压。例如，集成器件1-102可以被配置为重置读出区FD的电压，对电压进行采样，将电荷载子转移到读出区FD中，并且再次对电压进行采样。在该示例中，在与第一采样电压相比时，第二采样电压可以指示转移到读出区FD中的电荷载子的数目。在一些实施例中，集成器件1-102可以被配置为按序将电荷载子从每个像素1-112读出到位线，诸如逐列和/或逐行。应当了解，像素1-112的一些阵列可以具有电耦合到不同的像素1-112和/或像素1-112组的多个位线。在一些实施例中，多个行的像素可以同时被读出到相应的处理电路。例如，每一行的第一像素(例如，像素(1,1)和(1,2)等)可以同时被读出到相应的处理电路，并且随后每一行的第二像素(例如，像素(2,1)和(2,2)等)可以同时被读出到相应的处理电路。应当了解，在一些实施例中，作为每一行的替代例或除每一行之外，可以为阵列的每一列提供处理电路。在一些实施例中，集成器件1-102可以包括多个处理电路单元，诸如各自电耦合到位线。
应当了解，根据各种实施例，本文中描述的转移闸可以包括半导体材料和/或金属，并且可以包括场效晶体管(FET)的栅极、双极接面晶体管(BJT)的基极和/或其类似物。还应当了解，本文中描述的施加到各种转移闸的控制信号可以在形状和/或电压方面变化，诸如取决于半导体区的电位和电耦合到半导体区(例如，相邻区)的区的电位。
在一些实施例中，本文中描述的像素可以包括多于两个电荷储存区。例如，本文中结合图1G-1I描述的像素2-112包括三个电荷储存区。
图1E为根据一些实施例的替代性像素1-112’的平面图。在一些实施例中，像素1-112’可以针对像素1-112描述的方式来配置。在图1E中，像素1-112’的漏极区D与电荷储存区SD0和SD1以及读出区FD位于光检测区PPD的同一侧上。同样如图1E中所示，光检测区PPD可以包括具有三角形开口的掩模，其中三角形开口的底座在接近电荷储存区SD0和SD1以及漏极区D的光检测区的一侧上，并且三角形开口的对应顶点在光检测区PPD的与漏极区D以及电荷储存区SD0和SD1相对的一侧上。
在一些实施例中，光检测区PPD可以被配置为在从光检测区PPD朝向电荷储存区SD0和SD1以及漏极区D的方向上诱发固有电场。例如，光检测区PPD可以由通过开口掺杂集成器件1-102的基板而形成，从而在通过开口暴露的基板的区中产生比在掺杂期间通过掩模覆盖的区中更高的掺杂剂浓度。在该示例中，三角形开口的底座端处的较大量的掺杂剂(例如n-型掺杂剂)可以使得接近漏极区D和电荷储存区SD0的光检测区PPD的底座端处的电位低于光检测区PPD的相对侧上的光检测区PPD的顶点端处的电位。即使在不存在施加到像素1-112的外部电场的情况下，光检测区PPD中的固有电场也可以存在。发明人认识到，光检测区PPD的固有电场增加了从光检测区PPD到漏极区D和/或储存区SD0和SD1的电荷转移速率，从而提高在像素1-112的操作期间对电荷载子被排放和/或收集的效率。在图1E的示例中，可以沿漏极区与电荷储存区SD0之间的点线箭头引导固有电场。例如，固有电场可以使电荷载子沿点线箭头流动，并且由施加到转移闸REJ或ST0的控制信号诱发的外质电场可以使电荷载子分别流动到漏极区D或电荷储存区SD0。
图1F为根据一些实施例的像素1-112’的俯视示意图。如图1F中所示，接点可以设置在像素1-112’的部分上方。在一些实施例中，接点可以被配置为阻止入射光子到达除光检测区PPD之外的像素1-112’的部分和/或阻止入射光子以倾斜入射角到达相邻像素的光检测区。例如，接点可以在平行于光轴的方向上伸长，光检测PPD被配置为沿该光轴接收入射光子。在一些实施例中，可以使用诸如钨的不透明材料形成接点。本发明人已认识到，本文中所描述的接点防止许多或所有入射光子沿着除光轴之外的光学路径到达电荷储存区SD0和SD1，从而防止入射光子在电荷储存区SD0和SD1中产生噪声电荷载子。
在图1F中，一对接点设置在光检测区PPD的相对侧上，其中该对中的第一接点更接近于掩模的三角形开口的顶点而设置，并且该对中的第二接点更接近于掩模的三角形开口的底座而设置。第二接点可以被配置为阻挡入射光子到达电荷储存区SD0和SD1。第三接点设置在与设置有光检测区PPD的末端相对的像素1-112的末端处。第一接点和第三接点设置在像素1-112与相应的相邻像素之间，并且第二接点设置在光检测区PPD与转移闸ST0和REJ之间。应当了解，在一些实施例中，光检测区PPD的相对侧上的该对接点可以由至少部分地包围光检测区PPD的至少一个接触壁(诸如单个圆柱形接触壁)替换。
图1G是根据一些实施例的可以被包括在集成器件1-102中的替代示例像素2-112的截面图。在一些实施例中，像素2-112可以以结合图1A-1F针对像素1-112所描述的方式来配置。例如，如图1G所示，区域FD和漏极区D以及转移闸，其中的每一个可以以针对像素1-112所描述的方式来配置。像素2-112还包括电耦合在电荷储存区SD1和读出区FD之间的电荷储存区SD2。例如，传输通道可以将电荷储存区SD1电耦合到电荷储存区SD2，并且将电荷存储区SD2电耦合到读出区FD。在图1G中，转移闸TX0被配置为控制电荷载子从电荷储存区SD1到电荷储存区SD2的转移，并且转移闸TX1被配置为控制对电荷载子从电荷储存区SD2到读出区FD的转移。
图1H为根据一些实施例的像素2-112的电路图。如图1H中所示，将电荷储存区SD1电耦合到电荷储存区SD2的转移通道为具有转移闸TX0的晶体管的通道，并且将电荷储存区SD2电耦合到读出区FD的转移通道为具有转移闸TX1的晶体管的通道。图1H中所示的像素2-112的其他晶体管，诸如具有重置闸RST的晶体管和具有列选择转移闸RS的晶体管，可以以针对像素1-112描述的方式来配置。例如，像素2-112的阵列可以以具有如本文针对像素1-112所描述的处理电路的配置来布置。
图1I为根据一些实施例的可以被包括在图1B的集成器件1-102中的像素2-112’的俯视图。在一些实施例中，像素2-112’可以以本文针对像素1-112’描述的方式配置。例如，像素2-112’的光检测区PPD可以被配置为在从光检测区PPD朝向电荷储存区SD0和漏极区D的方向上诱发固有电场。
在一些实施例中，集成器件包括样本制备模块，其能够执行制备生物样本的过程，例如用于检测和/或分析。在一些实施例中，本文所述的制备生物样本的过程可以用于识别样本的性质或特征，包括生物样本中一种或多种靶分子的身份或序列(例如，核苷酸序列或氨基酸序列)。在一些实施例中，生物样本是单细胞、哺乳动物细胞组织、动物样本、真菌样本或植物样本。在一些实施例中，生物样本是血液样本、唾液样本、痰样本、粪便样本、尿液样本、口腔拭子样本、羊水样本、精液样本、滑膜样本、脊柱样本或胸膜液样本。在一些实施例中，生物样本来自人类、非人灵长类动物、啮齿动物、狗、猫、马或任何其他哺乳动物。在一些实施例中，生物样本来自细菌细胞培养物(例如，大肠杆菌细菌细胞培养物)。在一些实施例中，一种或多种靶分子是核酸。在一些实施例中，一种或多种靶分子是蛋白质。
在一些实施例中，制备生物样本的方法可以包括一个或多个样本转化步骤，诸如样本裂解、样本纯化、样本片段化、片段化样本的纯化、库制备(例如，核酸库制备)、库制备的纯化、样本富集(例如，使用亲和SCODA)和/或靶分子的检测/分析。
在一些实施例中，可以制备样本(例如，包括细胞或组织的样本)，例如裂解(例如，破坏、降解和/或以其他方式消化)。在一些实施例中，使用任何一种已知的物理或化学方法裂解包括细胞或组织的样本，以从所述细胞或组织释放靶分子(例如，靶核酸或靶蛋白)。在一些实施例中，可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法裂解样本。例如，可以使用电解法、酶促法、基于洗涤剂的方法和/或机械均化来裂解样本。在一些实施例中，样本(例如，复杂组织、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)可能需要连续进行多种裂解方法。在一些实施例中，在缓冲系统的存在下制备样本，例如裂解样本。该缓冲系统可以用于在任何已知的裂解方法(包括本文所述的那些方法)期间制作样本的浆液、悬浮样本和/或稳定样本。在一些实施例中，通过机械均化引起裂解的方法包括但不限于珠击、加热(例如，加热到足以破坏细胞壁的高温，例如，大于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或95℃)、注射器/针/微通道通路(引起剪切)、超声处理或用研磨机浸渍。在一些实施例中，样本制备包括细胞破坏(即，裂解后随后去除不需要的细胞和组织元素)。在一些实施例中，细胞破坏涉及蛋白质和/或核酸沉淀。在一些实施例中，在沉淀之后，对裂解和破坏的样本进行离心。在一些实施例中，在离心之后，丢弃上清液。在一些实施例中，蛋白质或肽是免疫沉淀的。
在一些实施例中，样本(例如，包括靶核酸或靶蛋白的样本)可以在例如裂解之后在根据本公开的方法中纯化。在一些实施例中，可以使用色谱法(例如选择性结合样本的亲和色谱法)或电泳来纯化样本。在一些实施例中，可以在沉淀剂的存在下纯化样本。在一些实施例中，在纯化步骤或方法之后，可以使用洗脱缓冲液洗涤样本和/或从纯化基质(例如亲和层析基质)中释放样本。在一些实施例中，纯化步骤或方法可以包括使用可逆可切换的聚合物，诸如电活性聚合物。在一些实施例中，可以通过样本通过多孔基质(例如，乙酸纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺)的电泳通道来纯化样本。
在一些实施例中，样本(例如，包括靶核酸或靶蛋白的样本)可以在根据本公开的过程中被片段化(即消化)。在一些实施例中，核酸样本可以被片段化以产生用于序列特异性鉴定的小片段(<1千碱基)至用于长读定序应用的大片段(高达10+千碱基)。在一些实施例中，核酸或蛋白质的片段化可以使用机械(例如，流体剪切)、化学(例如，铁(Fe+)裂解)和/或酶促(例如，限制性内切酶、使用转座酶的标记)方法来完成。在一些实施例中，蛋白质样本可以被片段化以产生任何长度的肽片段。在一些实施例中，蛋白质的片段化可以使用化学和/或酶(例如，蛋白水解酶，诸如胰蛋白酶)方法来完成。在一些实施例中，平均片段长度可以通过反应时间、温度和样本和/或酶(例如限制性内切酶、转座酶)的浓度来控制。在一些实施例中，核酸可以通过标记而被片段化，使得核酸同时被片段化并用荧光分子(例如荧光团)标记。在一些实施例中，可以对片段化样本进行一轮纯化(例如，色谱或电泳)，以去除小的和/或不需要的片段以及片段化步骤中使用的残余有效载荷、化学物质和/或酶(例如，转座酶)。
在一些实施例中，样本(例如，包含靶核酸或靶蛋白的样本)可以在根据本公开的方法中富集靶分子。当未富集样本的复杂性超过定序平台的能力时，或者当靶分子以低丰度存在于样本中时(例如，使得其无法容易地被定序平台检测到)，通常使用富集。富集涉及使用一种选择性地扩增靶分子的机制。这种富集可以涉及使用抗体、适体、基于大小的选择或基于静电电荷的选择，以便选择性地扩增靶分子(例如，靶蛋白或靶核酸)。当样本制备的目的是对特定的靶分子进行定序时，通常可以使用富集。当靶分子彼此相关或同源时，富集可以用于执行或进行蛋白质组学、基因组学或宏基因组分析或调查。
在一些实施例中，使用电泳方法富集样本中的靶分子。在一些实施例中，使用亲和SCODA富集样本的靶分子。在一些实施例中，使用场反转凝胶电泳(FIGE)富集样本的靶分子。在一些实施例中，使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)富集样本中的靶分子。在一些实施例中，富集期间使用的基质(例如多孔介质、电泳聚合物凝胶)包括与样本中存在的靶分子结合的固定化亲和剂(也被称为“固定化捕获探针”)。在一些实施例中，富集期间使用的基质包括1、2、3、4、5或更多独特的固定化捕获探针，每种探针结合独特的靶分子和/或以不同的结合亲和力结合相同的靶分子。
除了扩增靶分子，或者作为扩增靶分子的替代方案，可以通过耗尽不需要的非靶分子(例如，高丰度蛋白质(例如白蛋白))来富集样本(例如，对于低丰度靶分子)。不需要的非靶分子的消耗可以使用如上所述的类似捕获策略来执行。当使用耗尽策略时，捕获探针将与不需要的非靶分子结合，并允许靶分子留在溶液中。该策略同样能够富集靶分子(即，增加靶分子的相对浓度)。
在一些实施例中，在确定靶核酸的序列之前，对靶核酸进行富集(例如，使用电泳方法富集，例如，亲和SCODA)。在一些实施例中，本文提供了确定存在于样本(例如，纯化样本、细胞裂解物、单细胞、细胞群或组织)中的多种靶核酸(例如，至少2、3、4、5、10、15、20、30、50或更多)的序列的方法。在一些实施例中，在确定样本中存在的靶核酸或多种靶核酸的序列之前，如本文所述制备样本(例如裂解、纯化、片段化和/或富集靶核酸)。在一些实施例中，靶核酸是富集的靶核酸(例如，使用电泳方法富集，例如亲和SCODA)。
在一些实施例中，在根据本公开的过程中，可以在富集和随后释放之后检测一种或多种靶分子，以能够分析所述靶分子及其上游样本。在一些实施例中，可以使用基因定序、吸光度、荧光、电导率、电容、表面等离子体共振、杂交捕获、抗体、核酸的直接标记(例如，末端标记、标记的标记有效载荷)、嵌入染料的非特异性标记(例如溴化乙锭、SYBR染料)或用于核酸检测的任何其它已知方法来检测目标核酸。在一些实施例中，可以使用吸光度、荧光、质谱、氨基酸定序或任何其他已知的蛋白质或肽检测方法来检测目标蛋白质或肽片段。
在一些实施例中，器件还包括泵(例如，蠕动泵)，其被配置为将一种或多种流体输送到器件的任何一个模块中、模块内或模块外。在一些实施例中，器件还包括泵(例如，蠕动泵)，其被配置成在由器件或器件的模块接收的盒的任何微流体通道内或通过其输送一种或多种流体。在一些实施例中，器件被配置为输送具有小于或等于1000微升、小于或等于100微升、小于或等于50微升或小于或等于10微升的流体流量分辨率的流体。在一些实施例中，该器件被配置为同时接收两个或更多个盒。在一些实施例中，该器件被配置为在由该器件同时接收的两个或更多个盒之间建立流体连通。在一些实施例中，该器件被配置为顺序地接收两个或更多个盒。
在一些实施例中，蠕动泵包括一个装置，该装置包括轧辊和流体器件(例如，盒)。在一些实施例中，蠕动泵包括一个装置，该装置包括轧辊和连接到轧辊的曲柄摇杆机构。在一些实施例中，该器件包括样本制备模块，该样本制备模件包括蠕动泵，该蠕动泵包括流体盒，该流体盒包括具有包括通道的表面的基底层，其中，至少一些通道的至少一部分具有大致三角形的横截面，该横截面在通道的底部具有单个顶点，并且在基底层的表面具有两个其它顶点。检测模块可以在样本制备模块的下游。在一些实施例中，样本制备区域包括一个以上的流体盒。
根据一些方面，提供了一种流体系统。根据一些实施例，流体系统可以用于例如使用蠕动泵送将流体转移到流体容器。根据一些实施例，流体系统包括被配置为使用对准特征件来接收流体容器的盒或模块。根据某些实施例，盒或模块被配置为经由对准特征件被流体连接到流体容器。这可以允许器件的盒或模块同时与流体容器对准并流体连接到流体容器。根据某些实施例，这种类型的连接有利地减少了器件的盒或模块与流体容器之间的流体连接的死体积(例如，通过减少对过量通道长度的需要)。
如果在实施例的某些配置下，流体可以在两个组件之间通过，则两个组件是流体连接的。例如，如果第一流体组件和第二流体组件通过通道、微通道或管连接，则它们可以流体连通。作为另一个示例，被阀分开的两个组件仍然被认为是流体连接的，只要阀可以被配置为允许流体在两个组件之间流动。相反，仅机械连接而在它们之间没有流体路径的两个组件将不被认为是流体连接的。流体连接的组件可以直接流体连接(即，通过不穿过任何中间组件的流体路径连接)。然而，在一些情况下，流体连接的组件可以通过流体路径通过1、2、3、4、5、8、10、15、20或更多的中间组件连接。
根据一些实施例，该器件包括通道。在一些实施例中，通道流体连接到器件的对准特征件。对准特征件可以是器件的第一对准特征件。根据一些实施例，该器件还包括第二对准特征件。根据某些实施例，第二对准特征件被连接到通道，例如，经由由穿过流体容器的流体路径建立的流体连接。然而，在一些实施例或配置中，第二对准特征件不被连接到通道。根据一些实施例，该器件被配置为接收流体容器。例如，根据一些实施例，该器件被配置为保持流体容器。根据一些实施例，该器件包括盒。在一些实施例中，该器件包括固体基板(例如，盒的固体基板)。固体基板可以包括被配置成接收流体容器的凹部。
流体容器可以具有各种适当几何形状中的任何一种。例如，根据某些实施例，流体容器可以具有大致矩形的横向轮廓。在一些实施例中，当与流体容器的最小横向尺寸相比时，流体容器具有窄的横向尺寸。在一些实施例中，流体容器可以被配置为容纳基板(例如，集成器件、芯片)。根据一些实施例，流体容器是流动池(例如，包括内部、入口和出口的池，配置为通过入口接收流体并通过出口传输流体)。例如，流体容器可以是包括集成器件的流动池。在一些实施例中，流体容器具有内部(例如，内部腔室)。在一些实施例中，器件的内部能够至少部分地或完全地填充有流体。在一些实施例中，流体器件的内部具有容积。在一些实施例中，流体容器具有一个以上的内部。例如，流体容器可以包括1、2、3、4、5或更多内部。根据一些实施例，这些内部中的至少一些彼此流体连接。在一些实施例中，这些内部彼此分开，使得流体不能直接从一个内部流到另一个内部。根据一些实施例，包括流体容器的多个内部是有利的，因为它可以允许同时填充多个集成器件或集成器件部分。多个集成器件或集成器件部分的同时填充可以允许流体流动的更大的均匀性，和/或可以允许分析多个样本，这些样本同时被允许与单独的集成器件或集成器件部分相互作用。
流体容器的每个内部可以包括入口和出口。根据一些实施例，入口和/或出口可以被连接到流体器件(例如，经由一个或多个对准特征件)。在一些实施例中，流体(例如，包括诸如肽或多核苷酸的生物分子的流体样本)流过流体容器的一个或多个内部。在一些实施例中，流过内部的流体可以至少部分或完全填充流体容器的内部。
在一些实施例中，器件的盒或模块包括具有包括通道的表面的基底层。在一些实施例中，至少一些通道的至少一部分具有大致三角形的横截面，该横截面在通道的底部具有单个顶点并且在基底层的表面具有两个其它顶点。在一些实施例中，至少一些通道的至少一部分具有表面层。表面层可以包括弹性体。表面层可以被配置为基本上密封通道的表面开口。
如本文所用，术语“通道”将为本领域普通技术人员所知，并可以指配置为容纳和/或输送流体的结构。通道通常包括：壁；基座(例如，连接到壁和/或由壁形成的基座)；以及表面开口，其可以在通道的一个或多个部分处打开、覆盖和/或密封。在一些实施例中，被密封的表面部分被完全密封。在一些实施例中，被密封的表面部分基本上被密封。如果表面开口的50％以上、60％以上、75％以上、90％以上或95％以上被密封，则表面开口可以被基本上密封。在一些实施例中，表面开口由弹性体密封。
如本文所用，术语“微通道”是指在大小上至少一个尺寸小于或等于1000微米的通道。例如，微通道可以包括在大小上至少一个尺寸(例如，宽度、高度)小于或等于1000微米(例如，小于或等于100微米、小于或等于10微米、小于等于5微米)。在一些实施例中，微通道包括至少一个尺寸大于或等于1微米(例如，大于或等于2微米、大于或等于10微米)。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于1微米且小于或等于1000微米、大于或等于10微米且小于等于100微米)。其他范围也是可能的。在一些实施例中，微通道具有小于或等于1000微米的水力直径。如本文所用，术语“水力直径”(DH)对本领域普通技术人员来说是已知的，并且可以确定为：DH＝4A/P，其中A是通过通道的流体流的横截面积，并且P是横截面的润湿周长(流体接触的通道横截面的周长)。
在一些实施例中，流体组件可以操作以将液体移动到器件的储液器和/或通道(例如，培养通道)、从储液器和/或通道移动或在储液器和/或通道之间移动。在一些实施例中，器件组件可以操作以使液体移动通过器件的通道，例如，移动到流体器件的储液器和/或其它通道(例如，培养通道)、从流体器件的储液器和/或其他通道移动或在储液器与/或其它通道之间移动。在一些实施例中，器件组件经由蠕动泵送机构(例如，装置)移动液体，该蠕动泵送机构被配置为与弹性体组件(例如，包括弹性体的表面层)相互作用，该弹性体组件与盒或模块的通道相关联，以将流体泵送通过该通道。
在一些实施例中，在装载模块或盒期间发生流体交换。例如，在一些实施例中，在将生物样本装载到集成器件的样本制备模块上的过程中发生流体交换。在装载样本期间的流体交换可能涉及将溶液(例如，缓冲溶液或用于裂解样本的溶液)添加或移除到包含样本的储液器中。在一些实施例中，装载样本期间的流体交换可能涉及样本从第一通道、微通道或储液器(例如，用于样本输入的通道、微信道或储液器)到第二通道、微通道或储液器的流体转移(例如，用于裂解、片段化、消化、富集等)。此外，在一些实施例中，在将一种或多种靶分子装载到检测模块或器件(例如，如本文所述的定序模块或定序器件)中期间发生流体交换。在一些实施例中，在将一种或多种靶分子装载到检测模块或器件中期间发生的流体交换涉及添加或移除检测中涉及的溶液(例如，包括荧光团或参考分子的溶液)。
