WO2011002010A1 - 高感度蛍光検出デバイス - Google Patents

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WO2011002010A1
WO2011002010A1 PCT/JP2010/061124 JP2010061124W WO2011002010A1 WO 2011002010 A1 WO2011002010 A1 WO 2011002010A1 JP 2010061124 W JP2010061124 W JP 2010061124W WO 2011002010 A1 WO2011002010 A1 WO 2011002010A1
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nano
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transparent
opening
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PCT/JP2010/061124
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友幸 坂井
剛志 曽根原
孝信 芳賀
Original Assignee
株式会社日立製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence

Definitions

  • the present invention belongs to a technical field related to high-sensitivity fluorescence detection used for measurement and analysis of biological substances such as DNA, RNA, or protein.
  • Non-Patent Document 1 As a means for measuring biological substances such as DNA and proteins, a method of detecting fluorescence generated by labeling the substance with a fluorescent substance and irradiating the fluorescent substance with excitation light such as a laser is common.
  • a conventional irradiation detection method for highly sensitive fluorescence detection for example, there is a total reflection evanescent irradiation detection method described in Non-Patent Document 1.
  • high-sensitivity imaging at a single molecule level of fluorescently labeled biological material is performed. Phosphor Cy3-labeled heavy meromyosin is fixed on quartz glass, and an aqueous solution is dropped.
  • the excitation light intensity decays exponentially as it moves away from the refractive index boundary plane, so that the excitation light irradiation volume and the fluorescence detection volume can be greatly reduced compared to the epifluorescence detection method. It is possible to drastically reduce background light such as fluorescence emission of free phosphors other than the phosphors labeled with biomolecules to be performed and Raman scattering of water.
  • Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 the sensitivity of fluorescence detection is further improved by the nano-aperture irradiation detection method that enables the excitation light irradiation volume to be further reduced as compared with the total reflection evanescent irradiation detection method.
  • An Al thin film is formed on a flat plate having a thickness of about 100 nm having a minute opening (nano opening) having a diameter of 50 nm on the surface of the glass substrate.
  • the intensity of the excitation light decays exponentially as it moves away from the nano-aperture bottom plane.
  • the excitation light irradiation width in the direction parallel to the glass substrate is limited to the opening diameter, that is, 50 nm, so that the excitation light irradiation volume is further reduced. For this reason, it becomes possible to drastically reduce background light such as fluorescence emission of free phosphor and Raman scattering of water.
  • Non-Patent Document 2 a nano-aperture irradiation detection method is used to immobilize a polymerase on the bottom surface of a micro-aperture and apply it to the measurement of incorporation of a phosphor-labeled dCTP into the polymerase.
  • Patent Document 2 a nanomaterial is filled with a transparent material and a target phosphor is fixed thereon, or a glass substrate on the bottom surface of the nanoopening is dug down about several hundred nanometers, and the target phosphor is fixed to the bottom surface. , The detection efficiency of light emission of the target phosphor is improved.
  • Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 For reducing background light, it is effective to reduce the excitation light irradiation volume.
  • the nano-aperture irradiation detection methods of Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 not only the excitation light irradiation area reduction in the fluorescence detection optical axis direction by the evanescent field but also the excitation light irradiation area perpendicular to the fluorescence detection optical axis is diffraction limited. Since it can be controlled below the level, the influence of background light can be greatly reduced.
  • the nano-aperture irradiation detection method there is a possibility of background light rising for the following reasons.
  • a nano-aperture device having an aluminum thin film having an opening with a diameter of about 50 nm on the upper surface of a glass substrate is used.
  • the laser beam as excitation light is reflected by a dichroic mirror, condensed using an objective lens, and irradiated in a direction perpendicular to the glass substrate surface from the bottom surface of the nano aperture device, an evanescent field is generated inside the nano aperture.
  • fluorescence is excited by the evanescent field to emit light.
  • the emitted fluorescence is condensed from the lower surface of the nano-aperture device using the objective lens, transmitted through the dichroic mirror, and detected by a detector.
  • the scattered light of the glass substrate and the reflected light of the excitation light on the glass substrate and the aluminum thin film surface are simultaneously condensed.
  • the scattered light and the reflected light of the excitation light are transmitted through a little bit and detected.
  • the scattered light and the reflected light of the excitation light that are detected become background light, leading to a decrease in detection sensitivity.
  • Detecting from the upper surface of the nano-aperture device can prevent the background light from rising due to the scattered light generated by the glass substrate and the reflected light of the excitation light.
  • the excitation light is slightly transmitted through the aluminum thin film, it is detected and the background light rises.
  • the transmitted light is increased the thickness of the aluminum thin film, the depth of the nano-opening is increased, and the detection sensitivity of the fluorescence emitted from the bottom surface is lowered.
  • nano-aperture oblique irradiation detection method it is conceivable to irradiate with an incident angle of excitation light and detect from the upper surface of the nano-aperture device (nano-aperture oblique irradiation detection method). For example, if it is incident at a critical angle or more, the leakage light of the excitation light from the aluminum thin film to the detection side is practically zero.
  • the signal intensity can be increased by increasing the intensity of the excitation light.
  • the cost of a light source increases with its output intensity. Therefore, an efficient irradiation method is desired.
  • irradiation can be performed efficiently, it is possible to irradiate a wide area while maintaining the irradiation intensity necessary for detection sensitivity. This can improve the throughput because a plurality of targets fixed on the substrate surface can be irradiated at the same time.
  • the present invention provides a method for increasing the signal intensity by efficiently irradiating excitation light in the nano-aperture oblique irradiation detection method which is a low background light irradiation detection method.
  • a nano-aperture device having a light-shielding film with a small aperture on a transparent substrate is irradiated with excitation light from the transparent substrate side at an incident angle and fluorescence is detected from the light-shielding film side.
  • the target molecule can be irradiated with excitation light more efficiently by providing a metal thin film for generating plasmon resonance on the bottom surface of the nano-aperture and a fine structure smaller than the excitation light wavelength.
  • biological samples include those that can detect fluorescence, such as DNA, RNA, and protein.
  • the fluorescence detection device of the present invention is provided between a transparent substrate transparent to incident light, a non-light guide film provided with an opening for placing a biological sample, and the transparent substrate and the non-light guide film, And a spacer layer having a refractive index lower than that of the substrate and transparent to light incident through the substrate.
  • the light incident on the substrate is preferably incident with an inclination with respect to the substrate, for example, by making the incident angle to the substrate more than a right angle.
