TWI537550B - 非標定型檢測系統及其應用 - Google Patents

Description

非標定型檢測系統及其應用

本發明係關於一種用於檢測化學物質之非標定型檢測系統，以及使用前述非標定型檢測系統進行非標定型檢測的方法。

定點照護檢測(point-of-care testing，POCT)係指在患者接受照護的地點來進行醫療檢測，也稱為床邊檢測(bedsite test)。目前普遍應用於定點照護檢測的技術之一是橫向側流免疫色譜分析(Lateral-flow immunochromatographic assay or Lateral-flow assay)，這種技術常用於一次性的定性檢測，其中最普遍的商業化產品是應用於驗孕檢測，每年生產驗孕試劑的數量高於10⁷劑^[1,2]。如第一圖所示，典型的橫向側流分析藉由表面層的毛細力來傳遞待測樣品，從放置區(sample application pad)經標定物結合區(conjugate release pad)至檢測區(detection zone)進行檢測辨識，最後抵達吸水區(absorbent pad)。當待測樣品(例如一特定抗體)流經標定物結合區時，會與修飾有標定物的抗原結合，而常被使用的標定物為具有顏色或螢光的奈米小球，如膠體金球、量子點、酵素標記、塑膠小球等，且標定物大小約在15至800nm。而在檢測區，不同的特定抗體事先被修飾在檢測線區(T line)與控制線區(C line)，當待測樣品流經此二區，樣品內已結 合標定物抗原的抗體將與檢測區上的抗體結合，因標定物的聚集形成一條線，而控制線區上的抗體將與樣品中的標定物抗原結合形成另一條線，所以陽性的檢測為兩條線。反之，當檢測樣品內無特定抗體時，則只會在控制線區形成一條線。因此，橫向側流分析係藉由雙線或單線的觀察來進行樣品定性的分析。此外，也可以藉由具有電荷耦合元件(charge-coupled device，CCD)的相機或平板掃描器及專用軟體分析檢測線的顏色深淺，以判定待測樣品之濃度，進行樣品定量分析。

另外，Yanik等人利用週期性奈米金屬孔洞結構會產生菲諾共振(Fano resonance)的特性，發展出一種可直接憑藉肉眼觀察來判定單層生物分子的技術^[3]。所謂菲諾共振是由一寬波段的共振與一窄波段的共振系統互相干涉產生的耦合共振現象^[4,5]，其共振波段比一般的共振系統更窄，可提供更高的強度偵測靈敏度。Yanik等人係使用一白光光源、窄頻濾光片及奈米金屬孔洞結構晶片來進行檢測，在待測樣本(如含有抗原之溶液)與晶片上的偵測物質(如抗體)結合後，可直接觀測吸附分子造成孔洞結構在特定波長的穿透強度變化，如第二圖所示。此一簡易的非標定檢測方法係藉由測量特定波長之穿透強度變化來進行定點照護診斷。

本發明提供一種非標定檢測晶片及檢測方法，其晶片係由數個不同週期的金屬結構陣列組成，在窄頻光源入射後，每個陣列會產生不同共振波長，且這些共振波長的範圍係涵蓋前述窄頻光源的波長，之後利用量測晶片上穿透光譜影像的光譜位移量來進行檢測。其結果可 直接以肉眼判斷，亦可透過影像感測器轉化為數位訊號，具有定性與定量的效果。與先前技術相較之下，習知的強度量測法的動態檢測範圍(dynamic range)由共振波峰的頻寬寬窄決定，但本發明之光譜影像量測法的動態檢測範圍可以藉由改變金屬結構陣列的週期範圍來調變，故其動態檢測範圍較大。此外，強度檢測易受燈源穩定度之影響，而本發明的檢測方法係觀測光譜影像變化，可免除燈源不穩之干擾。