在一些实施例中，在一种或多种靶分子(例如，待定序的靶蛋白、多肽或核酸)的检测或数据采集期间发生流体交换。例如，在一些实施例中，在样本井(例如，包括一种或多种靶分子的样本井)或反应腔室中的检测和/或数据采集期间发生流体交换。在一些实施例中，在检测和/或数据采集期间发生的流体交换涉及添加或移除用于检测和/或数据采集的溶液(例如，包括用于检测的荧光团的缓冲液)。在一些实施例中，在检测和/或数据采集期间发生的流体交换涉及添加或移除用于剥离、重新装载和/或卸载样本井或反应腔室的溶液(用于从反应腔室表面剥离涂层分子的溶液)。
在一些实施例中，器件、使用该器件的方法以及相关联的流体，以及其他公开内容如以下申请中所描述的：2020年10月28日提交的题为“PERISTALTIC PUMPING OF FLUIDSAND ASSOCIATED METHODS,SYSTEMS,AND DEVICES”的第17/083,106号美国专利申请；2020年10月28日提交的题为“PERISTALTIC PUMPING OF FLUIDS FOR BIOANALYTICALAPPLICATIONS AND ASSOCIATED METHODS,SYSTEMS,AND DEVICES”的第17/083,126号美国专利申请；2020年10月28日提交的题为“SYSTEMS AND METHODS FOR SAMPLE PREPARATION”的第17/082,223号美国专利申请；2020年10月28日提交的题为“METHODS AND DEVICES FORSEQUENCING”的第17/082,226号美国专利申请；2021年1月20日提交的题为“COMPOUNDS ANDMETHODS FOR SELECTIVE C-TERMINAL LABELING”的第17/153,490号美国专利申请；以及2021年4月21日提交的题为“DEVICES AND METHODS FOR SEQUENCING”的第PCT/US2021/028471号国际专利申请，这些申请的全部内容通过引用并入本文。
III.芯片重复使用技术
如本文所述，发明人开发了用于重复使用集成器件的传感器芯片来处理样本的连续部分的技术。发明人已经认识到，简单地用额外的样本等分试样而不是更多装载集成器件，会导致不准确的结果，因为先前装载的样本可能会干扰新装载样本的信号收集。因此，本文描述的技术涉及用于从集成器件的反应腔室卸载先前装载的样本并在装载后续样本之后重复使用集成器件的方法。
图2A是根据一些实施例的已经固定在集成器件的腔室158中的分析物159的示例图。分析物159可以包括生物分子，诸如多肽或多核苷酸。图2A提供了具有待采样的分析物159(诸如肽链)的反应腔室158的示例。分析物159可以经由涂覆反应腔室158的表面150的涂层分子152(例如，生物素)和结合到分析物159的偶联部分154(例如，链霉亲和素)之间的键结合到反应腔室158的表面150。在执行分析物159的采样时，涂层分子152和偶联部分154之间的键将分析物149固定在反应腔室158中。分析物159可以用荧光染料进行标记。可以用被配置为结合特定分析物的辨识分子160A、160B来促进标记分析物。反应腔室158可以设置在光检测区161附近，光检测区161包括互补金属氧化物半导体芯片164和用于收集来自反应腔室158的发射光的光子组件162。在采样之后，分析物159的至少一部分可以被切割分子156切割，如本文所述。
图2B是根据一些实施例的用于重复使用图1A的集成器件以处理多个样本的示例过程。过程200开始于动作202，其中样本的第一等分试样可以被装载到集成器件的反应腔室中。例如，包括大量分析物物种的样本可以被划分为多个等分试样，以便用集成器件连续处理。可以将第一等分试样装载到集成器件的反应腔室中。例如，反应腔室的表面可以涂覆有涂层分子，诸如生物素。样本的第一等分试样的分析物可以被结合到偶联部分，诸如链霉亲和素。当第一等分试样被装载到反应腔室中时，通过(样本的)偶联部分与涂层分子(固定到反应腔室表面)的结合，将分析物固定(或附着)到反应腔室的表面。
在图2B的动作204处，当分析物存在于反应腔室中时，可以对第一等分试样的分析物进行采样。对分析物进行采样可以包括在动作205A处向反应腔室传递激发光以激发分析物和/或附着于其上的荧光标记物。在动作205B处，激发的样本发射可以由集成器件的光检测区收集的信号(例如，光子)。在一些实施例中，发射的信号可以用于识别分析物。
在一些实施例中，分析物包括待采样的一个肽或多个肽。在一些实施例中，分析物包括一种或多种肽，并且待激发的荧光标记物与氨基酸辨识分子缀合。在一些实施例中，肽分析物识别可以通过使多肽与与一种或多种类型的末端氨基酸相关联的一个或多个氨基酸辨识分子接触来进行。在一些实施例中，如图2A所示的裂解分子或切割器可以用于移除分析物的一部分(例如，通过从肽链中移除肽)，并且可以对分析物的下一部分进行采样。
一旦从分析物中收集到足够的信号，就可以在动作206处从集成器件的反应腔室中移除第一等分试样。例如，为了收集关于额外样本的信息，可能需要将额外的样本(即，额外的样本等分试样)装载到集成器件中。然而，如本文所述，存在于反应腔室中的先前处理的分析物可能干扰新装载的分析物的信号收集。因此，在将额外的样本装载到集成器件中之前，可以从集成器件中移除第一等分试样。
用于卸载传感器芯片的示例性技术包括(a)破坏偶联部分和涂层分子之间(例如，链霉亲和素和生物素之间)的结合锚定；(b)从传感器芯片的表面剥离分子(例如，生物素)涂层；(c)在占用的反应腔室中酶促消化样本分析物；以及(d)熔化样本分析物和偶联部分(例如链霉亲和素、生物素)之间的键。这些技术将在本文中进一步描述。
在动作206处从集成器件移除第一等分试样之后，在动作208处可以将样本的第二等分试样装载到反应腔室中。第二等分试样的分析物同样可以结合到被配置为结合到涂覆(例如，结合到)反应腔室表面的涂层分子的偶联部分。可以对第二等分试样的分析物进行采样以收集关于分析物的信息。
可以根据需要重复上述装载和卸载具有样本的多个等分试样的集成器件的过程。该过程允许通过将样本分成多个等分试样并连续处理等分试样来处理具有大量分析物物种的样本。本文所述的卸载技术防止了可能由先前装载的分析物在新装载的等分试样的采样期间发射信号引起的干扰。下面描述的任何卸载技术都可以组合使用(例如，串联使用)来实现研究人员的目标。
破坏涂层分子与耦联部分之间的键
从集成器件的反应腔室中卸载一部分样本的第一种示例性技术涉及破坏涂覆反应腔室表面的涂层分子和结合到样本分析物的偶联部分之间的共价键。破坏涂层分子和偶联部分之间的键会将固定的分析物从反应腔室的表面释放，从而允许分析物从集成器件中被冲洗。在一些实施例中，破坏涂层分子和偶联部分之间的共价键包括解离偶联部分和涂层分子。
图3A是根据一些实施例的用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的示例过程310。过程310开始于动作312，其中第一等分试样的分析物在存在于集成器件的反应腔室中时被采样。例如，来自至少一个光源的激发光可以被传递到反应腔室，并且从反应腔室发射的信号(例如，来自第一等分试样的分析物和/或附着在其上的荧光标记物)可以在集成器件的光检测区处被检测。
在采样之后，在动作314处，可以从反应腔室中移除第一等分试样。例如，第一等分试样可以从集成器件中移除，以允许在没有来自第一等分试样的信号干扰的情况下装载样本的第二等分试样。动作314提供了从集成器件卸载第一等分试样的一个示例，其涉及破坏涂覆在反应腔室表面的涂层分子(例如，生物素、链霉亲和素)与结合到已固定到反应腔室表面上的样本分析物的偶联部分(例如，链霉亲和素、生物素)之间的键。
本发明人已经认识到，破坏诸如生物素和链霉亲和素的分子之间的键的常规技术是不充分的。这种技术通常需要苛刻的条件，包括高温(例如，90摄氏度)和可能对集成器件造成损害的化学品。这种技术可能需要很长的时间来执行(例如，大于60分钟)，这与在单个集成器件上连续处理样本的连续等分试样的期望不相容。
因此，本发明人开发了用于破坏涂层分子和偶联部分之间的键的改进技术。用于破坏涂层分子-偶联部分键的示例过程开始于动作315A。在动作315A处，反应腔室的表面可以与再生溶液接触(例如，浸泡在其中)。再生溶液有助于破坏涂层分子和偶联部分之间的键。
在一些实施例中，再生溶液包括乙酸盐和水。在一些实施例中，乙酸盐是乙酸铵。乙酸铵可以提高分析物(例如，肽或其他生物样本)的溶解度，使得一旦分析物从反应腔室的表面释放，分析物就可以被溶解和/或冲走。在其它实施例中，乙酸盐为乙酸钠。如本文所述，用于破坏结合分子和涂层分子之间的键的现有解决方案包含可能损害集成器件的组件的刺激性化学物质。相比之下，水与集成器件组件兼容，并且不存在对集成器件造成损害的风险。
再生溶液可以进一步包括适于破坏偶联部分和涂层分子的化合物(例如，有机化合物)。例如，在一些实施例中，再生溶液包括用于破坏生物素-链霉亲和素复合物的有机化合物，诸如氟化醇(或氟代醇)，诸如六氟-2-丙醇(即，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙酮、六氟-异丙醇或“HFIP”)，或六氟-2-丙醇类似物。这种化合物能够破坏涂层分子和偶联部分之间的键，从而允许分析物从反应腔室的表面释放。在一些实施例中，该化合物可以进一步破坏偶联部分(例如，链霉亲和素)复合物本身，破坏结合分子和分析物之间的键。
在一些实施例中，再生溶液包括醇、乙酸盐(例如，乙酸铵)和水。在一些实施例中，再生溶液包括氟化醇、乙酸盐和水。在一些实施例中，再生溶液包括氟化酮、乙酸盐和水。在一些实施例中，再生溶液包括酒精刺激物、乙酸盐和水。在一些实施例中，再生溶液还包括游离生物素或其类似物，例如单生物素、亚氨基生物素和/或脱硫生物素。
在一些实施例中，游离生物素类似物可以包括具有聚乙二醇(PEG)连接子或另一种连接子的生物素，用于增加再生溶液的溶解度。下文提供了示例性游离生物素类似物的化学结构。
如本文所述，现有的用于破坏分子的技术冗长，这与连续处理样本的期望不相容。在一些实施例中，具有本文所述成分的再生溶液能够或适于在60分钟或更短时间内破坏涂层分子和偶联部分。在一些实施例中，浸泡被执行30分钟或更短的离散时间段。较短的浸泡持续时间允许以连续的流动处理样本的多个等分试样。在一些实施例中，本文所述的再生溶液适用于芯片再生的自动化方法。
如本文所述，现有的用于破坏分子的技术必须在高温下进行，例如90摄氏度。具有本文所述成分的再生溶液能够在室温(例如，至少20摄氏度且不超过22摄氏度)下破坏涂层分子和偶联部分。较低的操作温度降低了使用高温可能对样本、集成器件和/或操作人员造成损害的风险。
在一些实施例中，再生溶液包括乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施例中，再生溶液包括甲酰胺。在一些实施例中，再生溶液包括EDTA和甲酰胺。在一些实施例中，再生溶液包括乙酸钠和甲酰胺。在一些实施例中，再生溶液包含选自六氟-2-丙醇、九氟叔丁醇、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇和八氟-2-丁酮的氟代醇。在一些实施例中，再生溶液包括六氟-2-丙醇。在一些实施例中，再生溶液包括六氟-2-丙醇的类似物，诸如九氟叔丁醇、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇、八氟-2-丁醇或八氟-2-丁酮。在一些实施例中，再生溶液包括九氟叔丁醇、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇和八氟-2-丁酮、乙酸盐(例如乙酸铵)和水中的一种或多种。
在动作315B处，通过破坏结合分子和涂层分子之间的键，例如，通过将再生溶液施加到芯片，从涂层分子破坏相应的偶联部分。例如，如本文所述，再生溶液可以包含用于从偶联部分破坏键合分子的化合物，诸如六氟-2-丙醇(例如，HFIP)。HFIP是一种具有芳香气味的无毒酒精。HFIP是一种刺激物，因为它对皮肤和粘膜具有腐蚀性。在一些实施例中，溶液含有六氟-2-丙醇的量为约1-5mL、3-7mL、4-8mL、5-9mL、5-10mL、8-10mL、9-11mL、10-12.5mL或大于12.5mL。
在一些实施例中，溶液含有的HFIP的量为约1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5或大于12.5mL。在一些实施例中，溶液含有HFIP的量为约1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5或大于12.5mL。在一些实施例中，溶液含有HFIP的量为约1-15mL、1-12.5mL、1-5mL、3-7mL、4-8mL、6-9mL、5-10mL、7-11mL、8-10mL、9-11mL、10-12.5mL或大于12.5mL。在一些实施例中，溶液含有HFIP的量为约9mL。在一些实施例中，溶液含有HFIP的量为9毫升。
再生溶液可能进一步含有乙酸铵(C2H4O2·H3N)。在一些实施例中，溶液含有5M乙酸铵，其量为0.1、0.2、0.25、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mL。在一些实施例中，溶液含有5M乙酸铵的量为0.5mL。
在一些实施例中，溶液包含生物素化合物。生物素化合物的添加可以增强再生溶液对功能化样本井表面上的链霉亲和素结合位点的竞争。生物素化合物的添加可以(进一步或以其他方式)促进样本井表面的生物素-链霉亲和素相互作用的解离，如由溶液的六氟-2-丙醇组分介导的。该溶液可以包含单生物素或双生物素。在一些实施例中，溶液PEG化生物素，诸如生物素-PEG3。PEG连接子可以提高生物素在溶液中的溶解度。在一些实施例中，溶液包含生物素-PEG3、生物素-PEG 4、生物素PEG5、生物素-PEG6、生物素-PEG 7或生物素-PE8。在一些实施例中，再生溶液含有的生物素化合物的浓度在10和500μM之间、50和250μM之间、100和250μM之间、100和500μM之间、100和200μM之间或100和150μM之间。在一些实施例中，再生溶液含有的生物素化合物的浓度在100μM和200μM之间。
在示例性实施例中，再生溶液含有9mL HFIP、0.5mL 5M乙酸铵、1mL水和浓度在100μM和200μM之间的生物素-PEG3(双-生物素-PEG4)。
在再生溶液的一些实施例中，例如用于核酸分析物的识别和/或定序的实施例，再生溶液含有DNase酶。DNase酶可以作为核苷消化混合物的一部分被提供。
在示例性实施例中，DNase酶(或核苷消化混合物)与再生溶液分开施加到芯片。因此，在一些实施例中，本文提供的芯片再生方法包括将再生溶液和DNase酶一起或单独应用。在一些实施例中，在再生溶液之前将DNA酶施加到芯片。因此，在这些实施例中，在样本井的表面与再生溶液接触之前，核酸(DNA)分析物至少部分地用DNase酶促消化。
在一些实施例中，将反应腔室的表面浸泡在再生溶液中进一步导致偶联部分和分析物之间的共价键被破坏。作为这种破坏的结果，在动作315C处，分析物和偶联部分从相应反应腔室的表面被释放。在动作315D处，释放的分析物和偶联部分可以从反应腔室中被冲洗出来。如本文所述，再生溶液可以包含用于增加分析物的溶解度的组分，诸如乙酸铵。因此，在一些实施例中，分析物可以附加地或可替选地溶解在再生溶液中。
在从集成器件的反应腔室中移除第一等分试样之后，过程310可以进行到动作316。本文所述的移除过程确保在对随后装载的等分试样进行采样时，不会出现由先前装载的等分样本发出的信号引起的干扰。因此，一旦第一等分试样被移除，在动作316处，第二等分试样可以被装载到集成器件的反应腔室中。第二等分试样可以包括分析物，分析物结合到相应的偶联部分。在移除第一等分试样之后，涂覆反应腔室表面的涂层分子可以保留在反应腔室中。因此，过程310可能不需要在装载第二等分试样之前将额外的涂层分子装载到集成器件的反应腔室中的重新涂覆步骤。第二等分试样的偶联部分可以结合到剩余的涂层分子，以将第二等分样本的分析物固定到反应腔室的表面，从而可以执行采样。
在动作316之后，可以对第二等分试样的分析物进行采样。例如，来自至少一个光源的激发光可以被传递到反应腔室，并且从反应腔室发射的信号(例如，来自第二等分试样的分析物和/或附着在其上的荧光标记物)可以在集成器件的光检测区处被检测。经由用于破坏涂层分子和偶联部分键的技术来装载和卸载集成器件的上述过程可以根据需要重复多次。
在一些实施例中，该方法包括破坏偶联部分与多个涂层分子(诸如第一涂层分子和第二涂层分子)之间的一个或多个键，其中，第一和第二涂层分子被官能化至井表面。在一些实施例中，第一涂层分子和第二涂层分子是不同的。在一些实施例中，第一涂层分子是链霉亲和素蛋白，并且第二涂层分子不是链霉亲和素蛋白(例如，是抗生物素蛋白或叠氮化物部分)。在一些实施例中，该方法包括破坏涂层分子与多种类型的偶联部分(诸如第一偶联部分和第二偶联部分)之间的键，其中，涂层分子被官能化至井表面。在一些实施例中，第一偶联部分和第二偶联部分是不同的。在一些实施例中，第一偶联部分是生物素部分，而第二偶联部分不是生物素部分(例如，是SNAP标签或叠氮化物部分)。在所有这样的实施例中，根据所公开的方法使用再生溶液可以实现多种类型的涂层分子和多种类型的偶联部分的组合之间的键的破坏。
在一些实施例中，在动作315A处使反应腔室的表面与再生溶液接触以破坏涂层分子和偶联部分之间的键之前，分析物可以至少部分地被酶促消化。例如，在一些实施例中(例如，在DNA定序应用中)，被采样的分析物相当大，使得由于分析物的大小，包括适于破坏偶联部分和涂层分子的化合物的再生溶液可以被阻止接触反应腔室的表面。因此，在一些实施例中，在反应腔室中采样的分析物的至少一部分可以被酶促消化，以便允许适于破坏偶联部分和涂层分子的化合物接触反应腔室的表面。例如，在分析物包括DNA链的情况下(例如，在DNA定序中)，在反应腔室的表面与再生溶液接触之前，可以酶促消化(例如，使用核酸内切酶(例如，DNase)和/或核酸外切酶消化)DNA链的至少一部分。
剥离反应腔室涂层
从集成器件的反应腔室中卸载一部分样本的第二种示例性技术涉及从反应腔室表面剥离涂层分子。从反应腔室表面剥离涂层分子从反应腔室释放结合到涂层分子的偶联部分和附着到其上的分析物，并允许溶解和/或冲洗从集成器件释放的组分。
例如，根据一些实施例，图3B是用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的示例过程，该过程涉及从反应腔室表面剥离涂层。过程320开始于动作322，在动作322中当第一等分试样的分析物存在于集成器件的反应腔室中时对其进行采样。例如，来自至少一个光源的激发光可以被传递到反应腔室，并且从反应腔室发射的信号(例如，来自第一等分试样的分析物和/或附着在其上的荧光标记物)可以在集成器件的光检测区处被检测。
在采样之后，在动作324处，可以从反应腔室中移除第一等分试样。例如，第一等分试样可以从集成器件中移除，以允许在没有来自第一等分试样的信号干扰的情况下装载样本的第二等分试样。动作324提供了从集成器件卸载第一等分试样的第二示例，其涉及从反应腔室的表面移除包括一种或多种涂层分子(例如，生物素、链霉亲和素)的涂层。
特别地，在动作325A处，从反应腔室表面剥离涂覆反应腔室表面的一种或多种涂层分子。在一些实施例中，剥离一种或多种涂层分子的步骤包括添加如上所述的任何再生溶液。在一些实施例中，该步骤包括添加HFIP或1,1,1,3,3-六氟-2-丙醇溶液。
如本文所述，偶联部分结合到反应腔室中的涂层分子，以将结合到偶联部分的第一等分试样的样本分析物固定到反应腔室的表面，从而能够进行采样。因此，在动作325B处，作为移除涂层的结果，分析物和偶联部分也从相应反应腔室的表面释放。在动作325C处，可以从反应腔室中冲洗释放的分析物和偶联部分。在一些实施例中，释放的组分可以附加地或可替选地溶解，例如，通过将芯片的表面浸泡在溶液中，诸如本文所述的任何再生溶液中。在一些实施例中，所公开的方法包括从反应腔室表面剥离第一涂层分子和第二涂层分子，其中第一涂层分子和第二涂层分子是不同的。在这种实施例中，第一涂层分子可以包括链霉亲和素蛋白，并且第二涂层分子可以包括不是链霉亲和素蛋白的部分(例如，可以是抗生物素蛋白或叠氮化物部分)。
在从集成器件的反应腔室中移除第一等分试样之后，过程320可以进行到动作326。在动作326处，通过将额外的涂层分子(例如，生物素、链霉亲和素)装载到反应腔室中来对反应腔室的表面进行重新涂覆，以准备装载第二等分试样。
在动作328处，可以用样本的第二等分试样重新装载集成器件的反应腔室。在动作328之后，可以对第二等分试样的分析物进行采样。可以根据需要重复上述经由剥离反应腔室涂层的技术装载和卸载集成器件的过程。