  • the analysis system of the present invention includes a light source, a device for installing a biological sample, a detector for detecting fluorescence emitted by irradiating the biological sample with light from the light source, and analyzing the fluorescence detected from the detector.
  • the device includes a transparent substrate transparent to light incident from the light source, a non-light-guiding film provided with an opening for placing a biological sample, a transparent substrate, and a non-light-guiding film. And a spacer layer having a refractive index lower than that of the substrate and transparent to light incident through the substrate.
  • the present invention enables high-efficiency irradiation into the nano-aperture, and enables fluorescence-labeled biological substances to be measured at a single molecule level with high sensitivity.
  • Example 1 Enlarged view of nano-aperture device in Example 1
  • Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 1 Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 1
  • Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 1 Simulation model in Example 1 Graph of the relationship between irradiation intensity and propagation distance at the center of the nano aperture
  • Graph of the relationship between irradiation intensity and propagation distance at the center of the nano aperture A graph of the relationship between the irradiation intensity at the bottom of the aperture at each thickness of a low refractive index transparent thin film Reaction process diagram of DNA sequencing Reaction process diagram of DNA sequencing Reaction process diagram of DNA sequencing Reaction process diagram of DNA sequencing Reaction process diagram of DNA sequencing Configuration diagram of nano-aperture device in Example 2
  • Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 2 Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 2
  • Example of fabrication method of nano-aperture device in Example 2 Example of fabrication method of nano-aperture device in
  • FIG. 1 shows an overview of the analysis system.
  • DNA sequencing using the system is performed.
  • This system consists of four components: an irradiation unit, a detection unit, a nano-aperture device, and a chamber unit.
  • Laser light oscillated from the excitation light source 101 and the excitation light source 102 is circularly polarized by the ⁇ / 4 plates 103 and 104, respectively, and the optical axes of the two laser beams are made the same by the mirror 105 and the dichroic mirror 106 (reflecting a wavelength of 550 nm or more).
  • the incident angles of the two laser beams having the same optical axis are adjusted by a mirror 107, stopped by a lens 108, incident on a prism 109, and further incident on a nano aperture device 110.
  • the space between the prism 109 and the nano aperture device 110 is filled with matching oil so that total reflection does not occur at the two interfaces.
  • an Ar-ion laser with a wavelength of 488 nm is used as the excitation light source 101
  • a He-Ne laser with a wavelength of 633 nm is used as the excitation light source 102.
  • a YAG laser or a semiconductor laser may be used.
  • the chamber section includes a cover plate 115, a detection window 116, an inlet 112 that is a solution exchange port, and an outlet 113.
  • Acrylic resin was used as the material for the cover plate 115.
  • the detection window 116 is preferably made of an optically transparent material. Here, a quartz glass cover glass is used, and the thickness thereof is 0.17 mm.
  • a gap was provided between the nano-opening device 110 and the cover plate 115, and a flow path 114 (height: 25 ⁇ m) through which the sample solution and the like flow was produced.
  • the light emitted from the surface of the nano-aperture device 110 is collected by the objective lens 117 ( ⁇ 40, NA 0.95) and collimated, and then the notch filter 118 (cuts only the wavelength of 488 nm) and 119 (only the wavelength of 633 nm).
  • the component (elastically scattered light) having the same wavelength as the excitation light in the emitted light is removed by cutting. Thereafter, the light is dispersed in different directions for each wavelength by the dispersive element 120 and imaged on the photocathode of the image sensor 122 by the imaging lens 121.
  • An image obtained by the image sensor 122 is recorded in a control unit 123 having a function as a computer having calculation, storage, and control functions.
  • a prism is used as a dispersive element, but a diffraction grating may of course be used.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the nano-aperture device 110 in this example.
  • the nano-aperture device is formed on an optically transparent substrate 201, a low refractive index transparent thin film 202 formed on the transparent substrate 201, a light shielding thin film 203 formed on the low refractive index transparent thin film 202, and a light shielding thin film.
  • the nano-aperture 204 is formed.
  • the low refractive index transparent thin film 202 only needs to have a refractive index lower than that of the transparent substrate 201 and may be transparent to incident light.
  • FIG. 3A to 3C show a method for manufacturing the nano-aperture device 110.
  • a coating prevention film 206 is attached to one side of a quartz substrate, which is a transparent substrate 201, and CYTOP (R) is coated by dipping up to a thickness of 200 nm, and the low refractive index transparent thin film 202 is applied to the transparent substrate 201.
  • the coating preventing film 206 is removed.
  • aluminum is deposited on the surface of the low refractive index transparent thin film 202 to a thickness of 100 nm by sputtering to form the light-shielding thin film 203 (FIG. 3B).
  • the light-shielding thin film 203 may be a metal film, but may be a light-shielding thin film using, for example, silver, gold, chromium, silicon carbide, or the like as a material other than aluminum.
  • a plurality of nano-openings 204 having a diameter of 200 nm are formed in a lattice pattern at intervals of 1 ⁇ m by Electron beam lithography (EB lithography) (FIG. 3C).
  • the aperture size may be equal to or smaller than the wavelength of light incident on the nano aperture device 110.
  • a monomolecular biotin 205 is fixed to the bottom surface of the nano opening 204.
  • the biotin-avidin bond is used in this embodiment as a method for immobilizing the unimolecular DNA polymerase to the nano-opening bottom surface 204, but a method of immobilizing directly using non-specific adsorption may be used.
  • FIG. 4 shows a model used for the simulation.
  • a low refractive index transparent thin film (refractive index 1.34) 302 and an aluminum film 303 (thickness 100 nm) are laminated in this order on a glass substrate 301 (refractive index 1.46), and the aluminum film has a diameter of 200 nm.
  • An opening 304 was provided.
  • the wavelengths of the excitation light were 488 nm and 633 nm, and the incident angle 311 was 70 degrees.
  • the model width 308 was 2 ⁇ m
  • the glass width 309 was 1 ⁇ m
  • the model length 307 was 1.06709 ⁇ m at an irradiation light wavelength of 488 nm
  • 1.38416 ⁇ m at an irradiation light wavelength of 633 nm
  • the mesh size was 0.003 ⁇ m.
  • the simulation was performed by changing the thickness of the low refractive index transparent thin film 302 to 0 to 500 nm.
  • FIG. 5A and FIG. 5B show the relationship between the irradiation intensity at the central portion 310 of the opening and the propagation distance at various thicknesses of the low refractive index transparent thin film 302 obtained by simulation.
  • FIG. 5A shows a simulation result with an excitation light wavelength of 488 nm
  • FIG. 5B shows a simulation result with an excitation light wavelength of 633 nm.