本發明之一目的係提供一種能以肉眼直接觀測的非標定型檢測系統，其可用於檢測化學物質。

本發明之又一目的係提供一種使用如前文所述之非標定型檢測系統進行非標定型檢測的方法。

為達上述目的，本發明係提供一種用於檢測化學物質之非標定型檢測系統，其包括：一非標定型檢測晶片，其包含複數組具有不同週期長度的週期性金屬結構；以及一窄頻光源。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述週期性金屬結構係選自單層或多層週期性金屬孔狀結構、或單層或多層週期性金屬狹縫結構。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述週期性金屬孔狀結構係為圓形或多邊形的孔狀結構；較佳者，前述多邊形的孔狀結構係為方形、三角形或長方形。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述週期性金屬狹縫結構係包括：(a)一透明基板，其包含複數組第一週期性凸槽結構(first periodic ridges)，且各組第一週期性凸槽結構具有不同的週期長度；以及(b)一金屬層，其係包覆前述透明基板，且包括對應前述複數組第一週期性 凸槽結構之複數組第二週期性凸槽結構(second periodic ridges)及複數組第三週期性凸槽結構(third periodic ridges)，其中該第二週期性凸槽結構之各凸槽係與其所對應之第一週期性凸槽結構之各凸槽之間所形成的凹部結構互相嵌合，而該第三週期性凸槽結構係位於其所對應之第一週期性凸槽結構之上。該第二週期性凸槽結構的高度(T2)係大於或等於其所對應之第一週期性凸槽結構的高度(T1)(T2≧T1)；或者，當該第二週期性凸槽結構的高度小於其所對應之第一週期性凸槽結構的高度時，則其差值須小於100nm(0≦(T1-T2)≦100nm)。

前述非標定型檢測晶片中的第二週期性凸槽結構及第三週期性凸槽結構均為金屬狹縫，兩者結合後形成一雙層奈米金屬光柵結構，當偏極光入射時，會產生菲諾共振。可改變金屬凸槽結構的週期來調變其共振波長，惟其所產生的共振波長範圍須涵蓋入射之窄頻光源的波長。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述非標定型檢測晶片進一步包含一分子層，該分子層係包覆在前述金屬層上，且包含一或多種可與前述化學物質結合的分子；更佳者，前述化學物質包含元素、生物分子、聚合物或藥物；又更佳者，前述生物分子係包含蛋白、DNA或RNA。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述第二週期凸槽結構的高度為數十至數百奈米，狹縫寬度為十至兩百奈米。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述第二週期凸槽結構的週期長度為數百奈米至數微米；更佳者，前述第二週期凸槽結構的週期長 度為380nm至780mm。金屬結構週期的選擇係由窄頻光源的波長決定，在使用波長為532nm、632nm及650nm之雷射光、或使用LED搭配632nm窄頻濾光片所產生之窄頻光源時，較佳為選擇380nm至780nm作為第二週期凸槽結構的週期長度。前述LED可為白光或紅光LED，在使用紅光LED燈搭配632nm窄頻濾光片時，可消除影像中的藍色背景光。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述透明基板係由玻璃或塑膠材料所製成；更佳者，前述塑膠材料係選自壓克力、紫外線凝膠、聚碳酸酯、或環烯烴聚合物。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述金屬層係由選自金、銀、鋁或銅之材料所製成；更佳者，前述金屬層係為銀。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述光源係為窄頻光源，其可使用雷射光、或使用白光搭配雷射線窄頻濾光片所形成的窄頻光源；更佳者，係為單一波長之偏極入射光。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述非標定型檢測晶片之週期性金屬結構所產生的共振波長範圍係涵蓋前述窄頻光源的波長。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述非標定型檢測系統進一步包含一影像感測器；更佳者，前述影像感測器係包含電荷耦合元件(CCD元件)。