酶促消化分析物
用于从集成器件的反应腔室中卸载一部分样本的第三种示例性技术涉及在采样之后酶促消化反应腔室中存在的分析物(例如，肽)。在采样之后酶促消化分析物允许从反应腔室中移除先前采样的分析物，而不需要破坏涂层分子和偶联部分或重新涂覆集成器件的反应腔室的表面。
例如，根据一些实施例，图3C是用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的示例过程，其涉及酶促消化先前采样的分析物。过程330开始于动作332，在动作332中当第一等分试样的分析物存在于集成器件的反应腔室中时对其进行采样。例如，来自至少一个光源的激发光可以被传递到反应腔室，并且从反应腔室发射的信号(例如，来自第一等分试样的分析物和/或附着在其上的荧光标记物)可以在集成器件的光检测区处被检测。
在采样之后，在动作334处，可以从反应腔室中移除第一等分试样。例如，第一等分试样可以从集成器件中移除，以允许在没有来自第一等分试样的信号干扰的情况下装载样本的第二等分试样。动作334提供了从集成器件卸载第一等分试样的第二示例，其涉及完全酶促消化存在于集成器件的反应腔室中的先前采样的分析物。
特别地，在动作335A处，第一等分试样的分析物可以被酶促消化。例如，如图2A所示，通常用于蛋白质和DNA/RNA定序的裂解酶，也被称为切割器，可以用于将分析物从其在反应腔室表面上的固定位置切割。通常，裂解酶用于从肽链中切割单个肽来进行定序。然而，本发明人已经认识到，通过将参考腔室在含有一定浓度的裂解酶的溶液中浸泡较长时间，整个肽链可以从其在反应腔室表面上的固定点切割。酶促消化的分析物可以随后被冲洗和/或溶解，以从集成器件中移除第一等分试样的分析物。
在一些实施例中，每个反应腔室可以包括涂覆反应腔室表面的多个涂层分子。因此，即使在先前结合的涂层分子被先前结合的在过程330的动作335A处酶促消化的分析物占据的情况下，额外的涂层分子也可以保留在反应腔室中以结合样本的后续等分试样的偶联部分。在一些实施例中，在动作335之后，可以将额外的涂层分子装载到芯片中以重新涂覆反应腔室的表面。
在从集成器件的反应腔室中移除第一等分试样之后，过程330可以进行到动作336。在动作336处，可以用样本的第二等分试样重新装载集成器件的反应腔室。第二等分试样的分析物可以经由偶联部分与反应腔室中存在的剩余涂层分子结合。在动作336之后，可以对第二等分试样的分析物进行采样。可以根据需要重复上述经由酶促消化先前采样的分析物的技术装载和卸载集成器件的过程。
熔化分析物-偶联部分键
用于从集成器件的反应腔室中卸载一部分样本的第四种示例性技术涉及当样本分析物存在于反应腔室中时，熔化样本分析物和附着于其上的偶联部分之间的键。例如，图3D示出了根据一些实施例的用于再生图1A的集成器件的腔室的表面的示例性过程，该过程涉及熔化在样本分析物和偶联部分之间形成的键。过程340开始于动作342，其中第一等分试样的分析物在存在于集成器件的反应腔室中时被采样。例如，来自至少一个光源的激发光可以被传递到反应腔室，并且从反应腔室发射的信号(例如，来自第一等分试样的分析物和/或附着在其上的荧光标记物)可以在集成器件的光检测区处被检测。在一些实施例中，在样本分析物和偶联部分之间形成的键包括双链核酸分子(例如，蛋白质定序应用中的DNA分子连接子)，并且熔化该键包括将双链核酸分子变性为单链以释放样本分析物。
在采样之后，在动作344处，可以从反应腔室中移除第一等分试样。例如，第一等分试样可以从集成器件中移除，以允许在没有来自第一等分试样的信号干扰的情况下装载样本的第二等分试样。动作344提供了从集成器件卸载第一等分试样的第二示例，其涉及熔化在样本分析物和偶联部分之间形成的键，该偶联部分被配置为结合到涂覆反应腔室表面的涂层分子。
特别地，在动作335A处，样本分析物和偶联部分之间的键可以被熔化。在一些实施例中，动作335A包括将连接样本分析物与偶联部分的DNA链从双链DNA变性为单链DNA，以释放分析物。使在样本分析物和偶联部分之间形成的DNA分子连接子变性可以包括向系统中注入能量，诸如热，以熔化DNA链。在一些实施例中，该步骤包括添加如上所述的任何再生溶液和/或粘附任何其他化学溶液。
如本文所述，样本分析物被配置为经由在涂覆反应腔室表面的涂层分子和附着到样本分析物的偶联部分之间形成的键固定到反应腔室表面。过程340考虑破坏偶联部分和样本分析物之间的键，使得分析物不再固定到反应腔室表面。因此，在熔化偶联部分和样本分析物之间的共价键之后，在动作345B处，第一等分试样的分析物可以从反应腔室的表面被释放。在动作345C处，释放的组分可以从反应腔室被冲洗。在一些实施例中，释放的组分可以附加地和/或可替选地被溶解。
在从集成器件的反应腔室中移除第一等分试样之后，过程340可以进行到动作346。在动作346处，可以用样本的第二等分试样重新装载集成器件的反应腔室。第二等分试样的分析物可以经由偶联部分与反应腔室中存在的剩余涂层分子结合。在动作346之后，可以对第二等分试样的分析物进行采样。可以根据需要重复上述经由用于熔化偶联部分-分析物键的技术装载和卸载集成器件的过程。
在一些实施例中，熔化样本分析物和偶联部分之间的键的步骤包括熔化分析物和多种类型的偶联部分(诸如第一偶联部分和第二偶联部分)之间的键。在一些实施例中，第一偶联部分和第二偶联部分是不同的。在一些实施例中，第一偶联部分是生物素部分，而第二偶联部分不是生物素部分(例如，是SNAP标签或叠氮化物部分)。
示例1
例如，如图4A-4J所示，本文进一步证明了从集成器件中移除一部分样本的技术的有效性。特别地，图4A-4J示出了使用芯片再生技术积累的用于破坏涂层分子和偶联部分之间的键的数据。产生以下数据的实验中使用的再生溶液包括乙酸铵、水和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)。特别地，再生溶液含有9mL HFIP、0.5mL 5M乙酸铵、1mL水和浓度在100μM和200μM之间的生物素-PEG3。
图4A-D示出了根据一些实施例的描绘在芯片装载和再生过程中获得的分析物存在的示例图。以图4A为例，示出了连续的三个曲线图411-413。曲线图411示出了当集成器件的反应腔室装载93.6％的分析物时的信号采集。曲线图412示出了根据本文所述的破坏技术(以22.5％装载)从反应腔室中移除分析物15分钟后获得的信号采集。曲线图413示出了在用68％装载的额外样本重新装载集成器件的反应腔室之后的信号采集。
图4B-4D示出了描绘在装载和卸载集成器件的过程中获得的分析物存在的附加示例图。如图4B所示，曲线图421示出在以58.7％装载执行了第一次装载之后的信号采集，曲线图422示出在已经执行了随后的卸载(以8.5％装载)之后的信号采集，曲线图423示出了在以27.7％装载执行了第二次装载之后的信号采集，曲线图424示出了在已经执行了随后的卸载(以3.8％装载)之后的信号采集，并且曲线图425示出了已经以23.4％装载执行了第三次重新装载之后的信号采集。如图4C所示，曲线图431示出在以30.4％装载执行了第一次装载之后的信号采集，曲线图432示出在已经执行了随后的卸载(以13.8％装载)之后的信号采集，并且曲线图433示出了在以57.7％装载执行第二次装载之后的信号采集。如图4D所示，曲线图441示出了在以27.9％装载执行了第一次装载之后的信号采集，曲线图442示出了在已经执行了随后的卸载(以7.2％装载)之后的信号采集，并且曲线图443示出了以64.9％装载执行了第二次装载之后的信号采集。
图4E示出了根据一些实施例，在使用高效液相色谱法获得的不同条件下浸泡在再生溶液中的样本的光谱。特别地，曲线451示出了从首先在水中稀释并随后与剥离缓冲液混合的样本中的信号采集，曲线452示出了从与剥离缓冲液孵育10分钟并随后用水稀释的样本中的信号采集，并且曲线453示出了从与剥离缓冲液孵育50分钟并随后用水稀释的样本中的信号采集。
图4F示出了示出根据一些实施例的在再生和装载步骤之间从集成器件的反应腔室获取的信号的示例曲线图。特别地，第一曲线图示出了在卸载时响应于传递到集成器件的辨识脉冲的信号采集。第二曲线图示出了在第一再生和装载步骤之后的信号采集。第三曲线图示出了在集成器件的附加装载之后的信号采集。第四曲线图示出了在集成器件的卸载和再生之后的信号采集。
图4G-4I示出了根据一些实施例的附加示例图，其示出了在再生和装载步骤之间从集成器件的反应腔室获取的信号。如图4G所示，曲线图461A和461B示出了来自具有28％样本装载的集成器件的反应腔室的信号采集。曲线462A和462B示出了来自具有7％样本装载的集成器件的反应腔室的信号采集。曲线图463A和463B示出了来自具有65％样本装载的集成器件的反应腔室的信号采集。
图4J示出了示出根据一些实施例的在再生和装载步骤之间从集成器件的反应腔室获取的信号的附加示例图。特别地，第一列的曲线图示出了在集成器件的第一样本装载之后的信号采集，第二列的曲线图示出了集成器件的第一次卸载之后的信号采集，并且第三列的曲线图示出了集成器件的重新装载之后的信号采集。
IV.与芯片重复使用技术相关的方面
发明人进一步开发了可以与本文描述的芯片重复使用技术结合使用的附加技术。例如，图5A是根据一些实施例的用于确定样本是否存在于图1A的集成器件的腔室中的示例过程。发明人已经认识到，在用额外样本装载集成器件之前，确定本文所述的卸载技术是否已经成功执行是有利的。
图5A中所示的过程500开始于动作502，其中从集成器件的反应腔室移除样本的第一部分。例如，可以根据本文描述的用于从集成器件的反应腔室移除样本的任何技术来执行动作502。样本的第一部分可以包括已经被分成多个等分试样的样本的第一等分试样。
在从集成器件移除样本的第一部分之后，可以执行辨识过程，从而使用激发光的辨识脉冲来确定在集成器件的反应腔室中是否有任何样本剩余，或者在动作502处样本是否已经被充分移除。因此，在动作504处，来自至少一个光源的激发光被传递到集成器件的反应腔室。
如果在动作502之后样本的第一部分的任何分析物保留在反应腔室中，则在动作504处，剩余的分析物和/或附着在其上的荧光标记物可以响应于来自至少一个光源的激发光的传递而被激发。在动作504处，被激发的分析物和/或附着于其上的荧光标记物可以响应于激发而发射光子，其可以由集成器件的光检测区收集。此外，附着于其上的涂层分子、偶联部分和/或荧光标记物可以响应激发光而发射信号。因此，在一些实施例中，由集成器件的光检测区从反应腔室接收的任何信号可以用于确定在集成器件的反应腔室中是否存在任何涂层分子和/或偶联部分。
在动作508处，基于在动作506处收集的信号来确定样本的第一部分中的任何一个是否存在于集成器件的反应腔室中。例如，所发射的信号可以包含关于分析物、涂层分子、偶联部分和/或附着于其上的荧光标记物的信息(例如，发光强度、发光寿命、波长、脉冲持续时间、脉冲间持续时间)，该信号是从该信息发射。集成器件可以被配置为使用排放信息来确定反应腔室中存在什么(如果有的话)。
如果在动作508处确定样本的第一部分中的至少一些仍然存在于反应腔室中，则过程500可以通过“是”分支进行到动作502，在动作502处重复用于从反应腔室卸载样本的第一部分的移除过程。在一些实施例中，在通过“是”分支返回到动作502时执行的移除过程可以不同于在过程500开始时执行的初始移除过程。
如果在动作508处，基于在动作506处收集的信号确定样本的第一部分不再存在于反应腔室中，则过程500可以通过“是”分支进行到动作510，在动作510中，样本的第二部分被装载到集成器件的反应腔室中。样本的第二部分可以包括样本被分成的多个等分试样中的第二等分试样。
因此，过程500可以用于确定何时应该用额外的样本对集成器件执行重新装载。如本文所述，发明人已经认识到，当正在对新装载的分析物进行采样时，存在于反应腔室中的先前采样的分析物可能干扰来自新装载分析物的信号收集。因此，过程500可以用于确认先前采样的分析物在继续重新装载集成器件之前已被充分移除。
在一些实施例中，在动作508处，确定样本的第一部分是否存在于反应腔室中包括确定反应腔室中剩余的第一样本的量。在这种实施例中，可以将所确定的量与阈值进行比较。如果所确定的量低于阈值，则过程500可以进行到动作510，在动作510中，将额外的样本装载到集成器件的反应腔室中。相反，如果在动作508处，所确定的量不低于阈值，则过程500可以避免将额外的样本装载到反应腔室中。
如本文所述，在动作506处收集的信号可以用于确定反应腔室中涂层分子和/或偶联部分的存在。在这种实施例中，收集的信号可以用于确定是否将额外的涂层分子和/或偶联部分装载到集成器件的反应腔室中，例如，在将样本的第二部分装载到集成器件的反应腔室之前。
发明人进一步开发了可以与本文描述的芯片重复使用技术结合使用的技术，用于确定是否继续对已被划分为多个等分试样的样本的后续等分试样进行采样。例如，发明人已经认识到，一些样本可以包含感兴趣的信息，而其他样本不需要被完全采样。因此，关于样本的信息可以从样本的多个等分试样的第一等分试样中收集，并且用于确定是否通过将样本的第二等分试样装载到集成器件中来继续处理样本。
例如，根据一些实施例，图5B是用于确定是否用图1A的集成器件继续处理样本的示例过程。图5B中所示的过程500开始于动作522，其中样本的第一部分被装载到集成器件的反应腔室中。例如，样本的第一部分可以包括样本的第一等分试样，其中样本已经被分成多个等分试样。样本的第一部分可以包括待采样的多个分析物。分析物可以结合到本文所述的偶联部分，用于经由偶联部分和涂覆反应腔室表面的涂层分子之间的键将分析物固定到反应腔室的表面。在一些实施例中，分析物可以用荧光染料标记。
在动作524-526，可以对在动作522处装载到反应腔室中的样本的第一部分进行采样。例如，在动作524处，当样本存在于集成器件的反应腔室中时，来自至少一个光源的激发光可以被传递到样本的第一部分。结果，在动作526处，样本的第一部分的分析物和/或附着于其上的荧光标记物可以被激发并发射由集成器件的光检测区收集的光子。
在动作528处，基于在动作526处收集的信号，确定是否将样本的第二部分装载到集成器件的反应腔室中。例如，如本文所述，发射信号可以包括可以由集成器件提取的信息，诸如特征强度、波长、发光寿命、脉冲持续时间、脉冲间持续时间等。在一些实施例中，提取的信息可以用于确定样本的第一部分中存在的分析物的身份。基于分析物的身份，可以确定样本作为一个整体是感兴趣的，并且期望对样本的额外等分试样进行进一步处理。在这种情况下，过程520可以通过“是”分支进行到动作530。
在其他情况下，基于所确定的分析物的身份，可以确定样本作为一个整体不感兴趣，并且不需要花费时间和其他资源来进一步处理样本。因此，如果在动作528处确定不装载样本的第二部分，则过程520可以通过“否”分支进行到动作532。在动作532处，用户可以避免将样本的第二部分装载到集成器件的反应腔室中。相反，样本的第一部分可以从集成器件的反应腔室中移除。在一些实施例中，在动作532处，可以将第二额外样本的第一部分装载到集成器件的反应腔室中用于采样。在一些实施例中，集成器件的传感器芯片可以附加地或可替选地被丢弃。
如果在动作528处确定应当装载样本的第二部分，则过程520可以通过“是”分支进行到动作530，在动作530处，移除样本的第一部分，例如根据本文所述的任何技术，并且将样本的第二半部分装载到集成器件的反应腔室中。在动作530之后，可以根据需要通过返回到动作524来重复过程520，在动作524中样本的第二部分被处理。
V.增加芯片寿命
如本文所述，发明人已经认识到，在将集成器件重复用于多次实验时，集成器件的组件可能会随着传感器芯片的长期使用而退化。因此，本文描述的技术的一些方面涉及用于增加集成器件的使用寿命的技术。例如，由于反应腔室在再生溶液中的反复浸泡，集成器件的组件可能容易受到腐蚀。因此，在一些实施例中，集成器件的组件可以被配置为抵抗这种劣化(例如，包括耐腐蚀涂层等)。在一些实施例中，集成器件的组件可以被配置为抵抗对定序工作流程产生的发光信号的干扰，该干扰可能随着芯片和/或流动池的顺序再生而出现。
例如，在一些实施例中，通过保持集成器件的反应腔室的表面涂层的稳定性，可以促进增加集成器件芯片的寿命。用于保持集成器件的反应腔室的表面涂层的稳定性的合适技术的示例被描述于2020年10月9日以代理人案卷号为R0708.70066US01提交的题为“SURFACE MODIFICATION IN THE VAPOR PHASE”的第17/067,184号美国专利申请，其全部内容通过引用并入。在一些实施例中，本文描述的再生溶液的PH值可以保持在7，以增加反应腔室表面涂层的稳定性。
VI.附加设备组件
根据一些方面，本文所述的集成器件可以被配置为具有一个或多个附加组件。例如，图6A是根据一些实施例的包括紧凑型锁模激光模块的分析仪器的框图。如图6A所示，便携式高级分析仪器6-100可以包括一个或多个脉冲光学源6-106，其作为可替换模块安装在仪器6-100内或以其他方式耦合到仪器6-100。便携式分析仪器6-100可以包括光学耦合系统6-115和分析系统6-160。光学耦合系统6-115可以包括光学组件的一些组合(例如，其可以不包括以下组件中的任一个、包括以下组件中的一个或一个以上：透镜、反射镜、滤光器、衰减器、光束控制组件、光束整形组件)，并且被配置为对来自脉冲光学源6-106的输出光脉冲6-122进行操作和/或耦合到分析系统6-160。分析系统6-160可以包括多个组件，这些组件被布置成将光脉冲引导到至少一个反应腔室用于样本分析，从至少一个反应腔室接收一个或多个光信号(例如，荧光、反向散射辐射)，并且产生代表所接收的光信号的一个或多个电信号。在一些实施例中，分析系统6-160可以包括一个或多个光检测器，并且还可以包括被配置为处理来自光检测器的电信号的信号处理电子器件(例如，一个或多个微控制器、一个或多个现场可编程门阵列、一个或多个微处理器、一个或多个数字信号处理器、逻辑门等)。分析系统6-160还可以包括数据传输硬件，其被配置为向外部设备(例如，仪器6-100可以经由一个或多个数据通信链路连接到的网络上的一个或多个外部设备)传输数据和从外部设备接收数据。在一些实施例中，分析系统6-160可以被配置为接收生物光电子芯片6-140，其持有一个或多个待分析的样本。
图6B描绘了包括紧凑型脉冲式光学源6-108的便携式分析仪器6-100的进一步详细示例。在该示例中，脉冲光学源6-108包括紧凑型被动锁模的激光模块6-113。被动锁模激光器可以在不施加外部脉冲信号的情况下自主产生光脉冲。在一些实施方式中，模块可以被安装到仪器底盘或框架6-103，并且可以位于仪器的外壳体内部。根据一些实施例，脉冲光学源6-106可以包括附加组件，这些附加组件可以用于操作光学源并对来自光学源6-106的输出光束进行操作。锁模激光器6-113可以包括在激光腔中或耦合到激光腔的元件(例如，饱和吸收器、声光调制器、克尔透镜)，其引起激光器的纵向频率模式的相位锁定。激光腔可以部分地由腔端镜6-111、6-119限定。频率模式的这种锁定导致激光器的脉冲式操作(例如，腔内脉冲6-120在腔端镜之间来回反弹)，并从一个端反射镜6-111产生部分透射的一串输出光学脉冲6-122。
在某些情况下，分析仪器6-100被配置为接收可移除、封装的生物光电子或光电子芯片6-140(也称为“一次性芯片”)。一次性芯片可以包括例如生物光电子芯片，其例如包括多个反应腔室、被布置为将光学激发能传递到反应腔室的集成光学组件和被布置为检测来自反应腔室的荧光发射的集成光检测器。在一些实施方式中，芯片6-140可以在单次使用后被丢弃，而在其他实施方式中，芯片6-140可以重复使用两次或更多次。当芯片6-140被仪器6-100接收时，它可以与脉冲光学源6-106和分析系统6-160中的装置进行电通信和光通信。例如，可以通过芯片封装上的电触点进行电通信。
在一些实施例中并参考图6B，可以将一次性芯片6-140安装(例如，经由插座连接)在电子电路板6-130上，诸如可以包括附加仪器电子件的印刷电路板(PCB)。例如，PCB 6-130可以包括被配置为向光电子芯片6-140提供电功率、一个或多个时钟信号和控制信号的电路，以及被布置为接收表示从反应腔室检测到的荧光发射的信号的信号处理电路。在一些实施方式中，尽管数据可以经由网络连接传输到一个或多个远端数据处理器，但从光电子芯片返回的数据可以部分或全部由仪器6-100上的电子件处理。PCB 6-130还可以包括被配置为从芯片接收反馈信号的电路，该反馈信号与耦合到光电子芯片6-140的波导中的光学脉冲6-122的光学耦合和功率水平有关。反馈信号可以被提供给脉冲光源6-106和光学系统6-115中的一个或两个，以控制光学脉冲6-122的输出光束的一个或多个参数。在一些情况下，PCB 6-130可以向脉冲光学源6-106提供或路由功率，用于操作光学源和光学源6-106中的相关电路。
根据一些实施例，脉冲光学源6-106包括紧凑型锁模激光模块6-113。锁模激光器可以包括增益介质6-105(在一些实施例中，可以是固态材料)、输出耦合器6-111和激光腔端镜6-119。锁模激光器的光学腔可以受输出耦合器6-111和端镜6-119约束。激光腔的光轴6-125可以具有一个或多个折叠(匝)，以增加激光腔的长度并提供所需的脉冲重复率。脉冲重复率由激光腔的长度(例如，光学脉冲在激光腔内往返的时间)决定。