  • the horizontal axis represents the propagation distance
  • the vertical axis represents the irradiation intensity.
  • the origin 0 of the propagation distance is the interface between the low refractive index transparent thin film and the solvent 305 in the nano opening.
  • FIG. 6 shows the relationship between the irradiation intensity at the bottom of the opening 304 at each thickness (Space) of the low refractive index transparent thin film 302.
  • the irradiation intensity at the bottom of the opening was the average value of the irradiation intensity over the entire bottom of the opening, and was normalized by the value when the thickness of the low refractive index transparent thin film 302 was zero.
  • the irradiation intensity at the bottom of the aperture at any excitation light wavelength increases from the thickness 0 of the low refractive index transparent thin film 302 to near 250 nm, and decreases when it reaches 250 nm or more. From FIG. 6, if the thickness of the low-refractive-index transparent thin film 302 is about 100 to 400 nm, the strength can be improved by 1.5 or more as compared to the case without the thin film. Further, if the thickness of the low refractive index transparent thin film 302 is about 200 to 300 nm, the strength can be improved by about twice as compared with the case where there is no thin film. In this embodiment, since the thickness of the low refractive index transparent thin film 302 is 200 nm, the irradiation intensity is improved about twice as compared with the case where there is no low refractive index transparent thin film.
  • the incident angle 311 of the excitation light on the glass substrate 301 is larger than 0 degree, the effect of improving the irradiation efficiency due to the presence of the low refractive index transparent thin film 302 can be obtained, but the leakage light of the excitation light to the channel side of the light shielding film Is small, that is, the incident angle 311 is preferably equal to or greater than the critical angle at the interface between the glass substrate 301 and the low refractive index transparent thin film 302 in order to obtain low background light.
  • a buffer added with streptavidin 602 is introduced into the flow path 114 through the inlet 112, and the streptavidin 602 is bound to biotin 601 fixed to the bottom surface 603 of the nano opening, and the biotin-avidin complex is attached to the bottom surface 603 of the nano opening.
  • Form FIG. 7A
  • Biotin-modified DNA polymerase 604 is introduced into channel 114 from inlet 112, and single molecule DNA polymerase 604 is fixed to nano-opening bottom surface 603 through a biotin-avidin bond (FIG.
  • dNTPs dATP- (Alexa488) 608, dCTP- (Cy3) 609, dGTP- (Cy5) 607, dTTP- (Cy5.5) 610) fluorescently labeled at the phosphate end are flown from the inlet 112 to the channel 114.
  • the evanescent field 611 was formed inside the nano-aperture by irradiating with excitation light at the same time as it was introduced into the structure and performing an extension reaction (FIG. 7D).
  • a dNTP complementary to the base on the sequence of the single-stranded template DNA 605 at the complementary position next to the base at the 3 ′ end of the primer 606 is incorporated into the template DNA-primer complex by extension reaction.
  • the fluorescent substance labeled with the incorporated dNTP emits light because it enters the evanescent field 611 (FIG. 7E).
  • the type of dNTP incorporated into the template DNA-primer complex in the nano-aperture is determined by specifying the presence or absence of light emission and the wavelength of the emitted fluorescence.
  • the incorporated dNTP-labeled phosphor is labeled at the phosphate end, so that it is cleaved from dNTP and the extension reaction continues (FIG. 7F).
  • the excitation light intensity decreases exponentially as the distance from the bottom surface of the nano aperture increases, so that no excitation light exists above the nano aperture.
  • excitation light is not propagated outside the nano-aperture in a direction perpendicular to the fluorescence detection optical axis, phosphors and dust that are non-specifically adsorbed on the light-shielding thin film 203 are not excited. Therefore, it is possible to suppress an increase in background light.
  • the irradiation efficiency is improved by providing the low refractive index transparent thin film 202 between the transparent substrate 201 and the light shielding thin film 203, the template DNA-primer complex fixed to the bottom surface of the nano-opening is formed even with a low output excitation light source.
  • a fluorescent substance labeled with the incorporated dNTP can be detected with high sensitivity.
  • DNA sequencing is performed using a method that further improves the irradiation efficiency.
  • a method for improving the irradiation efficiency the present invention and plasmon resonance are used. Except for the shape of the nano-aperture device, it is the same as Example 1.
  • FIG. 8 shows the structure of the nano-aperture device in this example.
  • FIGS. 9A to 9D show a manufacturing method of the nano-aperture device of this example.
  • a nano-opening device was fabricated by the same method as in Example 1, a resist 207 was applied to the upper surface of the light-shielding thin film 203 of the nano-opening device (FIG. 9A), and an opening having a diameter of 50 nm was formed at the center of the nano-opening 204 by EB lithography.
  • 208 is provided on the resist (FIG. 9B).
  • Silver 209 is deposited to a thickness of 50 nm by sputtering (FIG. 9C), and the resist is peeled off.
  • a columnar structure 701 having a diameter of 50 nm and a height of 50 nm is formed at the center of the bottom of the nano-opening 204 by the above method (FIG. 9D).
  • biotin 702 is fixed to the upper surface edge of the structure 701.
  • the material of the structure 701 may be a metal such as aluminum, gold, platinum, or tungsten, and the shape may be a fine protrusion such as a cone or a cube, or fine particles may be used. Further, the size of the structure body 701 may be smaller than the diameter of the nano opening.
  • FIG. 10 shows a model used for the simulation.
  • Example 1 is the same as FIG. 4 except that a structure 801 is provided at the center of the opening.
  • the material of the structure 801 provided in the center of the opening was silver, the structure width 802 was 0.05 ⁇ m, and the structure length 803 was 0.05 ⁇ m.
  • FIG. 11 shows the relationship between irradiation intensity and propagation distance (with structures) obtained by simulation.
  • the result obtained in Example 1 in FIG. 4 (without structure) is also shown.
  • Example 1 4 of Example 1 is shown, and in the case of the structure, the irradiation intensity of the left end portion 804 of the structure in FIG.
  • the excitation light wavelength was 488 nm
  • the thickness of the low refractive index transparent thin film 302 was 200 nm.
  • the origin 0 of the propagation distance is the boundary surface between the low refractive index transparent thin film and the solvent 305 in the nano opening. It can be seen that with the structure, the irradiation intensity of the upper surface edge of the structure 801 is about 30 times higher than that without the structure due to plasmon resonance.
  • DNA sequencing is performed with high sensitivity using the present invention and a method for improving the light emission detection efficiency of the target phosphor. Except for the shape of the nano-aperture device, it is the same as Example 1.