本發明另外提供一種使用如前文所述之非標定型檢測系統進行非標定型檢測的方法，其包括下列步驟：(a)提供一樣本； (b)將該樣本置於前述非標定型檢測晶片上，使之覆蓋晶片表面；(c)使光源從前述非標定型檢測晶片之透明基板方向正向入射，通過前述複數組具有不同週期長度的週期性凸槽結構後分別產生穿透光影像，並組合形成一光譜影像；以及(d)觀測前述光譜影像，以判定該樣本中是否含有前述化學物質。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法所使用的非標定型檢測晶片係包括：(a)一透明基板，其包含複數組第一週期性凸槽結構，且各組第一週期性凸槽結構具有不同的週期長度；以及(b)一金屬層，其係包覆前述透明基板，且包括對應前述複數組第一週期性凸槽結構之複數組第二週期性凸槽結構及複數組第三週期性凸槽結構，其中該第二週期性凸槽結構之各凸槽係與其所對應之第一週期性凸槽結構之各凸槽之間所形成的凹部結構互相嵌合，而該第三週期性凸槽結構係位於其所對應之第一週期性凸槽結構之上。此外，前述樣本係覆蓋該金屬層。該第二週期性凸槽結構的高度(T2)係大於或等於其所對應之第一週期性凸槽結構的高度(T1)(T2≧T1)；或者，當該第二週期性凸槽結構的高度小於其所對應之第一週期性凸槽結構的高度時，則其差值須小於100nm(0≦(T1-T2)≦100nm)。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法所使用的非標定型檢測晶片進一步包含一分子層，該分子層係包覆在該金屬層上，且包含一或多種可與前述化學物質結合的分子；更佳者，前述化學物質包含元素、生物分子、聚合物或藥物；又更佳者，前述生物分子係包含蛋白、DNA或RNA。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法中的步驟(b)和(c)之間係進一步包含一清洗步驟。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法所使用的光源係為窄頻光源，其可使用雷射光、或使用白光搭配雷射線窄頻濾光片所形成的窄頻光源；更佳者，係為單一波長之偏極入射光。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法所使用的非標定型檢測晶片的週期性金屬結構所產生的共振波長範圍係涵蓋前述窄頻光源的波長。

在本發明之較佳具體實施態樣中，前述方法所使用的非標定型檢測系統進一步包含一影像感測器；更佳者，前述影像感測器係包含電荷耦合元件。

本發明係利用化學物質與檢測晶片之週期性金屬結構表面結合後，會使共振波長產生紅移的特性，而使用複數組具有不同週期長度的週期性金屬光柵來觀察穿透光譜影像的紅移現象。這樣的檢測方法簡便快速、成本低廉，可直接用肉眼觀察，亦可進一步進行定性與半定量的分析，非常適用於定點照護檢測。

第一圖係顯示習知橫向側流免疫色譜分析檢測技術的原理示意圖。

第二圖係顯示習知利用高品質奈米孔洞結構之電漿子菲諾共振特性來檢測生物分子的方法。

第三圖係顯示本發明之非標定型檢測系統與檢測方法，其中(a) 係為系統示意圖；(b)為晶片之穿透光譜影像與晶片光譜曲線圖；(c)係顯示在不同表面條件下，晶片上不同週期長度的週期性凸槽之共振波長與雷射光波長的相對位置示意圖。

第四圖係顯示本發明之非標定型檢測晶片之製造流程示意圖。

第五圖係顯示本發明之非標定型偵測晶片上的週期性奈米凸槽示意圖。

第六圖為本發明之非標定型偵測系統中的雷射光源與影像感測器示意圖。

第七圖係顯示本發明非標定型偵測晶片上具有不同週期長度的週期性凸槽結構在空氣環境下的菲諾共振圖譜，其中(a)係使用白光之TM極化波正向入射後，由光纖耦合線性CCD陣列光譜儀所得的穿透光譜圖，其上的插圖則為使用波長532nm綠光雷射正向照射後所得的穿透光譜影像；(b)則為本發明之雙層奈米金屬光柵結構(即週期性凸槽結構)的週期長度與共振波長的實驗值與理論計算值的關係圖。

第八圖係顯示本發明之非標定型檢測系統在二氧化矽厚度檢測的方法與結果，其中(a)係為使用本發明之非標定型檢測晶片檢測不同二氧化矽薄層厚度的方法示意圖；(b)係為本發明非標定型偵測晶片上具有不同週期長度的週期性凸槽結構在不同二氧化矽薄膜厚度下的穿透光譜影像；(c)係為本發明非標定型偵測晶片上具有不同週期長度的週期性凸槽結構在不同二氧化矽薄膜厚度下的穿透光強度與結構週期關係圖；(d)係為光譜積分訊號與二氧化矽薄膜厚度之對應曲線。

第九圖係顯示本發明之非標定型檢測系統在生物分子檢測的方 法與結果，其中(a)係為使用本發明之非標定型檢測晶片檢測抗原與抗體的方法示意圖；(b)係為本發明之非標定型檢測晶片在空氣、500μg/mL BSA及375μg/mL抗BSA抗體環境下的穿透光譜影像；(c)係為(b)之影像虛線區域中的穿透光強度分布圖。