在一些实施例中，激光腔内可以有额外的光学元件(图6B中未示出)，用于波束成形、波长选择和/或脉冲形成。在一些情况下，端镜6-119包括饱和吸收镜面(SAM)，其引起纵向腔模式的被动模式锁定，并导致锁模激光器的脉冲操作。锁模激光模块6-113可以进一步包括用于激发增益介质6-105的泵浦源(例如，激光二极管，图6B中未示出)。锁模激光模块6-113的进一步细节可以在2017年12月15日以代理人案卷号R0708.70025US01提交的题为“Compact Mode-Locked Laser Module”的第“15/844,469”号美国专利申请中找到，该申请通过引用并入本文。
当激光器6-113被模式锁定时，腔内脉冲6-120可以在端镜6-119和输出耦合器6-111之间循环，并且腔内脉冲的一部分可以通过输出耦合器6-112传输作为输出脉冲6-122。因此，当腔内脉冲6-120在激光腔中的输出耦合器6-111与端镜6-119之间来回反弹时，可以在输出耦合器处检测到输出脉冲串6-122。
根据一些实施方式，波束转向模块6-150可以接收来自脉冲光源6-106的输出脉冲，并且被配置为至少调整光学脉冲在光电子芯片6-140的光学耦合器(例如，光栅耦合器)上的位置和入射角。在一些情况下，来自脉冲光学源6-106的输出脉冲6-122可以通过波束转向模块6-150操作，以附加地或可替选地改变光电子芯片6-140上的光学耦合器处的光束形状和/或光束旋转。在一些实施方式中，波束转向模块6-150可以进一步将输出脉冲的波束的聚焦和/或偏振调整提供到光学耦合器上。波束转向模块的一个示例被描述在2016年5月20日以代理人案卷号R0708.70010US02提交的题为“Pulsed Laser and BioanalyticSystem”的第15/161,088号美国专利申请中，该申请通过引用并入本文。光束转向模块的另一个示例被描述在2017年12月14日以代理人案卷号R0708.70024US01提交的题为“CompactBeam Shaping and Steering Assembly”的第15/842,720号独立美国专利申请中，该申请通过引用并入本文。
图6C示出了根据一些实施例的可以由脉冲式激光器经由一个或多个波导光学地激发的平行反应腔室的示例。例如，参考图6C，来自脉冲光学源的输出脉冲6-122可以耦合到生物光电子芯片6-140上的一个或多个光波导6-312中。在一些实施例中，光脉冲可以经由光栅耦合器6-310耦合到一个或多个波导，但在一些实施例中，可以使用光电子芯片上的一个或多个光波导的末端的耦合。根据一些实施例，四边形检测器6-320可以位于半导体基板6-305(例如，硅基板)上，用于帮助将光学脉冲6-122的光束对准到光栅耦合器6-310。一个或多个波导6-312和反应腔室或反应腔室6-330可以被集成在与基板、波导、反应腔室和光检测器6-322之间的介入介电层(例如二氧化硅层)相同的半导体基板上。
每个波导6-312可以包括反应腔室6-330下方的锥形部分6-315，以使沿波导耦合到反应腔室的光功率相等。减小的锥度可以迫使波导的核心外部的更多光能增加与反应腔室的耦合，并补偿沿着波导的光学损耗，包括耦合到反应腔室中的光损耗。第二光栅耦合器6-317可以位于每个波导的末端处，以将光能引导到集成光电二极管6-324。例如，集成光电二极管可以检测沿波导向下耦合的功率的量，并将检测到的信号提供给控制光束转向模块6-150的反馈电路。
反应腔室6-330或反应腔室6-330可以与波导的锥形部分6-315对准，并凹入与槽6-340中。可以存在位于半导体基板6-305上的用于每个反应腔室6-330的光检测器6-322。在一些实施例中，半导体吸收体(在图6-5中显示为滤光器6-530)可以位于每个像素处的波导和光检测器6-322之间。金属涂层和/或多层涂层6-350可以形成在反应腔室周围和波导上方，以防止不在反应腔室中(例如，分散在反应腔室上方的溶液中)的荧光团的光学激发。金属涂层和/或多层涂层6-350可以升高超过槽6-340的边缘，以减少在每个波导的输入端和输出端处的波导6-312中的光能的吸收损耗。
在光电子芯片6-140上可以有多个波导列、反应腔室和时间分格光检测器。例如，在一些实施方式中，对于总共65,536个反应腔室，可以有128列，每列具有512个反应腔室。其他实施方式可以包括更少或更多的反应腔室，并且可以包括其他布局配置。来自脉冲式光学源6-106的光功率可以经由一个或多个星形耦合器或多模干涉耦合器分布到多个波导，或通过任何其他方式位于芯片6-140的光耦合器6-310和多个波导6-312之间。
图6D中描绘了在反应腔室6-330中发生的生物反应的非限制性示例。该示例描绘了核苷酸或核苷酸类似物顺序并入到与靶核酸互补的生长链中。顺序并入可以在6-330的反应腔室中发生，并且可以通过先进的分析仪器进行检测以对DNA进行定序。反应腔室可以具有在约150nm和约250nm之间的深度和在约80nm和约160nm之间的直径。金属化层6-540(例如，用于电参考电位的金属化物)可以被图案化于光检测器6-322上方，以提供阻挡来自邻近反应腔室和其他不需要的光源的杂散光的孔径或光圈。根据一些实施例，聚合酶6-520可以位于反应腔室6-330内(例如，附着到反应腔室的基底)。聚合酶可以溶解靶核酸6-510(例如，源自DNA的一部分核酸)，并对互补核酸生长链进行定序，以产生DNA生长链6-512。用不同荧光团标记的核苷酸或核苷酸类似物可以分散在反应腔室内上方和反应腔室内的溶液中。
VII.芯片重复使用技术的应用
已经描述了用于传感器芯片的重复使用的多种技术，以便增加单个器件处理的样本数量，现在将描述芯片重复使用技术的示例应用。例如，发明人已经认识到，可以结合本文所述的技术来执行待分析样本中的一个或多个分子的识别。特别地，发射光的一个或多个特性的测量值可以由诸如本文所述的集成器件的器件获得，并且收集的测量值可以与荧光标记物的测量特性的已知值进行比较，以确定哪个荧光标记物是最有可能发射光的源。反过来，通过识别荧光标记物，基于已知荧光标记所附着的分子的特定类型，可以知道荧光标记物所附着的分子的身份。
本文所述的技术可以与用于检测和/或识别样本中分子的技术结合使用，例如，包括以下申请中描述的那些：2019年11月15日以代理人案卷号R0708.70042US02提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTEIN SEQUENCING”的第16/686,028号美国专利申请，2019年11月15日以代理人案卷号R0708.70042WO00提交的题为“METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR PROTEIN SEQUENCING”的第PCT/US19/61831号PCT申请，以及2021年3月2日以代理人案卷号为R0708.70090US01提交的题为“INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SIGNAL ANALYSIS”的第17/190,331号美国专利申请，每个申请的全部内容通过引用并入。例如，这种技术可以用于蛋白质定序和/或核酸(例如，DNA和/或RNA)定序的应用中。
核酸定序
本公开的一些方面可以用于对生物聚合物(诸如核酸和蛋白质)进行定序。在一些实施例中，本公开中描述的方法、组合物和器件可以用于识别并入到核酸或蛋白质中的一系列核苷酸或氨基酸单体(例如，通过检测一系列标记的核苷酸或氨基酸单体的并入时间进程)。在一些实施例中，本公开中描述的方法和器件可以用于识别被并入到由聚合酶合成的模板依赖性核酸定序反应产物中的一系列核苷酸。
在一些实施例中，核酸定序包括提供感兴趣的核酸，其通过偶联部分和/或涂层分子被涂覆到固体支持物的表面(例如，附着到样本井的底表面)。在一些实施例中，偶联部分-涂层分子缀合物是通过生物素偶联部分和涂覆到井表面的链霉亲和素偶联部分之间的连接形成的。
在一些方面，提供了一种对靶核酸进行定序的方法。在一些实施例中，对靶核酸进行定序的方法包括以下步骤：(i)提供混合物，该混合物包括(a)所述靶核酸，(b)与所述靶核苷酸互补的引物，(c)核酸聚合酶和(d)用于并入与所述靶核酸互补的生长核酸链中的核苷酸，其中，所述核苷酸包括不同类型的发光标记的核苷酸，其中，所述发光标记的核苷酸在顺序并入所述生长核酸链期间产生可检测信号，所述不同类型的发光标记的核苷酸的可检测信号在时域上是可彼此区分的(例如通过确定可检测信号的时间和/或频率)；(ii)使(i)的所述混合物在足以通过引物的延伸产生所述生长核酸链的条件下进行聚合反应；(iii)在顺序并入所述生长核酸链之后，测量来自所述发光标记的核苷酸的所述可检测信号；以及(iv)在顺序并入到所述生长核酸链中时，确定来自所述发光标记的核苷酸的所述测量的可检测信号的时间和/或频率，以识别所述发光标记的核苷酸并入到所述生长核酸链中的时间序列，从而确定所述靶核酸的序列。
在一些方面，提供了定序方法，其包括以下步骤：(i)将样本井的目标体积中的复合物暴露于一个或多个标记的核苷酸，该复合物包括样本中存在的靶核酸或多种核酸、与所述靶核酸互补的至少一种引物和DNA聚合酶；(ii)使复合物在足以通过引物的延伸产生生长核酸链的条件下进行聚合反应；(iii)将激发光的一系列脉冲引导向目标体积；(iv)在核苷酸顺序并入包括引物的生长核酸中之后，检测来自一个或多个标记的核苷酸的多个发射光子；以及(v)通过确定发射光子的一个或多个特性来识别并入的核苷酸的序列。这些特性可以选自发光寿命、保持时间、发光强度、发光波长、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间。在一些实施例中，该特性是发光寿命。
在一些实施例中，游离核苷酸与相同类型的发光标记物缀合，使得发光标记的核苷酸的可检测信号在时域中彼此可区分(例如，通过确定可检测信号的时间、强度和/或频率)。在示例性实施例中，游离核苷酸与相同类型的标记物缀合，并且在时域内测量可检测信号的强度差异。通过聚合酶并入到与靶核酸互补的生长核酸链中的核苷酸将比游离核苷酸在检测区中停留更长的持续时间，并且因此它们的强度将比未并入的核苷酸更大和/或更长。
在一些实施例中，游离核苷酸(例如，四种类型的核苷酸)各自与不同类型的发光标记物缀合，使得发光标记的核苷酸的可检测信号在时域中彼此可区分(例如，通过确定可检测信号的时间、强度和/或频率)。通过聚合酶并入到与靶核酸互补的生长核酸链中的核苷酸将比游离核苷酸在检测区域中停留更长的持续时间，并且因此它们的强度将比未并入的核苷酸更大和/或更长。
此处提供的芯片再生方法的实施例能够以高精确度和长读取长度对单个核酸分子进行定序，诸如精确度为至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％或99.9999％和/或读取长度大于或等于约10个碱基对(bp)、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1000bp、2500bp、5000bp、6000bp、7000bp、7500bp、7750bp、8000bp、8500bp、9000bp、10000bp、20000bp、30000bp、40000bp、50000bp或100000bp。在示例性实施例中，所公开的方法能够以约70％、约72.5％、约74％、约75％、约80％、约85％、约90％或约92％的精确度对单个核酸分子进行定序。在一些实施例中，所公开的方法能够以约94％的精确度对单个核酸分子进行定序。在示例性实施例中，所公开的方法能够对读取长度为约8500个碱基对的单个核酸分子进行定序。
在一些实施例中，靶核酸或核酸聚合酶附着到支持物上。在一些实施例中，并入的时间序列是在使(i)的混合物进行聚合反应之后确定的。在一些实施例中，本申请的各方面可以用于测定生物样本，例如确定样本中一种或多种核酸或多肽的序列和/或确定样本中一种或多种核酸或多肽变体(例如，感兴趣基因中的一种或多种突变)的存在或不存在。在一些实施例中，可以对患者样本(例如，人类患者样本)执行测试，以提供核酸序列信息或确定一种或多种感兴趣的核酸的存在或不存在，用于诊断、预后和/或治疗目的。在一些实施例中，诊断测试可以包括对受试物的生物样本中的核酸分子进行定序，例如通过对受试物的生物样本中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)分子和/或表达产物(例如核糖核酸(RNA))进行定序。
在一些实施例中，使用发光寿命和/或强度分析(例如，询问和/或识别)的一个或多个分析物可以是标记分子(例如，已经用一种或多种发光标记物标记的分析物)。在一些实施例中，包括一种或多种生物分子的分析物可以使用标记物来识别。在一些示例中，发光标记物用于识别生物分子的单个亚基。一些实施例使用发光标记物(本文也被称为“标记物”)，其可以是外源性或内源性标记物。外源性标记物可以是用作发光标记的报告物和/或标签的外部发光标记物。外源性标记物的示例可以包括但不限于荧光分子、荧光团、荧光染料、荧光染色剂、有机染料、荧光蛋白、参与荧光共振能量转移(FRET)的物种、酶和/或量子点。其他外源性标记物是本领域已知的。这种外源性标记物可以与特异性结合特定靶或组分的探针或官能团(例如，分子、离子和/或配体)缀合。将外源性标签或报告物附着到探针允许通过检测外源性标签或者报告物的存在来识别靶。探针的示例可以包括蛋白质、核酸(例如，DNA、RNA)分子、脂质和抗体探针。外源标记物和官能团的组合可以形成用于检测的任何合适的探针、标签和/或标记物，包括分子探针、标记探针、杂交探针、抗体探针、蛋白质探针(例如，生物素结合探针)、酶标记物、荧光探针、荧光标记物和/或酶报告物。
在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物可以选自包括芳族或杂芳族化合物的染料，并且可以是芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚、苯并咪唑、恶唑、咔唑、噻唑、苯并噻唑、菲啶、吩恶嗪、卟啉、喹啉、乙锭、苯甲酰胺、花青、碳花青、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸酯、香豆素、荧光素、罗丹明或其他类似化合物。示例性染料包括呫吨染料，诸如荧光素或罗丹明染料、萘染料、香豆素染料、吖啶染料、花青染料、苯并恶唑染料、二苯乙烯染料、芘染料、酞菁染料、藻胆蛋白染料、方丹染料、BODIPY染料等。
在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa546、Alexa/>555和Alexa/>555，以及FRET对Alexa/>555和在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa/>555、Alexa/>546和/>554-R1。在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa/>555、/>ATTO Rho6G和/>554-R1。在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa/>555、/>ATTO Rho6G和554-R1。在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa/>555、/>ATTO 542和/>554-R1。在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括Alexa/>555、/>ATTO 542和Alexa/>546。在一些实施例中，一组四个核苷酸中的发光标记物包括/>ATTO Rho6G和/>554-R1。
在某些实施例中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型的发光标记核苷酸包括发光染料，该发光染料选自6-TAMRA、5/6-羧基罗丹明6G、Alexa546、Alexa/>555、Alexa/>568、Alexa/>610、Alexa/>647、Aberrior Star 635、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTORho6G、ATTO 542、ATTO 647N、ATTO Rho14、Chromis 630、Chromis 654A、ChromeoTM642、CFTM514、CFTM532、CFTM543、CFTM546、CFTM546、CFTM555、CFTM568、CFTM633、CFTM640R、CFTM660C、CFTM660R、CFTM680R、/>Dyomics-530、Dyomics-547P1、Dyomics-549P1、Dyomics-550、Dyomics-554、Dyomics-555、Dyomics-556、Dyomics-560、Dyomics-650、Dyomics-680、/>554-R1、/>530-R2、594、/>635-B2、/>650、/>655-B4、/>675-B2、/>675-B4、/>680、HiLyteTMFluor 532、HiLyteTMFluor 555、HiLyteTMFluor 594、/>640R、SetaTM555、SetaTM670、SetaTM700、SetaTMu 647、and SetaTMu 665组成的组，或者如本文所述的式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
在一些实施例中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型的发光标记核苷酸各自包括发光染料，该发光染料选自Alexa546、Alexa/>555、554-R1、Alexa/>546、Atto Rho6G、ATTO 425、ATTO465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G、and ATTO 542组成的组。
在一些实施例中，第一类型的发光标记的核苷酸包括Alexa546，第二类型的发光标记的核苷酸包括/>第三类型的发光标记的核苷酸包括两个Alexa并且第四类型的发光标记的核苷酸包括阿莱Alexa/>555和/>
在一些实施例中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型的发光标记的核苷酸包括发光染料，该发光染料选自Alexa532、Alexa/>546、AleAlexa/>555、/>594、Alexa/>610、CFTM532、CFTM543、CFTM555、CFTM594、/> 530-R2、/>554-R1、/>590-R2、/>594、/>610-B1组成的组，或者为式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
在一些实施例中，第一类型和第二类型的发光标记的核苷酸包括发光染料，该发光染料选自Alexa532、Alexa/>546、Alexa/>555、CFTM532、CFTM543、CFTM555、/>530-R2、/>554-R1组成的组，并且第三类型和第四类型的发光标记的核苷酸包括选自Alexa/>594、Alexa/>610、CFTM594、590-R2、/>594、/>610-B1组成的组，或者为式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
在某些实施例中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型的发光标记的核苷酸分子包括发光蛋白，该发光蛋白选自TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquiise2、单体Midoriishi Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、单体Kusabira-Orange、mKOK、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、iRFP、mKeima红、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP、PA-GFP、PAmCherry1、PATagRFP、Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、mEos2(绿色)和mEos2(红色)、PSmOrange或Dronpa组成的组。