  • FIG. 12 shows the structure of the nano-aperture device in this example.
  • FIGS. 13A to 13C show a method for manufacturing the nano-aperture device of this example.
  • an application preventing film 206 is applied to the side surface of the transparent substrate 201 of the nano-opening device 110, and CYTOP (R) 210 is coated by dipping (FIG. 13A). .
  • the coating preventing film is removed after the coating.
  • CYTOP (R) coating surplus CYTOP (R) is polished until the height becomes equal to that of the light-shielding thin film 203, and the solution layer side surface of CYTOP (R) and the solution layer side surface of the light shielding thin film 203 are The surface is flattened so as to be substantially coplanar, and the transparent filling phase 1001 is formed (FIG. 13B).
  • one molecule of biotin 1002 is immobilized on the surface of the transparent filling layer 1001 (FIG. 13C).
  • the transparent filling layer 1001 may be made of an optically transparent material.
  • the same CYTOP (R) as that of the low refractive index transparent thin film is used.
  • FIG. 14 shows a model used for the simulation. Except that the transparent filling layer 1101 is provided in the opening 304, it is the same as FIG.
  • the material of the transparent filling layer 1101 provided in the opening 304 was the same as that of the low refractive index transparent thin film 302 (refractive index 1.34).
  • FIG. 15 shows the relationship between the irradiation intensity and propagation distance (with a filler and with a thin film) obtained by simulation.
  • the results obtained in Example 1 in FIG. 4 are “no filler, with thin film” and “no filler, no thin film”.
  • the thickness of the low refractive index thin film 302 was set to 200 nm, and in the case of “without thin film”, the thickness of the low refractive index thin film 302 was set to 0 nm.
  • the irradiation intensity was determined at the central portion of the aperture (the central portion of the aperture 310 in FIG. 4 and the central portion of the aperture 1102 in FIG. 14), and the excitation light wavelength was 488 nm.
  • the origin 0 of the propagation distance is the boundary surface between the low refractive index transparent thin film and the solvent 305 in the nano opening.
  • a fine metal structure having a wavelength equal to or less than the excitation light wavelength causing plasmon resonance as shown in Example 2 is fixed to the surface of the transparent filling layer 1001 shown in FIG. 12, and fluorescence is emitted on the surface of the fine metal structure. This makes it possible to detect with higher sensitivity.
  • DNA is used as a biological sample, but it can also be used for analysis of RNA, protein, and the like.

Abstract

　蛍光計測におけるＳ／Ｂ比向上に必要なナノ開口斜め照射検出方式において，効率良く励起光を照射することによるシグナル強度の増加方法を提供する。　ナノ開口斜め照射検出方式において，ナノ開口デバイスの遮光膜と透明基板間に透明基板よりも低屈折率な透明薄膜を設ける。

Description

高感度蛍光検出デバイス 参照による取り込み
　本出願は、２００９年７月３日に出願された日本特許出願第２００９－１５８３５６号の優先権を主張し、その内容を参照することにより本出願に取り込む。
　本発明は，ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はタンパク質等の生体物質の計測，分析に使用される高感度蛍光検出に関する技術分野に属する。
　ＤＮＡやタンパク質等の生体物質を計測する手段として，前記物質に蛍光体を標識して，前記蛍光体にレーザ等の励起光を照射して発生する蛍光を検出する方法が一般的である。従来の高感度蛍光検出のための照射検出方式として，例えば非特許文献１に記載の全反射エバネッセント照射検出方式がある。前記文献では，蛍光標識生体物質の単分子レベルの高感度イメージングを行っている。石英ガラスに蛍光体Ｃｙ３標識ヘビーメロミオシン固定し，水溶液を滴下する。石英ガラス（高屈折率）と水溶液（低屈折率）の境界面に対して，石英ガラスよりレーザ光を前記境界面の臨界角で照射すると，全反射が起こり，前記境界面の水溶液側にエバネッセント場が生じる。このエバネッセント場により励起された蛍光体Ｃｙ３の蛍光を，レーザ光照射側の反対側から，対物レンズを用いて２次元検出器であるＣＣＤ上に結像することによって検出される。エバネッセント場では，励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰するため，落射蛍光検出方式と比較して励起光照射体積および蛍光検出体積を大幅に低減することができ，対象とする生体分子に標識された蛍光体以外の遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。