第十圖係顯示以智慧型手機記錄晶片光譜影像之方法與結果，其中(a)係為本發明實施例五所使用之非標定型偵測系統示意圖；(b)係為本發明實施例五所使用之非標定型檢測晶片示意圖；(c)係以智慧型手機擷取的光譜影像。

第十一圖係顯示以穿透式掃描器記錄晶片光譜影像之方法與結果，其中(a)係為本發明實施例六所使用之非標定型偵測系統示意圖，其使用了穿透式掃描器及一雷射線窄頻濾光片；(b)係為本發明實施例六所使用之非標定型檢測晶片示意圖；(c)係以穿透式掃描器擷取的光譜影像。

第三圖(a)是本發明之非標定型檢測系統的一具體實施例的示意圖，其係由一檢測晶片、一光源及一影像感測器所組成。本發明所使用的檢測晶片是一種電漿子晶片，其上包含複數組具有不同週期長度的週期性金屬光柵。當待測樣本(如含有抗原之溶液)覆蓋於晶片、或與晶片上可與特定化學物質(如抗原)結合的偵測分子(如抗體)反應後，樣本中的特定化學物質會與偵測分子結合。當單一波長之雷射光(532nm)通過線偏極板，從晶片下方正向入射時，入射光波會使不同週期長度之週期性金屬光柵產生不同的菲諾共振波長，這些菲 諾共振波長的分佈範圍與入射光的波長位置有所重疊，故會在不同的金屬結構陣列產生不同的穿透強度，而在晶片上形成穿透光譜影像。可透過CCD元件記錄晶片上的穿透光譜影像，如第三圖(b)所示。晶片表面原本只有抗體存在，當有抗原吸附在抗體上時，會使各個週期性金屬光柵的菲諾共振波長產生紅移，而影響入射光(532nm)的穿透強度，如第三圖(c)所示。此外，晶片上由不同週期長度(510nm至525nm)之週期性金屬光柵所構成的穿透光譜影像也會產生紅移，如第三圖(b)所示。利用這個方法，除透過CCD元件記錄影像外，亦可直接用肉眼觀測晶片上的穿透光譜影像，或利用智慧型手機的照相功能(如第十圖)、穿透式掃描器(如第十一圖)或其他類似的影像記錄器來記錄晶片光譜影像，並可利用影像分析軟體來進行精確的定量分析。

以下提供的實施例僅係進一步闡明本發明，而非以任何方式限制本文所揭露的內容。縱無進一步之闡述，該領域熟習此技藝之人士亦可根據此處之說明而充分實施本發明。在此引用的出版文獻均以其全文作為本發明之參考文獻。

實施例 實施例一，本發明之非標定型偵測晶片的製備與系統架設

可採用多種方式來製備非標定型偵測晶片。在本實施例中，係採取奈米熱壓印法來製備本發明之非標定型偵測晶片。此方法之示意圖見於第四圖。亦可使用其他方式來製備，如熱退火輔助基板剝離法。

首先提供一矽基板，使用電子束微影術(e-beam lithography，EBL) 與反應式離子蝕刻術(reactive ion etching，RIE)在該矽基板上製作出多組具有不同週期的週期性奈米凹槽結構，作為母模。接著依序將環烯烴聚合物(cyclic olefin polymer，COP)塑膠基板及PET(polyethylene terephthalate)塑膠密封膜覆蓋在矽母膜上，放入一壓印腔體內，加熱腔體基板至170℃，使覆蓋於母膜上的塑膠軟化。待塑膠軟化後，導入氮氣於壓印腔體內，產生20kgw/cm²的壓力於塑膠上，使母膜上的週期性奈米凹槽結構轉印到COP塑膠基板上，形成第一週期性凸槽結構。待矽基板溫度降至室溫後，再將COP塑膠基板與矽母膜及PET塑膠密封膜分離。最後利用電子槍蒸鍍設備或濺鍍設備在具有週期性奈米凸槽結構之COP塑膠基板上蒸鍍(或濺鍍)75nm厚的銀膜，即完成本發明之非標定型偵測晶片的製備。前述銀膜係由第二及第三週期性凸槽結構所組成的週期性金屬光柵。