尽管本公开参考了发光标记物，但其他类型的标记物也可以与本文提供的设备、系统和方法一起使用。这种标记物可以是质量标签、静电标签、电化学标记或其任何组合。
虽然外源性标记物可以被添加到样本中，但内源性标记物可能已经是样本的一部分。内源性标记物可以包括任何存在的发光标记物，其可以在激发能量存在的情况下发光或“自发荧光”。内源性荧光团的自发荧光可以提供无标记和非侵入性标记，而不需要引入外源荧光团。这种内源性荧光团的示例可以包括血红蛋白、氧合血红蛋白、脂质、胶原和弹性蛋白交联、还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化黄素(FAD和FMN)、脂褐素、角蛋白和/或卟啉，作为示例而非限制。
本公开提供了使用一组发光标签(例如，发光标记物、发光标记)来标记不同分子来检测单个分子的技术。这种单个分子可以是具有标签的核苷酸或氨基酸。标签可以在结合到单个分子时、从单个分子释放时、或者在结合到单个分子并从单个分子释放时被检测。在一些示例中，标签是发光标签。所选集合中的每个发光标签与相应分子相关联。例如，可以使用一组四个标签来“标记”DNA中存在的核碱基——该集合中的每个标签与不同的核碱基相关，例如，第一个标签与腺嘌呤(A)相关联，第二个标签与胞嘧啶(C)相关联，第三个标签与鸟嘌呤(G)相关联，并且第四个标签与胸腺嘧啶(T)相关联。此外，标签集合中的每个发光标签具有不同的性质，这些性质可以用于将该集合的第一标签与该集合中的其他标签区分开。以这种方式，使用这些区别特征中的一个或多个，每个标签都是唯一可识别的。通过示例而非限制的方式，可以用于区分一个标签与另一个标签的标签的特性可以包括由标签响应于激发能量而发射的光的发射能量和/或波长、被特定标签吸收以将标签置于激发状态的激发光的波长和/或标签的发射寿命。
在某些实施例中，模板依赖性核酸定序产物通过天然存在的核酸聚合酶进行。在一些实施例中，聚合酶是天然存在的聚合酶的突变体或修饰变体。在一些实施例中，模板依赖性核酸序列产物将包括与模板核酸链互补的一个或多个核苷酸片段。在一个方面，本公开提供了一种通过确定模板(或靶)核酸链的互补核酸链的序列来确定其序列的方法。
本文使用的术语“聚合酶”通常指能够催化聚合反应的任何酶(或聚合酶)。聚合酶的示例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可以是一种聚合作用酶。
针对单分子核酸延伸的实施例(例如，用于核酸定序)可以使用能够合成与靶核酸分子互补的核酸的任何聚合酶。在一些实施例中，聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和/或其一种或多种的突变体或改变形式。
聚合酶的示例包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶(psi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶，EX-Taq聚合酶、LA-Taq酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、铂Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tth聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶，Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’至5’核酸外切酶活性的聚合酶及其变体、修饰产物和衍生物。在一些实施例中，聚合酶是单亚基聚合酶。DNA聚合酶及其性质的非限制性示例在DNA复制第二版Kornberg and Baker，W.H.Freeman，New York，N.Y.(1991)中有详细描述。
在靶核酸的核碱基和互补dNTP之间的碱基配对时，聚合酶通过在新合成的核酸链的3’羟基末端和dNTP的α磷酸盐之间形成磷酸二酯键，将dNTP并入到新合成的核苷酸链中。在缀合到dNTP的发光标签是荧光团的示例中，其存在通过激发发出信号，并且在并入步骤期间或之后检测发射脉冲。对于与dNTP的末端(γ)磷酸盐缀合的检测标记物，将dNTP并入到新合成的链中导致释放β和γ磷酸盐以及检测标记物(其在样本井中自由扩散)，导致从荧光团检测到的发射减少。
在一些实施例中，聚合酶是具有高持续合成能力的聚合酶。然而，在一些实施例中，聚合酶是具有降低的持续合成能力的聚合酶。聚合酶持续合成能力通常是指聚合酶在不释放核酸模板的情况下将dNTP连续并入到核酸模板中的能力。在一些实施例中，聚合酶是具有低5’-3’核酸外切酶活性和/或3’-5’核酸外切酶的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶被修饰(例如，通过氨基酸取代)以相对于相应的野生型聚合酶具有降低的5’-3’核酸外切酶活性和/或3’-5’活性。DNA聚合酶的其他非限制性示例包括9°NmTMDNA聚合酶(新英格兰生物实验室)和Klenow外切聚合酶的P680G突变体(Tuske等人(2000)JBC 275(31):23759-23768)。在一些实施例中，具有降低的持续合成能力的聚合酶为含有一段或多段核苷酸重复序列(例如，两个或更多个相同类型的连续碱基)的定序模板提供了增加的准确性。在一些实施例中，聚合酶是对标记的核苷酸比对未标记的核酸具有更高亲和力的聚合酶。
在其他方面，本公开提供了通过对多个核酸片段进行定序来对靶核酸进行定序的方法，其中靶核酸包括该片段。在某些实施例中，该方法包括组合多个片段序列以提供亲本靶核酸的序列或部分序列。在一些实施例中，组合的步骤由计算机硬件和软件执行。本文所述的方法可以允许对一组相关的靶核酸，诸如整个染色体或基因组进行定序。
在定序期间，聚合酶可以偶联(例如，附着)到靶核酸分子的引物位置。引物位置可以是与靶核酸分子的一部分互补的引物。作为替代方案，引物位置是在靶核酸分子的双链片段内提供的间隙或缺口。间隙或缺口的长度可以为从0到至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或40个核苷酸。缺口可以在双链序列的一条链中提供断裂，这可以为聚合酶(例如，诸如链置换聚合酶)提供引物位置。
在某些情况下，定序引物可以退火至靶核酸分子，该靶核酸分子可以固定或不固定于固体支持物。固体支持体可以包括例如用于核酸定序的微芯片(或芯片)上的样本井(例如，纳米孔、反应腔室)。在一些实施例中，定序引物可以固定在固体支持物上，并且靶核酸分子的杂交也将靶核酸分子固定在固体支持物上。在一些实施例中，将聚合酶固定在固体支持物上，并将可溶性引物和靶核酸与聚合酶接触。然而，在一些实施例中，在溶液中形成包括聚合酶、靶核酸和引物的复合物，并且将该复合物固定到固体支持物上(例如，通过固定聚合酶、引物和/或靶核酸)。
在适当的条件下，与退火的引物/靶核酸接触的聚合酶可以将一个或多个核苷酸添加或并入到引物上，并且核苷酸可以以5’至3’的模板依赖的方式添加到引物中。核苷酸在引物上的这种并入(例如，经由聚合酶的作用)通常可以被称为引物延伸反应。每个核苷酸可以与可检测标签相关联，该可检测标签可以在核酸延伸反应期间被检测和识别(例如，基于其发光寿命和/或其他特性)，并用于确定并入到延伸引物中的每个核苷酸，并且因此确定新合成的核酸分子的序列。经由新合成的核酸分子的序列互补性，还可以确定靶核酸分子的序列。在一些情况下，定序引物与靶核酸分子的退火和核苷酸到定序引物的并入可以在相似的反应条件下(例如，相同或相似的反应温度)或在不同的反应条件下(例如，不同的反应温度)发生。
因此，在一些方面，本公开提供了用于确定来自核酸生物分子的核苷酸序列信息(例如，用于对多核苷酸进行定序)的方法和组合物。在一些实施例中，可以确定单个核酸生物分子的核苷酸序列信息。本公开的定序方法可以包括“通过合成定序”测定。本公开的定序方法可以包括时间进程(或时域)测量测定。在一些实施例中，通过合成方法定序可以包括靶核酸分子群体(例如，靶核酸的复制)的存在和/或扩增靶核酸以获得靶核酸群体的步骤。然而，在一些实施例中，通过合成定序用于确定正在评定的每个反应中的单个分子的序列(并且不需要核酸扩增来制备用于定序的靶模板)。在一些实施例中，根据本申请的各方面，并行地(例如，在单个芯片上)执行多个单分子定序反应。例如，在一些实施例中，多个单分子定序反应各自在单独的反应腔室(例如，纳米孔、样本井)中执行，所述反应腔室已经被制造在单个芯片上。
在一些实施例中，所公开的核酸定序方法在已经在互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片上制造的样本井中进行。每个井可以在CMOS光电二极管上对准。在一些实施例中，所公开的核酸定序方法结合台式集成器件在CMOS芯片上执行。在一些实施例中，结合单通道或多通道光电检测通过合成定序集成器件在CMOS芯片上执行定序方法(参见图2A)。
在一些实施例中，发光标记的核苷酸的核酸还包括与第一和第二寡核苷酸链中的至少一个退火的第三寡核苷酸链。在一些实施例中，核酸还包括与第一、第二和第三寡核苷酸链中的至少一个退火的第四寡核苷酸链。在一些实施例中，寡核苷酸链形成霍利迪连结体。
在一些方面，本公开提供了确定模板核酸序列的方法。在一些实施例中，该方法包括将目标体积中的复合物暴露于多种类型的发光标记的核苷酸的步骤，该复合物包括模板核酸、引物和聚合酶。在一些实施例中，每种类型的发光标记的核苷酸包括经由核酸连接到一种或多种核苷多磷酸盐的一个或多个发光标记物(例如，包括相同的发光标记物或包括不同的发光标记物)。在一些实施例中，核酸包括保护分子。因此，在一些方面，本公开提供了利用本文所述的任何发光标记的核苷多磷酸盐组合物的核酸定序方法。
在一些实施例中，该方法还包括将一个或多个激发能量的一系列脉冲导向目标体积附近的步骤。在一些实施例中，该方法还包括在顺序并入包括引物的核酸期间检测来自发光标记的核苷酸的多个发射光子的步骤。在一些实施例中，该方法还包括通过确定发射光子的时间和任选的频率来识别并入的核苷酸序列的步骤。
在一些实施例中，反应混合物中的四种不同类型的核苷酸(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶/尿嘧啶)可以各自用一种或多种发光分子(例如，一种或多种发光标记物)标记。在一些实施例中，每种类型的核苷酸可以被连接到一种以上的相同发光分子(例如，连接到核苷酸的两种或更多种相同荧光染料)。在一些实施例中，每个发光分子可以连接到多于一个核苷酸(例如，相同核苷酸中的两个或更多个)。在一些实施例中，多于一个核苷酸可以连接(例如，经由包括一个或多个保护分子的核酸连接子)到多于一个发光分子。在一些实施例中，所有四个核苷酸用在相同光谱范围(例如，520-570nm)内吸收和发射的发光分子标记。
实施例能够以高精确度和长读取长度对单个核酸分子进行定序，例如精确度为至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％或99.9999％，和/或读取长度大于或等于约10个碱基对(bp)、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1000bp、10000bp、20000bp、30000bp、40000bp、50000bp或100000bp。在一些实施例中，用于单分子定序的靶核酸分子是单链靶核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)、DNA衍生物、核糖核酸(RNA)、RNA衍生物)模板，其被添加或固定到样本井(例如，纳米孔)，该样本井包含固定或附着到固体支持物(诸如样本井的底部或侧壁)的定序反应的至少一种额外组分(例如聚合酶，诸如DNA聚合酶，定序引物)。靶核酸分子或聚合酶可以直接或通过连接子附着到样本壁，诸如样本井的底部或侧壁。样本井(例如，纳米孔)还可以包含经由引物延伸反应进行核酸合成所需的任何其他试剂，例如，诸如合适的缓冲液、辅因子、酶(例如，聚合酶)和脱氧核糖核苷多磷酸盐，例如，诸如脱氧核糖核苷三磷酸盐，包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，其包括发光标签，诸如荧光团。在一些实施例中，每一类dNTP(例如，含腺嘌呤的dNTP(例如，dATP)、含胞嘧啶的dNTP(例如，dCTP)、含有鸟嘌呤的dNTP(例如，dGTP)，含尿嘧啶的dNTP(例如，dUTP)和含胸腺嘧啶的dNTP(例如，dTTP))与不同的发光标签缀合，使得对从标签发射的光的检测表明并入新合成的核酸中的dNTP的身份。经由任何合适的器件和/或方法，包括本文别处描述的用于检测的这种器件和方法，来自发光标签的发射光可以被检测并归因于其合适的发光标签(以及因此相关联的dNTP)。发光标签可以在任何位置与dNTP缀合，使得发光标签的存在不会抑制dNTP并入新合成的核酸链或聚合酶的活性。在一些实施例中，发光标签与dNTP的末端磷酸盐(例如，γ磷酸盐)缀合。
在一些实施例中，单链靶核酸模板可以与定序引物、dNTP、聚合酶和核酸合成所需的其他试剂接触。在一些实施例中，所有合适的dNTP可以同时与单链靶核酸模板接触(例如，所有dNTP同时存在)，使得dNTP的并入可以连续发生。在其他实施例中，dNTP可以顺序地与单链靶核酸模板接触，其中单链靶核酸模版分别与每个合适的dNTP接触，其中在单链靶核酸模板与不同dNTP接触之间有洗涤步骤。对于待识别的单链靶核酸模板的每个连续碱基位置，可以重复这种将单链靶核酸模版与每个dNTP分别接触然后洗涤的循环。
在一些实施例中，定序引物与单链靶核酸模板退火，并且聚合酶基于单链靶核酸模版将dNTP(或其他脱氧核糖核苷多磷酸盐)连续并入引物。在将dNTP并入到引物中期间或之后，可以用适当的激发光激发与每个并入的dNTP相关联的独特发光标签，并且随后可以使用任何合适的器件和/或方法(包括本文其他地方描述的用于检测的器件和方法)来检测其发射。对特定光发射的检测(例如，具有特定发射(发光)寿命、强度、光谱和/或其组合)可以归因于所并入的特定dNTP。从检测到的发光标签的集合中获得的序列然后可以用于经由序列互补性确定单链靶核酸模板的序列。
虽然本公开参考了dNTP，但本文提供的器件、系统和方法可以与各种类型的核苷酸一起使用，诸如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(例如，具有至少4、5、6、7、8、9或10个磷酸基团的脱氧核糖核苷多磷酸盐)。这种核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸可以包括各种类型的标签(或标记物)和连接子。在一些实施例中，本公开提供了可以有利地用于以下申请号的美国专利中描述的技术的方法和组合物：14/543,865、14/543,867、14/543,888、14/821,656、14/821,686、14/821,688、15/161,067、15/161,088、15/161,125、15/255,245、15/255,303、15/255,624、15/261,697和15/261,724，其中每一个的内容通过引用并入本文。
并入核苷酸时发出的信号可以存储在存储器中，并在稍后的时间点进行处理，以确定靶核酸模板的序列。这可以包括将信号与参考信号进行比较，以确定作为时间函数的并入核苷酸的身份。可替选地或除此之外，可以实时收集和处理在核苷酸并入时发出的信号(例如，在核苷酸并入时)，以实时确定靶核酸模板的序列。
本文中使用的术语“核酸”通常是指包括一个或多个核酸亚基的分子。核酸可以包括选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚基。在一些示例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以是环状的。
本文所用的术语“核苷酸”通常指核酸亚基，其可以包括A、C、G、T或U，或其变体或类似物。核苷酸可以包括可以并入到生长核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是A、C、G、T或U，或者对一个或多个互补的A、C，G、T、或U具有特异性或与嘌呤(例如A或G，或其变体或类似物)或嘧啶(例如C、T或U，或其变变体或类似品)互补的任何其他亚基。亚基可以使单个核酸碱基或碱基组(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶对应物)能够被解析。
核苷酸通常包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中的糖是脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷单磷酸盐或核苷多磷酸盐。核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸盐，例如，诸如脱氧核糖核苷三磷酸，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸盐(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸dNTP，其包括可检测的标签，诸如发光标签或标记物(例如，荧光团)。
核苷多磷酸盐可以具有“n”个磷酸基团，其中“n”是大于或等于2、3、4、5、6、7、8、9或10的数字。核苷多磷酸盐的示例包括核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸可以是末端磷酸标记的核苷，诸如末端磷酸标记的核苷多磷酸盐。这种标记可以是发光(例如，荧光或化学发光)标记、荧光标记、彩色标记、发色标记、质量标记、静电标记或电化学标记。标记(或标记物)可以通过连接子与末端磷酸盐偶联。连接子可以包括例如至少一个或多个羟基、巯基、氨基或卤代烷基，其可以适合于在天然或修饰核苷酸的末端磷酸处形成例如磷酸酯、硫酯、磷酰胺基或烷基膦酸酯连接。连接子可以是可裂解的，以便诸如借助于聚合酶将标记物与末端磷酸盐分离。核苷酸和连接子的示例在美国专利第7,041,812号中被提供，该专利通过引用并入本文。
核苷酸(例如，核苷酸多磷酸盐)可以包括甲基化的核碱基。例如，甲基化核苷酸可以是包括附着到核碱基上的一个或多个甲基的核苷酸(例如，直接附着到核碱基的环上，附着到核碱基的环的取代基上)。示例性的甲基化核碱基包括1-甲基胸腺嘧啶、1-甲基尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶，3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶，1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，N2-甲基鸟嘌呤和N2,N2-二甲基鸟嘌呤。
本文使用的术语“引物”通常指核酸分子(例如，寡核苷酸)，其可以包括序列，该序列包括A、C、G、T和/或U，或其变体或类似物。引物可以是包括DNA、RNA、PNA或其变体或类似物的合成寡核苷酸。引物可以被设计为其核苷酸序列与靶链互补，或者引物可以包括随机核苷酸序列。在一些实施例中，引物可以包括尾部(例如，多聚腺苷酸尾部、索引适配体、分子条形码等)。在一些实施例中，引物可以包括5至15个碱基、10至20个碱基、15至25个碱基、20至30个碱基、25至35个碱基、30至40个碱基、35至45个碱基、40至50个碱基、45至55个碱基、50至60个碱基、55至65个碱基、60至70个碱基、65至75个碱基、70至80个碱基、75至85个碱基，80至90个碱基、85至95个碱基、90至100个碱基、95至105个碱基、100至150个碱基、125至175个碱基、150至200个碱基或超过200个碱基。
肽定序
在一些实施例中，本公开的各方面可以用于测定生物样本，例如确定样本中一种或多种多肽的身份或序列，和/或确定样本中一种或多种变体(例如，感兴趣多肽中的一种或多种氨基酸取代)存在或不存在。在一些实施例中，本文所述的化合物可以通过检测肽降解过程中的单分子结合相互作用进行肽定序(也被称为“多肽定序”)。在一些实施例中，感兴趣的肽共价或非共价附着到表面。
如本文所用，对多肽进行定序是指确定多肽的序列信息。在一些实施例中，这可以涉及确定多肽的一部分(或全部)的每个序列氨基酸的身份。然而，在一些实施例中，这可以涉及评定多肽内氨基酸子集的身份(并且，例如，在不确定多肽中每个氨基酸的身份的情况下，确定一种或多种氨基酸类型的相对位置)。在一些实施例中，可以从多肽获得氨基酸含量信息，而无需直接确定多肽中不同类型氨基酸的相对位置。可以单独使用氨基酸含量来推断存在的多肽的身份(例如，通过将氨基酸含量与多肽信息数据库进行比较并确定哪些多肽具有相同的氨基酸含量)。