　一方，非特許文献２および特許文献１では，全反射エバネッセント照射検出方式よりも励起光照射体積の一層の低減が可能となるナノ開口照射検出方式によって，蛍光検出の感度を更に向上させている。ガラス基板の表面に直径５０ｎｍの微小開口（ナノ開口）を有する膜厚約１００ｎｍの平板上のＡｌ薄膜を成膜する。ガラス基板のＡｌ薄膜が成膜されている面とは反対の面よりレーザ光を前記面に対して直角に照射すると，前記微小開口内部にエバネッセント場が生じる。エバネッセント場では，励起光強度がナノ開口底平面から離れるに従って指数関数的に減衰する。更に，ナノ開口エバネッセント照射検出方式では，全反射エバネッセント照射検出法と異なり，ガラス基板と平行方向の励起光照射幅が開口径すなわち５０ｎｍに限定されるため，励起光照射体積が一層低減される。このため，遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。その結果，より高濃度の遊離の蛍光体存在下で，対象とする生体分子に標識された蛍光体だけを選択的に検出することが可能となり，非常に高感度な蛍光検出を実現できる。非特許文献２では，ナノ開口照射検出方式を用いて，微小開口内底面部にポリメラーゼを固定し，蛍光体標識ｄＣＴＰのポリメラーゼへの取込み計測に応用している。
　特許文献２では，ナノ開口内部に透明材質を充填し，その上にターゲット蛍光体を固定する，もしくはナノ開口底面のガラス基板を数百ｎｍ程度掘下げ，その底面にターゲット蛍光体を固定することにより，ターゲット蛍光体の発光の検出効率を向上させている。
米国特許第６，９１７，７２６ 特開２００７－１９８８０１
Ｎａｔｕｒｅ　１９９５，Ｖｏｌ．３７４，ｐｐ．５５５－５５９． ＳＣＩＥＮＣＥ　２００３，Ｖｏｌ．２９９，ｐｐ．６８２－６８６．
　一般に蛍光標識された生体物質を単分子レベルで高感度に計測するためには，背景光の低減とシグナル強度の増加が必要となる。
　背景光低減に関しては，励起光照射体積を縮小することが有効である。非特許文献２および特許文献１のナノ開口照射検出方式では，エバネッセント場による蛍光検出光軸方向での励起光照射領域低減だけでなく，蛍光検出光軸と垂直方向の励起光照射領域を回折限界レベル以下に制御することができるため，背景光の影響を大幅に低減することが可能である。しかしながら，前記ナノ開口照射検出方式では，以下の理由による背景光上昇の可能性が生じる。ナノ開口照射検出方式では，ガラス基板上面に直径５０ｎｍ程度の開口を設けたアルミ薄膜を有したナノ開口デバイスを使用する。励起光であるレーザ光をダイクロイックミラーで反射させ，対物レンズを用いて集光し，ナノ開口デバイス下面より前記ガラス基板面と垂直方向に照射するとナノ開口内部にエバネッセント場が生じる。ナノ開口内部に蛍光標識のターゲット分子が存在すると，前記エバネッセント場により蛍光が励起されて発光する。この発光蛍光をナノ開口デバイスの下面より前記対物レンズを用いて集光し，前記ダイクロイックミラーを透過させ，検出器で検出する。この時，ガラス基板の散乱光や励起光のガラス基板やアルミ薄膜面での反射光も同時に集光される。ダイクロイックミラーの性能にもよるが，前記散乱光や励起光の反射光も僅かながら透過して検出される。前記検出されてしまう散乱光や励起光の反射光は背景光となり，検出感度の低下につながる。
　ナノ開口デバイス上面より検出すれば，前記ガラス基板で生じる散乱光や励起光の反射光による背景光の上昇を防ぐ事は可能である。しかしながら，アルミ薄膜を励起光が僅かながら透過してしまうため，それを検出してしまい背景光が上昇してしまう。アルミ薄膜を厚くする事により前記透過光を防ぐ事も可能ではあるが，ナノ開口の深さが深くなり，底面部で発光した蛍光の検出感度が低下してしまう。
　前記問題を解決するため，励起光の入射角を大きくして照射し，ナノ開口デバイス上面より検出する方法が考えられる（ナノ開口斜め照射検出方式）。例えば，臨界角以上で入射すれば，アルミ薄膜からの検出側への励起光の漏れ光は事実上０になる。
　高感度検出方法として前記背景光を低減する以外に，シグナル強度の増加がある。励起光の強度を強くする事により，シグナル強度を増加させることはできる。しかしながら，一般的に光源のコストはその出力強度とともに上昇する。そのため，効率良い照射方式が望まれる。また，効率良く照射できれば，検出感度に必要な照射強度を維持したまま広範囲を照射することが可能となる。これは，基板表面に固定された複数のターゲットを同時に照射することができるため，スループットの向上にもつながる。
　本発明では，低背景光照射検出方式であるナノ開口斜め照射検出方式において，効率良く励起光を照射することによるシグナル強度の増加方法を提供する。
　透明基板上に微小開口を設けた遮光膜を有したナノ開口デバイスの透明基板側から、入射角度を付けて励起光を照射し，遮光膜側から蛍光検出するナノ開口斜め照射検出方式において，ナノ開口デバイスの遮光膜と透明基板間に透明基板よりも低屈折率な透明薄膜を設けることにより，効率良く励起光をナノ開口内のターゲット分子に照射することができる。
　また，上記デバイスにおいて，ナノ開口底面にプラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜や励起光波長よりも小さな微細構造を設けることにより，より高効率にターゲット分子に励起光を照射することが可能となる。
　生体試料としては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，タンパク質等、蛍光検出可能なものが挙げられる。
　本発明の蛍光検出デバイスは、入射される光に対して透明な透明基板と、生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、透明基板と非導光膜との間に設けられ、基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えることを特徴とする。ここで、基板に入射する光は、基板に対して入射角を直角以上にする等、基板に対して傾きを設けて入射するのがよい。
　また、本発明の分析システムは、光源と、生体試料を設置するデバイスと、光源からの光が生体試料に照射されて発光した蛍光を検出する検出器と、検出器から検出された蛍光を分析する計算器とを有し、当該デバイスは、光源から入射される光に対して透明な透明基板と、生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、透明基板と非導光膜との間に設けられ、基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えることを特徴とする。
　本発明により，ナノ開口内への高効率照射が可能となり，蛍光標識された生体物質を単分子レベルで高感度に計測することが可能となる。