在以下實施例中，使用了三種不同的晶片。其中實施例二至四所使用之非標定型偵測晶片上共有四組具有不同週期的週期性金屬結構陣列，其面積分別為150μm²，陣列間距300μm，金屬結構之週期(P)為510nm至525nm，週期間距為5nm，狹縫寬度(W)為60nm。實施例五所使用的晶片上共有十一個陣列結構，其面積分別為150μm²，陣列間距5μm，其週期為615nm至665nm，週期間距為5nm，狹縫寬度為60nm。實施例六所使用的晶片上共有十個陣列結構，其面積分別為150μm²，陣列間距5μm，其週期為440nm至485nm，週期間距為5nm，狹縫寬度為60nm。

本發明之非標定型偵測晶片上的週期性奈米凸槽示意圖係如第五 圖所示。

第六圖為本發明之非標定型偵測系統中的雷射光源與影像感測器示意圖。在下列實施例中，係使用一波長532nm的雷射光當作光源。使雷射光通過一毛玻璃以破壞雷射光的同調性，再經過一透鏡進行擴束(beam expansion)，接著利用一反射鏡使雷射光通過一線偏極板，使入射光的極化方向垂直於本發明之非標定型檢測晶片的第三週期性凸槽結構的狹縫方向(TM Mode)，並照射在晶片上，其穿透光會由另一透鏡收光，並由一電荷耦合元件(charge-coupled device,CCD)記錄晶片的穿透光譜影像。除了利用CCD記錄影像，晶片上的穿透光譜影像也可以直接由肉眼觀測，不需額外的量測設備。

實施例二，本發明之非標定型檢測系統的週期與波長計算

本發明之檢測晶片中的第二週期性凸槽結構及第三週期性凸槽結構均為金屬狹縫，兩者結合後形成一雙層奈米金屬光柵結構(即，金屬層)，如第五圖所示。本發明之檢測晶片包含複數組具有不同週期長度的週期性凸槽結構，每組週期性凸槽結構各自包含三個奈米凸槽結構，其中第一週期性凸槽結構是由透明基板的基底相同的材質構成的透明凸槽結構，寬度為w，高度為T1。其他兩個週期性凸槽結構(第二及第三週期性凸槽結構)則是由金屬構成，其中第二週期性凸槽結構係與前述透明凸槽結構「咬合」：亦即第二週期性凸槽結構中的之各凸槽係與其所對應之第一週期性凸槽結構之各凸槽之間所形成的凹部結構互相嵌合。此外，第二週期性凸槽結構的高度(T2)係與第三週期性凸槽結構的高度(T3)相同。第三週期性凸槽結構係位於其所對應 之第一週期性凸槽結構之上。第二週期性凸槽結構的週期長度係以P表示。由於光可穿透透明材料，但無法穿透金屬。對入射光來說，前述兩組金屬凸槽結構形成了一系列的「腔體」，它們實質上就是前述透明凸槽結構。也就是說，入射光會被捕捉在這些腔體內。

使用本發明之非標定型檢測晶片時，係將樣本加到雙層奈米金屬光柵上，使目標化學物質吸附於晶片表面，之後藉由清洗步驟移除未結合的目標化學物質。之後使一偏極化的入射光從垂直於晶片方向由下層基板側入射時，入射光會在前述腔體(I區)中產生侷域性電漿子共振(localized surface plasmon resonances，LSPR)。此外，當情況符合Bragg條件(Bragg conditions)時，在金屬/樣本(II區)與金屬/基板(III區)介面會各別產生Bloch波表面電漿極化子(Bloch wave surface plasmon polaritons，BW-SPP)。LSPR和BW-SPP分別會在穿透光譜中產生一寬波段的共振和一窄波段的共振，它們會耦合形成菲諾共振(Fano resonance)。