在一些方面，本文提供的肽定序方法可以通过识别多肽的一种或多种类型的氨基酸来执行。在一些实施例中，多肽的一个或多个氨基酸(例如，末端氨基酸和/或内部氨基酸)被标记(例如，直接或间接地，例如使用结合剂诸如氨基酸辨识分子)，并且标记的氨基酸在多肽中的相对位置被确定。在一些实施例中，使用一系列氨基酸标记来确定多肽中氨基酸的相对位置。在某些实施例中，使用一系列标记和裂解步骤来确定多肽中氨基酸的相对位置。然而在一些实施例中，标记的氨基酸在多肽中的相对位置可以在不从多肽中移除氨基酸的情况下被确定，而是通过将标记的多肽通过孔(例如，蛋白质通道)易位并在易位通过孔期间检测来自标记的氨基酸的信号(例如，FRET信号)来确定在多肽分子中标记氨基酸的相对位置。
在一些实施例中，评定末端氨基酸(例如，N末端或C末端氨基酸)的身份，之后移除末端氨基酸，并评定末端处的下一个氨基酸的身份，并且重复该过程，直到评定多肽中的多个连续氨基酸。在一些实施例中，评定氨基酸的身份包括确定存在的氨基酸的类型。在一些实施例中，确定氨基酸的类型包括确定实际的氨基酸身份，例如通过确定天然存在的20个氨基酸中的哪一个是末端氨基酸(例如，使用对单个末端氨基酸特异的结合剂)。在一些实施例中，氨基酸的类型选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
然而，在一些实施例中，评定末端氨基酸类型的身份可以包括确定可能存在于多肽的末端处的潜在氨基酸的子集。在一些实施例中，这可以通过确定氨基酸不是一种或多种特定氨基酸(并且因此可以是任何其他氨基酸中的任一种)来实现。在一些实施例中，这可以通过确定氨基酸的指定子集中的哪一个(例如，基于大小、电荷、疏水性、翻译后修饰、结合特性)可以位于多肽的末端处(例如，使用结合两个或更多个末端氨基酸的指定子集的结合剂)来实现。在一些实施例中，评定末端氨基酸类型的身份包括确定氨基酸包含翻译后修饰。
在一些实施例中，本文提供的方法包括使多肽与选择性结合一种类型的末端氨基酸的标记的氨基酸辨识分子接触。在一些实施例中，标记的辨识分子选择性地结合一种类型的末端氨基酸，而不是其他类型的末端核酸。在一些实施例中，标记的辨识分子选择性地结合一种类型的末端氨基酸，而不是相同类型的内部氨基酸。在另一些实施例中，标记的辨识分子在多肽的任何位置处选择性地结合一种类型的氨基酸，例如与末端氨基酸和内部氨基酸相同类型的氨基酸。
在一些实施例中，多肽定序可以通过使多肽与一种或多种氨基酸辨识分子接触来进行，一种或多种氨基酸辨识分子与一种或多种类型的末端氨基酸相关联。在一些实施例中，标记的氨基酸辨识分子通过与末端氨基酸相关联而与多肽相互作用。
在一些实施例中，通过检测标记的辨识分子的一个或多个电特性来识别一种或多种类型的氨基酸。在一些实施例中，标记的辨识分子包括选择性结合一种类型的氨基酸的辨识分子和与辨识分子相关联的导电性标记。以这种方式，一个或多个电特性(例如，电荷、电流振荡颜色和其他电特性)可以与辨识分子的选择性结合相关联，以识别多肽的氨基酸。在一些实施例中，多种类型的标记辨识分子可以用于根据本申请的方法中，其中，每种类型包括导电性标记，该导电性标记产生电信号的变化(例如，导电性的变化，诸如导电性的幅度的变化和特征图案的导电性转变)，该变化在多个中是唯一可识别的。在一些实施例中，多种类型的标记辨识分子各自包括具有不同数量的带电基团(例如，不同数量的负电荷和/或正电荷基团)的导电性标记。因此，在一些实施例中，导电性标记是电荷标记。电荷标记的示例包括树枝状聚合物、纳米颗粒、核酸和具有多个带电基团的其他聚合物。在一些实施例中，导电性标记通过其净电荷(例如，净正电荷或净负电荷)、其电荷密度和/或其带电基团的数量是唯一可识别的。
因此，在一些实施例中，通过检测选择性结合一种或多种类型的氨基酸的一种或多种标记的氨基酸辨识分子的发光寿命或发光强度来识别一种或多种类型的氨基酸。在一些实施例中，本文提供的方法包括使多肽与选择性结合一种或多种类型的末端氨基酸的一种或多种标记的氨基酸辨识分子(或辨识分子)接触。作为在本申请的方法中使用四个标记的辨识分子的说明性和非限制性示例，任何一种试剂选择性地结合一种类型的末端氨基酸，该末端氨基酸不同于其它三种试剂中的任何一种选择性结合的另一种类型的氨基酸(例如，第一试剂结合第一种类型，第二试剂结合第二种类型，第三试剂结合第三种类型，第四试剂结合第四种类型的末端氨基酸)。
在一些实施例中，辨识分子可以由本领域技术人员使用常规已知技术进行设计。在一些实施例中，所需的性质可以包括仅当一种类型的氨基酸位于多肽的末端(例如，N末端或C末端)时，选择性地且以高亲和力结合该类型氨基酸的能力。在其他实施例中，所需的性质可以包括当一种类型的氨基酸位于多肽的末端(例如，N末端或C末端)时以及当其位于多肽的内部位置时，选择性地且以高亲和力结合该类型氨基酸的能力。在一些实施例中，所需的性质包括选择性地且以低亲和力(例如，以约50nM或更高的KD，例如，在约50nM和约50μM之间、在约100nM和约10μM之间，在约500nM和约50um之间)结合到一种以上类型的氨基酸的能力。例如，在一些方面，本公开提供了通过检测可逆结合相互作用进行定序的方法。有利地，这样的方法可以使用辨识分子来执行，该辨识分子以低亲和力可逆地结合一种以上类型的氨基酸(例如，氨基酸类型的子集)。
在一些实施例中，多肽定序包括提供感兴趣的多肽，该多肽通过偶联部分和/或涂层分子被涂覆到固体支持物的表面(例如，附着到样本井的底表面)。在一些实施例中，偶联部分-涂层分子缀合物是通过生物素偶联部分和涂覆到井表面的链霉亲和素偶联部分之间的连接形成的。
在一些实施例中，通过一个末端处的偶联部分将感兴趣的多肽固定到表面，使得另一个末端是自由的，用于在定序反应中检测和裂解末端氨基酸。因此，在一些实施例中，某些多肽定序反应中使用的试剂优先与多肽的非固定化(例如，游离)末端的末端氨基酸相互作用。以这种方式，多肽在检测和裂解的重复循环中保持固定。
在一些实施例中，多肽定序可以通过使多肽与与一种或多种类型的末端氨基酸相关联的一个或多个氨基酸辨识分子接触来进行。在一些实施例中，标记的氨基酸辨识分子通过与末端氨基酸相关联而与多肽相互作用。
在一些实施例中，该方法还包括通过检测标记的氨基酸辨识分子来识别多肽的氨基酸(末端或内部氨基酸)。在一些实施例中，检测包括检测来自标记的氨基酸辨识分子的发光。在一些实施例中，发光与标记的氨基酸辨识分子唯一相关，并且由此发光与标记氨基酸辨识分子选择性结合的氨基酸类型相关。因此，在一些实施例中，通过确定标记的氨基酸辨识分子的一个或多个发光性质来识别氨基酸的类型。
在其他实施例中，多肽定序通过使多肽与结合并裂解多肽的末端氨基酸的外肽酶接触来移除末端氨基酸而进行。在通过外肽酶移除末端氨基酸后，多肽定序通过使多肽(具有n-1个氨基酸)经历额外的末端氨基酸辨识和裂解循环来进行。在一些实施例中，这些步骤可以发生在相同的反应混合物中，例如在动态肽定序反应中。在一些实施例中，这些步骤可以使用本领域已知的其他方法进行，例如通过Edman降解的肽定序。
在一些实施例中，通过评定末端氨基酸与标记的氨基酸辨识分子以及任选的裂解试剂(例如，外肽酶)的结合相互作用，实时进行动态多肽定序。标记的氨基酸辨识分子可以与末端氨基酸相关联(例如，结合)并从末端氨基酸解离，这在信号输出中产生一系列脉冲，这些脉冲可以用于识别末端氨基酸。在一些实施例中，脉冲序列提供脉冲模式(例如，特征模式)，其可以判断对应末端氨基酸的身份。
Edman降解涉及修饰和裂解多肽末端氨基酸的重复循环，其中识别每个连续裂解的氨基酸以确定多肽的氨基酸序列。通过常规Edman降解的肽定序可以通过(1)使感兴趣的多肽与选择性结合一种或多种类型的末端氨基酸的一种或多种氨基酸辨识分子接触来进行。在一些实施例中，步骤(1)还包括移除不选择性结合多肽的一种或多种标记的氨基酸辨识分子中的任何一种。
在一些实施例中，通过观察不同的关联事件(例如氨基酸辨识分子和肽末端的氨基酸之间的关联事件)来进行动态肽定序，其中，每个关联事件产生持续一段时间的信号(例如，发光信号)的量值变化。
在一些实施例中，可以在肽降解过程中观察不同的关联事件，例如氨基酸辨识分子和肽末端的氨基酸之间的关联事件。在一些实施例中，从一种特征信号模式到另一种特征信号模式的转变指示氨基酸裂解(例如，由肽降解引起的氨基酸裂解)。在一些实施例中，氨基酸裂解是指从多肽的末端移除至少一个氨基酸(例如，从多肽移除至少一种末端氨基酸)。在一些实施例中，通过基于特征信号模式之间的持续时间的推断来确定氨基酸裂解。在一些实施例中，通过检测由标记的裂解试剂与多肽末端的氨基酸关联所产生的信号的变化来确定氨基酸裂解。在一些实施例中，其中使用裂解剂(外肽酶)，因为在降解过程中氨基酸从多肽的末端顺序裂解，所以检测到一系列幅度变化或一系列信号脉冲。
在一些实施例中，信号脉冲信息可以用于基于一系列信号脉冲中的特征模式来识别氨基酸。在一些实施例中，特征模式包括多个信号脉冲，每个信号脉冲包括脉冲持续时间。在一些实施例中，多个信号脉冲可以通过特征模式中的脉冲持续时间分布的汇总统计(例如，平均值、中值、时间衰减常数)来表征。在一些实施例中，特征模式的平均脉冲持续时间在约1毫秒和约10秒之间(例如，在约1ms和约1s之间，在约1ms和约100ms之间，在约1ms和约10ms之间，在约10ms和约10s之间，在约100ms和约10s之间、在约1s和约10s直接、在约10ms与约100ms之间或约100ms和约500ms之间)。在一些实施例中，对应于单个多肽中不同类型氨基酸的不同特征模式可以基于汇总统计中的统计学显著差异而彼此区分。例如在一些实施例中，基于至少10毫秒的平均脉冲持续时间的差异(例如，在约10ms和约10s之间，在约10ms和约1s之间，在约10ms和约100ms之间，从约100ms到约10s之间、在约1s到约10ms之间，或在约100ms到约1s之间)，一个特征模式可以与另一个特征模式区分开来。应当理解，在一些实施例中，不同特征模式之间的平均脉冲持续时间的较小差异可能需要每个特征模式内的较大数量的脉冲持续时间来以统计置信度来区分彼此。
在一些方面，本公开提供了通过将本文所述的任何一种化合物附着到样本井的表面来将肽或氨基酸辨识分子固定到表面的方法。在一些实施例中，用配置用于附着(例如共价附着)到肽的功能化末端的偶联部分对表面进行功能化。在一些实施例中，该方法包括将单个肽固定到多个样本井中的每个样本井的表面。在一些实施例中，每个样本井限制单个肽对于单分子检测方法是有利的，例如单分子肽定序。
在一些实施例中，将包含功能化末端的肽与互补偶联部分接触。在一些实施例中，功能化末端和偶联部分包括非共价结合配偶体，例如，其在肽和样本井表面之间形成非共价连接。非共价结合配偶体的示例包括蛋白质-蛋白质结合配偶体(例如，barnase和barstar)和蛋白质-配体结合配偶体(例如，生物素和链霉亲和素)。
使用发光寿命测量进行定序
集成光检测器上的单个像素可能能够进行发光寿命测量，用于识别标记一个或多个目标(诸如分子或分子上的特定位置)的荧光团和/或报告物。尽管以下描述讨论了基于寿命测量的样本识别，但是应当理解，响应于激发光从反应腔室发射的信号的一个或多个附加或替代特性可以用于识别样本。例如可以使用2021年3月2日以代理人案卷号R0708.70090US01提交的题为“INTEGRATED SENSOR FOR MULTI-DIMENSIONAL SIGNALANALYSIS”的第17/190,331号美国专利申请中描述的任何技术，该申请全部内容通过引用并入本文。
任何一种或多种感兴趣的分子都可以用荧光团标记，包括蛋白质、氨基酸、酶、脂质、核苷酸、DNA和RNA。当与检测发射光的光谱或其他标记技术相结合时，发光寿命可以增加可以使用的荧光团和/或报告物的总数。基于寿命的识别可以用于单分子分析方法，以提供关于复杂混合物中分子相互作用特征的信息，该复杂混合物可以包括蛋白质-蛋白质相互作用、酶活性、分子动力学和/或在膜上的扩散。此外，在基于标记组分的存在的各种测定方法中，可以使用具有不同发光寿命的荧光团来标记目标组分。在一些实施例中，可以基于检测荧光团的特定寿命来分离组分，诸如通过使用微流体系统。
测量发光寿命可以与其他分析方法结合使用。例如，发光寿命可以与荧光共振能量转移(FRET)技术结合使用，以区分位于一个或多个分子上的供体和受体荧光团的状态和/或环境。这种测量可以用于确定供体和受体之间的距离。在某些情况下，从供体到受体的能量转移可能会降低供体的寿命。在另一个示例中，发光寿命测量可以用于DNA定序应用，诸如其中具有不同寿命的四个荧光团可以用于用未知核苷酸序列标记DNA分子中的四个不同核苷酸(A、T、G、C)。荧光团的发光寿命而不是发射光谱可以用于识别核苷酸序列。对于某些技术，通过使用发光寿命而不是发射光谱，可以提高精确度和测量分辨率，因为减少了由于绝对强度测量引起的伪影。此外，寿命测量可以降低系统的复杂性和/或费用，因为需要更少的激发能量波长和/或需要检测更少的发射能量波长。
在一些实施例中，如本公开中描述的集成光检测器可以测量或区分发光寿命。发光寿命测量是基于激发一个或多个荧光分子，并测量发射的发光的时间变化。荧光分子达到激发状态后，荧光分子发射光子的概率随时间呈指数下降。概率降低的速率可能是荧光分子的特性，并且对于不同的荧光分子可能不同。检测由荧光分子发射的光的时间特性可以允许识别荧光分子和/或相对于彼此区分荧光分子。发光分子在本文中也被称为发光标记物(或简称“标记物”)、标记和荧光团。
在达到激发状态之后，标记物可以在给定的时间以一定的概率发射光子。在标记物被激发之后，光子从被激发的标记物发射的概率可以随着时间的推移而降低。光子发射概率的随着时间的降低可以用指数衰减函数p(t)＝e-t/τ来表示，其中p(t)是在某一时间t处光子发射的概率，并且τ是标记物的时间参数。时间参数τ表示激发后标记物发射光子的概率为某个值的时间。时间参数τ是标记物的一种性质，其可能与其吸收和发射光谱性质不同。这种时间参数τ被称为标记物的发光寿命，或者简称为“寿命”。在一些实施例中，标记物可以具有在0.1-20ns的范围内的发光寿命。然而，本文描述的技术不限于所使用的标记物的寿命。
标记物的寿命可以用于在多于一个的标记物之间进行区分，和/或可以用于识别标记物。在一些实施例中，可以执行发光寿命测量，其中通过激发源激发具有不同寿命的多个标记物。作为一个示例，寿命分别为0.5、1、2和3纳秒的四个标记物可以由发射具有选定波长(例如，635nm，作为示例)的光的光源激发。可以基于测量由标记物发射的光的寿命来识别标记物或将标记物彼此区分。
发光寿命测量可以通过比较强度如何随时间变化而使用相对强度测量，而不是绝对强度值。因此，发光寿命测量可以避免绝对强度测量的一些困难。绝对强度测量可以取决于存在的荧光团的浓度，并且对于不同的荧光团浓度可能需要校准步骤。相比之下，发光寿命测量可能对荧光团的浓度不敏感。
通过寿命测量区分标记物可以允许使用比通过发射光谱测量区分标记时更少波长的激发光。在一些实施例中，当使用较少波长的激发光和/或发光时，可以减少或消除传感器、滤波器和/或衍射光学器件的数量。在一些实施例中，可以用具有不同寿命的标记物进行标记，并且标记物可以由具有相同激发波长或光谱的光激发。在一些实施例中，可以使用发射单个波长或光谱的光的激发光源，这可以降低成本。然而，本文描述的技术在这方面不受限制，因为可以使用任何数量的激发光波长或光谱。在一些实施例中，集成光检测器可以用于确定关于接收到的光的光谱信息和时间信息。在一些实施例中，可以通过确定标记物发射的发光的时间参数、光谱参数或时间参数和光谱参数的组合来执行存在的分子类型的定量分析。
根据本申请的各方面的具有集成光检测器的集成器件可以被设计为具有用于各种检测和成像应用的合适功能。这种集成光检测器可以在一个或多个时间间隔或“时间分格”内检测光。为了收集关于光到达时间的信息，电荷载子响应于入射光子而产生，并且可以根据它们的到达时间划被分离到相应的时间分格。
检测入射光子到达时间的集成光检测器可以减少额外的光学滤波(例如，光谱滤波)要求。如下所述，根据本申请的集成光检测器可以包括在特定时间移除光生载子的漏极。通过以这种方式移除光生载子，响应于激发光脉冲产生的不需要的电荷载子可以被丢弃，而不需要光学滤波以防止接收来自激发脉冲的光。这种光检测器可以降低整体设计集成的复杂性、光学和/或滤波组件和/或成本。
在一些实施例中，发光寿命可以通过测量发射的发光的时间分布来确定，所述测量是通过在集成光检测器的一个或多个时间分格中收集的电荷载子来检测作为时间函数的发光强度值。在一些实施例中，标记物的寿命可以通过执行多次测量来确定，其中标记物被激发到激发状态，并且然后测量光子发射的时间。对于每次测量，激发源可以产生指向标记物的激发光脉冲，并且可以确定激发脉冲和来自标记物的后续光子事件之间的时间。附加地或可替选地，当激发脉冲重复且周期性地发生时，可以测量光子发射事件发生时与后续激发脉冲之间的时间，并且可以从激发脉冲间的时间间隔(即，激发脉冲波形的周期)中减去测量的时间，以确定光子吸收事件的时间。
通过用多个激发脉冲重复这样的实验，可以确定在激发后的特定时间间隔内从标记物发射光子的实例的数量，这指示了在激发后这种时间间隔内发射光子的概率。收集的光子发射事件的数量可以基于发射到标记物的激发脉冲的数量。在一些实施例中，在测量周期内的光子发射事件的数量可以在50-10,000,000或更多的范围内，然而，本文描述的技术在这方面不受限制。在激发之后的特定时间间隔内从标记物发射光子的实例的数量可以填充直方图，该直方图表示在一系列离散时间间隔或时间分格内发生的光子发射事件的数量。可以设置和/或调整时间分格的数量和/或每个分格的时间间隔，以识别特定的寿命和/或特定的标记物。时间分格的数量和/或每个分格的时间间隔可以取决于用于检测发射的光子的传感器。时间分格的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8或更多，诸如16、32、64或更多。曲线拟合算法可以用于将曲线拟合到记录的直方图，从而产生表示在给定时间激发标记物之后发射光子的概率的函数。上述衰减函数p(t)＝e-t/τ可以用于近似拟合直方图数据。根据这种曲线拟合，可以确定时间参数或寿命。可以将所确定的寿命与标记物的已知寿命进行比较，以识别存在的标记物的类型。
可以根据在两个时间间隔获得的强度值来计算寿命。在一些实施例中，光检测器在至少两个时间分格上测量强度。在时间t1和t2之间发射发光能量的光子由光检测器被测量为强度I1，并且在时间t3和t4之间发射的发光能量被测量为I2。可以获得任何合适数量的强度值。这种强度测量然后可以用于计算寿命。当在某个时间存在一个荧光团时，则时间分格的发光信号可以被拟合为单指数衰减。在一些实施例中，可能仅需要两个时间分格来准确识别荧光团的寿命。当存在两个或更多个荧光团时，可以通过将发光信号拟合到多个指数衰减，诸如双指数或三指数，从组合的发光信号中识别个体寿命。在一些实施例中，可能需要两个或更多个时间分格以便从这样的信号中准确地识别一个以上的发光寿命。然而，在具有多个荧光团的一些情况下，可以通过将单个指数衰减拟合到发光信号来确定平均发光寿命。
在某些情况下，光子发射事件的概率以及标记的寿命可能会基于标记物的周围环境和/或条件而变化。例如，被限制在直径小于激发光波长的体积中的标记物的寿命可以小于标记物不在该体积中时的寿命。可以在类似于标记物用于标记时的条件下用已知标记物进行寿命测量。当识别标记物时，可以使用由具有已知标记物的这种测量确定的寿命。
示例2
在根据本公开的DNA定序应用中芯片再生的示例性方法的执行之后，对定序准确性执行了芯片上评定。CMOS芯片上的样本井阵列装载有含有已知感兴趣的DNA分子的样本的等分试样。在该评定中，对样本的等分试样的末端DNA定序执行进行了三次连续运行：第一次运行在新鲜、干净的芯片上执行；第二次运行是在施加本公开的示例性再生溶液之后执行的；以及第三次运行是在第二次将再生溶液施加到芯片上之后执行的。因此，第三次运行的结果代表了对第二再生步骤的评定。本实验中使用的再生溶液包含9mL HFIP、0.5mL5M乙酸铵、1mL水、浓度在100μM和200μM之间的生物素-PEG3(双-生物素-PEG4)。
本实验再生步骤的处理如下：第一次定序运行后，清除芯片中的任何残留物，并且然后将核苷消化混合物(NEB#M0649)施加到芯片。然后将芯片在37℃下孵育40分钟。随后，将再生溶液施加到芯片上，并将芯片在室温下进一步孵育30分钟。最后，再次清除芯片上的任何残留物。
在第二次和第三次运行之前应用再生溶液似乎已经成功地解离了样本井表面的链霉亲和素-生物素相互作用。测量三次运行中每一次的核苷酸定序读取长度和精确度，并将其绘制在图7A和图7B所示的图中。如图7B所示，在第二次和第三次运行中观察到约74％的平均精确度和超过94％的最大(或“最佳”)精确度。事实上，令人惊讶的是，第二次和第三次运行表现出与第一次运行相当的优越定序性能。因此，在这个实验中，芯片再生和重复使用可能改善了读出。图7A示出了从三次运行中获得的信号中的平均读取长度，其包括在第三次运行中的大约8500bp的读取长度。图7B还示出了每个序列读出相对于分子的已知序列的“比对分数”。