実施例１における分析用システムの概観図 実施例１におけるナノ開口デバイスの拡大図 実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例１におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例１におけるシミュレーションモデル ナノ開口中央部の照射強度と伝播距離の関係のグラフ ナノ開口中央部の照射強度と伝播距離の関係のグラフ 低屈折率透明薄膜の各厚さにおける開口底部の照射強度の関係のグラフ ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 ＤＮＡシーケンシングの反応プロセス図 実施例２におけるナノ開口デバイスの構成図 実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例２におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例２におけるシミュレーションモデル 構造物の有無における照射強度と伝播距離の関係のグラフ 実施例３におけるナノ開口デバイスの構成図 実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例３におけるナノ開口デバイスの作製方法の例 実施例３におけるシミュレーションモデル 充填層の有無における照射強度と伝播距離の関係のグラフ
　以下，図面に従って本発明の実施の形態を説明する。
　図１に，分析用システムの概観を示す。本実施例では，前記システムを用いたＤＮＡシーケンシングを行う。本システムは，照射部，検出部，ナノ開口デバイスおよびチャンバ部の４つの構成から成る。
　励起光源１０１および励起光源１０２から発振するレーザ光をλ／４板１０３，１０４によってそれぞれ円偏光にし，ミラー１０５およびダイクロイックミラー１０６（波長５５０ｎｍ以上を反射）によって２本のレーザ光の光軸を同一にする。前記光軸が同一となった２本のレーザ光をミラー１０７によって入射角度を調整し，レンズ１０８で絞り，プリズム１０９に入射し，さらにナノ開口デバイス１１０に入射する。プリズム１０９とナノ開口デバイス１１０の間はマッチングオイルで満たされており，前記２つの界面では全反射が起こらないようにしてある。本実施例では励起光源１０１として波長４８８ｎｍのＡｒ－ｉｏｎレーザを，励起光源１０２として波長６３３ｎｍのＨｅ－Ｎｅレーザを使用したが，もちろんＹＡＧレーザ，半導体レーザを用いても良い。
　チャンバ部は，カバープレート１１５と検出窓１１６と溶液交換用口である注入口１１２と排出口１１３から構成される。カバープレート１１５の材質として，アクリル樹脂を使用した。検出窓１１６は，光学的に透明な材質が望ましく，ここでは，石英ガラス性のカバーガラスを使用し，その厚さは０．１７ｍｍとした。スペーサ１１１を用いて，ナノ開口デバイス１１０とカバープレート１１５の間に隙間を設け，サンプル溶液等が流れる流路１１４（高さ：２５μｍ）を作製した。
　ナノ開口デバイス１１０表面での発光は，対物レンズ１１７（×４０，ＮＡ０．９５）で集光されて，平行化された後に，ノッチフィルタ１１８（波長４８８ｎｍのみをカット），１１９（波長６３３ｎｍのみをカット）によって発光のうち励起光と同一の波長を持つ成分（弾性散乱光）が除去される。その後に分散素子１２０で波長ごとに異なる方向へ分散させ，結像レンズ１２１でイメージセンサ１２２の光電面上に結像させる。イメージセンサ１２２で得られた画像は，演算，記憶および制御機能を備えたコンピュータとしての機能を有する制御部１２３に記録される。本実施例では分散素子としてプリズムを使用しているが，回折格子でももちろんかまわない。
　図２は本実施例におけるナノ開口デバイス１１０の拡大図である。ナノ開口デバイスは，光学的に透明な基板２０１，透明基板２０１上に成膜された低屈折率透明薄膜２０２，低屈折率透明薄膜２０２に成膜された遮光性薄膜２０３，遮光性薄膜に形成されたナノ開口２０４から構成される。低屈折率透明薄膜２０２は，屈折率が透明基板２０１よりも低いものであればよく，また，入射される光に対して透明であればよい。
　図３Ａ－図３Ｃにナノ開口デバイス１１０の作製方法を示す。まず，透明基板２０１である石英製基板の片面に塗布防止用フィルム２０６を貼り，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）を２００ｎｍの厚さになるよう浸漬引き上げにてコーティングし，低屈折率透明薄膜２０２を透明基板２０１の片面に形成させる（図３Ａ）。低屈折率透明薄膜成膜後に塗布防止用フィルム２０６を取り除く。次いで，低屈折率透明薄膜２０２の表面にスパッタにてアルミニウムを厚さ１００ｎｍになるように成膜し，遮光性薄膜２０３を形成させる（図３Ｂ）。遮光性薄膜２０３は、金属膜を用いることができるが、ここでのアルミニウム以外の材質として，例えば、銀，金，クロム，炭化シリコンなどを用いて遮光性薄膜としても良い。遮光性薄膜２０３上に，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｂｅａｍ　ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（ＥＢリソ）技術により直径２００ｎｍのナノ開口２０４を１μｍの間隔で格子状に複数形成する（図３Ｃ）。開口サイズはナノ開口デバイス１１０に入射される光の波長以下であれば良い。
　なお，ナノ開口２０４の底面に，単分子のビオチン２０５を固定しておく。後述するように，単分子ＤＮＡポリメラーゼをナノ開口底面２０４に固定する方法として，本実施例ではビオチン－アビジン結合を用いているが，非特異吸着を用いて直接固定する方法を用いても良い。
　励起光がナノ開口デバイス１１０に照射されるとナノ開口２０４内部にエバネッセント場が生じる。ナノ開口内部の電界強度（以下，照射強度とする）を時間領域差分法シミュレーションＯｐｔｉＦＤＴＤ（Ｏｐｔｉｗａｖｅ社）によりシミュレートした。図４にシミュレーションに用いたモデルを示す。２Ｄ　Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　Ｍｏｄｅにおいて，ガラス基板３０１（屈折率１．４６）上に，低屈折率透明薄膜（屈折率１．３４）３０２，アルミニウム膜３０３（厚１００ｎｍ）の順に積層し，アルミニウム膜に直径２００ｎｍの開口３０４を設けた。アルミニウム膜３０３上面と開口３０４内部には溶媒３０５（屈折率１．３３）が満たされていると想定した。励起光の波長を４８８ｎｍおよび６３３ｎｍとし，入射角度３１１を７０度とした。モデル幅３０８を２μｍ，ガラス幅３０９を１μｍ，モデル長さ３０７を照射光波長４８８ｎｍでは１．０６７０９μｍ，照射光波長６３３ｎｍでは１．３８４１６μｍとし，メッシュサイズを０．００３μｍとした。低屈折率透明薄膜３０２の厚みを０～５００ｎｍに変化させシミュレーションを行った。
　図５Ａ，図５Ｂにシミュレーションにより得られた様々な低屈折率透明薄膜３０２の厚さにおける開口中央部３１０の照射強度と伝播距離の関係を示す。図５Ａは励起光波長４８８ｎｍ，図５Ｂは励起光波長６３３ｎｍのシミュレーション結果である。いずれも，横軸が伝播距離を，縦軸が照射強度を示す。伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。照射光波長４８８ｎｍにおいて伝播距離５０ｎｍ程度まで照射強度が若干上昇傾向を示すが，それ以外は伝播距離にしたがって急速に照射光強度が減少する。図６に低屈折率透明薄膜３０２の各厚さ（Ｓｐａｃｅ）における開口３０４底部の照射強度の関係を示す。開口底部の照射強度は，開口底部全面の照射強度の平均値とし，低屈折率透明薄膜３０２の厚み０の時の値で規格化した。いずれの励起光波長における開口底部の照射強度は，低屈折率透明薄膜３０２の厚み０から２５０ｎｍ近傍までは増加し，２５０ｎｍ以上になると減少する。図６から，低屈折率透明薄膜３０２の厚さは１００～４００ｎｍ程度あれば，薄膜が無い場合に比べて１．５以上強度向上を図ることが出来る。また，低屈折率透明薄膜３０２の厚さが２００～３００ｎｍ程度あれば，薄膜が無い場合に比べて２倍前後の強度向上を図ることが出来る。本実施例において低屈折率透明薄膜３０２の厚みは２００ｎｍであるため，低屈折率透明薄膜が無い時に比べ，照射強度は約２倍程度向上する。