LSPR(即腔體共振)的共振條件可由Fabry-Perot腔體公式表示如下：

其中n_eff是侷域性電漿子在前述腔體中的等效折射率，k₀是真空中的波向量，h是狹縫深度(即T1)，Φ1及Φ2是上下介面的相位移。

至於BW-SPP，當入射光正向入射時，一維週期性狹縫金屬表層的表面電漿子共振條件(λ₀=λ_SPR)可以由下式表示：

其中i是共振階數，P是奈米結構的週期寬度，ε_m是金屬的介電常數，n是與金屬面接觸的環境折射率。

LSPR與BW-SPP會互相干涉耦合，形成包含一共振波峰及一共振波谷的菲諾共振圖譜，其共振位置接近公式(2)所預測的共振位置(即λ_SPR，共振波長)。

第七圖(a)是在空氣環境下，使用白光之TM極化波正向入射本發明之非標定型檢測晶片後，使用光纖耦合線性CCD陣列光譜儀(BWTEK，型號BTC112E)所測得之穿透光譜圖，其中入射光之電場方向垂直於狹縫方向定義為TM極化波。只有當入射光波具有特定極化方向(TM polarized)時，才能激發奈米金屬狹縫內的腔體共振與狹縫間的表面電漿子共振。當TM極化波正向入射此晶片時，可觀察到數個非對稱的菲諾共振光譜。第七圖(a)上方插圖係使用波長532nm之綠光雷射正向照射本發明具有四組不同週期長度(510、515、520及525nm)的晶片所得的穿透光譜影像。前述插圖的光譜影像可以驗證圖三中所提的概念，亦即利用數個不同週期金屬結構陣列組成的晶片可以呈現光譜影像。如第七圖(a)所示，週期為510、515、520及525nm之週期性凸槽結構的菲諾共振波峰波長分別為516、519、525及528nm，而其波谷波長分別為533、535、539及543nm。在不同週期的結構所量測到的菲諾共振位置明顯與週期成正比，且與公式(2)的理論計算值相當一致，如第七圖(b)所示。

實施例三，本發明之非標定型檢測系統在二氧化矽厚度檢測的應用

如第八圖(a)所示，利用熱蒸鍍機依序蒸鍍不同厚度之二氧化矽薄膜於本發明之非標定型檢測晶片上，二氧化矽薄膜之厚度分別為0、5、10、15nm，之後使用CCD分別記錄每個厚度的穿透光譜影像，如第八圖(b)所示。第八圖(c)是相對於第八圖(b)的穿透光譜圖，其中X軸代表週期性金屬凸槽結構的週期長度，Y軸則為穿透光強度。由第八圖(b)、(c)可知，穿透光譜會隨著二氧化矽薄膜厚度的增加而產生紅移。進一步利用光譜積分法的概念，利用下式(3)^[6]對第八圖(c)的穿透光譜進行光譜分析：

其中I(h,n)為厚度h、第n個週期性金屬結構陣列的穿透光強度，h₀為厚度參考值，N為金屬結構陣列總數。在本實施例中，係以二氧化矽薄膜厚度為0nm的光譜作為參考光譜，陣列週期為510、515、520、525nm，總數為4。利用式(3)分析後，可得出一積分訊號與膜厚對應關係曲線，如第八圖(d)所示。積分訊號與二氧化矽薄膜厚度存在著指數增加的對應關係。因此，後續可以透過影像回推蒸鍍於本發明之非標定型檢測晶片上的二氧化矽薄膜厚度，達成定性及定量的分析。

實施例四，本發明之非標定型檢測系統在生物分子檢測方面的應用

如第九圖(a)所示，在本發明之非標定型檢測晶片上製備分子層，並使之與待測化學物質結合。首先將超純水滴在本發明之非標定型檢測晶片的金屬層上，使用氮氣槍吹乾後，使用CCD擷取晶片穿透光譜 影像(標示為「空氣」)，接著在金屬層上加入500μg/Ml之牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(購自Sigma-Aldrich)，靜置一小時，使BSA分子吸附於金屬表面，再利用超純水洗去未吸附於金屬表面的BSA分子。再次將晶片吹乾，並擷取晶片穿透光譜影像(標示為「BSA」)。最後再加入375μg/mL的抗BSA抗體(購自Sigma-Aldrich)，靜置兩小時，使BSA分子與抗BSA抗體分子反應，再利用超純水洗去未吸附於BSA的抗BSA抗體分子。再次將晶片吹乾，並擷取晶片穿透光譜影像(標示為「抗BSA抗體」)。第九圖(b)顯示了四種具有不同週期寬度(510、515、520、525nm)的週期性金屬光柵在不同表面條件下的穿透影像。很明顯地，當單層的BSA生物分子吸附於金屬表面，不同週期的週期性凸槽結構分別產生穿透光強度增加與減少的現象，且光譜影像產生紅移。而當抗BSA抗體分子與BSA分子結合時，光譜更加紅移。第九圖(c)則顯示了第九圖(b)中影像虛線區域的穿透光強度分佈圖。很明顯地，隨著生物分子的吸附，晶片光譜產生紅移。