随后，在根据本公开的肽定序应用中的芯片再生的示例性方法的执行之后，对定序准确性执行芯片上评定。CMOS芯片上的样本井阵列装载有含有已知感兴趣肽分子的样本的等分试样。在该评定中，对样本的等分试样进行了八次连续运行：第一次运行在新鲜、干净的芯片上执行；并且在如上所述施用再生溶液之后执行每次连续运行。在该实验中，使用与末端氨基酸结合的标记氨基酸辨识分子来检测感兴趣肽的存在。标记辨识分子的发光在信号输出中产生一系列脉冲。该系列脉冲提供特征脉冲模式，该特征脉冲模式判断对应末端氨基酸的身份。使用两种不同的芯片S42906-16-14和S42906-16-19重复该实验。
本实验的再生步骤的处理如下：第一次定序运行后，清除芯片中的任何残留物，并且然后将再生溶液施加到芯片，并将芯片在室温下孵育30分钟。最后，再次清除芯片上的任何残留物。
如图8A-8H所示的信号输出结果所示，对于超过第一次运行的运行，肽分子的精确度和读取长度结果超出了预期。在图8A中绘制了每次运行的装载井的百分比。运行5到8的装载百分比超过25％。在图8B中绘制了芯片上的主动装载和脉冲样本井的总数的百分比(主动％)。该数字表明，在运行2和运行8之间，约2.4％至17.5％的样本主动表现出脉冲。在运行5和运行8之间，主动％频率约为15％。
对于八次运行中的每一次，读取长度1、2和3(R1、R2和R3)的定序结果的精确性如图8C-8E所示。y轴反映了为正在绘制的读取长度提供定序读数的样本井(孔径)的计数。当从读取长度1到读取长度3时，这些计数在数量上减少。图8E示出了八次运行中的每一次的中值信噪比(SNR)。图8G示出了跨越所有读取长度的平均切割深度。图8H示出了对于具有大于3的读取长度的每次运行的芯片的活动井的一部分。
两个实验的结果都表明，再生过程不会产生明显的干扰，该干扰由先前装载的等分试样发出的信号引起的，而这些信号是在对随后装载的等分试样进行采样时产生的，并且因此为从芯片中移除样本提供了可行的解决方案。
VIII.使用光漂白信息的集成器件校准
本文所述技术的各方面还提供了使用从参考染料获得的光漂白信息校准集成器件和/或与集成器件相互作用的一个或多个组件的技术。例如，集成器件可以是进一步包括至少一个激发源的系统的一部分。本文描述的校准技术可以被用于校准包括集成器件的系统。图9示出了根据一些实施例的用于使用光漂白信息校准包括集成器件的系统的示例过程900。
在动作902处，可以用参考染料标记样本分子。例如，参考染料可以包括荧光分子，其响应于来自至少一个光源的光的激发而发射发射光。参考染料分子可以是与特定样本分子结合的类型，使得由参考染料分子发射的发射光的特性可以用于识别参考染料分子所结合的样本分子。
在动作904处，将染料标记的样本装载到一个或多个反应腔室中。例如，在一些实施例中，将相同类型的多种参考染料装载到多个反应腔室中，以评估从多个反应腔室接收的信号的差异。在一些实施例中，在将样本分子装载到反应腔室中之后，可以用参考染料标记样本分子，因为本文所述技术的各方面在这方面不受限制。
图10-1示出了根据一些实施例的用附着到表面1006的参考染料1010标记的样本分子1009。图10-2示出了根据一些实施例的附着在反应腔室中的染料标记的样本。特别地，在图10-2中，将包含氨基酸链(苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)和丝氨酸(S))的样本分子1009被装载到反应腔室1008中。样本分子1009被参考染料分子1010标记。可以提供包括用于收集由参考染料分子1010发射的信号的光子组件1012的CMOS芯片1014，如本文参考集成器件概述所述。
可以在反应腔室没有被激发光照射时执行动作904。应当理解，在一些实施例中，在动作904处，可以将多个染料标记的样本分子装载到多个反应腔室中。
在一些实施例中，可以将具有参考染料的样本分子单独装载到反应腔室中，然后可以将待定序的分子装载到反应腔室中。在一些实施例中，具有参考染料的分子可以在执行校准过程之后与待定序的分子一起装载到反应腔室中。在一些实施例中，参考染料可以被附着到待定序的分子本身，并且参考染料可以在执行定序之前被裂解。在一些实施例中，参考染料可以是自由扩散的染料分子，其不需要附着或以其他方式固定在反应腔室中。在一些实施例中，参考染料可以作为芯片的表面化学制备的一部分被装载到反应腔室中。因此，该技术的各方面不限于参考染料在反应腔室中的特定配置。根据一些实施例，动作902可以包括于2020年10月28日以代理人案卷号R0708.70077US01提交的题为“METHODS OFPREPARING SAMPLES FOR MULTIPLEX POLYPEPTIDE SEQUENCING”的第17/082906号美国专利申请，其全部内容通过引用并入本文。
在动作906处，用来自光源(例如，激光器)的激发光照射反应腔室。特别地，在动作906处，可以用激发光周期性地照射一个或多个反应腔室(例如，通过解锁光源，将光源重新耦合到芯片中，和/或在相对于系统的特征漂白时间较快的时间内增加由光源传递的功率)。例如，图11示出了根据一些实施例的示例曲线图1100，其示出了光源激发功率随时间的变化。在一些实施例中，激发光可以被传递到反应腔室直到参考染料已经被漂白。在一些实施例中，可以控制激发光到反应腔室的传递，以避免漂白参考染料分子。本文提供了对光漂白参考染料分子的进一步讨论。
在动作908处，记录时间轨迹，其显示包含在动作906处照射的一个或多个样本分子的反应腔室的漂白步骤。例如，图12-1示出了根据一些实施例的示例曲线图1200，其示出了来自参考染料的测量信号随时间的变化。如图12-1所示，测量信号的强度增加，并且随后在一段时间后强度下降。测量信号的强度上升和下降之间的时间段可以等于参考染料分子的漂白时间。
在动作910处，确定是否有额外的激发路径要激发。如果在动作910处确定有额外的激发路径要激发，则过程900通过“是”分支返回到动作906，以用额外的激发路径照射额外的反应腔室。如果在动作910处确定不存在额外的激发路径，则过程900可以通过“否”分支进行到动作912。
在动作912处，可以存储参考指标。例如，参考指标可以包括示出在动作908处获得的漂白步骤的时间轨迹。例如，图12-2示出了根据一些实施例的反应腔室中单个分子的集合的测量的漂白时间和染料强度的示例直方图。曲线图1902示出了装载在集成器件的反应腔室中的单个分子参考染料的集合的测量漂白时间的直方图。如图12-2所示，单个分子参考染料的集合的中值漂白时间为5.8秒。曲线图1904示出了装载在集成器件的反应腔室中的单个分子参考染料的集合的测量的参考染料信号强度的直方图。在一些实施例中，漂白时间可以至少部分地基于测量的信号强度来确定。例如，测量的信号强度可以指示峰值，并且在达到峰值强度和从峰值强度下降之间的时间段可以等于漂白时间。
参考指标可以包括从在动作908处获得的信息导出的信息。在一些实施例中，参考指标可以包括反应腔室中分子的参考激发强度，其可以基于特征漂白时间来确定。例如，漂白时间的指数分布如下exp(-t/τ)，其中，τ是特征漂白时间。对于单个分子的集合，中值漂白时间除以ln(2)提供了特征漂白时间τ的估计。较高的激发强度可能导致较快的特征漂白时间，反之亦然。
在动作914处，可以基于参考指标(例如，特征漂白时间、激发强度)来调整定序参数。在一些实施例中，可以调整将激发光传递到反应腔室的激光器的功率。例如，在一些实施例中，考虑到相对快速的特征漂白时间，可以降低激光功率。在一些实施例中，可以降低激光功率，以确保在随后的定序应用期间的激发强度不超过目标值。因此，定序应用的读取长度可以得到改善，其中光损伤可能是定序反应寿命的一个因素。
在一些实施例中，可以基于参考指标来调整集成器件的配置。例如，本发明人已经认识到，反应腔室中的差异可能导致参考染料的特征漂白时间在不同的反应腔室之间变化。这样，可以基于参考指标来调整反应腔室、光检测器和/或向像素传递激发光的光源的配置。例如，对于漂白时间相对较快的反应腔室，可以降低传递到反应腔室的激发光的强度和/或持续时间。
在一些实施例中，漂白信息可被用于识别反应腔室中的许多参考染料分子。例如，在激发光被传递到一个或多个参考染料分子直到参考染料分子已经被光漂白的实施例中，可以通过观察从反应腔室收集的信号(例如，从一个或多个参考染料分子发射的)的强度随时间的变化来观察漂白步骤。一个参考染料分子的光漂白可以用强度的单个步骤来表示(例如，在某个时间点信号强度的特征性下降)。在一些实施例中，信号强度的特征性下降可以基本上等于参考染料分子在漂白之前发射的信号强度。具体地，在漂白之后，参考染料分子不再发射信号，导致强度的单个步骤降低基本上等于漂白之前由参考染料分子发射的信号的强度。
如果观察到单个漂白步骤(例如，如观察到的信号强度随时间的变化所表示的)，则可以确定单个参考染料分子已经漂白，并且因此单个参考染料分子存在于从中收集信号的反应腔室中。如果观察到两个或更多个漂白步骤，则可以确定多个参考染料分子已经被装载到反应腔室中。确定被装载在反应腔室中的参考染料分子的数量可以被认为是用于确定存在于反应腔室中样本的生物分子数量的代理。在一些实施例中，反应腔室中样本分子数量的测量可被用于包括或排除某些反应腔室进行后续分析。本文提供了使用光漂白来确定定量装载的测量的进一步描述。
在执行校准过程900之后，集成器件可被用于收集和分析来自设置在反应腔室中的分子的信号。例如，图13示出了根据一些实施例的可以在校准过程900之后执行的反应腔室中的定序反应。图13中所示的定序反应可以包括将参考染料分子1010A、1010B附着到反应腔室1008中的样本1009上。如本文所述，参考染料分子可以是特定类型的，例如与特定类型的样本分子结合。例如，参考染料分子1010A仅选择性地结合第一类型的氨基酸(例如，亮氨酸，表示为L)，而参考染料分子1010B选择性地结合第二类型的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，分别表示为F、Y和W)。在对样本分子1009进行采样之后(例如，通过将激发光传递到反应腔室308并收集从结合的参考染料分子1010A、1010B发射的信号)，可以用裂解分子1016执行样本分子和/或与其结合的参考染料分子1010A和1010B的裂解。可以基于参考分子发射的信号来识别样本分子。对于单个样本分子和/或反应腔室，可以多次重复结合、接收发射信号和裂解的过程。在一些实施例中，本文所述的校准技术可被用于校准包括集成器件的系统，该集成器件被配置用于蛋白质和/或DNA/RNA定序应用。
本文所述的校准技术可以与校准后执行的任何合适的采样技术结合使用。例如，在一些实施例中，本文所述的校准技术可以与2021年10月22日以代理人案卷号R01408.70112US02提交的题为“SYSTEMS AND METHODS FOR SAMPLE PROCESS SCALING”的第17/508783号美国专利申请中描述的样本复用技术结合使用，该申请的全部内容通过引用并入本文。
IX.定量装载
一些方面涉及用于确定集成器件的一个或多个反应腔室的定量装载的测量的系统和方法。例如，发明人已经认识到，实时(例如，在装载过程中)确定集成器件的一个或多个反应腔室的定量装载的测量是有利的。定量装载的测量可以包括反应腔室中存在多少生物分子的指示(例如，反应腔室是空的、单装载的、双装载的还是有两个以上生物分子的多装载)。在一些实施例中，定量装载的测量可以包括单装载(或所需的任何其他装载度)的反应腔室的百分比的指示。
图14示出了根据一些实施例的用于量化一个或多个反应腔室的装载的示例过程1400。过程1400可以在动作1402处开始，其中集成器件装载有样本。样本可以包括多个生物分子。多个生物分子可以是任何合适的类型。例如，多个生物分子可以包括希望通过定序来识别的生物分子。在一些实施例中多个生物分子包括肽。在一些实施例中，多个生物分子包括核酸(例如核糖核酸、脱氧核糖核酸)。
多个生物分子可以用荧光标记分子(本文也被称为参考染料分子)标记。在一些实施例中，可以在将样本装载到集成器件上之前标记多个生物分子。在一些实施例中，多个生物分子可以在装载时未被标记，并且先前或随后装载到集成器件上的荧光标记分子可以与多个生物分子结合。
在一些实施例中，荧光标记分子可以直接附着到生物分子本身。荧光标记分子可以共价附着到生物分子或非共价附着到生物分子(例如，经由连接子或链霉亲和素)。在一些实施例中，荧光标记分子可以作为芯片的表面化学制备的一部分被装载到反应腔室中。在一些实施例中，荧光标记分子可逆地结合到生物分子上，如本文进一步描述的。因此，本技术的各方面不限于反应腔室中荧光标记分子的特定配置。根据一些实施例，动作1402可以包括2020年10月28日以代理人案卷号R01408.70077US01提交的题为“METHODS OFPREPARING SAMPLES FOR MULTIPLEX POLYPEPTIDE SEQUENCING”的第17/082906号美国专利申请中描述的技术，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，荧光标记分子包括寡核苷酸。寡核苷酸可以共价附着到生物分子上。在一些实施例中，寡核苷酸与共价附着到生物分子的互补寡核苷酸杂交。
荧光标记分子可以与生物分子分离开(例如，经由一个或多个间隔物)最小距离(例如，大于1nm、大于2nm、大于5nm、5-10nm、大于10nm、10-15nm、大于15nm、15-90nm、大于90nm)。将荧光标记分子与生物分子分离开最小距离可以防止在定量装载测定期间(例如，在光漂白期间)对生物分子造成损害。
在动作14704处，激发光可以被传递到集成器件的一个或多个反应腔室。激发光可以经由至少一个激发源(例如，激光器)产生，如本文所述。激发光可以被传递到集成器件的所有反应腔室或其一部分。
激发光使与反应腔室中的生物分子结合的任何荧光标记分子激发并发射激发光。在动作1406处，可以获得由一个或多个参考染料分子响应于激发光从相应的反应腔室发射的信号。
例如，发射光可以由集成器件的一个或多个光检测区收集。在一些实施例中，集成器件可以包括用于每个反应腔室的一个光检测区。在一些实施例中，可以为单个反应腔室提供多个光检测区。在一些实施例中，多个反应腔室可以对应于单个光检测区。
在动作1408处，可以基于在动作1406处获得的发射信号来确定定量装载的测量。如本文所述，定量装载的测量可以包括反应腔室中存在多少生物分子的指示(例如，反应腔室是空的、单装载的、双装载的还是有两个以上生物分子的多装载)。在一些实施例中，定量装载的测量可以包括单装载(或所需的任何其他装载度)的反应腔室的百分比的指示。
在一些实施例中，将激发光传递到集成器件的一个或多个反应腔室包括光漂白一个或多个荧光标记分子，并且定量装载的测量是基于在发射信号中表示的光漂白步骤的数量(例如可以在发射信号中观察到的光漂白步骤的数量)来确定的。例如，可以用激发光作为步骤函数来照射反应腔室(例如，通过解除光源封锁，将光源重新耦合到芯片中，和/或在相对于系统的特征漂白时间较快的时间内增加光源所传递的功率)。激发光可以被传递到反应腔室，直到参考染料已经被漂白。图15-1、图15-2和图15-3示出了在动作1404处从具有被光漂白的荧光标记分子的腔室获得的示例迹线。在其他实施例中，可以在不执行光漂白的情况下获得由反应腔室中的一种或多种参考染料发射的信号。
图15-1示出了根据一些实施例的表示单个装载井的来自芯片装载过程的示例迹线1500A。如图15-1所示，绘制了一段时间内的信号强度。当激发光第一次被传递到反应腔室时，从反应腔室接收的信号的强度可以上升到峰值。在将激发光传递到反应腔室之后(例如，通过打开诸如激光器的光源)，在图15-1中可以看到强度的单个步骤(例如，在某个时间点的信号强度的特征性下降)。在一些实施例中，如图15-1所示，信号强度的特征性下降可以基本上等于参考染料分子在漂白之前发射的信号强度。漂白后，参考染料分子不再发出信号，导致图15-1所示的强度的单个步骤下降。因此，图15-1中所示的信号指示在反应腔室中存在单个荧光标记物，并且因此指示单个生物分子。
图15-2示出了根据一些实施例的来自芯片装载过程的示例迹线1500B，其表示双装载井。如图15-2所示，信号包括信号强度的两个步骤，指示反应腔室中存在两个荧光标记分子，并且因此存在两个生物分子。
图15-3示出了根据一些实施例的来自芯片装载过程的示例迹线1500C，其表示多装载井。如图15-3所示，该信号包括信号强度的三个步骤(接收到的信号的三个特征性强度下降)，指示反应腔室中存在三个荧光标记分子，并且因此存在三个生物分子。
在某些情况下，可能没有观察到光漂白步骤。因此，基于观察到的缺乏光漂白，可以确定在反应腔室中不存在生物分子。
在一些实施例中，可以在反应腔室中不存在光漂白荧光标记分子的情况下从反应腔室获得信号。在这种实施例中，可以通过从反应腔室获得的信号的相对强度来确定反应腔室中存在的荧光标记分子的数量，并且因此确定生物分子的数量。
在一些实施例中，荧光标记分子可以可逆地与生物分子或附着于其上的次级生物分子结合。例如，次级生物生物分子可以包括N-末端氨基酸识别器(例如，ClpS、UBR盒等)。在一些实施例中，次级生物分子是寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸能够与生物分子或附着于其上的寡核苷酸可逆杂交。
荧光标记分子与生物分子的结合可以通过荧光标记分子的开启和关闭脉冲来表达。特别地，当荧光标记分子与生物分子结合并用激发光激发时，荧光标记分子发射可以被一个或多个光检测区收集的发射光。当未结合时，荧光标记分子可能不发射发射光。荧光标记分子可以遵循与生物分子的周期性结合模式。因此，荧光标记分子产生周期性脉冲模式，该模式可以通过收集荧光标记分子与生物分子结合时发射的光来检测。
图16示出了根据一些实施例的可逆地结合到生物分子的荧光分子的周期性脉冲模式。曲线1602和1604示出了在单个脉冲周期T期间由一个或多个光检测区检测到的脉冲的示例。
曲线1602和1604示出了具有两个生物分子和与其可逆结合的相应荧光标记物的双装载井的示例。因此，在脉冲周期T期间检测到两个脉冲。在曲线1602的所示实施例中，两个荧光标记分子在周期T期间基本上同时结合到相应生物分子。因此，在周期T中检测到由来自两个荧光标记分子中的每一个的相应脉冲组成的单个复合脉冲，其强度为2I。在曲线1604所示的实施例中，两个荧光标记分子在周期T期间的离散时间与相应生物分子结合。因此，在周期T中检测到具有强度I的两个脉冲。
尽管所示的实施例给出了反应腔室双装载两个生物分子的示例，但本文所述的技术同样可被用于通过确定在脉冲周期T期间从反应腔室发射的脉冲的强度来检测单个生物分子、多于两个的生物分子的存在或者任何生物分子的缺乏。脉冲的脉冲周期和强度可以基于可逆地结合到生物分子的荧光标记分子的特征脉冲宽度和强度来确定。
图16示出了如何检测脉冲的定时和强度，并将其用于确定在相应的脉冲周期T期间反应腔室中与生物分子结合的荧光标记分子的数量，并且因此确定当前存在于反应腔室中的生物分子的数量。因此，可以使用本文所述的可逆结合分子来执行过程1400的动作1408。
回到过程1400，过程1400可以在基于发射信号确定定量装载的测量之后进行到动作1410。在动作1410处，确定是否继续装载。可以基于在动作1410处确定的定量装载的测量来确定继续或终止装载的确定。
例如，在一些实施例中，可以基于定量装载的测量来优化集成器件的操作。在一些实施例中，定量装载的测量可以被用于调整如何将样本装载到集成器件上。在一些实施例中，定量装载的测量可以被用于确定最佳数量的反应腔室是否已经装载了期望数量的生物分子。在一些实施例中，所需数量的生物分子是一，使得定量装载的测量被用于确定是否单装载最佳数量(例如，最大数量)的反应腔室。
如果没有达到装载反应腔室的最佳数量，如定量装载的测量所指示的，则可以执行额外的装载。例如，过程1400可以循环回到动作1402，在动作1402中，将额外的样本装载到集成器件上。
在一些实施例中，定量装载的测量可被用于调整在随后的装载步骤中装载到集成器件上的额外样本的量。例如，样本可以包括特定浓度的生物分子。定量装载的测量可以被用于确定是增加还是减少生物分子的浓度。例如，如果确定没有满足单装载反应腔室的最佳数量，则可以用生物分子浓度高于初始样本的额外样本进行额外装载。
在一些实施例中，定量装载的测量可被用于调整如何处理来自反应腔室的信号以供后续分析。例如，当反应腔室被确定为空的、双装载的或多装载的时，可以通过不对这些反应腔室执行定序或不处理从这些反应腔室接收的信号来确定忽略来自这些反应腔室的信号。
在一些实施例中，定量装载的测量可以被用于通知集成器件的未来操作。例如，定量装载的测量可以被用于调整将来如何将样本装载到集成器件上(例如，样本中存在什么浓度的生物分子、执行装载多长时间、以什么速率执行装载等)。
当在动作1410处确定不继续装载时，过程1400可以进行到动作1412，在动作1412处终止装载。例如，在一些实施例中，可以通过移除、洗涤和/或更换含有非固定化(例如未结合)肽的溶液来执行终止。在一些实施例中，可以自主地执行终止。
在一些实施例中，终止装载可以包括从反应腔室中移除荧光标记分子。在一些实施例中，荧光标记分子可以通过化学裂解过程去除。在一些实施例中，荧光标记分子可以通过酶促裂解过程去除。