　励起光のガラス基板３０１における入射角度３１１は０度よりも大きい場合，上記低屈折率透明薄膜３０２の存在による照射効率向上という効果が得られるが，遮光膜の流路側への励起光の漏れ光を小さく，つまり低背景光にするために入射角度３１１はガラス基板３０１と低屈折率透明薄膜３０２の境界面における臨界角以上が好ましい。
　以下，図７Ａ－図７Ｆを用いてＤＮＡシーケンシングの工程を説明する。ストレプトアビジン６０２を加えたバッファを注入口１１２より流路１１４に導入し，ストレプトアビジン６０２をナノ開口の底面６０３に固定されているビオチン６０１に結合させ，ビオチン－アビジン複合体をナノ開口底面６０３に形成させる（図７Ａ）。固定反応後に，余剰のストレプトアビジンを洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。ビオチン修飾したＤＮＡポリメラーゼ６０４を注入口１１２より流路１１４に導入し，ビオチン－アビジン結合を介して，単分子のＤＮＡポリメラーゼ６０４をナノ開口底面６０３に固定する（図７Ｂ）。固定反応後に，余剰のＤＮＡポリメラーゼを洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。ターゲット一本鎖鋳型ＤＮＡ６０５にプライマ６０６をハイブリダイゼーションさせて鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体を形成させ，注入口１１２より流路１１４に導入し，前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体とＤＮＡポリメラーゼ複合体を形成させる（図７Ｃ）。固定反応後に，余剰な鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体を洗浄用バッファにて流路１１４より洗い流した。リン酸末端に蛍光標識した４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ－（Ａｌｅｘａ４８８）６０８，ｄＣＴＰ－（Ｃｙ３）６０９，ｄＧＴＰ－（Ｃｙ５）６０７，ｄＴＴＰ－（Ｃｙ５．５）６１０）を注入口１１２より流路１１４へ導入して伸長反応を行うと同時に，励起光を照射しナノ開口内部にエバネッセント場６１１を形成した（図７Ｄ）。プライマ６０６の３’末端の塩基の次に位置するところの相補的な位置にある一本鎖鋳型ＤＮＡ６０５の配列上の塩基と相補的なｄＮＴＰが伸長反応によって前記鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれると同時に，前記取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体はエバネッセント場６１１に進入するため発光する（図７Ｅ）。この時，発光の有無とその発光蛍光の波長の特定をすることにより，ナノ開口内の鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰの種別を判断する。前記伸長反応と同時に前記取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体はリン酸末端に標識されているため，ｄＮＴＰから切断され，伸長反応が続く（図７Ｆ）。本システムでは，複数のナノ開口底面６０３からの発光を同時計測できるため，各ナノ開口底面６０３にそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを固定した場合，前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰの塩基種を，つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。
　本実施例で示した照射方式において，励起光強度は，ナノ開口底面から離れるに従って指数関数的に減少するため，ナノ開口より上方には励起光は存在しない。また，蛍光検出光軸と垂直方向においてナノ開口外部に励起光は伝播されないため，遮光性薄膜２０３に非特異吸着した蛍光体やゴミは励起されない。そのため，背景光の上昇を抑えることが可能となる。さらに，透明基板２０１と遮光薄膜２０３の間に低屈折率透明薄膜２０２を設けることにより，照射効率が向上するため，低出力の励起光源でもナノ開口底面に固定された鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。
　本実施例では，より照射効率を向上させる方法を用いてＤＮＡシーケンシングを行う。照射効率向上の方法としては本発明とプラズモン共鳴を利用する。ナノ開口デバイスの形状以外は，実施例１と同等である。
　図８に本実施例におけるナノ開口デバイスの構造を示す。また，図９Ａ－図９Ｄに本実施例のナノ開口デバイスの作製方法を示す。実施例１と同等の方法でナノ開口デバイスを作製した後に，レジスト２０７をナノ開口デバイスの遮光性薄膜２０３上面に塗布し（図９Ａ），ＥＢリソ技術によりナノ開口２０４の中心に直径５０ｎｍの開口２０８をレジスト上に設ける（図９Ｂ）。スパッタにより銀２０９を厚さ５０ｎｍになるように成膜し（図９Ｃ），レジストを剥離する。上記方法によりナノ開口２０４底面中心部に直径５０ｎｍ高さ５０ｎｍ円柱形状の構造体７０１を形成させる（図９Ｄ）。次いで，構造体７０１の上面縁にビオチン７０２を固定する。構造体７０１の材質としては，アルミニウム，金，白金，タングステンなどの金属であれば良く，形状は円錐や立方体などの微細な突起でも，微粒子を用いても良い。また，構造体７０１の大きさはナノ開口の直径よりも小さければ良い。
　照射効率向上の効果を確認するため，実施例１の図４と同等のシミュレーションを行った。図１０にシミュレーションに用いたモデルを示す。開口中央に構造体８０１を設けた以外は実施例１図４と同等である。開口中央部に設けた構造体８０１の材質を銀，構造体幅８０２を０．０５μｍ，構造体長さ８０３を０．０５μｍとした。図１１にシミュレーションにより得られた（構造物あり）照射強度と伝播距離の関係を示す。比較対象として実施例１図４で得られた結果（構造物なし）も示す。構造物なしでは，実施例１図４開口中央部３１０の照射強度を，構造物ありでは図１０構造体左端部８０４の照射強度を示す。いずれの場合も励起光波長は４８８ｎｍとし，低屈折率透明薄膜３０２の厚みは２００ｎｍとした。また，伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。構造物ありでは，構造体８０１の上面縁の照射強度がプラズモン共鳴により構造物なしに比べて３０倍程度高いことが分かる。
　本デバイスを用いる事により，ターゲット蛍光体に対して非常に効率的に励起光を照射することが可能となり，低出力の励起光源でも銀構造体縁に固定された鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。
　本実施例では，本発明とターゲット蛍光体の発光検出効率を向上させる方法を用いてＤＮＡシーケンシングを高感度に行う。ナノ開口デバイスの形状以外は，実施例１と同等である。