實施例五，使用智慧型手機記錄本發明之非標定型偵測系統所得之晶片光譜影像

第十圖(a)是使用智慧型手機記錄晶片光譜影像之非標定型偵測系統示意圖。在本實施例中所使用的窄頻光源係由一白光LED搭配一632nm雷射線窄頻濾光片構成。在使用雷射光作為窄頻光源時，會產生光斑，光斑可使雷射光通過固定轉速的轉動毛玻璃加以去除，而使用白光LED燈及一窄頻濾光片構成的窄頻光源也可產生無光斑的均勻穿透影像。而在本實施例中使用的非標定型檢測晶片上共有十一個金 屬結構陣列結構，其週期為615nm奈米至665nm，週期間距為5nm，如第十圖(b)所示。

首先使窄頻光源正向入射於本發明之非標定型檢測晶片，再使用具有塑膠透鏡的智慧型手機記錄晶片上的穿透光譜影像，其擷取的光譜影像如第十圖(c)所示。第十圖(c)的影像有藍色背景光，可使用紅光LED燈搭配一632nm雷射線窄頻濾光片作為本發明的窄頻光源，如此可消除拍攝影像中的藍色背景光。

實施例六，使用掃描器記錄本發明之非標定型偵測系統所得之晶片光譜影像。

除了上述的非標定型檢測系統，亦可使用市面販售、價格便宜的穿透式掃描器做成一掃描式非標定型檢測系統，該系統係使用白光LED搭配632nm窄頻濾光片作為窄頻光源，如所用的掃描器本身即使用窄頻光源作為燈源，可直接使用掃描器的窄頻光源。

第十一圖(a)為本實施例中使用的掃描式非標定型偵測系統示意圖。在本實施例中，非標定型檢測晶片上共有十個陣列結構，其週期為440nm至485nm，週期間距為5奈米，如第十一圖(b)所示，此週期範圍的選擇可使晶片應用於溶液環境檢測。首先放置一632nm雷射線窄頻濾光片於前述晶片上方，使掃描器中的白光LED光源通過雷射線濾光片而產生一窄頻光源，使光源入射到晶片上，之後在晶片滴上超純水，以蓋玻片覆蓋後，由掃描器中的CCD收光，以掃描的方式記錄晶片全部區域的穿透光譜影像，再由電腦記錄影像，並分析數據，如第十一圖(c)所示。

本發明之非標定型檢測晶片可根據需求改變陣列週期，而應用在空氣環境(如實施例三至六)或溶液環境(如本實施例)進行檢測。在本實施例中，因為陣列週期440nm至485nm係針對在溶液環境檢測的設計，因此在晶片滴上超純水，以蓋玻片覆蓋後進行檢測。如改變晶片週期結構(如改用實施例五的晶片)，此掃描式非標定型偵測系統也可應用在空氣環境的檢測。晶片的陣列週期亦可根據液體的折射率進行調整，而應用在其他液體，不限於純水。這種掃描式檢測系統將具有操作簡單、快速分析、價格便宜及可被普遍使用的優勢。

本發明提供了一種簡易、快速、低成本、非標定檢測技術。這個技術無需昂貴的量測設備，可以直接用肉眼觀測晶片上光譜影像的變化，在空氣環境或溶液環境對待測樣品進行定性與半定量的分析。此外，也可以利用智慧型手機的照相功能、穿透式掃描器與影像分析軟體對樣品進行精確的定量分析。如果在晶片上修飾多種不同的辨識分子，這個晶片可用來檢測多種樣品，成為一多功能檢測晶片。因此，本發明之非標定型檢測技術可應用於生物分子專一性結合檢驗、濃度分析、親合性分析、動態分析及高通量檢測且適用於定點照護檢測與診斷。

參考文獻

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[6] Kuang-Li Lee, Pei-Kuen Wei, “Enhancing Surface Plasmon Detection Using Ultrasmall Nanoslits and Multispectral Integration Method,” Small 6, 1900-1907, 2010.