如本文所述，过程1400可以连续执行。在一些实施例中，过程1400可以自主地执行，例如，使用软件。这可以允许连续监测每个反应腔室中标记的生物分子的数量。软件分析过程可以实时地监测装载。例如，软件分析可以检测信号脉冲/光漂白步骤，如本文所述。
在一些实施例中，向生物分子提供一种或多种不同类型的荧光标记分子。例如，可以提供第一类型的荧光标记分子和第二类型的荧光标记分子用于与生物分子结合。
在一些实施例中，可以生成反应腔室的“热图”，以直观地示出装载有一个或多个生物分子的集成器件的百分比(例如，反应腔室的百分比)。图17示出了根据一些实施例的反应腔室的示例热图，其示出了百分比装载。
在一些实施例中，定量装载的测量可以仅针对集成器件的一部分(例如，集成器件的所有反应腔室的一部分)获得。定量装载的测量可以外推到集成器件的剩余反应腔室，以获得整个集成器件(或因此的其他部分)的定量装载的外推测量。
在一些实施例中，可以在执行本文所述的校准和定量装载技术之后执行样本的定序(例如，在过程1400的动作1414处)。例如，校准和定量装载技术可以与使用机器学习的样本识别技术结合使用，例如，如2020年6月12日以代理人案卷号为R0708.70063US01提交的题为“TECHNIQUES FOR PROTEIN IDENTIFICATION USING MACHINE LEARNING AND RELATEDSYSTEMS AND METHODS”的第16/900582号美国专利申请中描述的，该申请的全部内容通过引用并入本文。
本文所述的用于获得与集成器件(例如，与集成器件的一个或多个反应腔室的占用)相关的实时测量的技术可以在使用集成器件期间的任何时间实施(例如，在样本制备期间、在装载期间、在定序期间、在样本移除期间等)，并且这样的技术不限于在集成器件的装载期间使用。
X.等同物和范围
因此，已描述了本公开的技术的若干方面和实施例，应当了解，本领域普通技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这种改变、修改和改进旨在在本文所描述的技术的精神和范围内。因此，应当理解，前述实施例仅通过示例呈现，并且在随附权利要求及其等同物的范围内，本发明的实施例可以以不同于具体描述的其他方式来实践。另外，如果本文描述的特征、系统、制品、材料、套组和/或方法并非相互不兼容，则在本公开的范围内包括两个或更多个特征、系统、制品、材料、套组和/或方法的任何组合。
此外，如所描述的，一些方面可以体现为一种或多种方法。作为方法的一部分执行的动作可以以任何适合的方式排序。因此，可以建构如下实施例：其中动作以不同于所示出的次序的次序执行，这可以包括同时执行一些动作，即使动作在说明性实施例中被示出为连续动作。
如本文所定义和使用的全部定义应当理解为控制在辞典定义、以引用的方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义内。
除非明确相反指示，否则如本文在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”应理解为表示“至少一个”。
如本说明书和权利要求中所使用的，短语“和/或”应当理解为表示如此结合的要素中的“任一个或两个”，即在一些情况下结合地存在并且在其他情况下未结合地存在的要素。
如本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为表示由选自要素的列表中的要素的任何一个或多个的至少一个要素，但未必包括要素的列表内具体列出的每一和每个要素中的至少一个，并且未必排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许可以可选地存在除短语“至少一个”所指的要素的列表内具体鉴别的要素以外的要素，而无论与具体鉴别的那些要素相关还是不相关。
在权利要求以及在上述说明书中，所有过渡短语，诸如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由……组成”和类似短语应理解为开放的，即表示包括但不限于。过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”分别应为封闭或半封闭的过渡短语。

Claims (61)

1.一种用于重复使用集成器件来处理样本的方法，所述样本被分成多个等分试样，其中，所述样本包括分析物，并且所述分析物包括生物分子，所述生物分子包括一个或多个发光标记分子，所述方法包括：
将所述多个等分试样中的第一等分试样装载到所述集成器件的多个腔室中的至少一些腔室中；
当所述分析物存在于所述多个腔室中的至少一些腔室中时，对所述第一等分试样的分析物进行采样，其中，所述采样步骤包括确定由所述一个或多个发光标记分子发射的信号的发光寿命、发光强度、波长、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间；
从所述集成器件的所述多个腔室中的至少一些腔室中移除所述第一等分试样；以及
将所述多个等分试样中的第二等分试样装载到所述集成器件的所述多个腔室中的至少一些腔室中。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述第二等分试样的分析物存在于所述多个腔室中的至少一些腔室中时对所述第二等分试样的分析物进行采样。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，从所述多个腔室中的至少一些腔室中移除所述第一等分试样包括：
破坏结合到所述多个腔室的表面上的两个或更多个涂层分子与偶联部分之间的共价键，所述第一等分试样的分析物结合到偶联部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述解离通过使所述多个腔室的表面与溶液接触离散的时间段来执行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述解离步骤在大于或等于20摄氏度且小于或等于22摄氏度的温度下执行。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述离散时间段包括不超过60分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述溶液包括乙酸铵、水和六氟-2-丙醇。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述溶液进一步包括游离生物素和/或其一种或多种类似物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述溶液包括乙酸铵、水和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇。
10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述溶液包括乙酸铵、水和在九氟叔丁醇、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇和八氟-2-丁酮中的一种或多种。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，从所述多个腔室中的至少一些腔室移除所述第一等分试样包括：
从所述多个腔室的表面移除涂层分子，所述第一等分试样的分析物通过偶联部分结合到所述多个腔室的至少一些腔室中的至少一些涂层分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在将所述第二等分试样装载到所述多个腔室的至少一些腔室中的步骤之前，用所述涂层分子重新涂覆所述多个腔室的表面。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，从所述多个腔室中的至少一些腔室中移除所述第一等分试样的步骤包括在所述多个腔室的至少一些腔室中将所述第一等分试样的分析物酶促消化。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述第一等分试样的分析物被结合到偶联部分，并且从所述多个腔室的至少一些腔室中移除所述第一等分试样包括破坏所述偶联部分与所述第一等份试样的分析物之间的共价连接子。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述采样步骤还包括：
用从至少一个光源传递的激发光激发所述第一等分试样的分析物；以及
在所述集成器件的光检测区处收集当被从所述至少一个光源传递的光激发时从所述第一等分试样的分析物发射的信号。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括在将所述第一等分试样装载到所述多个腔室的至少一些腔室中之前用涂层分子涂覆所述多个腔室的表面，其中，所述第一等分试样的分析物被结合到偶联部分，用于结合到所述涂层分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述涂层分子包括生物素和链霉亲和素中的一种，所述偶联部分包括生物素或链霉亲和素中的一种，并且所述偶联部分不同于所述涂层分子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，在从所述多个腔室的至少一些腔室中移除所述第一等分试样的分析物的步骤之后，所述涂层分子保留在所述多个腔室中。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，在将所述第一等分试样装载到所述多个腔室的至少一些腔室中之后，所述多个腔室中的其他腔室不包含所述第一等分试样的任何分析物。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，还包括：
在从所述多个腔室的至少一些腔室中移除所述第一等分试样的分析物之后，通过将激发光传递到所述多个腔室并收集响应于所述激发光从所述多个腔室发射的信号来获得来自所述多个腔室的辨识信号；以及
基于响应于所述激发光从所述多个腔室发射的信号，确定所述第一等分试样是否已经从所述多个腔室的至少一些腔室中基本上被移除。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述生物分子是多核苷酸。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述生物分子是多肽。
23.一种用于重复使用集成器件来处理样本的方法，所述样本包括分析物，所述分析物包括生物分子，所述生物分子包括一个或多个发光标记分子，所述方法包括：
将所述样本的至少一部分装载到所述集成器件的多个腔室中；
当所述分析物存在于所述多个腔室中时，对所述样本的至少一部分的分析物进行采样，其中，所述采样步骤包括收集由所述一个或多个发光标记分子发射的信号，所述信号指示发光寿命、发光强度、波长、脉冲持续时间和/或脉冲间持续时间；以及
从所述多个腔室移除所述样本的至少一部分，其中，所述移除包括：
破坏结合到所述多个腔室的表面的相应涂层分子与偶联部分之间的共价键，所述样本的至少一部分的分析物被结合到所述偶联部分。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述共价键将所述分析物结合到所述多个腔室的表面，并且破坏所述键将所述分析物从所述多个腔室的表面释放。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述移除还包括在所述破坏之后，从所述多个腔室冲洗所述分析物。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中，所述破坏通过使所述多个腔室的表面与溶液接触离散的时间段来执行。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述破坏在大于或等于20摄氏度且小于或等于22摄氏度的温度下执行。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述离散时间段包括不超过60分钟。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述离散时间段包括不超过30分钟。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中，所述涂层分子包括生物素，并且所述偶联部分包括链霉亲和素。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中，所述涂层分子包括链霉亲和素，并且所述偶联部分包括生物素。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述溶液包括乙酸铵和水。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述溶液还包括六氟-2-丙醇。
34.根据权利要求26所述的方法，其还包括，在所述接触之后：
通过从至少一个光源向所述多个腔室传递激发光并收集响应于所述激发光从所述多个腔室发射的信号来从所述多个腔室获得辨识信号；以及
基于响应于所述激发光从所述多个腔室发射的信号，确定所述样本的至少一部分的分析物是否已从所述多个腔室中移除。
35.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，还包括，在从所述多个腔室移除所述样本的至少一部分之后，将所述样本的剩余部分装载到所述多个腔室中。
36.一种用于确定样本是否存在于集成器件的一个或多个腔室中的方法，所述方法包括：
将所述样本的至少一部分装载到所述集成器件的所述一个或多个腔室中；
从所述集成器件的所述一个或多个腔室移除所述样本的至少一部分；
将激发光传递到所述集成器件的所述一个或多个腔室；
在所述集成器件的光检测区处收集响应于所述激发光从所述多个腔室发射的信号；以及
基于所述信号确定所述样本的至少一部分中的至少一些是否存在于所述集成器件的所述一个或多个腔室中。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括：
基于所述信号确定在所述移除之后剩余在所述集成器件的所述一个或多个腔室中的所述样本的至少一部分的量。
38.根据权利要求37所述的方法，还包括：
当确定剩余在所述一个或多个腔室中的所述样本的至少一部分的量低于阈值时，将所述样本的剩余部分装载到所述一个或多个腔室中。
39.根据权利要求38所述的方法，还包括：
当确定剩余在所述一个或多个腔室中的所述样本的至少一部分的量不低于所述阈值时，抑制将所述样本的剩余部分装载到所述一个或多个腔室中。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中，所述移除包括：
破坏结合到所述一个或多个腔室的表面的相应涂层分子与偶联部分之间的共价键，所述样本的至少一部分的分析物结合到所述偶联部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述破坏通过使所述一个或多个腔室的表面与溶液接触离散的时间段来执行。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述破坏在大于或等于20摄氏度且小于或等于22摄氏度的温度下执行。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述离散时间段包括不超过60分钟。
44.根据权利要求41所述的方法，其中，所述溶液包括乙酸铵、水和六氟-2-丙醇。
45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中，所述移除包括：
从所述一个或多个腔室的表面移除涂层分子，所述样本的至少一部分的分析物通过偶联部分结合到所述一个或多个腔室中的所述涂层分子的至少一些。
46.根据权利要求45所述的方法，还包括用所述涂层分子重新涂覆所述一个或多个腔室的表面。
47.根据权利要求35-46中任一项所述的方法，其中，所述移除包括酶促消化存在于所述一个或多个腔室中的所述样本的至少一部分的分析物。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中，所述样本的至少一部分的分析物与偶联部分结合，并且所述移除包括破坏所述偶联部分与所述样本的至少一部分的分析物之间的共价连接子。
49.一种用于确定是否用集成器件继续处理样本的方法，所述样本被分成多个等分试样，所述方法包括：
当所述分析物存在于所述集成器件的一个或多个腔室中时，对所述多个等分试样的第一等分试样的分析物进行采样，所述采样包括：
用从至少一个光源传递的激发光激发所述第一等分试样的分析物；以及
在所述集成器件的光检测区处收集当被从所述至少一个光源传递的光激发时从所述第一等分试样的分析物发射的信号；以及
基于从所述第一等分试样的分析物发射的信号，确定将所述多个等分试样的第二等分试样装载到所述集成器件的所述一个或多个腔室中；以及
将所述多个等分试样的第二等分试样装载到所述集成器件的所述一个或多个腔室中。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，根据权利要求1-48中任一项所述的方法执行将所述多个等分试样的所述第二等分试样装载到所述集成器件的所述一个或多个腔室中。
51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，其中，所述确定包括：
基于从所述第一等分试样的分析物发射的信号识别所述第一等分试样的分析物的至少一个特性；以及
基于所述至少一个特性来确定是否装载所述第二等分试样。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述第一等分试样的分析物的所述至少一个特性包括波长、发光寿命、强度、脉冲持续时间或脉冲间持续时间中的至少一个。
53.根据权利要求51所述的方法，还包括：
基于所述至少一个特性确定所述第一等分试样的一个或多个分析物的身份；以及
基于所述第一等分试样的一个或多个分析物的身份来确定是否装载所述第二等分试样。
54.一种用于处理样本的可重复使用的器件，所述样本被分成多个等分试样，所述器件包括：
多个反应腔室，其用于接收所述多个等分试样的第一等分试样，其中，用被配置为结合到与所述第一等分试样的分析物结合的偶联部分的涂层分子涂覆所述多个反应腔室的表面；
光检测区，其被配置为接收响应于被传递到所述多个腔室的激发光从所述多个腔室发射的信号；
至少一个处理器，其被配置为基于由所述光检测区接收的信号来确定所述多个腔室是否包含所述第一等分试样的分析物的至少一部分。
55.根据权利要求54所述的器件，其中，所述至少一个处理器还被配置为基于由所述光检测区接收到的信号来确定包含在所述多个腔室中的所述第一等分试样的分析物的至少一部分的量。
56.根据权利要求54-55中任一项所述的器件，其中，所述至少一个处理器还被配置为基于由所述光检测区接收到的信号来确定所述多个腔室是否包含所述涂层分子的至少一部分。
57.根据权利要求56所述的器件，其中，所述至少一个处理器还被配置为基于由所述光检测区接收到的信号来确定包含在所述多个腔室中的所述涂层分子的至少一部分的量。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的器件，其中，所述至少一个处理器还被配置以基于由所述光检测区接收到的信号来确定所述多个腔室是否包含所述偶联部分的至少一部分。
59.根据权利要求58所述的器件，其中，所述至少一个处理器还配置为基于由所述光检测区接收到的信号来确定包含在所述多个腔室中的所述偶联部分的至少一部分的量。
60.一种方法，包括：
将第一样本装载到可重复使用的芯片的多个腔室中，所述可重复使用的芯片具有多个波导，用于将从包括至少一个光源的仪器接收的激发光引导到所述多个腔室，以及多个光检测区，用于接收从所述第一样本发射的光；
将激发光从所述仪器的至少一个光源传递到所述可重复使用的芯片的多个腔室；
对所述第一样本的分析物进行定序；
从所述可重复使用的芯片的多个腔室移除所述第一样本；以及
将第二样本装载到所述可重复使用的芯片的多个腔室中。
61.一种器件，包括：
可重复使用的芯片，用于与包括至少一个光源的仪器一起使用，所述可重复使用的芯片包括：
多个腔室，用于接收第一样本；
多个波导，用于将激发光从所述至少一个光源引导到所述多个腔室；以及
多个光检测区，用于接收从所述第一样本发射的光，其中，所述可重复使用的芯片被配置为使得所述第一样本能够从多个腔室移除，并且在所述第一样本被移除之后，第二样本能够被接收在所述多个腔室中。
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