　図１２に本実施例におけるナノ開口デバイスの構造を示す。また，図１３Ａ－図１３Ｃに本実施例のナノ開口デバイスの作製方法を示す。実施例１と同等の方法でナノ開口デバイスを作製した後に，ナノ開口デバイス１１０の透明基板２０１側面に塗布防止用フィルム２０６を貼り，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）２１０を浸漬引き上げにてコーティングする（図１３Ａ）。前記コーティング後に前記塗布防止用フィルムを取り除く。ＣＹＴＯＰ（Ｒ）コーティング後に，遮光性薄膜２０３と等しい高さになるまで，余剰のＣＹＴＯＰ（Ｒ）を研磨し，ＣＹＴＯＰ（Ｒ）の溶液層側表面と遮光性薄膜２０３の溶液層側表面が，ほぼ同一平面になるように表面を平面にし，透明充填相１００１を形成する（図１３Ｂ）。次いで，透明充填層１００１表面に一分子のビオチン１００２を固定する（図１３Ｃ）。透明充填層１００１の材質として，光学的に透明な材質であれば良く，本実施例では，低屈折率透明薄膜と同じＣＹＴＯＰ（Ｒ）を使用した。
　照射効率を求めるため，実施例１の図４と同等のシミュレーションを行った。図１４にシミュレーションに用いたモデルを示す。開口３０４内に透明充填層１１０１を設けた以外は実施例１の図４と同等である。開口３０４内に設けた透明充填層１１０１の材質を低屈折率透明薄膜３０２と同一（屈折率１．３４）とした。図１５にシミュレーションにより得られた（充填剤あり，薄膜あり）照射強度と伝播距離の関係を示す。比較対象として実施例１図４で得られた結果「充填剤なし，薄膜あり」ならびに「充填剤なし，薄膜なし」を示す。「薄膜あり」では低屈折率薄膜３０２の厚みを２００ｎｍ，「薄膜なし」では低屈折率薄膜３０２の厚みを０ｎｍとした。いずれの場合も，照射強度は開口中央部（図４開口中央部３１０，図１４開口中央部１１０２）での値を求め，励起光波長は４８８ｎｍとした。また，伝播距離の原点０はナノ開口部における低屈折率透明薄膜と溶媒３０５の境界面とした。「充填剤あり，薄膜あり」の前記境界面での照射強度は，「充填剤なし，薄膜あり」に比べて約５／６程度減少するが，「充填剤なし，薄膜なし」に比べて２倍程度向上する。これに加え，特許文献２で示すように「充填剤あり，薄膜あり」では，前記境界面上での発光蛍光の検出効率が向上する。
　本デバイスを用いる事により，ターゲット蛍光体に対して非常に効率的に励起光を照射することが可能となり，また検出効率も向上するため，低出力の励起光源でも固定された鋳型ＤＮＡ－プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体を高感度に検出することができる。
　この他に実施例２に示すようなプラズモン共鳴を起す励起光波長以下の微細金属構造体を図１２に示す透明充填層１００１表面に固定し，前記微細金属構造体の表面で蛍光発光を行うことにより，より高感度検出が可能となる。
　尚、これらの実施例においては、生体試料としてＤＮＡを用いているが、その他にも、ＲＮＡ、タンパク質等の分析にも用いることができる。
　本発明は、前述の説明および実施例に特に記載した態様以外でも実施できることは明らかである。そのため、本発明の多くの改変および変形が可能であり、したがって、それらも本件添付の特許請求の範囲内のものである。
　ＤＮＡシーケンサ等への利用が可能と考えられる。
　１０１：励起光源
　１０２：励起光源
　１０３：λ／４
　１０４：λ／４
　１０５：ミラー
　１０６：ダイクロイックミラー
　１０７：ミラー
　１０８：レンズ
　１０９：プリズム
　１１０：ナノ開口デバイス
　１１１：スペーサ
　１１２：注入口
　１１３：排出口
　１１４：流路
　１１５：カバープレート
　１１６：検出窓
　１１７：対物レンズ
　１１８：ノッチフィルタ
　１１９：ノッチフィルタ
　１２０：分光素子
　１２１：結像レンズ
　１２２：イメージセンサ
　１２３：制御部
　２０１：透明基板
　２０２：低屈折率透明薄膜
　２０３：遮光性薄膜
　２０４：ナノ開口
　２０５：ビオチン
　２０６：塗布防止用フィルム
　２０７：レジスト
　２０８：開口
　２０９：銀
　２１０：ＣＹＴＯＰ（Ｒ）
　３０１：ガラス基板
　３０２：低屈折率透明薄膜
　３０３：アルミニウム膜
　３０４：開口
　３０５：溶媒
　３０７：モデル長さ
　３０８：モデル幅
　３０９：ガラス幅
　３１０：開口中央部
　３１１：入射角度
　６０１：ビオチン
　６０２：ストレプトアビジン
　６０３：ナノ開口底面
　６０４：ＤＮＡポリメラーゼ
　６０５：一本鎖鋳型ＤＮＡ
　６０６：プライマ
　６０７：ｄＧＴＰ－Ｃｙ５
　６０８：ｄＡＴＰ－Ａｌｅｘａ４８８
　６０９：ｄＧＴＰ－Ｃｙ３
　６１０：ｄＴＴＰ－Ｃｙ５．５
　６１１：エバネッセント場
　７０１：構造体
　７０２：ビオチン
　８０１：構造体
　８０２：構造体幅
　８０３：構造体長さ
　８０４：構造体左端部
　１００１：透明充填層
　１００２：ビオチン
　１１０１：透明充填層
　１１０２：開口中央部

Claims (12)

  1. 　入射される光に対して透明な透明基板と、
    　生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、
    　前記透明基板と前記非導光膜との間に設けられ、前記基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、前記基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えた蛍光検出デバイス。
  2. 　前記入射される光の角度は、前記基板と前記スペーサ層の境界面における臨界角以上であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
  3. 　前記開口の径は、入射される光の波長以下の大きさであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
  4. 　前記非導光膜は、金属膜であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
  5. 　前記開口には、前記生体試料を設置する構造体が設けられていることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出デバイス。
  6. 　前記構造体は、金属であることを特徴とする請求項１記載の蛍光検出デバイス。
  7. 　前記開口は、前記基板より入射される光に対して透明な材料で充填されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出デバイス。
  8. 　前記充填された開口上に前記生体試料を配置する構造体が設けられていることを特徴とする請求項７に記載の蛍光検出デバイス。
  9. 　光源と、
    　生体試料を設置するデバイスと、
    　前記光源からの光が前記生体試料に照射されて発光した蛍光を検出する検出器と、
    　前記検出器から検出された蛍光を分析する計算器とを有し、
    　前記デバイスは、前記光源から入射される光に対して透明な透明基板と、前記生体試料を配置させる開口を設けた非導光膜と、前記透明基板と前記非導光膜との間に設けられ、前記基板の屈折率よりも低い屈折率を有し、前記基板を通して入射される光に対して透明なスペーサ層とを備えたことを特徴とする分析システム。
  10. 　前記光源から前記デバイスに対して照射される光の入射角度は、前記基板と前記スペーサ層との境界面における臨界角以上であることを特徴とする請求項９記載の分析システム。
  11. 　前記デバイスと前記検出器との間にはカバープレートを備え、前記カバープレートと前記デバイスとの間において溶液の流路を構成することを特徴とする請求項９記載の分析システム。
  12. 　前記生体試料はＤＮＡであって、前記計算器は、前記検出器によって検出された蛍光に基づいて、前記ＤＮＡの配列決定を行うことを特徴とする請求項９に記載の分析システム。
PCT/JP2010/061124 2009-07-03 2010-06-30 高感度蛍光検出デバイス WO2011002010A1 (ja)

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