Claims (21)

1. 一種用於檢測化學物質之非標定型檢測系統，其包括：一非標定型檢測晶片，其包含複數組具有不同週期長度的多層週期性金屬結構；以及一窄頻光源。
2. 如申請專利範圍第1項所述之非標定型檢測系統，其中前述週期性金屬結構係選自週期性金屬孔狀結構、或週期性金屬狹縫結構。
3. 如申請專利範圍第2項所述之非標定型檢測系統，其中前述週期性金屬孔狀結構係為圓形或多邊形的孔狀結構。
4. 如申請專利範圍第2項所述之非標定型檢測系統，其中前述週期性金屬狹縫結構包括：(a)一透明基板，其包含複數組第一週期性凸槽結構，且各組第一週期性凸槽結構具有不同的週期長度；以及(b)一金屬層，其係包覆前述透明基板，且包括對應前述複數組第一週期性凸槽結構之複數組第二週期性凸槽結構及複數組第三週期性凸槽結構，其中該第二週期性凸槽結構之各凸槽係與其所對應之第一週期性凸槽結構之各凸槽之間所形成的凹部結構互相嵌合，而該第三週期性凸槽結構係位於其所對應之第一週期性凸槽結構之上。
5. 如申請專利範圍第4項所述之非標定型檢測系統，其中前述非標定型檢測晶片進一步包含一分子層，該分子層係包覆在前述金屬層上，且包含一或多種可與前述化學物質結合的分子。
6. 如申請專利範圍第5項所述之非標定型檢測系統，其中前述化學物質包含元素、生物分子、聚合物或藥物。
7. 如申請專利範圍第6項所述之非標定型檢測系統，其中前述生物分子包含蛋白、DNA或RNA。
8. 如申請專利範圍第4項所述之非標定型檢測系統，其中前述第二週期凸槽結構的高度為數十至數百奈米。
9. 如申請專利範圍第4項所述之非標定型檢測系統，其中前述第二週期凸槽結構的週期長度為數百奈米至數微米。
10. 如申請專利範圍第4項所述之非標定型檢測系統，其中前述透明基板係由玻璃或塑膠材料所製成。
11. 如申請專利範圍第4項所述之非標定型檢測系統，其中前述金屬層係由選自金、銀、鋁或銅之材料所製成。
12. 如申請專利範圍第1項所述之非標定型檢測系統，其中前述光源係為窄頻光源。
13. 如申請專利範圍第12項所述之非標定型檢測系統，其中前述非標定型檢測晶片之週期性金屬結構所產生的共振波長範圍係涵蓋前述窄頻光源的波長。
14. 如申請專利範圍第1項所述之非標定型檢測系統，其進一步包含一影像感測器。
15. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之非標定型檢測系統進行非標定型檢測的方法，其包括下列步驟：(a)提供一樣本；(b)將該樣本置於前述非標定型檢測晶片上，使之覆蓋晶片表面；(c)使光源從前述非標定型檢測晶片之透明基板方向正向入射，通過前 述複數組具有不同週期長度的週期性凸槽結構後分別產生穿透光影像，並組合形成一光譜影像；以及(d)觀測前述光譜影像，以判定該樣本中是否含有前述化學物質。
16. 如申請專利範圍第15項所述之非標定型檢測的方法，其係使用如申請專利範圍第3項所述之非標定型檢測系統，且前述樣本係覆蓋該金屬層。
17. 如申請專利範圍第16項所述之非標定型檢測的方法，其中前述非標定型檢測晶片進一步包含一分子層，該分子層係包覆在該金屬層上，且包含一或多種可與前述化學物質結合的分子。
18. 如申請專利範圍第17項所述之非標定型檢測的方法，其中前述化學物質包含元素、生物分子、聚合物或藥物。
19. 如申請專利範圍第15項所述之非標定型檢測的方法，其中前述步驟(b)和(c)之間係進一步包含一清洗步驟。
20. 如申請專利範圍第15項所述之非標定型檢測的方法，其中前述光源係為窄頻光源。
21. 如申請專利範圍第15項所述之非標定型檢測的方法，其中前述非標定型檢測系統進一步包含一影像感測器。